(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (2) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (9) PL () PL/EP (3) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (5) Int. Cl. C07K4/47 (2006.0) (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej Europejski Biuletyn Patentowy 2007/50 EP B (54) Tytuł wynalazku: Oczyszczanie peptydów z siary (30) Pierwszeństwo: GB GB (43) Zgłoszenie ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2006/02 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 05/2008 (73) Uprawniony z patentu: ReGen Therapeutics Plc, London, GB (72) Twórca (y) wynalazku: PL/EP T3 GEORGIADES Jerzy Alexander, Houston, US POLANOWSKI Antoni, Wrocław, PL WILUSZ Tadeusz, Wrocław, PL KRUZEL Marian L., Houston, US (74) Pełnomocnik: Przedsiębiorstwo Rzeczników Patentowych Patpol Sp. z o.o. rzecz. pat. Kossowska Janina Warszawa 30 skr. poczt. 37 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 () Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 Opis [000] Zgłoszenie dotyczy oczyszczania peptydów z siary. Wynalazek w szczególności dotyczy oczyszczania kolostryniny z siary. [0002] Kolostrum zwane siarą, jest przezroczystą wydzieliną gruczołu mlekowego, charakteryzującą się obecnością wielu elementów potrzebnych noworodkom ssaczym do prawidłowego rozwoju. Jest pierwszą wydzieliną mleczną po porodzie i zawiera wysokie stężenie immunoglobulin (IgG, IgM i IgA) oraz białka nieswoiste. Jest zastępowana przez dojrzałe mleko około cztery do pięciu dni po porodzie. W porównaniu z mlekiem o normalnym składzie, siara posiada niską zawartość cukru, lecz jest bogatsza w lipidy, białka, sole mineralne i immunoglobuliny. Zawiera także różne komórki wędrujące, takie jak komórki ziarniste i zrębowe, neutrofile, monocyty/makrofagi oraz limfocyty. Jest także bogata w czynniki wzrostu, hormony i cytokiny. [0003] Najpowszechniej występującymi wśród białek obecnych w siarze są kazeiny i wiadomo, że tworzą one agregaty (micele), podobne u wszystkich ssaków. Wiele białek i peptydów jest związanych z tymi agregatami słabymi siłami hydrofobowymi i jonowymi. Powstająca sieć białkopodobnych miceli posiada zdolność do wychwytywania wielu związków o niskim ciężarze cząsteczkowym o zróżnicowanej naturze, takich jak lipidy, węglowodany i peptydy, tworząc unikatowy homogenny roztwór. Micele pomagają w rozmieszczeniu tych mikrocząsteczek stosunek jednorodnie w siarze, a także zapobiegają tworzeniu przez nie niepożądanych agregatów. [0004] Opisano szereg peptydów z mleka o różnych aktywnościach biologicznych. Niektóre peptydy istnieją naturalnie, a niektóre mogą być uwalniane z rodzicielskich białek mleka przez proteolizę enzymatyczną. Szczególnie interesujące są te peptydy istniejące naturalnie, które są związane z micelami kazeinowymi. Poza kazeiną, wapniem i fosforanem, micele zawierają także cytrynian, mniej istotne jony, lipazę i plazminę oraz różne peptydy złapane w ich strukturę. Zatem, ostatnio największym wyzwaniem dla przemysłu mleczarskiego staje się dalszy proces oczyszczania wielu składników pochodzących z mleka. [0005] Zasadniczo, dalszy proces oczyszczania mleka rozpoczyna się koagulacją kazein przez dodanie chymozyny dla uzyskania twarogów, które są następnie oddzielane od cieczy, serwatki, po czym mogą być one przetwarzane i dojrzewają w celu produkcji serów. Chymozyna przerywa cząsteczki kappa-kazeiny prowadząc do ogólnego rozpadu miceli kazeinowych. W wyniku tego wiele składników rozpuszczalnej frakcji mleka zostaje uwięzionych w precypitacie i odrzuconych. Szczególnie mogą zostać utracone małe cząsteczki peptydów z wysokim indeksem hydrofobowym, takie jak kolostrynina. [0006] Oryginalny protokół oczyszczania dla uzyskania kolostryniny (Janusz i wsp.), składa się z zależnego od ph wytrącania kazeiny, a następnie różnych etapów chromatografii, w tym jonowymiennej, powinowactwa i molekularnego odsiewania, w połączeniu z wytrącaniem siarczanem amonowym. Pomimo, że jest to metoda powtarzalna, jest pracochłonna i trudna do prowadzenia na większą skalę w zastosowaniach przemysłowych. Od tego czasu ustalono wiele protokołów, wykorzystujących filtrację przez błony, celem odzyskiwania peptydów o niskim ciężarze cząsteczkowym z mleka i siary, lecz wszystkie one obarczone są wadami.

3 [0007] W jednym ze standardowych protokołów do rozdzielania składników mleka w przemyśle mleczarskim stosowana jest filtracja z przepływem stycznym. Przykładowo, metoda rozdzielania składników mleka za pomocą filtracji z przepływem stycznym ujawniona jest w patencie USA Kutzko i wsp., zatytułowanym Purification of Biologically Active Peptides from Milk. [0008] Także, Roger i wsp. proponują ultrafiltrację w patencie USA zatytułowanym: Process for Obtaining an α-lactalbumin Enriched Product from Whey, and Uses Thereof, do rozdzielania składników mleka na błonie o wartości odcięcia większej niż 5000 (np ) przy ph pomiędzy 6,3 i 7 (np. 6,6) i temperaturze pomiędzy 30ºC i 60ºC. [0009] Zastosowanie filtracji jest także opisane przez Wilsona i wsp., w patencie USA zatytułowanym: Process for Obtaining Transfer Factor from Colostrum, Transfer factor so Obtain and Use Thereof. W rzeczywistości, filtracja mleka lub siary jest dzisiaj standardową procedurą w przemyśle mleczarskim. Wilson i wsp., opisuje użycie środka do wytwarzania Transfer factor (czynnik transferowy) z siary. Odpowiednie środki obejmują alkohole, ketony i glikol polietylenowy. Nie ma natomiast opisu odzyskiwania kolostryniny z siary. [000] Patent USA ujawnia proces otrzymywania kappa-kazeino-glikomakropeptydu z produktu serwatki zatężonego w białkach. Proces obejmuje zastosowanie etanolu w stężeniu od 5% do 25% w odniesieniu do objętości roztworu. Produkt serwatki nie jest kolostryniną. [00] Patent UK ujawnia proces ekstrakcji konkretnego oktapeptydu ze skóry żaby przy użyciu alkoholu. [002] JP ujawnia sposób ekstrakcji peptydów cyklicznych z korzenia Ribia akane Nakai przy użyciu, między innymi, alkoholu. [003] W J Pharm Pharmaceut Sci, tom 5, MEC Lutsiak i wsp., Analysis of peptide and lipopeptide content in liposomes, str , ujawniony jest sposób ekstrakcji peptydów z liposomów. [004] W Journal of Antibiotics, tom XL, 987, E Meyers i wsp., Xylocandin: a new complex of antifungal peptides I. Taxonomy, isolation and biological activity, str , ujawniony jest sposób ekstrakcji peptydów z bakterii Pseudomonas cepacia. [005] W Acta Endocrinologica, tom, 986, WF Blum i wsp., Isolation and partial characterisation of six somatomedin-like peptides from human plasma Cohn fraction IV, str , ujawniona jest ekstrakcja peptydów typu somatomedyny z osocza ludzkiego przy użyciu etanolu. [006] W J Dairy Research, tom 54, 987, DS Horne, Ethanol stability of Casein miceles - a hypothesis concerning the role of calcium phosphate, str , ujawnione jest hipotetyczne opracowanie dotyczące struktury miceli kazeiny i uwalniania wapnia. [007] W Ir. J. Fd. Sci. Technol., tom 9, 985, MM Hewedi i wsp., Recovery of milk protein by ethanol precipitation, str. -3, ujawniony jest sposób wytrącania białek mleka przy użyciu etanolu. [008] Kolostrynina (w jęz. ang. colostrinin, znana także jako lub colostrinine), polipeptyd bogaty w prolinę lub PRP, była wyizolowana po raz pierwszy w 974 (Janusz i wsp., FEBS Lett., 49, ) z siary owczej. 2

4 [009] Pewne terapeutyczne zastosowania kolostryniny, w szczególności w leczeniu choroby Alzheimer'a, opisano w WO98/4473. W tym zgłoszeniu patentowym opisano fizyczną charakterystykę kolostryniny, jaka była osiągalna w tamtym czasie. Chociaż charakterystyka fizyczna była poprawna, wiedza na temat kolostryniny posunęła się od czasu złożenia zgłoszenia. WO98/4473 opisuje także sposób ekstrakcji kolostryniny z nieprzetworzonej siary, który często jest określany jako metoda Janusza. Metoda ta jest obecnie główną metodą ekstrakcji kolostryniny z siary. Posiada wady związane z tym, że trudne jest uzyskanie zwiększenia produkcji na skalę przemysłową i metoda ta daje niskie wydajności. [0020] WO00/7573 opisuje szereg peptydów znalezionych w kolostryninie. WO02/462, opisuje szereg które można znaleźć w kolostryninie. [002] US ujawnia sposób odzyskiwania inaktywatora kalikreiny z siary bydła, który obejmuje zmieszanie siary z metanolem. [0022] US ujawnia sposób odzyskiwania czynnika transferowego z siary krów, który obejmuje zmieszanie siary z izopropanolem. [0023] Znaczące zainteresowanie wzbudza obecność w siarze różnych polipeptydów, które można wyizolować wyłącznie z siary, a nie z dojrzałego mleka. Po kilku dniach po porodzie, stężenie kolostryniny w wydzielinie sutka ssaków gwałtownie zmniejsza się do końca trzeciego dnia. Taki krótki czas trwania niektórych peptydów kolostryniny wskazuje na ich istotną rolę we wczesnym rozwoju systemu odpornościowego niemowląt i ochronie noworodków przed szokiem środowiskowym. [0024] Ostatnio odkryto, że kolostrynina istnieje w dwóch formach: wolnej i zagregowanej (związanej). Uważa się, że wolne formy kolostryniny są wymagane do ochrony noworodka ssaczego przed stresem oksydacyjnym, który pojawia się zaraz po urodzeniu. Formy związane lub zagregowane, są przeznaczone do utrzymywania tej funkcji przez dłuższy czas po urodzeniu. Uważa się, że forma związana kolostryniny dodatkowo bierze udział w rozwoju i/lub ochronie różnych narządów i układów. Ma to miejsce wówczas, gdy problemy stresu oksydacyjnego ustępują i stężenia wolnej kolostryniny zaczynają się zmniejszać. Związana forma kolostryniny jest powoli uwalniana do płynów ustrojowych w celu modulowania funkcji fizjologicznych, kiedy forma wolna jest wyczerpana. Model ten znajduje potwierdzenie w badaniach nad stopniowym zanikiem specyficznych peptydów kolostryniny w siarze po porodzie. [0025] Uważa się, że kompleks kolostryniny składa się z co najmniej pięciu podgrup peptydów; przy czym każda grupa posiada swój własny charakterystyczny wzór hydrofobowy. Dowody sugerują, że peptydy te mają tendencję do agregowania, ze względu na obecność specyficznie ułożonych aminokwasów niepolarnych, polarnych, aromatycznych, o ładunku dodatnin i ujemnym. Ponadto, tę zdolność do agregowania sugeruje skład aminokwasowy peptydów i ich charakter hydrofobowy. [0026] Na podstawie dostępnych obecnie informacji, stwierdziliśmy, że peptydy kolostryniny mają najlepszą aktywność biologiczną, kiedy są obecne w formie natywnej. Wówczas, gdy są oczyszczone, zaczynają oddziaływać ze sobą tworząc niekowalencyjne związane kompleksy z widocznie słabszymi aktywnościami biologicznymi. Uważa się, że kolostrynina jest mieszaniną ponad 62 niezależnych peptydów, pochodzących od białek prekursorowych, takich jak aneksyna, beta-kazeina, 3

5 hipotetyczny homolog beta-kazeiny i inne, które nie mają homologii z żadnym specyficznym białkiem w aktualnej bazie danych GenBank. [0027] Celem wynalazku jest stworzenie nowego sposobu ekstrakcji i odzyskiwania peptydów z płynów zawierających materiały o wyższych ciężarach cząsteczkowych. Konkretnym celem wynalazku jest stworzenie sposobu oczyszczania kolostryniny z surowej siary, tak aby kolostrynina mogła być wytwarzana z wysoką wydajnością w formie, w której byłaby aktywna biologicznie i zasadniczo czysta. Sposób oczyszczania powinien dawać większość peptydów kolostryniny, zarówno wolnych jak i związanych lub zagregowanych. Oczyszczona kolostrynina, wolna od zanieczyszczeń i własnych agregatów, będzie posiadała bardziej aktywne składniki na jednostkę wagi. Dalszym celem wynalazku jest opracowanie protokołu oczyszczania, który będzie dostarczać stały zestaw peptydów charakteryzujących się specyficznymi aktywnościami biologicznymi. [0028] Wynalazek jest oparty na niespodziewanym odkryciu, że do ekstrakcji kolostryniny o wysokim stopniu czystości z siary można zastosować prosty sposób ekstrakcji. [0029] Zgodnie z jednym aspektem wynalazku dostarczany jest sposób odzyskiwania peptydów z siary ssaczej jak określono w zastrz.. [0030] Wynalazek ma zastosowanie w oczyszczaniu kolostryniny z siary i podany poniżej opis w większości odnosi się do tego specyficznego zastosowania. [003] Alkohol może być dowolnym alkoholem zdolnym do tworzenia fazy alkoholowej zawierającej peptydy kolostryniny po zmieszaniu z siarą i zdolnym do wytrącania niepożądanych materiałów o wysokim ciężarze cząsteczkowym. [0032] Alkohol może być liniowy lub rozgałęziony oraz może zawierać jedną lub większą liczbę grup hydroksylowych; korzystna jest jedna grupa hydroksylowa. Korzystnie, alkohol zawiera do 5 atomów węgla, korzystniej do 4 atomów węgla, najkorzystniej do 3 atomów węgla. Zbadaliśmy, że najlepsze wyniki są uzyskiwane z metanolem lub etanolem. [0033] Wskazane jest dodawanie do siary alkoholu w formie stężonej: korzystnie jest to alkohol o czystości co najmniej 80%, korzystniej o czystości co najmniej 95%, i najkorzystniej o czystości zasadniczo 00%. [0034] Ilość alkoholu dodawanego do siary korzystnie jest taka, że daje stężenie alkoholu w całej kompozycji od 40% (obj./obj.) do 80% (obj./obj.), korzystniej 50% (obj./obj.) do 70% (obj./obj.), jeszcze korzystniej 55% (obj./obj.) do 65% (obj./obj.) i najkorzystniej zasadniczo 60% (obj./obj.). [0035] Etap mieszania alkoholu z surową siarą (znany jako ekstrakcja ) jest korzystnie prowadzony z mieszaniem w temperaturze pokojowej przez 0 do 30 min. Daje to precypitat zawierający kazeiny i inne białka, podczas gdy kolostrynina pozostaje w roztworze w fazie alkoholowej. Ważną, i nieoczekiwaną, cechą wynalazku jest to, że zasadniczo wszystkie peptydy kolostryniny pozostają w roztworze w alkoholu, podczas, gdy inne składniki siary ulegają wytrąceniu. [0036] Precypitat można następnie wydzielić z fazy alkoholowej dowolnymi klasycznymi metodami, korzystnie przez wirowanie przy około 5000 x g i odzyskiwana jest faza alkoholowa zawierająca siarę. Kolostrynina jest następnie oddzielana od alkoholu, korzystnie przez odparowanie, co daje fazę bogatą w kolostryninę (która w większości jest wodnym roztworem kolostryniny). 4

6 [0037] Etap oddzielenia alkoholu od peptydów kolostryniny można prowadzić przez odparowanie lub wydłużoną ultrafiltrację, w połączeniu z wymianą wody lub buforu, chociaż korzystne jest odparowanie. Odparowanie można prowadzić zwykle w temperaturze w zakresie od 0ºC do 50ºC. Korzystna jest temperatura około 30ºC. Odparowanie lub filtrację można prowadzić przez okres, przykładowo, 30 minut do 2 godzin lub więcej (np. przez noc). Chociaż ultrafiltracja jest opcją możliwą do zastosowania, wyższy odzysk daje odparowanie. Pożądana może być eliminacja alkoholu przez odparowanie w próżni. Po usunięciu alkoholu, do fazy bogatej w kolostryninę można dodać wystarczająco dużo wody tak, aby uzyskać roztwór roboczy o objętości, w przybliżeniu, wyjściowej. [0038] W korzystnym wykonaniu, precypitat z etapu ekstrakcji alkoholowej jest następnie płukany dalszą ilością alkoholu i ponownie jest oddzielana i odzyskiwana faza alkoholowa. Ta druga odzyskana faza alkoholowa może zawierać niektóre peptydy kolostryniny, które zostały w precypitacie po pierwszej ekstrakcji. Drugą odzyskaną fazę alkoholową można dodać bezpośrednio do fazy alkoholowej odzyskanej z pierwszej ekstrakcji lub najpierw można usunąć część lub cały alkohol. Po usunięciu alkoholu pozostałości można bezpośrednio dodać do fazy bogatej w kolostryninę. [0039] Ewentualnie, po usunięciu alkoholu można przeprowadzić dalszy etap wirowania w celu oddzielenia jakiegokolwiek osadu powstałego w czasie usuwania alkoholu z pozostającej frakcji rozpuszczalnej. [0040] W szczególnie korzystnym wykonaniu wynalazku, do fazy alkoholowej lub, korzystnie, fazy bogatej w kolostryninę (korzystnie po dowolnym dodatkowym etapie wirowania) dodawany jest czynnik wytrącający. Zadaniem czynnika wytrącającego jest wywołanie precypitacji peptydów kolostryniny. Stwierdziliśmy, że jako czynnik wytrącający szczególnie przydatny jest siarczan amonowy, lecz można, w zamian lub dodatkowo, użyć innych materiałów, które spełniają to samo zadanie. Najbardziej wydajnymi czynnikami wytrącającymi są sole z anionami o wielokrotnym ładunku, takie jak siarczan, fosforan i cytrynian. Biorąc pod uwagę kationy, powinny być stosowane kationy monowalentne z NH + 4 korzystniejszym od K + oraz K + korzystniejszym od Na +. Typowymi czynnikami wytrącającymi są siarczany, fosforany i cytryniany sodu, potasu i amonu, lecz najkorzystniejszy jest siarczan amonowy. Czynnikiem wytrącającym może być zamiennie polimer organiczny, taki jak glikol polietylenowy. Wytrącanie czynnikiem wytrącającym dalej obniża zanieczyszczenie kazeiną i dalej oczyszcza frakcję peptydów kolostryniny, umożliwiając wytworzenie, w przybliżeniu w ciągu dwóch dni, stałej puli peptydów zasadniczo wolnych od IgG. Proces ten umożliwia szybką izolację peptydów kolostryniny. [004] Pożądane jest, aby czynnik wytrącający był dodawany w ilości odpowiedniej do osiągnięcia 30% (wag./obj.) do 80% (wag./obj.) nasycenia, korzystnie 40% (wag./obj.) do 60% (wag./obj.) nasycenia i najkorzystniej zasadniczo 50% (wag./obj.) nasycenia. Procent nasycenia odnosi się do czynnika wytrącającego w cieczy, takiego jak siarczan amonowy. Pożądane jest, aby czynnik wytrącający był dodawany w postaci roztworu nasyconego (tzn. 00% (wag./obj.) nasycenia) w wodzie. [0042] Niemniej jednak, czynnik wytrącający może być także dodawany, w małych ilościach, w formie krystalicznej, po czym prowadzone jest energiczne mieszanie w celu uniknięcia miejscowego nasycenia, przez około 30 minut przykładowo, po każdym dodaniu. Można to kontynuować do 5

7 rozpuszczenia całego czynnika wytrącającego. Technika ta trwa przez kilka godzin, jest zatem mniej korzystna. [0043] Dodanie czynnika wytrącającego powoduje wytrącenie peptydów kolostryniny z roztworu. Po zakończeniu dodawania, mieszanina jest korzystnie pozostawiana na pewien okres, zazwyczaj 30 minut, z możliwym mieszaniem lub, korzystnie z kołysaniem. [0044] Na tym etapie, mieszanina obejmuje ciekłą fazę wodną i precypitat. Ciekła faza wodna zawiera rozpuszczony w niej czynnik wytrącający i, możliwe że trochę materiału o wyższym ciężarze cząsteczkowym, który nie został wytrącony podczas etapu ekstrakcji alkoholem. Precypitat zawiera peptydy kolostryniny. Faza ciekła jest zasadniczo oddzielona od precypitatu, korzystnie przez wirowanie przy około 5000 x g siły odśrodkowej i precypitat jest odzyskiwany. [0045] Odzyskany precypitat jest korzystnie rozpuszczany w wodzie, przy użyciu minimalnej ilości koniecznej wody, a następnie dializowany, zazwyczaj, wobec 0,0 M PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem) lub wody. Etap dializy jest przeprowadzany w celu usunięcia nadmiaru jonów, chociaż niektóre jony z jonów czynnika wytrącającego mogą pozostać. Dializowany roztwór może być następnie klarowany przez wirowanie, a następnie liofilizowany. Materiał końcowy zawiera wydzielone peptydy kolostryniny, które można przechowywać w -20ºC do czasu dalszego użycia przy wytwarzaniu kompozycji farmaceutycznych, odżywczych i innych. Można je wykonać klasycznymi sposobami. [0046] Można przeprowadzić testy kontroli jakości w celu zapewnienia, że materiał końcowy jest stosowny do użycia przy preparatyce leków. Testy takie są znane specjalistom w dziedzinie i mogą obejmować SDS PAGE; profil izoogniskowania; analizę aminokwasów; określenie składu antygenowgo kolostryniny przy pomocy metody ELISA wykorzystującej monoswoiste przeciwciała; określenie zdolności do indukowania cytokin, takich jak interferon gamma (IFN-γ); czynnik martwicy nowotworu (TNF) oraz określenie własności antyoksydacyjnych. Materiał końcowy nie powinien zawierać żadnych białek o wysokim ciężarze cząsteczkowym. Jeśli testy kontrolne wykazują obecność zanieczyszczeń, materiał końcowy może wymagać dalszego oczyszczenia. Istnieje wiele sposobów, za pomocą których można usunąć zanieczyszczenia z materiału końcowego, takich jak chromatografia wykluczenia zależna od wielkości cząstek, chromatografia w hydroksyapatycie, chromatografia w odwróconym układzie faz, ultrafiltracja i frakcjonowanie kwasem nadchlorowym. [0047] Przykładowo, chromatografia wykluczenia zależna od wielkości cząstek obejmuje następujące etapy. Materiał, z którego mają być usunięte zanieczyszczenia, jest rekonstytuowany w 00 mm buforze fosforanowym, ph 7,2 (stężenie 2,0 mg/ml). Dziesięć mililitrów świeżo rekonstytuowanego materiału nanosi się na kolumnę (2,5 cm średnica x 90 cm długość) upakowaną Bio-Gel P30 (BioRad) i zrównoważoną tym samym buforem. Chromatografia jest rozwijana przez noc przy szybkości przepływu 20 ml/godz. Zbierane są próbki (4 ml) i tworzona jest końcowa pula odpowiadająca białkom i peptydom o niskim ciężarze cząsteczkowym (>8K) zgodnie z rozmieszczeniem w SDS PAGE. [0048] Przykładowo, chromatografia w hydroksyapatycie obejmuje następujące etapy. Materiał, z którego mają być usunięte zanieczyszczenia, jest rekonstytuowany w 00 mm buforze fosforanowym, ph 6,5 (stężenie 2,0 mg/ml). Dziesięć mililitrów świeżo rekonstytuowanego materiału nano- 6

8 si się na kolumnę (0,7 cm średnia x 6 cm długość) upakowaną Bio-Gel HTP (Bio-Rad) i zrównoważoną tym samym buforem. Chromatografia jest rozwijana przy szybkości przepływu 0,25 ml/min. Kolumna jest płukana buforem równoważącym celem usunięcia niezwiązanego materiału. Następnie, prowadzona jest elucja buforem fosforanowym o liniowym gradiencie (0 mm do 500 mm). Zbierane są próbki (4 ml) i tworzona jest końcowa pula odpowiadająca białkom i peptydom o niskim ciężarze cząsteczkowym (>8K) zgodnie z rozmieszczeniem w SDS PAGE. [0049] Przykładowo wysokosprawna chromatografia cieczowa w odwróconym układzie faz obejmuje następujące etapy. Materiał, z którego mają być usunięte zanieczyszczenia, jest rekonstytuowany w 0,% (obj./obj.) kwasie trifluorooctowym (TFA) w stężeniu 2,0 mg/ml. Pięć mililitrów świeżo rekonstytuowanego materiału nanosi się na kolumnę (8 mm średnica x 50 mm długość) upakowaną 0μm Nucleosil 00 C8 (Knauer) i zrównoważoną 20% acetonitrylem w 0,% TAF. Chromatografia jest rozwijana przy szybkości przepływu,0 ml/min. Kolumna jest płukana buforem równoważącym celem usunięcia niezwiązanego materiału. Następnie, prowadzona jest elucja 00% acetonitrylem w 0,% TFA. Zbierane są próbki (2 ml) i tworzona jest końcowa pula odpowiadająca białkom i peptydom o niskim ciężarze cząsteczkowym (>8K) zgodnie z rozmieszczeniem w SDS PAGE. [0050] Przykładowo, frakcjonowanie kwasem nadchlorowym obejmuje następujące etapy. Materiał, z którego mają być usunięte zanieczyszczenia, jest rekonstytuowany w 0mM buforze fosforanowym, ph 7,2 (stężenie 2,0 mg/ml). Dodawany jest kwas nadchlorowy (0,45 M HClO 4 ) do stężenia 0,5 M i mieszaninę miesza się w temperaturze pokojowej przez godzinę. Uzyskany precypitat jest usuwany przez wirowanie i nadsącz, zawierający oczyszczoną CLN jest doprowadzany do ph 7,0 za pomocą M KOH i pozostawiany przez noc. Kryształy KClO 4 są usuwane przez filtrację przez filtr i nadsącz jest dializowany wobec wody przez noc. W innym wykonaniu według wynalazku frakcjonowanie kwasem nadchlorowym jest stosowane zamiast etapu precypitacji siarczanem amonowym. [005] Przykładowo, ultrafiltracja obejmuje następujące etapy. Materiał, z którego mają być usunięte zanieczyszczenia, jest rekonstytuowany w 0 mm buforze fosforanowym, ph 7,2 (stężenie 2,0 mg/ml). Ultrafiltrację prowadzi się w filtrach Centricon Plus Ultracell PL-0 lub Hollow fiber Amicon HP0-20 przy użyciu standardowych protokołów do ultrafiltracji. [0052] Jak wspomniano powyżej, stwierdziliśmy, że siara zawiera frakcję białkopodobną w formie miceli. Obserwowano, że kolostrynina może być odzyskiwana z wysoką wydajnością, wówczas, gdy surowa siara jest poddana wstępnemu działaniu materiału rozrywającego micele, a następnie czynnikowi odtwarzającemu micele, przy różnych poziomach ph, przed ekstrakcją alkoholem. Zatem w korzystnym wykonaniu wynalazku, surowa siara jest wstępnie kondycjonowana z materiałem rozrywającym micele, który indukuje skurczenie miceli, następnie z czynnikiem odtwarzającym micele, co uważane jest za działanie dezintegrujące struktury kazeiny w siarze i uwalniające więcej peptydów kolostryniny. [0053] Korzystnie materiałem rozrywającym micele jest czynnik chelatujący wapń, taki jak EDTA (kwas etyleno-diamino-n,n,n',n'-tetraoctowy), który wiąże także Mg + lub EGTA (kwas etylenoglikolo-o,-o'-bis(2-amino-etylo)-n,n,n',n'-tetraoctowy) o podobnych właściwościach. Ich celem jest 7

9 uwolnienie co najmniej niektórych, korzystnie większości, peptydów uwięzionych pomiędzy micelami kazeinowymi. [0054] Korzystnie, materiał rozrywający micele jest dodawany w takiej ilości, aby uzyskać roztwór zawierający stężenie materiału rozrywającego micele w roztworze mm. Mieszaninę miesza się i pozostawia na okres 0-30 min. Alkohol może być dodany od razu po podaniu materiału rozpuszczającego micele, lub, w korzystniejszym wykonaniu, po dodaniu materiału rozrywającego micele, przed dodaniem alkoholu, dodawany jest materiał odtwarzający micele. Materiałem odtwarzającym micele jest korzystnie źródło jonów Ca 2+, takie jak CaCl 2. Materiał odtwarzający micele ma zdolność do ponownego tworzenia miceli przez dostarczanie jonów wapnia koniecznych do tworzenia miceli (rekalcyfikacja). [0055] W korzystnym wykonaniu, siara jest kondycjonowana w warunkach ph od 5,5 do 8,0, korzystniej 5,5-7,5 przed dodaniem materiału rozrywającego micele, materiału odtwarzającego micele lub alkoholu. Najkorzystniej, siara jest kondycjonowana w warunkach ph od zasadniczo 6,5-7,5. Jeszcze korzystniej, siara jest utrzymywana w warunkach ph od zasadniczo 7,0 do 7,5, najkorzystniej zasadniczo 7,4. Warunki ph można osiągnąć przez dodanie kwasu lub zasady z kontrolą przy użyciu ph-metru. [0056] Przy użyciu sposobu według wynalazku można izolować z wysoką wydajnością stałą pulę peptydów zasadniczo wolnych od IgG. Przez równocześnie neutralizujące siły hydrofobowe i jonowe możemy uzyskać optimum fizjologicznej kombinacji peptydów. Wydajność wytwarzania peptydów kolostryniny przez ekstrakcję metanolem, zgodnie z niniejszym wynalazkiem, wynosi zazwyczaj około mg na litr siary. Przez stosowanie wstępnej obróbki EDTA i chlorkiem wapniowego, wydajność zwiększa się do około mg na litr siary. Jest to porównywalne z wcześniejszą wydajnością w tej dziedzinie, około mg na litr siary, uzyskiwaną przy użyciu metody Janusza opisanej w WO98/4473. [0057] Sposobem według niniejszego wynalazku z siary można wydzielać następujące peptydy: (i) peptydy ujawnione w WO00/7573, tzn., LQTPQPLLQVMMEPQGD (SEKW NR ID.: ); MPQN- FYKLPQM (SEKW NR ID.: 2); VLEMKFPPPPQETVT (SEKW NR ID.: 3); LKPFPKLKVEVFPFP (SEKW NR ID.: 4); SEQP (SEKW NR ID.: 5); DKE (SEKW NR ID.: 6); DPPPPQS (SEKW NR ID.: 7); LNF (SEKW NR ID.: 8); VLPPNVG (SEKW NR ID.: 9); KYKLQPE (SEKW NR ID.: 0); SEEMP (SEKW NR ID.: ); DSQPPV (SEKW NR ID.: 2); FPPPK (SEKW NR ID.: 3); VVMEV (SEKW NR ID.: 4); DLEMPVLPVEPFPFV (SEKW NR ID.: 5); LFFFLPVVNVLP (SEKW NR ID.: 6); MQPPPLP (SEKW NR ID.: 7); DQPPDVEKPDLQPFQVQS (SEKW NR ID.: 8); VYPFTGPIPN (SEKW NR ID.: 9); SLPQNILPL (SEKW NR ID.: 20); TQTPVVVPPF (SEKW NR ID.: 2); LQPE- IMGVPKVKETMVPK (SEKW NR ID.: 22); HKEMPFPKYPVEPFTESQ (SEKW NR ID.: 23); SL- TLTDVEKLHLPLPLVQ (SEKW NR ID.: 24); SWMHQPP (SEKW NR ID.: 25); QPLPPTVMFP (SE- KW NR ID.: 26); MHQPPQPLPPTVMFP (SEKW NR ID.: 27); PQSVLS (SEKW NR ID.: 28); LSQPKVLPVPQKAVPQRDMPIQ (SEKW NR ID.: 29); AFLLYQE (SEKW NR ID.: 30); FLLYQE- PVLGPVR (SEKW NR ID.: 3); RGPFPILV (SEKW NR ID.: 32) lub ATFNRYQDDHGEEILKSL (SEKW NR ID.: 33). 8

10 (ii) peptydy ujawnione w WO02/462, tzn., LVYPFTGPIPNSLPQNILP (SEKW NR ID.: 34); MIVVRLLQNEVPE (SEKW NR ID.: 35); SLSQSKVLPV (SEKW NR ID.: 36); LQTQTPVV (SEKW NR ID.: 37); EMPFPKY (SEKW NR ID.: 38); PVEPFT (SEKW NR ID.: 39); VPPFLQ (SEKW NR ID.: 40); PMFLQ (SEKW NR ID.: 4); EHMFV (SEKW NR ID.: 42); TDRD (SEKW NR ID.: 43); VQPT (SEKW NR ID.: 44); PKVK (SEKW NR ID.: 45); DDDE (SEKW NR ID.: 46); TEEV (SEKW NR ID.: 47); YQQE (SEKW NR ID.: 48); FPPQ (SEKW NR ID.: 49); GFGI (SEKW NR ID.: 50); LQS (SEKW NR ID.: 5); VVV (SEKW NR ID.: 52); GGK (SEKW NR ID.: 53); DMV (SEKW NR ID.: 54); ESQ (SEKW NR ID.: 55); GRV (SEKW NR ID.: 56); VEE (SEKW NR ID.: 57); IGN (SEKW NR ID.: 58); FFQ (SEKW NR ID.: 59); RMF (SEKW NR ID.: 60); FPP (SEKW NR ID.: 6); MHH (SEKW NR ID.: 62); NTE (SEKW NR ID.: 63). (iii) nonapeptydy ujawnione w WO98/4473, tzn., VESYVPLFP (SEKW NR ID.: 64). [0058] Zatem, wynalazek może być stosowany w procesach izolacji dowolnego peptydu identyfikowanego przez SEKW NR ID.: -64, zarówno pojedynczo, w wyselekcjonowanej grupie lub wszystkich razem. [0059] Wynalazek może być stosowany do dowolnej siary ssaczej, choć najpowszechniej stosowana jest siara owcza, bydlęca lub ludzka. [0060] Ponadto, punktem wyjściowym dla procesu rozdzielania według wynalazku nie musi być siara taka jaką uzyskuje się bezpośrednio od ssaka. Oczywistym jest, że siara może być poddana obróbce sposobem rozdzielania według wynalazku, przykładowo, może być odtłuszczona. Zatem, wynalazek może być stosowany, z korzyścią do pochodnych siary, pod warunkiem, że te pochodne nadal zawierają kolostryninę. [006] Stosowane tu określenie % kompozycji odnosi się do procentowego udziału materiału w częściach wagowych, o ile nie podano inaczej. [0062] Poniżej opisano odniesienie do rysunków, w którym: Na Figurze przedstawiony jest wykres podsumowujący protokół ekstrakcji/oczyszczania kolostryniny; oraz Figura 2 przedstawia wyniki analizy SDS PAGE, opisanej poniżej. [0063] Wynalazek będzie dalej opisany w odniesieniu do podanych poniżej przykładów. [0064] Protokoły oczyszczania W każdym porównywanym przykładzie, wykorzystywano 0 ml pulowanej siary. Siarę pobierano od owcy w różnych czasach po porodzie i do czasu eksperymentu zamrażano. W następujących przykładach wykorzystywany protokół był identyczny z wyjątkiem wstępnego kondycjonowania surowej siary, albo przez ph lalbo z EDTA, jak wskazano poniżej. Przykład 0 ml pulowanej surowej siary (ph ~ 6,5). Przykład 2 0 ml pulowanej surowej siary (ph ~ 6,5) w warunkach z 25 mm EDTA, z dodaniem następnie 50 mm CaCl 2 (rekalcyfikacja). Przykład 3 0 ml pulowanej siary kondycjonowanej przy ph 7,4. Przykład 4 0 ml pulowanej siary kondycjonowanej przy ph 7,4 z 25 mm EDTA, z dodaniem następnie 50 mm CaCl 2 (rekalcyfikacja). [0065] Pulowaną surową siarę (porcje 0 ml) pochodzącą z tego samego źródła, przed dodaniem metanolu, kondycjonowano przy specyficznym ph lub traktowano EDTA/CaCl 2 godz. Do każdej 9

11 próbki siary dodano 00% metanol, do końcowego stężenia 60%. Mieszaninę mieszano przez 30 min. w temperaturze pokojowej i wirowano przy 5000 x g. Nadsącz usuwano i umożliwiano wyparowanie etanolu z nadsączu w suszarce, aż objętość nadsączu zmniejszyła się do około 8,0 ml (zajmowało to około min.). Do nadsączu dodawano równą objętość siarczanu amonowego (00%) uzyskując końcowe stężenie siarczanu amonowego 50%. Mieszaninę nadsącz/siarczan amonowy kołysano delikatnie przez noc w 4ºC, umożliwiając wytrącenie peptydów kolostryniny. Preparat wirowano przy 5000 x g dla uzyskania osadu zawierającego peptydy kolostryniny. Osad rozpuszczano w wodzie destylowanej i dializowano przez noc wobec 0,0 M PBS (roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanem). Wytworzone tym sposobem peptydy kolostryniny można analizować różnymi testami i przechowywać w 20ºC. [0066] Test odzyskiwania białka Stężenie białka można określić przez odczyt gęstości optycznej roztworu w 280 nm przed zamrożeniem. Wyniki odzyskiwania białka przedstawiono w Tabeli, poniżej. Tabela Przykłady/Próbki OD 280 nm Objętość (ml) Wydajność (mg) - surowa siara ph 6,5 0,83 2,0,66 2- siara/edta/ ph 6,5 0,86 2,0,72 3- siara ph 7,4 3,97 2,0 7,94 4- siara/edta/ph 7,4 9,44 2,0 8,88 [0067] Uzyskane wyniki pokazują, że odzyskanie białka z wyjściowych 0 ml porcji siary jest bardzo zależne od ph. Wydajności te są wyższe niż uzyskiwane dla metody Janusza i są one uzyskiwane przy użyciu łatwiejszych i szybszych procesów. [0068] Test rozpoznawania antygenu Profil antygenowy materiału końcowego określono za pomocą testu ELISA, opartego na przeciwciałach wywołanych wobec dziewięciu peptydów syntetycznych, dla których sekwencje zidentyfikowano wcześniej i przedstawiono poniżej w Tabeli 2. Tabela 2 Klasa antygenu Sekwencja Miano A- LQTPQPLLQVMMEPQGD >25600 A-3 VLEMKFPPPPQETVT >25600 B-8 DLEMPVLPVEPFPFV >25600 B-9 LFFFLPVVNVLP >25600 C-2 SLPQNILPL >25600 C- LSQPKVLPVPQKAVPQPDMPIQ >25600 D- ATFNRYQDDHGEEILKSL >25600 LF KCRRWEWRMKKLGAPSIPSITCVRRAF >25600 IgG 2 Cała cząsteczka 0 [0069] Klasy antygenów A, B, C i D są wyjaśnione w WO00/7573. LF jest fragmentem laktoferyny, o właściwościach przeciwbakteryjnych, fragmenty przeciwciała IgG-2 służą jako wskaźnik czystości kolostryniny. 0

12 [0070] Skrótowo, 96-studzienkowe płytki do ELISA opłaszczano próbkami kolostryniny odzyskanej według protokołu -4 (w przybliżeniu 0 mikrogramów białka na ml buforu wodorowęglanowego 0, M (ph 9,0). Płytki inkubowano w 37ºC przez 3 godz., płukano buforem do sprzęgania i blokowano standardowym roztworem surowiczej albuminy bydlęcej (BSA). 50 mikrolitrów rozcieńczalnika BSA (roztwór 0,75%) odpipetowywano do każdej studzienki i do kolumny A w każdym rzędzie dodawano po 50 mikrolitrów próbki surowicy (oczyszczone na białku A przeciwciało królika wobec swoistego antygenu), rozcieńczonej zgodnie z wyjściowym mianem. Wykonano serię rozcieńczeń :2, przesuwając się w dół płytek. Płytki inkubowano, przykryte, przez 60 minut w temperaturze pokojowej, następnie płukano 4-krotnie roztworem PBS. Do każdej studzienki odpipetowano kozie przeciw królicze przeciwciała IgG skoniugowane z peroksydazą chrzanową (rozcieńczone :000 w BSA) w objętości 50 mikrolitrów i inkubowano przez 60 min. w temperaturze pokojowej. Płytki płukano następnie 4-krotnie roztworem płuczącym PBS i do każdej studzienki dodawano 50 mikrolitrów substratu (sól diamonowa kwasu 2,2 -azyno-bis-3-etylobenzotoiazolino-6-sulfonowego) i inkubowano przez 2 min. w temperaturze pokojowej. Reakcję kolorymetryczną hamowano przez dodanie do każdej studzienki 50 mikrolitrów % SDS i płytki odczytywano w czytniku do płytek Dynatech (przy 405 nm). [007] Wyniki tych doświadczeń (średnie miana) pokazano w Tabeli 3 poniżej. Wartości podano w jednostkach/ml x 0 3. Jednostka jest zdefiniowana jako ostatnie rozcieńczenie rozpoznające antygen. Jasno widać, że odzyskiwanie poszczególnych peptydów, pod kątem których były testowane materiały końcowe (A-; A-3; B-8; B-9; C-2; C-; D-; Lf i IgG-2), było wyższe dla ekstrakcji wykonanych przy ph 7,4 (Doświadczenie 3 i 4). W obu przypadkach antygeny były rozpoznawane do najwyższych testowanych rozcieńczeń. Tabela 3 Doświadczenie A- A-3 B-8 B-9 C-2 C- D- Lf IgG-2 Kontrola Doświadczenie Analiza aminokwasów Skład aminokwasowy siary oczyszczonej według niniejszego wynalazku potwierdza wysoką zawartość proliny (~20%) oraz aminokwasów. Tabela 4 pokazuje wysoki stopień podobieństwa składu aminokwasowego pomiędzy kolostryniną opisaną wcześniej i w niniejszym wynalazku. Tabela 4. Analiza aminokwasów CLN Aminokwas Kolostrynina Pierwotna* Pierwotna** Nowa*** Asp/Asn 3,42 3,05 2,80 Ser 5,66 5,70 5,05 Glu/Gln 5,48 5,29 5,77 Gly 3,5 3,3 3,03 His 2,54 2,45 2,4 Arg 2,32 2,45 3,34

13 Thr 5,73 5,69 5,30 Ala 2,78 2,99 2,3 Pro 2,07 20,92 22,50 Tyr,36,55,54 Val 9,27 0,34,0 Met 3,33 3,08,70 Lys 5,30 5,9 4,93 Ile 3,7 2,92 3,42 Leu,04,27 0,47 Phe 4,38 4,42 4,77 * - zgodnie z M. Janusz i wsp. ref. (FEBS LETTERS 974, 49, ) ** - zgodnie ze średnimi wyników uzyskanych w dalszej pracy przy użyciu protokołu z Janusz i wsp. *** - zgodnie ze sposobem według wynalazku [0072] Testy biologiczne: Możliwości CLN wytworzonej według nowego protokołu testowano w porównaniu z wytworzoną klasyczną metodą i udowodniono, że są one podobne w następujących aktywnościach: ) redukcja adduktów 4HNE-białko; 2) redukcja wewnątrzkomórkowych poziomów ROS; 3) hamowanie utraty glutationu odbywającej się za pośrednictwem 4HNE; oraz 4) hamowanie aktywacji NH2-terminalnej kinazy c-jun indukowanej przez 4HNE. [0073] Analiza SDS PAGE. Prowadzono D elektroforezę w 5% żelu poliakryloamidowym w warunkach redukujących. Barwienie % barwnikiem Coomassie Blue pokazuje uderzające podobieństwa pomiędzy końcowymi preparatami CLN uzyskanymi według niniejszego wynalazku i metodą klasyczną. [0074] Na Figurze 2 przedstawione są wyniki analizy SDS PAGE. Próbki ponownie uwadniano, badano na zawartość białka i równą ilość białka analizowano w D 5% żelu SDS PAGE po barwieniu barwnikiem Coomassie Blue. Na rysunku STD przedstawia markery masy cząsteczkowej; przedstawia kolostryninę według Janusza i wsp.; 2 przedstawia kolostryninę według niniejszego wynalazku; oraz 3 przedstawia kolostryninę według niniejszego wynalazku zmodyfikowanego EDTA/CaCl 2. Według analiz SDS PAGE, kolostrynina uzyskana według niniejszego wynalazku jest zasadniczo identyczna z materiałem odniesienia (metoda Janusza). Także modyfikacja z EDTA/CaCl2 dostarcza podobny materiał, chociaż, w składzie wzrosła ilość białek o wyższym ciężarze cząsteczkowym. [0075] Oczywiste jest, że wynalazek może być modyfikowany w zakresie objętym zastrzeżeniami. Przykładowo, etap precypitacji siarczanem amonowym można zastąpić, jak opisano wcześniej, frakcjonowaniem kwasem nadchlorowym. Podczas gdy punkt wyjściowy w sposobie jest opisany jako surowa siara lub odtłuszczona siara, będzie oczywiste, że jako punkt wyjściowy mogą być wykorzystywane inne formy siary lub częściowo oczyszczona siara. Przykładowo, sposób według niniejszego wynalazku może wykorzystywać i dalej oczyszczać peptydy kolostryniny, które były wcześniej oczyszczone metodami znanymi w dziedzinie, takimi jak metoda Janusza. LISTA SEKWENCJI [0076] 2

14 <0> ReGen Therapeutics plc <20> Oczyszczanie peptydów z kolostyniny <30> PAC/20362WO <50> GB <5> <60> 64 <70> Patent w wersji 3. <20> <2> 7 <400> Leu Gln Thr Pro Gln Pro Leu Leu Gln Val Met Met Glu Pro Gln Gly Asp <20> 2 <2> <400> 2 Met Pro Gln Asn Phe Tyr Lys Leu Pro Gln Met 5 0 <20> 3 <2> 5 <400> 3 Val Leu Glu Met Lys Phe Pro Pro Pro Pro Gln Glu Thr Val Thr

15 <20> 4 <2> 5 <400> 4 Leu Lys Pro Phe Pro Lys Leu Lys Val Glu Val Phe Pro Phe Pro <20> 5 <2> 4 <400> 5 Ser Glu Gln Pro <20> 6 <2> 3 <400> 6 Asp Lys Glu <20> 7 <2> 7 <400> 7 Asp Pro Pro Pro Pro Gln Ser 5 <20> 8 <2> 3 4

16 <400> 8 Leu Asn Phe <20> 9 <2> 7 <400> 9 Val Leu Pro Pro Asn Val Gly 5 <20> 0 <2> 7 <400> 0 Lys Tyr Lys Leu Gln Pro Glu 5 <20> <2> 5 <400> Ser Glu Glu Met Pro 5 <20> 2 <2> 6 <400> 2 5

17 Asp Ser Gln Pro Pro Val 5 <20> 3 <2> 5 <400> 3 Phe Pro Pro Pro Lys 5 <20> 4 <2> 5 <400> 4 Val Val Met Glu Val 5 <20> 5 <2> 5 <400> 5 Asp Leu Glu Met Pro Val Leu Pro Val Glu Pro Phe Pro Phe Val <20> 6 <2> 2 <400> 6 Leu Phe Phe Phe Leu Pro Val Val Asn Val Leu Pro 6

18 5 0 <20> 7 <2> 7 <400> 7 Met Gln Pro Pro Pro Leu Pro 5 <20> 8 <2> 8 <400> 8 Asp Gln Pro Pro Asp Val Glu Lys Pro Asp Leu Gln Pro Phe Gln Val Gln Ser <20> 9 <2> 0 <400> 9 Val Tyr Pro Phe Thr Gly Pro Ile Pro Asn 5 0 <20> 20 <2> 9 <400> 20 7

19 Ser Leu Pro Gln Asn Ile Leu Pro Leu 5 <20> 2 <2> 0 <400> 2 Thr Gln Thr Pro Val Val Val Pro Pro Phe 5 0 <20> 22 <2> 8 <400> 22 Leu Gln Pro Glu Ile Met Gly Val Pro Lys Val Lys Glu Thr Met Val Pro Lys <20> 23 <2> 8 <400> 23 His Lys Glu Met Pro Phe Pro Lys Tyr Pro Val Glu Pro Phe Thr Glu Ser Gln 8

20 <20> 24 <2> 8 <400> 24 Ser Leu Thr Leu Thr Asp Val Glu Lys Leu His Leu Pro Leu Pro Leu Val Gln <20> 25 <2> 7 <400> 25 Ser Trp Met His Gln Pro Pro 5 <20> 26 <2> 0 <400> 26 Gln Pro Leu Pro Pro Thr Val Met Phe Pro 5 0 <20> 27 <2> 5 <400> 27 9

21 Met His Gln Pro Pro Gln Pro Leu Pro Pro Thr Val Met Phe Pro <20> 28 <2> 6 <400> 28 Pro Gln Ser Val Leu Ser 5 <20> 29 <2> 22 <400> 29 Leu Ser Gln Pro Lys Val Leu Pro Val Pro Gln Lys Ala Val Pro Gln Arg Asp Met Pro Ile Gln 20 <20> 30 <2> 7 <400> 30 Ala Phe Leu Leu Tyr Gln Glu 5 20

22 <20> 3 <2> 3 <400> 3 Phe Leu Leu Tyr Gln Glu Pro Val Leu Gly Pro Val Arg 5 0 <20> 32 <2> 8 <400> 32 Arg Gly Pro Phe Pro Ile Leu Val 5 <20> 33 <2> 8 <400> 33 Ala Thr Phe Asn Arg Tyr Gln Asp Asp His Gly Glu Glu Ile Leu Lys Ser Leu <20> 34 <2> 9 2

23 <400> 34 Leu Val Tyr Pro Phe Thr Gly Pro Ile Pro Asn Ser Leu Pro Gln Asn Ile Leu Pro <20> 35 <2> 3 <400> 35 Met Ile Val Val Arg Leu Leu Gln Asn Glu Val Pro Glu 5 0 <20> 36 <2> 0 <400> 36 Ser Leu Ser Gln Ser Lys Val Leu Pro Val 5 0 <20> 37 <2> 8 <400> 37 Leu Gln Thr Gln Thr Pro Val Val 22

24 5 <20> 38 <2> 7 <400> 38 Glu Met Pro Phe Pro Lys Tyr 5 <20> 39 <2> 6 <400> 39 Pro Val Glu Pro Phe Thr 5 <20> 40 <2> 6 <400> 40 Val Pro Pro Phe Leu Gln 5 <20> 4 <2> 5 <400> 4 23

25 Pro Met Phe Leu Gln 5 <20> 42 <2> 5 <400> 42 Glu His Met Phe Val 5 <20> 43 <2> 4 <400> 43 Thr Asp Arg Asp <20> 44 <2> 4 <400> 44 Val Gln Pro Thr <20> 45 <2> 4 <400> 45 24

26 Pro Lys Val Lys <20> 46 <2> 4 <400> 46 Asp Asp Asp Glu <20> 47 <2> 4 <400> 47 Thr Glu Glu Val <20> 48 <2> 4 <400> 48 Tyr Gln Gln Glu <20> 49 <2> 4 <400> 49 25

27 Phe Pro Pro Gln <20> 50 <2> 4 <400> 50 Gly Phe Gly Ile <20> 5 <2> 3 <400> 5 Leu Gln Ser <20> 52 <2> 3 <400> 52 Val Val Val <20> 53 <2> 3 <400> 53 Gly Gly Lys 26

28 <20> 54 <2> 3 <400> 54 Asp Met Val <20> 55 <2> 3 <400> 55 Glu Ser Gln <20> 56 <2> 3 <400> 56 Gly Arg Val <20> 57 <2> 3 <400> 57 Val Glu Glu <20> 58 <2> 3 27

29 <400> 58 Ile Gly Asn <20> 59 <2> 3 <400> 59 Phe Phe Gln <20> 60 <2> 3 <400> 60 Arg Met Phe <20> 6 <2> 3 <400> 6 Phe Pro Pro <20> 62 <2> 3 <400> 62 28

30 Met His His <20> 63 <2> 3 <400> 63 Asn Thr Glu <20> 64 <2> 9 <400> 64 Val Glu Ser Tyr Val Pro Leu Phe Pro 5 Zastrzeżenia patentowe. Sposób odzyskiwania peptydów z ssaczej siary, lub pochodnych siary, który obejmuje: mieszanie siary z alkoholem dla wytworzenia fazy alkoholowej i precypitatu, przy czym faza alkoholowa obejmuje alkohol i co najmniej niektóre peptydy do odzyskania; oddzielenie fazy alkoholowej od precypitatu; oraz odzyskanie fazy alkoholowej, przy czym odzyskane peptydy obejmują kolostryninę. 2. Sposób według zastrz., w którym alkoholem jest metanol lub etanol. 3. Sposób według zastrz. lub 2, który ponadto obejmuje etap usuwania co najmniej części alkoholu z odzyskanej fazy alkoholowej z pozostawieniem stężonej fazy peptydowej i odzyskanie stężonej fazy peptydowej. 4. Sposób według zastrz., 2 lub 3, który ponadto obejmuje rozpuszczanie czynnika wytrącającego albo w odzyskanej fazie alkoholowej albo w zatężonej fazie peptydowej, przy czym czynnik wytrącający jest zdolny do indukowania wytrącania co najmniej niektórych peptydów. 5. Sposób według zastrz. 3 lub 4, w którym czynnikiem wytrącającym jest siarczan amonowy. 29

31 6. Sposób według dowolnego z poprzedzających zastrz., który ponadto obejmuje dodanie do siary EDTA przed dodaniem alkoholu. 7. Sposób według dowolnego z zastrz. do 5, w którym mieszanina zawiera micele białkowe związane z peptydami, przy czym omawiany sposób przed dodaniem alkoholu obejmuje etap dodawania do cieczy materiału rozrywającego micele, a materiał rozrywający micele jest zdolny do indukowania rozbicia miceli w cieczy. 8. Sposób według zastrz. 7, w którym materiałem rozrywającym micele jest EDTA lub EGTA. 9. Sposób według dowolnego z poprzedzających zastrz., który ponadto obejmuje dodanie do mieszaniny CaCl 2 przed dodaniem alkoholu. 0. Sposób według zastrz. 7 lub 8, który przed dodaniem alkoholu ponadto obejmuje dodanie do cieczy materiału odtwarzającego w celu odtworzenia miceli białkowych.. Sposób według zastrz. 0, w którym materiałem odtwarzającym micele jest CaCl Sposób według dowolnego z poprzedzających zastrz., w którym przed dodaniem alkoholu ciecz jest wstępnie doprowadzana do ph w zakresie 6,5-7,5. 3. Sposób według dowolnego z poprzedzających zastrz., w którym alkohol dodano do cieczy w ilości wystarczającej do uzyskania stężenia alkoholu, w odniesieniu do całkowitej objętości cieczy, od 40-80% (obj./obj.). 4. Sposób według dowolnego z poprzedzających zastrz., w którym alkohol dodano do cieczy w ilości wystarczającej do uzyskania stężenia alkoholu, w odniesieniu do całkowitej objętości cieczy, od 50-70% (obj./obj). 5. Sposób według dowolnego z poprzedzających zastrz., w którym alkohol dodano do cieczy w ilości wystarczającej do uzyskania stężenia alkoholu, w odniesieniu do całkowitej objętości cieczy, od 55-65% (obj./obj.). 6. Sposób według dowolnego z poprzedzających zastrz., w którym alkohol dodany do siary jest zasadniczo o 00% czystości. 30

32 Fig. Nieprzetworzona siara Etap I 60% Metanol Mieszanie przez 30 min., temp. pokojowa Wirowanie ok g Odparowanie metanolu z nadsączu w próżni przez noc (<40 C) Usunięcie osadu Etap II Nadsącz Wytrącanie (NH 4 ) 2 SO 4 do 50% przez noc (4 C) Wirowanie ok. 5000g Rozpuszczenie osadu i dializowanie wobec PBS przez noc (4 C) Usunięcie nadsączu Testowanie analityczne 3

33 Fig.2 32