Możliwość automatyzacji oznaczania szybkości opadania krwinek czerwonych w laboratorium rutynowym

Transkrypt

1 diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2013 Volume 49 Number Praca oryginalna Original Article Możliwość automatyzacji oznaczania szybkości opadania krwinek czerwonych w laboratorium rutynowym The possibility of automating the determination of erythrocyte sedimentation rate in the laboratory routine Beata Rojecka 1,2, Agnieszka Wiśniewska 1, Dagna Bobilewicz 1 1 Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej Wydziału Nauki o Zdrowiu, 2 Katedra i Zakład Biochemii I Wydziału Lekarskiego, Warszawski Uniwersytet Medyczny Streszczenie Proces automatyzacji laboratoriów obejmuje także OB (odczyn opadania krwinek), jako rutynowo zlecane badanie laboratoryjne. Wykonywanie oznaczeń na analizatorze TEST 1 umożliwia zapewnienie lepszej jakości poprzez uzyskiwanie wyników w znacznie krótszym czasie i zmniejszenie objętości pobieranej krwi. Celem pracy było porównanie wyników uzyskanych metodą Westergrena i metodą automatyczną, a także ocena przydatności analizatora w pracy rutynowego laboratorium. Oznaczenia wykonano w 370 próbkach krwi pobranych rutynowo na badanie morfologii (we krwi pełnej pobranej na wersenian potasu) i OB (we krwi pełnej pobranej na cytrynian sodu). Wykazano wysoką korelację (r=0,94), która zmniejsza się wraz ze wzrostem wartości OB. Niektóre wyniki uzyskane metodą Westergrena były w zakresie wartości prawidłowych, a wyniki uzyskane z analizatora były poza zakresem referencyjnym, co powoduje, że wyniki te nie powinny być interpretowane w odniesieniu do tych samych wartości referencyjnych. Niezbędne jest opracowanie zakresu wartości referencyjnych dla metody automatycznej. Summary Trend for automation of laboratory includes ESR (erythrocyte sedimentation rate), as a routine laboratory test ordered. The determination ESR on TEST 1 analyzer can provide better quality by getting results in a shorter time and reduce the volume of blood. The aim of this study was to compare the results obtained by Westergren method versus automatic method and evaluate the usefulness of analyzer in routine laboratory work. ESR was determinate in 370 blood samples taken routinely for CBC (whole blood collected EDTA) and ESR (in whole blood collected in sodium citrate). Values demonstrated a high correlation (r= 0.94), which decreases with increasing values of ESR. Some results obtained by Westergren were within the normal range, and the results from the analyzer were out of range, which means that these results should not be interpreted in relation to the same reference values. It is necessary to develop reference values for the automated method. Słowa kluczowe: analizator TEST 1, automatyzacja OB, metoda Westergrena Key words: TEST 1 analyzer, automation of ESR, Westergren method Wstęp Szybkość opadania krwinek czerwonych określana również jako Odczyn Biernackiego (OB), należy do najbardziej rozpowszechnionych rutynowych badań laboratoryjnych, jest badaniem nieswoistym, informującym o ogólnym stanie zdrowia ze szczególnym uwzględnieniem ostrych lub przewlekłych stanów zapalnych, a także stanów nowotworowych. Ze względu na to znajduje zastosowanie w rozpoznawaniu, monitorowaniu przebiegu i leczenia różnych stanów klinicznych, a także wchodzi w skład rutynowego panelu okresowych badań kontrolnych. W ostatnich latach opracowano kilka nowych technik oznaczania OB, opartych na automatyzacji, co poprawia jakość wyników oraz znacznie przyspiesza ich uzyskanie. Wpływa również na lepsze wykorzystanie zasobów ludzkich, a także dzięki zastosowaniu pomiarów w systemie zamkniętym przyczynia się do poprawy bezpieczeństwa personelu ograniczając jego kontakt z materiałem potencjalnie zakaźnym. Przykładem w pełni zautomatyzowanego urządzenia do oznaczania OB jest analizator TEST 1 Alifax. Dokonuje on pomiarów w próbkach krwi pobranych na wersenian potasu, umożliwiając tym samym wykorzystanie próbek z założenia przeznaczonych do badań hematologicznych, co zmniejsza objętość pobieranej krwi. Celem podjętych badań było porównanie wyników pomiaru 113

2 Możliwość automatyzacji oznaczania szybkości opadania krwinek w laboratorium rutynowym szybkości opadania krwinek czerwonych metodą automatyczną i rutynowo stosowaną oraz ocena użyteczności analizatora TEST 1 SDL Alifax, Padova, Italy w pracy laboratorium szpitala wieloprofilowego. Materiał i metody Oznaczenia OB wykonano w 370 próbkach krwi pobranych rutynowo na wersenian potasowy w celu wykonania morfologii krwi oraz pobranych na cytrynian sodu. Pomiar szybkości opadania krwinek był wykonany manualną metodą rutynową Westergrena we krwi cytrynianowej, a także metodą automatyczną (analizator TEST 1 SDL Alifax) w próbkach pobranych na wersenian, w których uprzednio wykonano morfologię [1, 2]. Wszystkie próbki, które wykorzystano do badań były pobrane w dniu analizy, przechowywane w temperaturze pokojowej, i analizowane w czasie nie przekraczającym 6 godzin od chwili pobrania. W celu sprawdzenia stabilności OB określono również w 70 próbkach przechowywanych przez 24 godziny w temperaturze 4 C. Ze względów technicznych (dostępna objętość krwi) ocenę nieprecyzji w serii wykonano tylko na analizatorze, wykonując jednoczasowo 21 oznaczeń z tej samej próbki. Jako materiał kontrolny zastosowano zestaw kontroli lateksowych o różnych wartościach OB dostarczonych przez producenta analizatora. Oznaczenia wykonano trzykrotnie w okresie badań (6 tygodni). Materiały kontrolne do metody manualnej nie były stosowane w pracy codziennej. Laboratorium uczestniczy w okresowej kontroli międzynarodowej, uzyskując pozytywne wyniki. Zarówno z próbkami od pacjentów, jak i z materiałem kontrolnym postępowano zgodnie z instrukcją producenta. Zastosowany analizator jest w pełni zautomatyzowanym urządzeniem do oznaczania szybkości opadania krwinek czerwonych w próbkach krwi pobranych na wersenian potasu w systemie zamkniętym [3]. Właściwy pomiar wykonywany jest przy użyciu techniki zatrzymanego przepływu. TEST 1 SDL poprzez zmiany absorbancji mierzy zdolność sedymentacji i agregacji erytrocytów. Przyrządem pomiarowym jest mikrofotometr na podczerwień (λ= 950 nm). Zmiany agregacji i mikrosedymentacji krwinek mierzone przy użyciu fotodiody 1000 razy w ciągu 20 sekund są ściśle skorelowane z agregacją erytrocytów obecnych na danym poziomie kapilary. Dla każdej próbki wykreślana jest krzywa sedymentacji. Zarejestrowane w kapilarze zmiany gęstości optycznej w jednostce czasu są przeliczane na mm/h [3]. Mierzona jest pierwsza faza opadania krwinek czerwonych, która głównie generuje szybkość opadania erytrocytów [3, 4, 5]. Otrzymane wyniki opracowano statystycznie z użyciem programu Statistica 10 (Stat Soft) i Microsoft Office Excel Do opracowania wyników użyto testu t-student dla zmiennych niezależnych, a dla oceny zależności korzystano z rachunku korelacji wg Pearsona. Różnice pomiędzy danymi uznano za statystycznie istotne przy poziomie istotności p <0,0500. Wyniki uzyskane zmodyfikowaną metodą Westergrena uznano za punkt odniesienia, ponieważ jest to metoda wykorzystywana podczas rutynowej pracy laboratorium. Każdemu z wyników przyporządkowano wynik uzyskany pomiarem automatycznym. Wyniki podzielono na trzy grupy : grupa 1 wartości OB w zakresie 2-20 mm/h (n =231) grupa 2 wartości OB w zakresie mm/h (n=130) grupa 3 wartości OB powyżej 100 mm/h (n =9) Dodatkowo wyodrębniono 20 próbek z obniżonymi wartościami hematokrytu (21 29%). Wyniki W 251 przypadkach, co stanowi 68% wszystkich oznaczeń, wyniki uzyskane metodą automatyczną były istotnie wyższe, niż uzyskane metodą rutynową, w 93 (25%) były niższe, (p=0,0100) a w 26 (7%) identyczne. Wartością minimalną dla obu metod było 2 mm/h, natomiast maksymalną 120 mm/h. Wartości przedstawione w tabeli I odnoszą się tak do całego zakresu jak i poszczególnych grup. Różnice między średnimi są istotne statystycznie, największe stwierdzono w przedziale wartości OB 2-20 mm/h (p=0,0001), a najmniejsze przy całym zakresie wartości (p=0,0100). W grupie, powyżej 100 mm/h nie zaobserwowano istotnych statystycznie różnic. Zależność między wynikami uzyskanymi obiema metodami ilustruje rycina 1. Istotną korelację obserwowano dla wszystkich wyników (r=0,94; p<0,001), oraz w grupach, 2-20 mm/h (r=0,71; Tabela I. Wartości średnie, odchylenia standardowe (SD), uzyskane zmodyfikowaną metodą Westergrena i metodą automatyczną przy użyciu analizatora TEST 1 Alifax zakres wartości OB n wartości średnie metoda Westergrena SD metoda Westergrena wartości średnie TEST 1 SDL SD TEST 1 SDL poziom istotności p ,84 25,72 30,16 30,16 0, ,26 5,04 12,44 7,61 0, ,91 20,88 56,16 28,08 0,0028 > ,77 7,16 111,88 18,82 0,

3 Rycina 1. Korelacja między wynikami oznaczeń szybkości opadania krwinek metodą rutynową i automatyczną (n= 370) p<0,001) i mm/h (r=0,86; p<0,001). Nie stwierdzono istotnej korelacji w przypadku wartości powyżej 100 mm/h. W 36 przypadkach prawidłowych wartości OB uzyskanych metodą manualną (poniżej 12 mm/h średnio 8,1 mm/h) określone na analizatorze było przyśpieszone (powyżej 12 mm/h, średnio 17,9 mm/h). Wartości OB określone na analizatorze TEST 1 SDL w 21 powtórzeniach tej samej próbki krwi pełnej, w tym samym czasie, były identyczne - 2 mm/h. Korelacja między wynikami uzyskanymi w dniu pobrania i po przechowywaniu w temperaturze 4 o C po 24 godzinach jest bardzo dobra (r=0,99; p<0,001). Oznaczenia wykonywane w przechowywanym materiale dawały wyniki bardzo zbliżone do tych uzyskiwanych w dniu pobrania. W 11 przypadkach (55%) próbek z obniżonym hematokrytem wyższe wyniki otrzymano z analizatora, w 9 przypadkach (45%) metodą rutynową. Wartości średnie wynosiły 64 mm/h dla metody Westergrena i 68 mm/h dla metody automatycznej i nie różniły się istotnie. Wyniki wszystkich oznaczeń wykonanych w materiale kontrolnym LATEX CONTROL KIT mieściły się w zakresie referencyjnym. Wartościami oczekiwanymi na poszczególnych poziomach były odpowiednio 9 mm/h, 19 mm/h i 65 mm/h, a uzyskane (średnia z 3 oznaczeń). to odpowiednio 9,5 + 0,58 mm/h, 19,7 + 0,96 mm/h i ,16 mm/h. Dyskusja Zastosowanie nowoczesnych technologii umożliwiło wykorzystanie automatyzacji również w odniesieniu do oznaczeń OB. Dzięki temu pomiary OB są wykonywane znacznie szybciej, a także z wykorzystaniem mniejszej objętości krwi pobieranej od pacjenta (możliwość dokonywania pomiarów we krwi wersenianowej). Wartości uzyskane za pomocą analizatorów z rodziny TEST 1 charakteryzuje dobra korelacja z metodą Westergrena, co wykazano w badaniach własnych. Podobne dane są podawane również przez innych autorów [5, 6, 7]. Korelacja zmniejsza się wraz ze wzrostem wartości OB i jest najsłabsza w grupie powyżej 100 mm/h. Przy tak wysokich wartościach znaczenie kliniczne różnic jest jednak znacznie mniejsze, ponieważ są to wyniki wybitnie patologiczne. Różnice występujące między parami wyników mogą być spowodowane zastosowaniem probówek zawierających różne antykoagulanty. K 3 EDTA jest antykoagulantem rekomendowanym do oznaczeń OB przez ICSH i NCCLS. Powoduje on zwiększenie stabilności komórek krwi, co sprzyja ich rulonizacji. Jednocześnie umożliwia zachowanie właściwości morfotycznych krwinek [1, 8, 9, 10]. Poza tym wpływ na wyniki mógł mieć fakt rozcieńczenia krwi cytrynianem. W badaniach własnych stwierdzono, że pomimo dobrej korelacji wyniki uzyskane z analizatora w większości przypadków były wyższe od uzyskiwanych metodą Westergrena w związku z czym wartości OB określone tymi dwiema metodami nie powinny być interpretowane w odniesieniu do tych samych wartości referencyjnych. W materiale własnym w 36 przypadkach, w których OB uzyskane metodą Westergrena znajduje się w zakresie przyjętych dla tej metody wartości prawidłowych (2-12 mm/h) wyniki uzyskane z analizatora są poza zakresem referencyjnym, co powoduje istotne rozbieżności zakwalifikowania pacjentów do tej samej grupy i może mieć niekorzystne konsekwencje kliniczne. Wprowadzając metodę automatyczną do rutynowej pracy laboratorium należałoby zmodyfikować zakres wartości referencyjnych. Sugerowany przez Soffiati (informacja ustna) zakres referencyjny to dla kobiet poniżej 38 mm/h a dla mężczyzn poniżej 29 mm/h. W oparciu o prezentowane badania własne można sugerować jako zakres wartości referencyjnych dla metody automatycznej przedział od 2 mm/h do 23 mm/h. W celu ustalenia zakresu referencyjnego należałoby zgromadzić większą grupę pacjentów i podzielić wyniki ze względu na płeć i wiek. Romero, Munoz i Ramirez zaobserwowali, że u pacjentów z obniżonym hematokrytem i szybkością opadania krwinek powyżej 60 mm/h wyniki uzyskane przy użyciu analizatora TEST 1 są znacząco niższe, niż te otrzymane w wyniku pomiaru metodą Westergrena, wyjaśniając że może ona zawyżać wyniki u pacjentów z obniżoną wartością hematokrytu [11]. W prezentowanej pracy w dziesięciu przypadkach, gdy OB przekraczało 60 mm/h, jedynie w 2 z nich wynik uzyskany przy użyciu metody automatycznej był niższy. W pozostałych 8 przypadkach niższe wartości uzyskano metodą rutynową. Nie uzyskano zatem potwierdzenia, że metodą manualną w próbkach krwi z obniżonym hematokrytem uzyskuje się wyniki zawyżone. Producent aparatu również wyraża opinię, że nieprawidłowy hematokryt ma minimalny wpływ na wartości uzyskane z analizatora. Wartości uzyskane w próbkach przechowywanych 24 godziny w temperaturze 4 C, podobnie jak w większości publikacji, wskazują na nieznaczne obniżenie po 24 godzinach w stosunku do oznaczeń wykonywanych bezpośrednio po pobraniu krwi. Najprawdopodobniej podczas przechowywania krwi dochodzi do zmniejszenia ilości kwasu sjalowego w błonie erytrocytów, co skutkuje zmniejszeniem oddziaływań między krwinkami i wolniejszym ich opadaniem [9]. W celu zapewnienia kontroli jakości pomiarów OB wprowadzono na rynek materiały kontrolne. Są to stabilizowane 115

4 Możliwość automatyzacji oznaczania szybkości opadania krwinek w laboratorium rutynowym próbki krwi pochodzenia ludzkiego. Ich użycie nie jest możliwe w analizatorach typu TEST 1 SDL ze względu na właściwości kinetyczne różniące się od właściwości erytrocytów w świeżej krwi. Analizator ocenia szybkość sedymentacji na podstawie pierwszej fazy opadania krwinek, natomiast przy użyciu próbek stabilizowanych możliwe byłoby jedynie określenie końcowej wartości OB po 60 minutach. Dla oceny jakości w tym analizatorze są dostępne materiały kontrolne, między innymi zestaw kontroli lateksowych (cząstki lateksu zawieszone w roztworze), na trzech różnych poziomach. Oznaczeń w materiale kontrolnym, podobnie jak w przypadku większości parametrów laboratoryjnych, dokonuje się postępując w sposób analogiczny jak z próbkami od pacjenta, co jest niewątpliwą zaletą, bo usprawnia proces analityczny. Ponadto właściwości materiału kontrolnego są kompatybilne z próbkami krwi ludzkiej [12]. Dzięki zastosowaniu analizatora łącznie z zestawem kontrolnym pomiar OB staje się prostym, w pełni zautomatyzowanym rutynowym testem laboratoryjnym i pomimo wysokiej ceny zestawu kontrolnego, znajduje swoje miejsce w wielu dużych laboratoriach, ponieważ umożliwia optymalizację pracy [12, 13, 14]. Prezentowane w pracy wyniki dowodzą, że pomimo statystycznie istotnych różnic między dwiema metodami: metodą rutynowo stosowaną w laboratorium i metodą automatyczną, wyniki uzyskiwane za pomocą tych metod wykazują bardzo dobrą korelację. Nie można jednoznacznie wypowiedzieć się na temat jakości obu metod, ponieważ są one oparte na zupełnie innych zasadach. Próbki, w których wykonano oznaczenia zawierały inny rodzaj antykoagulantu, temperatura oznaczeń była różna, co również mogło wpływać na odchylenia. Istotną zaletą metody automatycznej jest krótki czas uzyskania wyniku. W przypadku metody rutynowej jest to 60 minut, a w przypadku analizatora, to 20 sekund. Hardeman i współpracownicy zwracają uwagę, że czynniki takie jak wielkość agregatów komórkowych czy lepkość osocza nie mają wpływu na tę technikę pomiaru, co może tłumaczyć różnicę pomiędzy wynikami uzyskanymi metodą Westergrena i automatyczną [14]. W związku z różną procedurą pomiarów i faktem uzyskania wyższych wyników z analizatora, chcąc go wprowadzić do rutynowej pracy należałoby dokonać zmiany zakresów referencyjnych dla OB, tak aby większość uzyskiwanych wyników nie znajdowała się poza zakresem referencyjnym ustalonym dla wcześniej używanej metody. Z perspektywy pracy w dużym laboratorium analizator TEST 1 SDL jest dobrym rozwiązaniem z wielu względów, zarówno organizacyjnych jaki bezpieczeństwa pracowników. Pełna automatyzacja zapewnia minimalny udział operatora, który ogranicza się jedynie do załadowywani i wyładowywania statywów z analizatora. Jest to metoda bezodczynnikowa, co wpływa na zminimalizowanie kosztów eksploatacji analizatora [2]. Ważna jest także szybkość wykonywania oznaczeń. W praktyce po dokładnym wymieszaniu próbek, które trwa około 10 minut, wynik otrzymujemy co około 20 sekund. Podczas jednego cyklu analizy oznaczenia wykonywane są w 4 statywach maksymalnie po 10 probówek w każdym. Analizator cechuje także możliwość pracy bez zakłóceń przez 24 h/dobę. Aparat posiada duży zakres liniowości od 2 do 120 mm/h, a ponadto wymagana jest niewielka objętość krwi 150 µl. Oznaczenia wykonuje się w próbkach, wykorzystywanych do badań hematologicznych, co redukuje koszty pobrania i objętość krwi. Dodatkowymi zaletami technicznymi jest odczytywanie kodów kreskowych, podawanie dziennych i łącznych średnich wartości OB dla 30 dni i możliwość połączenia z wewnątrzlaboratoryjnym systemem informatycznym i przesyłania wyników. Wszystko to sprawia, że analizator wymagając niewielkiego udziału operatora, zmniejsza ryzyko błędów, a także przyśpiesza czas uzyskania wyniku. Wnioski 1. Pomiędzy wynikami OB uzyskanymi metodą Westergrena i w pełni zautomatyzowaną metodą z użyciem analizatora TEST 1 SDL stwierdza się istotną zależność, zmniejszająca się wraz ze wzrostem mierzonych wartości. 2. Różnice pomiędzy wynikami, szczególnie w zakresie wartości decyzyjnych, uzyskanymi przy zastosowaniu dwóch metod wskazują na konieczność opracowania zakresu wartości prawidłowych dla metody automatycznej. 3. Wprowadzenie automatyzacji do oznaczeń OB może być zalecane ze względu tak na jakość, skrócenie czasu wydania wyniku, mniejszą objętość krwi jak i bezpieczeństwo personelu. Piśmiennictwo: 1. International Council for Standardization in Haematology (Expert Panel on Blood Rheology). ICSH recommendations for measurement of erythrocyte sedimentation rate. J Clin Pathol 1993; 46: Lis K. Odczyn Biernackiego wczoraj i dziś. Diagn Lab 2012; 48: Piva E, Sanzari MC, Servidio G, et al. Length of sedimentation reaction in undiluted blood (Erythrocyte Sedimentation Rate): variations with sex and age and reference limits. Clin Chem Lab Med 2001; 39: Plebani M, De Toni S, Sanzari MC, et al. The TEST1 automated system: a new method for measuring the erythrocyte sedimentation rate. Am J Clin Pathol 1998; 110: Hardeman MR, Levitus M, Pelliccia A, et al. Test 1 analyser for determination of ESR, 2: experimental evaluation and comparison with RBC aggregometry. Scand J Clin Lab Invest 2010; 70: Imafuku Y, Yoshida H, Greenfield S, et al. Automated measurement of erythrocyte sedimentation rate and its relation to red blood cell concentration and plasma proteins. Hematol Cell Ther 1998; 40: National Committee for Clinical Laboratory Standards. Reference and Selected Procedure for Erythrocyte Sedimentation (ESR) Test; Approved Standard, 4th ed. H2-A4. Villanova, PA: NCCLS; Perovic E, Bakovic L, Valcic A. Evaluation of Ves-Matic Cube 200 an automated system for the measurement of the erythrocyte sedimentation rate. Int J Lab Hem 2010; 32 : Horsti J, Kovanen M. Using EDTA as an anticoagulant for ESR to replace citrate. Klin Lab J 2000; 4:

5 11. Romero A, Muñoz M, Ramírez G. Length of sedimentation reaction in blood: a comparison of the Test 1 ESR system with the ICSH reference method and the Sedisystem 15. Clin Chem Lab Med 2003; 41: Saadeh C. The erythrocyte sedimentation rate: old and new clinical application. South Med J 1998; 91: Piva E, Pajola R, Temporin V, et al. A new turbidimetric standard to improve the quality assurance of the erythrocyte sedimentation rate measurement. Clin Biochem 2007; 40: Giavarina D, Capuzzo S, Cauduro F, et al. Internal quality control for erythrocyte sedimentation rate measured by TEST-1 Analyzer. Clin Lab 2002; 48: Hardeman M.R, Levitus M, Pelliccia, et al. Test 1 analyser for determination of ESR. Practical evaluation and comparison with the Westergren technique. Scand J Clin Lab Invest 2010; 70: Adres do korespondencji: mgr Beata Rojecka Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej Wydziału Nauki o Zdrowiu WUM Warszawa, ul. Banacha 1a tel , faks beata_rojecka@wp.pl Zaakceptowano do publikacji: