Recenzja pracy doktorskiej mgr Agnieszki Belter zatytułowanej Strukturalne aspekty mirna swoistych dla guzów mózgu

Transkrypt

1 dr hab. Piotr Mucha, prof. UG Uniwersytet Gdański, Wydział Chemii, Wita Stwosza 63, Gdańsk tel , Gdańsk, Recenzja pracy doktorskiej mgr Agnieszki Belter zatytułowanej Strukturalne aspekty mirna swoistych dla guzów mózgu Ubiegły wiek był okresem wielu przełomów w nauce, które na zawsze zmieniły nasze widzenie świata w którym żyjemy. Jednym z najbardziej spektakularnych było odkrycie na początku lat 80-tych XX w. przez S. Altmana i T. Cecha (NN 1989 r.) rybozymów cząsteczek RNA o właściwościach katalitycznych RNA. Odkrycie rybozymów całkowicie zmieniło dotychczasową ugruntowaną wiedzę na temat roli RNA w metabolizmie komórki. Przed odkryciem rybozymów rola kwasów nukleinowych w komórce wydawała się być dobrze określona. DNA magazynował i przy pomocy białek uaktywniał zapisaną w nim informację, a RNA w postaci mrna, trna i rrna pełniły funkcję pomocniczą umożliwiając przepisanie kodu genetycznego na sekwencje białek. Odkrycie Altmana i Cecha uzmysłowiło nam, że to, co uważaliśmy za dobrze poznany aspekt funkcjonowania komórki okazało się jedynie czubkiem góry lodowej. Ta pozostająca poza zasięgiem wzroku część góry, to właśnie tak niedocenione RNA, które jak się później okazało, jest pierwszoplanowym graczem uczestniczącym w procesie regulacji ekspresji informacji genetycznej, a nie jedynie biernym obserwatorem lub ewentualnie pomocnikiem. Dzięki odkryciu rybozymów rodzina RNA rozrosła się błyskawicznie i obecnie liczy przynajmniej kilkunastu członków w postaci różnych rodzajów cząsteczek RNA. Jednym z najmłodszych jest mikrorna (mirna). Obecnie trudno znaleźć etap ekspresji informacji genetycznej, w który w jakiś sposób nie byłby zaangażowany jakiś rodzaj cząsteczek RNA. Odkrycie mirna było istotnym krokiem na drodze do poznania molekularnych mechanizmów ekspresji i regulacji informacji genetycznej. MiRNA są krótkimi, liczącymi ok. 20 nt niekodującymi ssrna regulującymi na poziomie post-transkrypcyjnym procesy komórkowe, takie jak wzrost, różnicowanie, proliferacja czy apoptoza. Ze względu na udział w regulacji ekspresji informacji genetycznej, zaburzenia aktywności mikrorna mogą mieć istotne znaczenie w procesach inicjacji i rozwoju chorób nowotworowych. Zwiększone ryzyko nowotworzenia może być wynikiem aktywacji onkogenów, jak i hamowania genów supresorowych. Oznacza to, że w zależności od funkcji mirna, zarówno spadek, jak i wzrost ich stężenia w komórce mogą sprzyjać lub być objawem procesu kancerogenezy. 1

2 Choroby nowotworowe są jedną z plag związanych ze zdrowiem współczesnego człowieka. Wśród nich jednymi z najgorzej rokujących są nowotwory OUN, a guzy mózgu (zwłaszcza te złośliwe) stanowią jedną z najpoważniejszych przyczyn jego zaburzeń. Schorzenia te rozwijają się często niepostrzeżenie, a objawy neurologiczne bywają trudne do stwierdzenia. Z tego powodu ich wczesna diagnostyka i terapia są dla pacjenta kwestią życia lub śmierci. W ciągu ostatnich lat obserwuje się intensywny rozwój badań nad patogenezą guzów mózgu. Ich wyniki pozwalające w coraz pełniejszym stopniu zrozumieć mechanizm powstawania guzów mózgu, przyczyniają się do opracowywania znacznie skuteczniejszych metod leczenia, jak również oceny możliwości zapobiegania ich powstawania i wzrostu. W ostatnich latach dokonuje się przełom w dziedzinie genetyki polegający na coraz lepszym rozumieniu biologicznej roli niekodującego RNA. Odkrycie mirna zmieniło sposób postrzegania procesu nowotworzenia. Obecnie znamy wiele przykładów związku zaburzeń ekspresji mikrorna z występowaniem różnych chorób, co stanowi podstawę poszukiwań nowych strategii terapeutycznych. Komórkowy świat mirna jest prawdziwą terra incognita. Z jak skomplikowanym fenomenem mamy do czynienia niech świadczy fakt, że liczba genów kodujących mirna u człowieka szacowana jest na ok. 1000, a jednocześnie mirna zaangażowane jest w regulację przynajmniej połowy (a prawdopodobnie znacznie więcej) mrna genów białkowych. Korelując ten fakt z niewielkim rozmiarem cząsteczek mirna wyraźnie widać, że regulacja aktywności mrna daleko wykracza poza klasyczną komplementarność (tworzenie par WC) oddziałujących ze sobą sekwencji. Glejak wielopostaciowy (ang. Glioblastoma Multiforme, GBM) jest najczęściej występującym u ludzi, najbardziej złośliwym oraz źle rokującym pierwotnym guzem mózgu. Jego naciekający wzrost i intensywna migracja zmienionych nowotworowo komórek w obrębie otaczającej tkanki nerwowej sprawiają, że walka z nim należy do wyjątkowo trudnych. Ze względu na specyficzny sposób wzrostu guza, jego całkowite chirurgiczne usunięcie jest problematyczne. W komórkach GBM mirna mogą pełnić funkcje zarówno supresorów nowotorowych, jak i czynników onkogennych, co predeterminuje je jako potencjalny cel terapeutyczny oraz narzędzie w diagnostyce i terapii guzów mózgu. Z jak poważnym problemem problemem medycznym mamy do czynienia w przypadku GBM, niech świadczy dość powszechne określenie jakie przylgnęło do tej choroby, że glejak to wyrok śmierci rozciągnięty w czasie. W nurt badań nad strukturą i rolą mirna w kontekście procesu onkogenezy w guzach mózgu włączyła się Doktorantka. Rozprawa doktorska mgr Agnieszki Belter zatytułowana Strukturalne aspekty mirna swoistych dla guzów mózgu powstała w Zespole Kwasów Nukleinowych Zakładu Biologii RNA Instytutu Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu, kierowanym przez prof. dr hab. Mirosławę Naskręt-Barciszewską, będącą również promotorem rozprawy. Promotorem pomocniczym była 2

3 dr Katarzyna Rolle. Zarówno środowisko naukowe Zespołu, jak i ICHB PAN, jednych z najbardziej liczących się polskich i światowych ośrodków zajmujących się tematyką RNA z całą pewnością ułatwiło Doktorantce pracę nad fascynującym i jednocześnie mało dotychczas poznanym problemem funkcji niekodujących, w tym mirna w procesie onkogenezy guzów mózgu. Recenzowana dysertacja zawiera wyniki badań Doktorantki dotyczących typowania mirna istotnych dla guzów GMB, oceną ich przydatności jako celu molekularnego terapii, charakterystyce strukturalnej i biochemicznej wytypowanych mirna i ich prekursorów, projektowania i charakterystyki rybo- i DNAzymów skierowane przeciwko wytypowanym mirna. Mimo, iż ten zwięzły opis mieści się w kilku linijkach tekstu, każdy kto spędził trochę czasu w laboratorium biochemicznym zdaje sobie sprawę, że realizacja tych badań wymagała od Doktorantki ogromnego nakładu pracy i pełnego zaangażowania w realizowane badania. W ramach przedstawionej do recenzji dysertacji Doktorantka wykonała analizę mikromacierzową profilu mirna tkanek guza mózgu i porównując go z tymi uzyskanymi z tkanek zdrowych wytypowała mirna, których poziom został istotnie zmieniony w wyniku procesu nowotworzenia. Wytypowane mirna zostały następnie scharakteryzowane przez Doktorantkę jako potencjalne cele terapii przeciwnowotworowej. Doktorantka metodami spektroskopowymi (NMR, CD, UV), biochemicznymi (ograniczone cięcie enzymami restrykcyjnymi lub jonami ołowiu) oraz przy pomocy algorytmów komputerowych i zaprojektowanych narzędzi typu anty-mirna, scharakteryzowała strukturę i zachowanie w komórce wytypowanych mirna. Doktorantka pokazała również, że mirna mogą wiązać się z białkami komórkowymi nie będącymi elementami kompleksu RISC, klasycznej ścieżki w oparciu o którą działają mirna. Zaprojektowała i scharakteryzowała narzędzia w postaci rybo- i DNAzymów, hamujące aktywność wybranych mirna w komórkach nowotworowych. Wszystkie wymienione aspekty przeprowadzonych przez Doktorantkę eksperymentów mają charakter nowości naukowej. Badania doktorantki miały charakter zarówno badań podstawowych, dostarczających nowych informacji o strukturze i mechanizmach działania mirna w komórce, jak również aplikacyjnych, o czym świadczą dwa patenty mające chronić potencjalne farmakologiczne zastosowanie badanych rybozymów i mirna. Badania Doktorantki potencjalnie mogą przyczynić się do stworzenia nowych narzędzi terapeutycznych w postaci leków opartych o cząsteczki RNA. Z tego punktu widzenia wybór tematu pracy doktorskiej uważam za bardzo trafną i bardzo dobrze umotywowaną pod względem merytorycznym decyzję. Zrealizowanie ogromu zaplanowanych badań eksperymentalnych i obliczeniowych/teoretycznych z pewnością wymagało od 3

4 Doktorantki nie tylko dużej wiedzy, lecz również dużego wysiłku i czasu spędzonego zarówno przy stole laboratoryjnym, jak również przed monitorem komputera. Formalna ocena rozprawy. Recenzowana rozprawa zawiera 210 stron tekstu. Praca zawiera 9 nienumerowanych rozdziałów, wśród których znajdują się: wprowadzenie i cel pracy (4 strony), wykaz skrótów stosowanych w pracy (3 str), tzw. opracowanie literaturowe opisujące Strukturę i funkcję małych RNA (25 str), materiały i metody (40 str), najobszerniejszy-wyniki i dyskusja (102 str), podsumowanie (1 str), referencje (18 str, 251 pozycji literaturowych), streszczenie (2 str) oraz abstrakt (2 str). W rozprawie zawarta jest również informacja o aktywności publikacyjnej doktorantki w postaci 1 publikacji w PLOS One (IF 3,5), gdzie Doktorantka jest pierwszym autorem, 3 manuskryptów (bez informacji o aktualnym statusie), dwóch zgłoszeń patentowych (polskiego i międzynarodowego) oraz posteru konferencyjnego. Pokazuje to dobry jakościowo dorobek naukowy doktorantki, a także umiejętność komercjalizowania uzyskanych wyników badań poprzez ich patentowanie. Fakt, że Doktorantka jest pierwszym autorem publikacji w dobrym czasopiśmie, co świadczy o jej samodzielności i dużej znajomości badanych przez nią zagadnień oraz wagi badanego problemu. Wstęp dysertacji zawiera krótki rys historyczny odkryć związanych z różnymi rodzajami RNA oraz charakterystykę strukturalną samej cząsteczki RNA. W tym rozdziale Doktorantka przedstawia także krótki opis korelacji pomiędzy strukturą i komórkową funkcją RNA. Najbardziej wartościowym fragmentem tej części rozprawy jest charakterystyka mirna i ich rola w komórkach GMB. Fragment ten mógłby posłużyć jako rdzeń niezwykle użytecznego artykułu przeglądowego o nowatorskim pomyśle na terapię guzów mózgu. W najobszerniejszej części dysertacji zatytułowanej Wyniki i dyskusja, Doktorantka przedstawia wyniki badań nad mirna wyselekcjonowanymi jako potencjalne cele terapii przeciwnowotworowej w komórkach GMB. Lektura tej części pracy doktorskiej pokazuje dużą wiedzę i doświadczenie eksperymentalne Doktorantki, pozwalające jej na rozwiązanie postawionych przed nią problemów i zwięzłe przedstawienie efektów swojej pracy. Szczególnie wyraźnie widać to w miejscach, gdzie Doktorantka interpretuje uzyskane przez siebie wyniki, zastanawia się nad przyczynami ewentualnych niepowodzeń i proponuje rozwiązania alternatywne. W tej części rozprawy Doktorantka precyzyjnie opisuje wyniki swoich eksperymentów związanych z profilowaniem mirna w komórkach GMB, analizą strukturalną wyselekcjonowanych mirna, badaniem stabilności mirna oraz ich oddziaływania z białkami komórkowymi, a także aktywność zaprojektowanych przez siebie rybo- i DNAzymów anty-mirna. Doktorantka wykazuje się dużą sprawnością i w projektowaniu i wykonywaniu opisywanych eksperymentów mających dać jej odpowiedź na postawione pytania. W wypadku niepowodzeń Doktorantka potrafi wytłumaczyć ich przyczyny i/lub 4

5 zaproponować rozwiązania alternatywne. Efektem tego są niezwykle ciekawe i wartościowe wyniki uzyskane przez Doktorantkę na temat aspektów strukturalnych i biochemicznych cząsteczek mirna w guzach GMB. Podsumowując tą część rozprawy muszę stwierdzić, że stanowi ona wynik ogromu pracy włożonej przez młodą ale już doświadczoną badaczkę, potrafiącą wykorzystywać własną wiedzę do rozwiązywania postawionych przed nią problemów z pogranicza biochemii i biologii molekularnej. Z obowiązku recenzenta muszę przedstawić również kilka uwag krytycznych, które nasunęły mi się po lekturze. Uchybień formalnych jest niewiele. Dysertacja napisana jest elegancką polszczyzną, ze zrozumieniem opisywanych problemów oraz dużą starannością edytorską. Szata edytorska wsparta rysunkami i fotografiami o bardzo dobrej jakości jest mocną stroną rozprawy. Dostrzeżone w tekście dysertacji uchybienia. Określenie cpm dotyczy cząstek beta (elektronów), a nie cząsteczek (str 9). Określenie konformacji wiązania glikozydowego w nukleotydzie jako cis i trans uważam za niezbyt fortunne (str. 15). Te określenia wykorzystywane są raczej do opisu rozkładu podstawników wokół wiązania podwójnego (np. w alkenach), a i to tylko wtedy gdy z atomami węgla związany jest jeden atom wodoru. W wypadku nukleotydów używane są określenia syn i anty. Skrót CNS to kalka z języka angielskiego, a odpowiada jej polskie określenie OUN. Inną kalką językową jest określenie procesowanie widm (chodzi o analizę widm NMR przy pomocy programu komputerowego, str 65). W całej pracy przewija się niefortunne określenie używane przez Doktorantkę, że cząsteczka mirna przyjmuje, tworzy lub ma strukturę. Każda cząsteczka ma jakąś strukturę. Struktura nieuporządkowana to też struktura. Rozumiem, że pod pojęciem posiadania struktury, Doktorantka rozumie strukturę uporządkowaną. Przy profilowaniu mirna guza GMB, w kontekście pobierania próbek z samego guza i jego obrzeża, nasunęło mi się pytanie czy sam guz jest strukturą homogenną histologicznie. A jeżeli nie, to na podstawie jakich cech morfologicznych były wybierane miejsca w obrębie samego guza z których pobierano próbki? W jaki sposób ustalono granicę między guzem i jego obrzeżem? Czy doktorantka byłaby w stanie odpowiedzieć na pytanie lub przedstawić własne przemyślenia czy zmiana poziomu mirna (zarówno wzrost stężenia, jak i spadek) są przyczyną czy skutkiem procesu nowotworzenia? Zastosowanie starych sprawdzonych metod, jak temperaturowo zależnej spektroskopii UV do oznaczenia wartości Tm, a zarazem rozróżnienia spinki od dupleksu, uważam za bardzo dobry pomysł. Jak widać czasami 5

6 wyrafinowane metody, takie jak NMR nie potrafią rozwiązać takich problemów. Czy elektroforeza PAGE również nie pomogłaby w rozwiązaniu problemu spinka czy dupleks? Na str Doktorantka pisze, że równowaga spinka-dupleks ustala się przy konkretnej wartości stężenia dla wytypowanych mirna. Z rysunku 2.14 wynika, że taka równowaga ustala się nie przy konkretnym stężeniu, ale w pewnym zakresie stężeń. Faktem natomiast jest, że przy różnych stężeniach mirna, proporcje pomiędzy spinką i dupleksem będą różne. Czy Doktorantka miałaby jakiś pomysł na rozwiązanie problemu dużego stężenia jonów magnezu (dużo wyższe od komórkowego), koniecznego dla efektywnego działania zaprojektowanych przez siebie rybozymów anty-mirna? Jakie metody można by zastosować w celu zwiększenia stabilności rybo- i DNAzymów anty-mirna w komórce? Poproszę Doktorantkę o wyjaśnienie faktu, że wyniki badań eksperymentalnych pokazują dominację dupleksu np. dla mir-21, a w opisie tabeli 2.4 widnieje informacja, że zaznaczona na czerwono dominująca struktura spinki, będąca efektem obliczeń komputerowych jest zgodna z wynikami eksperymentalnych badań strukturalnych. Zgodziłbym się natomiast z wnioskiem jaki wyciągnęła Doktorantka, że w wypadku stężeń komórkowych rzędu 200 pm dominującą strukturą powinna być spinka. Rysunek 4.16 jest opisany jako hydroliza pre-mir-21, a powinno być mir-21. Jak skomentuje Doktorantka fakt, że zastosowane LNA jest znacznie skuteczniejsze w obniżaniu poziomu endogennej puli mir-21, niż zaprojektowane rybozymy? Co przemawia za rozwijaniem technologii rybo- bądź DNAzymów anty-mirna, a nie antysensownych oligo, chociażby takich jak LNA? Interesującym osiągnięciem Doktorantki jest pokazanie, że mirna oddziałują z białkami komórkowymi spoza kompleksu RISC. Czy Doktorantka ma jakiekolwiek informacje bądź sugestie jakiego rodzaju/klasy są to białka? Kolejnym intrygującym problemem związanym z potencjalnym zastosowaniem RNA jako leku, jest jego wprowadzanie do wnętrza komórki. Doktorantka stosowała w tym celu m.in. lipofektaminę. Mimo, że metoda ta jest niezwykle skuteczna, ani ona, ani np. peptydy penetrujące błonę komórkową (CPP) nie znalazły się dotychczas na liście związków dopuszczonych do stosowania klinicznego. Transfekowanie komórek wektorami wirusowymi też znajduje dość ograniczone zastosowanie. Czy Doktorantka potrafi wytłumaczyć dlaczego? Powyższe uwagi i zastrzeżenia wynikają jedynie z konieczności wnikliwej i krytycznej analizy rozprawy doktorskiej, mają w większości charakter polemiczny i w żadnym stopniu nie umniejszają efektów naukowych osiągniętych przez Kandydatkę. 6

7 Reasumując, Kandydatka do stopnia naukowego doktora postawiła przed sobą ambitne zdania badawcze i skutecznie je zrealizowała. Doktorantka wykazała się przy tym nie tylko ogromnym zasobem wiedzy związanym z prowadzonymi badaniami, lecz również potrafiła tą wiedzę efektywnie wykorzystać praktycznie. Połączenie wiedzy umożliwiającej wykorzystanie szerokiego wachlarza technik eksperymentalnych i niezwykle dużych praktycznych umiejętności Doktorantki czynią z niej doświadczonego i samodzielnego badacza. Uzyskane wyniki uważam za niezwykle wartościowe. Pozwalają one na stopniowe odkrywanie tajemnic świata niekodujących RNA. Z całą pewnością przyczynią się one do lepszego zrozumienia mechanizmów regulacji ekspresji informacji genetycznej kontrolowanych przez mirna. Mogą również przyczynić się do opracowania nowej klasy leków XXI w. opartych na RNA, gdzie mirna będzie zarówno celem terapeutycznym, jak i czynnikiem farmakologicznym pozwalającym na regulowanie zaburzeń procesów metabolicznych komórki. Z pełnym, przekonaniem stwierdzam, że recenzowana przeze mnie dysertacja zawiera elementy nowości o wysokich walorach naukowych, spełnia ustawowe i zwyczajowe wymagania stawiane rozprawom doktorskim i wnoszę do Rady Naukowej IChB PAN o dopuszczenie mgr Agnieszki Belter do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Równocześnie ze względu na wartość naukową uzyskanych wyników, umiejętne i efektywne połączenie badań podstawowych (eksperymentalnych i teoretycznych) z aspektem aplikacyjnym w postaci dwóch patentów, wnoszę o wyróżnienie rozprawy doktorskiej mgr Agnieszki Belter. 7