Wykład III. Nośniki chemiczne plazmidowego DNA

Transkrypt

1 Wykład III Nośniki chemiczne plazmidowego DNA

2 Metody transfekcji Fizyczne Chemiczne Wirusowe 1. Mikroiniekcja 2. Ekektroporacja 3. Biolistyczne (strzelba genowa) 1. DEAE-dextran 2. Ca Liposomy - wiriosomy 4. Polipleksy 1. Adenowirusowe 2. AAV 3. Retrowirusy 4. Lentiwirusy 5. Inne

3 Rodzaje chemicznego wspomagania 1. Czynniki chroniące DNA przed nukleazami 2. Czynniki nakierowujące wektory na konkretne komórki 3. Czynniki zwiększające dostarczania DNA do cytozolu lub jądra 4. Czynniki umożliwiające długotrwałe lub kontorlowane uwalnianie DNA

4 Wektory Plazmidowe Wirusowe nagi DNA Kompleksy ze związkami kationowymi Kompleksy z białkami osłonek wirusowych RNA Retrowirusy (w tym lentiwirusy) DNA Adenowirusy AAV Wirus Herpes

5 Nośniki chemiczne plazmidowego DNA Jony Ca 2+ DEAE-dekstran Związki wielkocząsteczkowe Lipidy i lipsomy Polipeptydy Polimery dendrymery

6 Warunki udanego transferu genów do komórek 1. Dotarcie DNA do powierzchni komórki 2. Związanie się kompleksu zawierającego DNA do błony komórkowej 3. Przejście kompleksu przez błonę 4. Przejście DNA przez cytoplazmę 5. Wejście DNA do jądra komórkowego 6. Umiejscowienie się DNA w odpowiednim miejscu w jądrze komórkowym

7 Chemiczne metody transfekcji in vitro

8 DEAE-dextran diethylaminoethyl dextran 1. DEAE-dekstran jest polimerem kationowym, 2. Używany do transfekcji przejściowych 3. Działa dobrze z pewnymi typami komórek 4.. Pozwala na użycie mniejszych ilości DNA niż transfekcja przy pomocy Ca Metoda mało wydajna, zmienna, ale bardziej powtarzalna niż transfekcja za pomocą jonów wapnia

9 Transfekcja za pomocą fosforanu wapnia 1. Zmieszanie DNA z chlorkiem wapnia 2. Dodanie w kontrolowany sposób (wkroplenie) do zbuforowanego roztworu soli fosforanowej 3. Inkubacja mieszaniny w temperaturze pokojowej utworzenie precyptitatów (strątów) 4. Pobranie precypitatu przez komórki na drodze endocytozy lub fagocytozy

10 Warunki ułatwiające transfekcję za pomocą fosoforanu wapnia 1. Metoda działa skutecznie w wąskim zakresie warunków 2. Tworzenie dużych kryształów ogranicza transfekcję, najlepiej jest, gdy powstają bardzo drobne cząstki a) stężenie DNA b) temperatura rozpuszczalność fosforanu jest wyższa w niższej temperaturze c) czas tworzenie precypitatu przed dodaniem do komórek d) ph powyżej 6,9 nie tworzą się kompleksy, w ph 7,0 bardzo delikatne i drobne; powyżej duże kompleksy ale... Różne opinie e) DNA musi być rozpuszczone w wodzie! Bufor Tris zmienia ph i obniża wydajność transfekcji

11 Zwiększenie wydajności transfekcji DEAE-dekstranem lub fosforanem wapnia -glicerol -DMSO - chloroquine - sodium butyrate

12 Etapy rozwoju syntetycznych metod transferu genów 1958 Alexander et al. Oczyszczony RNA poliowirusa zakaża komórki 1962 Szybalski &Szybalska transfer DNA komórkowego jony wapnia i spermina 1965 Vaheri & Pagano DEAE dextran 1973 Graham & van der Eb fosforan wapnia 1979 Mulligan transfekcja plazmidu z genem króliczej β-globiny do komórek nerki małpiej 1982 Souther & Berg selekcja komórek opornych na neomycynę 1983 wektory retrowirusowe pozbawione wirusów pomocniczych 1987 Felgner lipsomy kationowe 1987 Wu & Wu transfekcja z wykorzystaniem receptorów (polilizyna) 1988 Johnson strzelba genowa 1995 Boussif et al.poliethylenoimina 1996 Tang i wsp. dendrymery

13 Cationic liposomes DOTMA General structure of synthetic cationic lipid Tfx TM

14 DOPE (L-dioleoyl phosphatidylethanolamine) obojętny fosfolipid -ułatwia fuzję z błoną komórkową -ułatwia uwalnianie z endosomu

15

16 Lipotransfekcja warunki in vitro 1. Jakość wyizolowanego DNA wolny od białek, RNA i zanieczyszczeń chemicznych 2. Rodzaj komórek 3. Rodzaj liposomu 4. Faza wzrostu komórek 5. Odpowiednie proporcje ilości DNA i liposomu 6. Warunki hodowli obecność/brak surowicy Optymalizacja warunków transfekcji

17 Lipotransfekcja procedura in vitro

18 Wydajność transfekcji za pomocą jonów Ca 2+ oraz liposomów Ca 2+ - transfection Lipotransfection wyższa wydajność transfekcji

19 Wydajność transfekcji a rodzaj liposomu

20 Wydajność transfekcji a ilość liposomu i DNA Ta sama ilość DNA, zmienna ilość liposomu Ta sama ilość liposomu, zmienna ilość DNA

21 Wydajność transfekcji a czas inkubacji lipopleksów z komórkami

22 Wydajność transfekcji a % pokrycia szalki przez komórki

23 Ekspresja genu a czas po transfekcji

24 Wydajność transfekcji przy pomocy liposomów kationowych 100% 1, 000,000 plasmids/cell transfected 30% 300,000 plasmid/cell in pellet 5% 50,000 plasmids/cell intracellular 0,3-0,1% 1,000 plasmids/cell intranuclear

25 Bariery ograniczające skuteczność transfekcji in vivo I. Bariery pozakomórkowe 1. Opsoniny 2. Komórki fagocytujące 3. Macierz pozakomórkowa 4. Enzymy trawienne II. Bariery wewnątrzkomórkowe 1. Błona komórkowa 2. Endosomy/lizosomy 3. Błona jądrowa

26 Lipotransfekcja lokalna systemowa

27 Lipsomy ochrona przed degradacją w endosomach i działaniem cytozolu 1. Chloroquine - podnosi ph w endosomach 2. Ominięcie przedziału endosomalnego: podjednostki toksyn Diphteria i Pseudomonas 3. PEG - stabilizuje plazmidowe DNA i chroni przed degradacją przez nukleazy - ogranicza rozpoznanie przez układ immunologiczny 4. Nuclear targeting a) bierne przechodzenie plazmidu do jądra podczas podziału komórki b) PEI - syntetyczny polimer - chroni DNA w cytoplazmie, ułatwia wchodzenie do jądra komórkowego c) wirusowe sygnały lokalizacji jądrowej (viral nuclear localization signal, NLS)

28 Lipopleksy - problemy ze skutecznością in vivo 1. Brak stabilności 2. Stosunkowo niska wydajność transfekcji 3. Krótkotrwała ekspresja 4. Niespecyficzne interakcje 5. Indukcja procesów zapalnych składniki liposomów - niezmetylowane CpG dwunukleotydy

29 Liposomy - optymalizacja 1. Poprawa właściwości elektrostatycznych a) odpowiedni dobór lipidów (np. DOPE - ułatwia opuszczanie liposomów) b) zróżnicowanie struktury chemicznej lipidów c) wybór i ilość lipidów obojętnych d) ostateczny ładunek i proporcja do kwasu nukleinowego Np. dodanie wzmacniaczy Effectene

30 Ligandy zwiększające wydajność transfekcji 1. Peptydy, dla których istnieją specyficzne receptory komórkowe, np. RGD oddziaływanie z receptorami integrynowymi 2. Jądrowe sygnały lokalizacyjne 3. Ligandy wrażliwe na ph, które umożliwiają opuszczenie endosomów 4. Sferyczne stabilizujące czynniki 5. Wprowadzenie cząstek wirusowych - wiriosomy HVJ (wirus Sendai)

31 Zastosowanie liposomów w eksperymentalnej terapii genowej 1. Choroby płuc - mukowiscydoza a) łatwość dostarczania - aerozol b) po wstrzyknięciu dożylnym lipopleksy gromadzą się w płucach 2. Nowotwory 3. Hemofilia 4. Choroby układu krążenia transfer do ściany tętnic, transfer do mięśni nóg

32 Nośniki chemiczne plazmidowego DNA Jony Ca 2+ DEAE-dekstran Związki wielkocząsteczkowe Lipidy i lipsomy Polipeptydy dendrymery Polimery kationowe

33 Nośniki polipeptydowe - poli-l-lizyna - poli-l-ornityna -białka (protamina) Nośniki złożone Gal4-invasin - tworzy kompleksy z PLL i DNA Zawiera domenę czynnika drożdżowego GAL-4 oraz domenę inwazyny, białka Yersinia pseudotuberculosis

34 PEI - polyetyleneimine 1. Syntetyczny polikation, masa ok. 22 kda 2. W niskim ph endosomów ulega pęcznieniu, co powoduje rozpad endosomu 3. Zachowuje się jak gąbka protonowa wzrasta stężenie jonów w w endosomie, napływ wody do endosomu, liza endosomu, uwolnienie kompleksu z DNA do cytoplazmy Inne zastosowania PEI 1. Transfekcja zależna od receptorów kompleksy PEI/DNA z inaktywowanym adenowirusem

35 Zalety niewirusowego sposobu transferu genu 1. Ograniczenie ryzyka mutagenezy insercyjnej 2. Brak ryzyka zakażenia wirusowego 3. Ograniczenie odpowiedzi obronnej (immunologicznej i zapalnej) organizmu 4. Niższe koszty i czas oczekiwania

36 Porównanie sposobów transfekcji Non-viral Retrovirus Lentivirus AAV Adenovirus Host tropism Broad Restricted Broad Broad Broad Construction system Simple Established Difficult Established Established Yield (titre) High Low Low Moderate High Transduction efficiency Capacity for transgene Very low Low Low Moderate High Unlimited 4-5 kb 9 kb 4-5 kb 7-10 kb Cytotoxic response Low Low Low Low High Duration of expression Days Long term Long term Long term weeks-months Wang Y. & Huang S DDT 5: 10.

37 Rodzaje wektorów/nośników stosowanych w terapii genowej Retrowirusowe - 63% Adenowirusowe - 16% Lipotransfekcja - 16% AAV - 6% Inne - 2%