(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/IL00/00550 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/IL00/00550 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO01/19360 PCT Gazette nr 12/01 (51) Int.Cl. A61K 31/7052 ( ) A61P 35/00 ( ) (54) Zastosowanie skutecznej ilości agonisty receptora adenozynowego A3 (30) Pierwszeństwo: ,IL, ,IL, (73) Uprawniony z patentu: CAN-FITE BIOPHARMA LTD., Petach Tikva,IL (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 13/04 (72) Twórca(y) wynalazku: Pnina Fishman,Herziliya,IL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 11/08 (74) Pełnomocnik: Kamiński Zbigniew, Kancelaria Patentowa (57) Przedmiot wynalazku należy do dziedziny leczenia nowotworów oraz zapobiegania szkodliwym działaniom ubocznym związanym z terapią przeciwnowotworową. Wynalazek obejmuje zastosowanie skutecznej ilości agonisty receptora adenozynowego A3 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia i przeciwdziałania mielotoksyczności wywołanej przez lek, zapobiegania lub leczenia leukopenii, zapobiegania lub leczenia działań ubocznych leków przeciwnowotworowych, leczenia chorób autoimmunologicznych oraz nowotworowych związanych z nieprawidłowym wzrostem lub namnażaniem komórek. PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Dziedzina techniki Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie skutecznej ilości agonisty receptora adenozynowego A3 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia i przeciwdziałania mielotoksyczności wywołanej przez lek, zapobiegania lub leczenia leukopenii, zapobiegania lub leczenia działań ubocznych leków przeciwnowotworowych, leczenia chorób autoimmunologicznych oraz nowotworowych związanych z nieprawidłowym wzrostem lub namnażaniem komórek. Dotychczasowy stan techniki Przedstawione poniżej publikacje ze stanu techniki zostały omówione w opisie wynalazku i włączone w całości w jego zakres. W nawiasach podano odnośniki do poszczególnych publikacji z podanej niżej listy. 1. Linden J, The FASEB J. 5: (1991), 2. Stiles R.L. Clin. Res. 3:10-18 (1990), 3. Stolfi R.L. i wsp. Cancer Res. 43: (1993), 4. Belardinelli L. i wsp. Prog, Cardiovasc. Dis. 32: (1989), 5. Collis M.G., Pharmacol. Ther. 41: (1989), 6. Clark B. i Coupe M., Int. J. Cardial. 23:1-10 (1989), 7. Dubey RK. i wsp., Circulation 96: (1997), 8. Soderback U, i wsp., Ciln. Sci, 81: (1994), 9. Gilbertsen R.B., Agents actions 22: (1987), 10. Bouma M.G. i wsp., J. Immunol. 153: (1994), 11. Rozengurt E., Exp. Cell Res. 1139:71-78(1982), 12. Gonzales F.A. i wsp., PNAS USA 87: (1990), 13. Sandberg G. i Fredholm B,B., Thymus 3:63-75 (1981), 14. Pastan l. H. i wsp., Annu. Rev. Biochem. 44: (1975), 15. WO 99/02143, 16. Fishman P. i wsp., Cancer Res. 58; (1998), 17. Djaldetti M. i wsp. Clin. Exp. Metastasis 14: (1996), 18. Fishman P. i wsp. Cancer. Reseach 58: (1998). Tło wynalazku, Toksyczny wpływ na szpik kostny stanowi główną poważną komplikację chemoterapii i jest jednym z czynników, które ograniczają ilość podawanego leku chemoterapeutycznego. Wpływ ten zwiększa zagrożenie życia oraz śmiertelność pacjentów w większym stopniu niż wszelkie inne skutki uboczne chemoterapii i może prowadzić do wydłużenia pobytu pacjenta w szpitalu. Ponadto zahamowanie czynności szpiku w wyniku podania leku ogranicza ilość środka chemoterapeutycznego podawanego pacjentom z nowotworami złośliwymi, który podany w większej dawce mógłby być potencjalnie skuteczniejszy. Podejmowano wiele prób rozwiązania tego niepożądanego działania, takich jak zastosowanie litu, prostaglandyny E, interferonu, laktoferyny i czynników wzrostu, czynnika stymulującego kolonie granulocytów-makofagów (GM-CSF) i czynnika stymulującego kolonie granulocytów (G-CSF). Aktualnie zastosowanie czynników wzrostu, takich jak G-CSF stanowi standardową terapię pacjentów z nowotworami cierpiących na neutropenię. Czynniki te stymulują namnażanie i różnicowanie prekursorowych komórek krwiotwórczych, a także regulują aktywności funkcjonalne obojętnochłonnych białych krwinek i makrofagów, przy czym jednak leczenie za pomocą G-CSF jest kosztowne i, ponieważ jest to białko uzyskane w wyniku rekombinacji, może powodować niepożądane działania uboczne. Adenozyna, endogenny nukleozyd purynowy, jest wszechobecna w komórkach ssaków. Adenozyna obecna w osoczu i innych płynach pozakomórkowych pośredniczy w wielu procesach fizjologicznych poprzez swoiste receptory na powierzchni komórek i jest ważnym białkiem regulacyjnym. Wydzielana jest ze środowiska międzykomórkowego z aktywnych metabolicznie albo poddanych stresowi komórek. Wiadomo, że działa ona poprzez związanie ze specyficznymi receptorami błonowymi (1-2) A1, A2 i A3 związanymi ze specyficznym białkiem G. Oddziaływanie adenozyny ze receptorami zapoczątkowuje szlaki przekaźnictwa sygnałowego, głównie układ efektorowy cyklazy adenylanowej, w którym wykorzystywane jest camp jako wtórny przekaźnik informacji. O ile receptory A1 i A3, które są sprzężone z białkami Gi, hamują aktywność cyklazy adenylanowej i prowadzą do obniżenia poziomu wewnątrzkomórkowego camp, to receptor A2, który jest sprzężony z białkami Gs, aktywuje cyklazę adenylanową zwiększając w ten sposób poziomy camp (3).

3 PL B1 3 Ponieważ specyficzne receptory powierzchniowe adenozyny znaleziono prawie we wszystkich komórkach, to niemal wszystkie układy organizmu są regulowane do pewnego stopnia przez jej miejscowe uwalnianie. Obejmuje to regulację elektrofizjologicznej charakterystyki serca, obniżenie i stłumienie uwalniania przekaźników nerwowych i regulację uwalniania reniny oraz napięcie naczyniowe w nerkach (4-7). Adenozyna ma znaczny wpływ na układ odpornościowy, w tym na aktywność przeciwzapalną poprzez hamowanie wydzielania cytokiny, hamowanie agregacji płytek, indukcję wytwarzania erytropoetyny i modulację funkcji limfocytów (8-10). Ustalono ponadto, że adenozyna odgrywa pewną rolę w zmianach czynnościowych pewnych funkcji centralnego układu nerwowego (CNS), w gojeniu się ran, przy zwiększonym wydalaniu moczu i regulowaniu odczuć bólowych. Wykazano także, że adenozyna jest zdolna do indukowania namnażania wielu różnych typów zdrowych komórek (11-40). W tych modyfikacjach namnażania komórek pośredniczy prawdopodobnie opisany wyżej układ efektorowy cyklazy adenylanowej. W obecnych badaniach ustalono, że adenozyna działa jako środek chemochronny, którego aktywność jest związana prawdopodobnie z jego zdolnością do stymulowania namnażania komórek szpiku kostnego. Ustalono ponadto, że adenozyna ma hamujący wpływ na namnażanie komórek nowotworowych, prawdopodobnie na skutek wstrzymania cyklu komórkowego w G0/G1 i zmniejszenie sygnału telomerycznego (17-18). Takie działanie adenozyny stanowi interesujący kierunek w opracowywaniu nowych koncepcji leczenia raka. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem stwierdzono, że związki agonistyczne receptora A3 adenozyny (A3RAg) wykazują podwójny wpływ polegający na tym, że z jednej strony hamują one namnażanie złośliwych komórek rakowych, a z drugiej strony przeciwdziałają toksycznym skutkom ubocznym leków chemoterapeutycznych. Związki A3RAg hamują specyficznie rozrost i wzrost komórek nowotworowych, wchodzą w układ synergistyczny z przeciwnowotworowym lekiem cytotoksycznym, co prowadzi do zmniejszenia obciążenia nowotworem, indukują namnażanie i różnicowanie komórek szpiku kostnego i białych krwinek oraz przeciwdziałają toksycznym skutkom ubocznym innych leków, a zwłaszcza leków chemoterapeutycznych. Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie skutecznej ilości agonisty receptora adenozynowego A3 (A3RAg), do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia i przeciwdziałania mielotoksyczności wywołanej przez lek, gdzie działanie A3RAg zachodzi przede wszystkim poprzez receptor A3, a A3RAg jest pochodną nukleotydu o wzorze ogólnym (I): gdzie R 1 oznacza C 1 -C 10 alkil, C 1 -C 10 hydroksyalkil, C 1 -C 10 karboksyalkil lub C 1 -C 10 cyjanoalkil lub grupę o wzorze ogólnym (II): w której: -Y oznacza tlen, siarkę lub CH 2 ; -X 1 oznacza H, C 1 -C 10 alkil, R a R b NC(=0)- lub HOR c -, gdzie R a i R b są takie same lub różne i są wybrane z grupy obejmującej wodór, C 1 -C 10 alkil, amino, C 1 -C 10 halogenoalkil, C 1 -C 10 aminoalkil, C 1 -C 10 BOC-aminoalkil, i C 3 -C 10 cykloalkil lub są połączone razem w pierścień heterocykliczny zawierający dwa do pięciu atomów węgla, i R c jest wybrany z grupy obejmującej C 1 -C 10 alkilen, -NH-, C 1 -C 10 halogenoalkilen, C 1 -C 10 aminoalkilen, C 1 -C 10 Boc-aminoalkilen i C 3 -C 10 cykloalkilen; -X 2 oznacza H, hydroksyl, C 1 -C 10 alkiloamino, C 1 -C 10 alkiloamido lub C 1 -C 10 hydroksyalkil; -X 3 i X 4 każdy niezależnie oznacza wodór, hydroksyle, amino, amido, azydo, halogeno, alkilo, alkoksy, karboksy, nitrylo, nitro, trifluoro, arylo, alkiloarylo, tio, tioestero, tioetero, -OCOPh, -OC(=S)OPh lub oba X 3 i X 4 są połączone przez tlen z >C=S w 5-członowy pierścień, lub X 2 i X 3 tworzą pierścień o wzorze (III):

4 4 PL B1 gdzie R' i R" oznaczają niezależnie C 1 -C 10 alkil; gdzie R' i R" oznaczają niezależnie C 1 -C 10 alkil; -R 2 jest wybrany z grupy obejmującej wodór, halogen, C 1 -C 10 alkiloeter, amino, hydrazyd, C 1 -C 10 alkiloamino, C 1 -C 10 alkoksy, C 1 -C 10 tioalkoksy, pirydylotio, C 2 -C 10 alkenyl; C 2 -C 10 alkynyl, tio, i C 1 -C 10 alkilotio oraz -R 3 oznacza grupę -NR 4 Rs, gdzie R 4 oznacza wodór lub grupę wybraną z następujących podstawników alkil, podstawiony alkil lub arylo-nh-c(z)-gdzie Z oznacza O, S, lub NR a gdzie R a ma znaczenie jak przedstawiono powyżej, -i R 5, gdzie R 4 oznacza wodór, jest wybrany z grupy obejmującej R- i S-1-fenyloetyl, benzyl, fenyloetyl lub grupy anilidowe niepodstawiony lub podstawiony przynajmniej w jednej pozycji podstawnikiem wybranym z grupy obejmującej C 1 -C 10 alkil, amino, halogeno, C 1 -C 10 halogenoalkil, nitro, hydroksyl, acetoamido, C 1 -C 10 alkoksy, i kwas sulfonowy lub jego sól; lub R 4 oznacza benzodioksanometyl, fururyl, L-propyloalanylo-aminobenzyl, β-alanyloamino-benzyl, T-BOC-β-alanyloaminobenzyl, fenylamino, karbamoil, fenoksy lub C 1 -C 10 cykloalkil; lub R 5 oznacza grupę o wzorze: - lub odpowiednia sól związku zdefiniowanego powyżej, np. sól trietyloamonowa; lub gdy R 4 oznacza grupę wybraną z następujących podstawników alkil, podstawiony alkil, lub arylo-nh-c(z)-, to R 4 jest wybrany z grupy obejmującej podstawiony lub niepodstawiony heteroarylo-nr a - C(Z)-, heteroarylo-c(z)-, alkiloarylo-nr a -C(Z)-, alkiloarylo-c(z)-, arylo-nr-c(z)- i arylo-c(z)-; gdzie Z ma znaczenie jak zdefiniowano powyżej. W korzystnym rozwiązaniu według wynalazku stosuje się kompozycję farmaceutyczną do podawania doustnego. Korzystne zastosowanie według wynalazku obejmuje A3RAg, który jest pochodną nukleozydu o wzorze ogólnym (IV): gdzie X 1, R 2 i R 5 mają znaczenia jak określono powyżej, korzystniej pochodną N6- benzyloadenozyno-5'-uronamidu. Korzystnie A3RAg jest wybrany z grupy obejmującej: N 6-2-(4-aminofenylo)etyloadenozynę (APNEA), N 6 -(4-amino-3-jodobenzylo)adenozyno-5'-(N-metylouronamid) (AB-MECA), N 6 -(3-jodobenzylo)-adenozyno-5'-N-metylo-uronamid (IB-MECA) i 2-chloro-N 6 -(3-jodobenzylo)-adenozyno-5'-N-metylo-uronamid (C1-IB-MECA). Inne rozwiązanie wynalazku obejmuje zastosowanie A3RAg, który jest wybrany z grupy obejmującej związki o wzorze(v)

5 PL B1 5 w którym: X oznacza O, R 6 oznacza R a R b NC(=O), gdzie R a i R b są takie same lub różne i są wybrane z grupy obejmującej wodór, C 1 -C 10 alkil, amino, C 1 -C 10 halogenoalkil, C 1 -C 10 aminoalkil, i C 3 -C 10 cykloalkil, R 7 i R 8 są takie same lub różne i są wybrane z grupy obejmującej C 1 -C 10 alkil, R- i S-1-fenyloetyl, niepodstawiona grupa benzylowa, i grupa benzylowa podstawiona przynajmniej w jednej pozycji podstawnikiem wybranym z grupy obejmującej C 1 -C 10 alkil, amino, halogen, C 1 -C 10 halogenoalkil, nitro, hydroksy, acetamido, C 1 -C 10 alkoksy i sulfo, i R 9 jest wybrany z grupy obejmującej halogen, benzyl, fenyl i C 3 -C 10 cykloalkil. Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku lekiem jest środek chemoterapeutyczny podawany pacjentowi w trybie leczenia przeciwnowotworowego. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie skutecznej ilości agonisty receptora adenozynowego A3 (A3RAg) o wzorze (I) jak definiowano powyżej, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania lub leczenia leukopenii, gdzie działanie A3RAg zachodzi przede wszystkim poprzez receptor A3. Korzystnie wynalazek obejmuje zastosowanie związku według wynalazku do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania lub leczenia leukopenii wywołanej lekami. W innej odmianie wynalazek obejmuje zastosowanie skutecznej ilości agonisty receptora adenozynowego A3 (A3RAg) o wzorze (I) jak zdefiniowano powyżej, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania lub leczenia działań ubocznych leków przeciwnowotworowych, gdzie działanie A3RAg zachodzi przede wszystkim poprzez receptor A3. W korzystnym rozwiązaniu zastosowanie związku według wynalazku obejmuje działania uboczne, które polegają na utracie wagi. Korzystnie zastosowanie obejmuje sytuację, w której lek przeciwnowotworowy jest lekiem chemoterapeutycznym. Korzystne rozwiązanie obejmuje ponadto zastosowanie związku według wynalazku do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia, obejmującego zwiększenie u pacjenta poziomu leukocytów w krążeniu. W korzystnym rozwiązaniu według wynalazku stosuje się kompozycję farmaceutyczną do podawania doustnego. Korzystnie agonista receptora adenozynowego A3 jest taki jak określono powyżej. W korzystnym rozwiązaniu stosuje się mieszaninę agonisty receptora adenozynowego A3 o wzorze (I), z lekiem powodującym niepożądane skutki uboczne u pacjenta. Korzystnie zastosowanie obejmuje sytuację, w której lek przeciwnowotworowy jest lekiem chemoterapeutycznym. W korzystnym rozwiązaniu według wynalazku stosuje się kompozycję farmaceutyczną do podawania doustnego. Korzystna odmiana wynalazku obejmuje zastosowanie skutecznej ilości agonisty receptora adenozynowego A3 (A3RAg) o wzorze (I) jak definiowano powyżej, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia chorób autoimmunologicznych związanych z nieprawidłowym wzrostem lub namnażaniem komórek układu immunologicznego, gdzie działanie A3RAg zachodzi przede wszystkim poprzez receptor A3. Inna korzystna odmiana wynalazku obejmuje zastosowanie skutecznej ilości agonisty receptora adenozynowego A3 (A3RAg) o wzorze (I) jak definiowano powyżej, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia chorób nowotworowych związanych z nieprawidłowym wzrostem lub namnażaniem komórek nowotworowych, gdzie działanie A3RAg zachodzi przede wszystkim poprzez receptor A3. W korzystnym rozwiązaniu według wynalazku stosuje się kompozycję farmaceutyczną do podawania doustnego. Korzystnie kompozycja farmaceutyczna jest stosowana w połączeniu z lekiem do chemoterapii. Zastosowanie skutecznej ilości agonisty receptora adenozynowego A3 (A3RAg) o wzorze (I) jak definiowano powyżej, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia raka u pacjenta, obejmującego hamowanie wzrostu lub namnażania komórek rakowych i przeciwdziałanie szkodliwym działaniom ubocznym leków do chemoterapii. W korzystnym rozwiązaniu według wynalazku agonista receptora adenozynowego A3 ma działanie synergistyczne z drugim lekiem powodując silniejszy efekt. Korzystnie agonista receptora adenozynowego A3 ma postać doustną. Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku dawka A3RAg wynosi <100 μg/kg masy ciała, korzystniej dawka A3RAg wynosi <50 μg/kg masy ciała, jeszcze korzystniej dawka A3RAg jest w zakresie 1-10 μg/kg masy ciała. Szczegółowy opis wynalazku Zgodnie z wynalazkiem opracowano nowe terapeutyczne zastosowania agonisty receptora adenozynowego A3 (A3RAg) do pośredniczenia przy wytwarzaniu i wydzielaniu G-CSF z komórek. Zgodnie z innym rozwiązaniem, środki te stosuje się do przeciwdziałania toksycznym działaniom ubocznym leków, na przykład leków chemoterapeutycznych albo nemoleptycznych. W innym rozwiązaniu, takie środki stosuje się do przeciwdziałania leukopenii, a zwłaszcza leukopenii indukowanej

6 6 PL B1 lekami. Zgodnie z jeszcze innym rozwiązaniem, takie środki stosuje się do selektywnego hamowania nienormalnego namnażania komórek. Stosowane tu określenie leukopenia" dotyczy zmniejszenia liczby krwinek białych w układzie krwionośnym. O ile leukopenia charakteryzuje się zwykle zmniejszoną liczbą we krwi białych krwinek obojętnochłonnych (neutropenia), to czasami stwierdza się zmniejszoną liczbę limfocytów, monocytów, eozynofilów albo bazofilów. Leukopenia, która może wystąpić w wyniku zmniejszonego wytwarzania albo nadmiernej sekwestracji białych krwinek obojętnochłonnych w śledzionie, jest chorobą dziedziczną albo wrodzoną przy czym jednak obserwuje się ją głównie po leczeniu lekami, takimi jak cytoredukcyjne leki przeciwnowotworowe, leki przeciwtarczycowe, fenotiazyny, środki przeciwdrgawkowe, penicyliny, sulfonamidy i chloramfenikol. Niektóre środki przeciwnowotworowe powodują leukopenię jako znane działanie uboczne. W dalszym tekście zmniejszenie liczby leukocytów albo liczby białych krwinek obojętnochłonnych w wyniku podawania leków będzie nazywane leukopenią indukowaną lekami" albo neutropenią indukowaną lekami". Co więcej, kiedykolwiek mówi się o leukopenii, to należy rozumieć, że dotyczy to zwłaszcza neutropenii". Określenie zapobieganie albo leczenie leukopenii" należy dalej rozumieć jako sposób postępowania, w wyniku którego nie nastąpi zmniejszenie liczby leukocytów, co może w przeciwnym razie wystąpić, lub nastąpi w niewielkim stopniu, albo, jeżeli takie zmniejszenie wystąpiło, stosuje się sposób postępowania, który spowoduje wzrost liczby leukocytów. Leukopenia objawia się różnymi skutkami ubocznymi, takimi jak zwiększona możliwość infekcji. Określenie zapobieganie albo leczenie leukopenii" należy rozumieć jako poprawę tych parametrów, które określają leukopenię. Skuteczną ilość, farmaceutycznie albo terapeutycznie, dla niniejszych celów, wyznacza się zgodnie ze stanem techniki w tej dziedzinie. Ilość musi być wystarczająca, aby uzyskać pożądane działanie terapeutyczne, które zależy od rodzaju i sposobu leczenia. Jest oczywiste dla specjalisty, że ilość ta powinna być wystarczająca, aby uzyskać zwiększenie przeżycia, szybsze wyzdrowienie, zmniejszenie albo wyeliminowanie objawów albo innych wskaźników, zgodnie z wiedzą specjalistów w tej dziedzinie. Gdy na przykład wymieniony składnik czynny podaje się w celu wywołania wytwarzania G-CSF, to skuteczna ilość składnika czynnego może być ilością, która prowadzi do wytwarzania i wydzielania G-CSF z jednojąderkowych komórek krwi obwodowej, komórek śródbłonkowych albo fibroblastów, w których jest on wytwarzany, przez co na przykład stymuluje się dojrzewanie komórek prekursorowych granulocytów do dojrzałych białych krwinek obojętnochłonnych. Tam, gdzie składnik czynny podaje się w celu przeciwdziałania leukopenii indukowanej przez leki, to skuteczna ilość składnika czynnego jest ilością, która chroni pacjenta przed indukowanym przez leki zmniejszeniem liczby leukocytów, a zwłaszcza białych krwinek obojętnochłonnych, zapewnia zwiększenie już zmniejszonego poziomu tych komórek, na przykład przywrócenie normalnego poziomu albo czasami nawet większej liczby leukocytów, itp. Tam, gdzie składnik czynny podaje się w celu zmniejszenia toksycznego skutku ubocznego leku, ilość składnika czynnego jest na przykład ilością skuteczną w zapobieganiu zmniejszania utraty masy ciała lub przywracającą właściwej masy ciała, w wyniku podanego leku. Tam, gdzie składnik czynny podaje się w celu zahamowania nienormalnego wzrostu komórek, skuteczna ilość jest ilością, która będzie hamować namnażanie takich komórek u pacjenta, a nawet eliminować nowotwór. Tam, gdzie składnik czynny podaje się w celu wzmocnienia skutku przeciwnowotworowego leku terapeutycznego, skuteczna ilość jest ilością, która albo zwiększa specyficzną toksyczność przeciwnowotworową leczenia chemoterapeutycznego, ilością, która jest skuteczna przy zmniejszaniu ilości leku chemoterapeutycznego albo połączenia leków wymaganego do uzyskania pożądanego efektu leku chemoterapeutycznego albo połączenia leków, to jest zmniejszenie obciążenia nowotworowego, itp. Przykładem skutecznej ilości jest dzienne podawanie A3RAg w ilości mniejszej niż 100 μg/kg masy ciała, typowo mniej niż 50 μg/kg masy ciała i ewentualnie nawet mniej niż 10 μg/kg masy ciała, na przykład około 3-6 μg/kg masy ciała. Taką ilość A3RAg podaje się typowo w postaci pojedynczej dawki, chociaż czasami dzienną dawkę można dzielić na kilka dawek podawanych w ciągu dnia albo czasami kilka dawek dziennych można łączyć w pojedynczą dawkę podawaną pacjentowi jeden raz na kilka dni, zwłaszcza jeżeli jest ona podawana w postaci kompozycji z przedłużonym wydzielaniem. W jednym z rozwiązań składnik czynny według wynalazku jest pochodną nukleozydową. Przez określenie nukleozyd" rozumie się każdy związek zawierający cukier, korzystnie rybozę albo dezoksyrybozę, albo zasadę purynową albo pirymidynową albo połączenie cukru z zasadą purynową albo pirymidynową korzystnie wiązaniem N-glikozylowym. Określenie pochodna nukleozydowa" będzie

7 PL B1 7 stosowane tu do oznaczenia naturalnie występującego nukleozydu, jak określono wyżej, syntetycznego nukleozydu albo nukleozydu, który poddawano modyfikacjom chemicznym grup funkcyjnych drogą insercji, delecji albo substytucji egzocyklicznej i endocyklicznej albo modyfikacjom konformacyjnym, które dają pochodną o pożądanym działaniu biologicznym. Korzystne składniki czynne według tego rozwiązania wynalazku można nazwać ogólnie jako N 6 -benzyloadenozyno-5'-uronoamidy i ustalono, że ich pochodne są agonistami selektywnych receptorów A3 adenozyny. Do przykładów takich pochodnych należy N 6-2-(4-aminofenylo)etyloadenozyna (APNEA), N 6 -(4-amino-3-jodobenzylo)adenozyno-5'-(N-metylo-uronoamid) (AB-MECA) i 1-dezoksy-1- -{6-[({3-jodofenylo}-metylo)amino]-9H-purynylo-9}-N-metylo-β-D-rybofuranuronoamid, przy czym ten ostatni jest nazywany w tej dziedzinie także N 6-3-jodobenzylo-5'-metylokarboksamidoadenozyna, N 6 -(3-jodobenzylo)adenozyno-5'-N-metylouronoamid (w skrócie IB-MECA), albo chlorowana pochodna IB-MECA (R2=CI), nazywana tu jako C1-IB-MECA, przy czym IB-MECA i C1-IB-MECA są szczególnie korzystne. Zgodnie z innym rozwiązaniem wynalazku składnik czynny może być pochodną adenozyny, nazywaną ogólnie jako N 1 -tlenek N 6 -benzyloadenozyno-5'-alkilouronamidu albo N 1 -tlenek N 6 -benzyloadenozyno-5'-n-dialilouronoamidu. Niektóre z wyżej określonych związków i sposób ich syntezy można znaleźć szczegółowo w dokumentach patentowych nr US , US , US , WO 95/02604, WO 99/20284 i WO 99/ Składnik czynny według wynalazku może być składnikiem określonym wyżej albo mieć postać soli albo solwatów, a zwłaszcza fizjologicznie akceptowalnych soli albo solwatów. Ponadto, gdy składnik czynny zawiera jeden albo więcej asymetrycznych atomów węgla, to może on obejmować izomery i diastereoizomery powyższych składników czynnych albo ich mieszaniny. Farmaceutycznie akceptowalne sole powyższych związków czynnych obejmują sole pochodzące od farmaceutycznie akceptowalnych kwasów nieorganicznych albo organicznych. Przykłady odpowiednich kwasów obejmują kwas chlorowodorowy, bromowodorowy, siarkowy, azotowy, nadchlorowy, fumarowy, maleinowy, fosforowy, glikolowy, mlekowy, salicylowy, bursztynowy, p-toluenosulfonowy, winowy, octowy, cytrynowy, metanosulfonowy, mrówkowy, benzoesowy, malonowy, naftaleno-2-sulfonowy i benzenosulfonowy. Składnik czynny można podawać w postaci substancji nieczynnej (na przykład proleku), która ulega aktywacji w wyniku modyfikacji drogą naturalnego procesu w specyficznym miejscu organizmu pacjenta. Zawsze pochodna musi zachowywać terapeutyczne działanie kompozycji farmaceutycznej według wynalazku. Takie proleki objęte są także, stosowanym tu określeniem składnik czynny". Podobnie określenia A3RAg", A1RAg", A1RAn", A2RAg" i A2RAn" należy rozumieć jako określenia obejmujące proleki, które chociaż nie wykazują a priori aktywności antagonistycznej albo agonistycznej jak to może się zdarzać), to stają się czynne in vivo. A3RAg według wynalazku można wybierać drogą poszukiwania takich związków, które jakościowo mają aktywność przypominającą aktywność IB-MECA. Na przykład takie związki do stosowania zgodnie z rozwiązaniem hamowanie leukopenii" można dobierać w oparciu o ich zdolność do stymulowania namnażania szpiku kostnego albo białych krwinek, a następnie w oparciu o ich aktywność in vivo. W przypadku stosowania w rozwiązaniu hamowanie namnażania" związki dobiera się pod względem ich zdolności do namnażania komórek nowotworowych i tej aktywności in vivo. Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może zawierać jedynie składnik czynny, lecz może być on łączony z innymi składnikami, które mogą być farmaceutycznie akceptowalnym nośnikiem, rozcieńczalnikiem, rozczynnikiem, dodatkiem i ewentualnie środkiem wspomagającym, znanymi specjaliście w tej dziedzinie, na przykład kompozycja farmaceutyczna może zawierać środki smakowo-zapachowe, barwniki, środki poślizgowe, itp. Oczywiście farmaceutycznie akceptowalny nośnik(i), rozcieńczalnik(i), rozczynnik(i), dodatek (dodatki) stosowane według wynalazku obejmują obojętne, nietoksyczne, stałe albo ciekłe wypełniacze, rozcieńczalniki albo materiały to uzyskiwania osłonek, które korzystnie nie reagują ze związkami w kompozycji według wynalazku. Składnik czynny można podawać także w połączeniu z lekiem chemoterapeutycznym, zwłaszcza w przypadku rozwiązania zapobieganie leukopenii". Zatem kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może zawierać dodatkowo do wymienionego składnika czynnego lek chemoterapeutyczny. Zgodnie z jednym z rozwiązań wynalazku lek chemoterapeutyczny jest przeciwnowotworowym lekiem chemoterapeutycznym. Przez to określenie rozumie się każdy lek cytotoksyczny albo koktajl

8 8 PL B1 stanowiący połączenie dwóch albo więcej leków cytotoksycznych podanych pacjentowi w celu zmniejszenia u pacjenta masy nowotworu. Należy podkreślić, że zgodnie z wynalazkiem A3RAg jest dostępny biologiczny po podaniu doustnym, co więcej po podaniu doustnym A3RAg wykazuje podwójną aktywność (zmniejsza namnażanie nieprawidłowych komórek i zapobiega albo zmniejsza leukopenię). Zatem zgodnie z jednym z korzystnych rozwiązań kompozycję farmaceutyczną według wynalazku przeznacza się do podawania doustnego. Taka kompozycja doustna może zawierać ponadto farmaceutycznie akceptowalny nośnik, rozcieńczalnik, rozczynnik, dodatek albo środek wspomagający, nadające się do podawania doustnego. Opisane kompozycje farmaceutyczne mogą zwiększać poziom G-CSF uwolnionego przez komórki. Takie kompozycje można stosować do przyspieszania odzyskiwania właściwego poziomu krwinek białych obojętnochłonnych po chemoterapii i transplantacji szpiku kostnego albo do hamowania namnażania nieprawidłowych komórek. Do chwili opracowania niniejszego wynalazku leczenie polegało na podawaniu samego czynnika wzrostu, co jak wiadomo prowadzi do niepożądanych skutków ubocznych. Co więcej, wiadomo, że średni koszt przeprowadzenia terapii G-CSF jest bardzo wysoki. W zakresie rozwiązania zapobieganie leukopenii" albo rozwiązania zapobieganie toksyczności" według niniejszego wynalazku opisane kompozycje farmaceutyczne stosuje się zwłaszcza do zwiększania poziomu krążących komórek leukocytowych u pacjenta albo przeciwdziałania innym skutkom toksycznym, takim jak utrata masy ciała. Ten aspekt wynalazku ma zastosowanie w szeregu sytuacji klinicznych. Jest oczywiste, że zmniejszony poziom leukocytów w krwiobiegu, a zwłaszcza białych krwinek obojętnochłonnych, może doprowadzić do osłabienia układu odpornościowego. Przykładem osłabienia układu odpornościowego, które można leczyć według tego aspektu wynalazku, jest osłabienie, które często występuje w zaawansowanych etapach raka albo które wynika z indukowanych lekami leukopenii albo neutropenii. Rozwiązanie hamowanie namnażania" jest użyteczne w przypadku leczenia szeregu nieprawidłowości związanych z namnażaniem nieprawidłowych komórek, takim jak nowotwór, łuszczyca i niektóre choroby autoimmunologiczne. Kompozycję według wynalazku stosuje się zwłaszcza do hamowania namnażania komórek nowotworowych, korzystnie w ramach terapii przeciwnowotworowej. W przypadku leczenia chłoniaka za pomocą A3RAg, hamowanie namnażania tych komórek było wyraźniej zaznaczone niż w przypadku leczenia adenozyną albo agonistami A1" lub A2", chociaż pewną aktywność obserwowano także w przypadku stosowania A2RAg (patrz na przykład fig. 5A). Te wyniki wskazują, że hamowanie namnażania komórek nowotworowych można przypisać głównie wiązaniu A3RAg z odpowiednim receptorem, lecz może być to naśladowane w pewnym stopniu przez A2RAg. Powyższe zaskakujące wyniki stanowią zatem nowe terapeutyczne rozwiązanie dla przyszłych przeciwnowotworowych leków cytostatycznych. Stwierdzono także, że A3RAg są ponadto silnymi środkami odpowiednimi do hamowania namnażania komórek nowotworowych innych niż komórki chłoniaka. na przykład komórki czerniaka albo raka okrężnicy (patrz na przykład fig. 6). Specjalista w tej dziedzinie wyraźnie może ocenić zaletę leczenia pacjenta za pomocą niespecyficznego leku przeciwnowotworowego zdolnego do hamowania wzrostu nieprawidłowo dzielących się komórek, a jednocześnie zdolnego do odnawiania układu odpornościowego u pacjenta drogą indukowania namnażania komórek szpiku kostnego. Na fig. 7A-7B przedstawiono na przykład zróżnicowane działania A3RAg. W tym szczególnym przypadku oceniano wpływ IB-MECA na komórki nowotworowe i normalne. Ponadto wyniki te wykazały wyraźnie na bardziej większy efekt uzyskany dla A3RAg w porównaniu z adenozyną. Działanie terapeutyczne A3RAg zostało zniesione przez antagonistę receptora A3, MRS Badania in vivo potwierdziły wyniki uzyskane in vitro, które wykazały chemochronny wpływ A3RAg na myszy, które leczono jednocześnie za pomocą A3RAg i za pomocą środka cytotoksycznego, w porównaniu z myszami leczonymi tylko za pomocą leku cytotoksycznego (patrz na przykład fig. 8). Ponadto obserwowano spadek liczby ognisk u myszy leczonych za pomocą A3RAg, co wskazuje na chemoterapeutyczną aktywność A3RAg (patrz na przykład fig. 9). Na fig. 10A-10B oraz na fig. 19A i 19B pokazano na przykład, że myszy mające nowotwór, leczone tylko lekiem cytotoksycznym, wykazywały spadek liczby leukocytów i krwinek białych obojętnochłonnych w krwi obwodowej, natomiast podawanie A3RAg po chemoterapii dawało przywrócenie całkowitej liczby białych krwinek, co daje wzrost procentowego udziału krwinek białych obojętnochłonnych.

9 PL B1 9 Zatem można wnioskować, że A3RAg ma podwójną funkcję terapeutyczną ponieważ działa zarówno jako środek terapeutyczny, jak i jako środek chemochronny. Jest oczywiste, że zastosowanie obu aktywności A3RAg w leczeniu jest także objęte zakresem niniejszego wynalazku. Zawsze kompozycje farmaceutyczne według wynalazku, podaje się i dawkuje zgodnie z dobrą praktyką medyczną biorąc pod uwagę stan kliniczny indywidualnego pacjenta, miejsce i sposób podawania, harmonogram podawania, wiek pacjenta, płeć, masę ciała i inne czynniki znane lekarzom. Kompozycję według wynalazku można podawać w różny sposób. Kompozycję można podawać doustnie, podskórnie albo pozajelitowo, włącznie z podawaniem dożylnym, dotętniczym, domięśniowym, dootrzewnowym albo podawaniem do nosa, jak również techniką dooponową i infuzyjną znaną specjaliście w tej dziedzinie. Jak wiadomo, przebieg leczenia u ludzi jest zwykle dłuższy niż u zwierząt, na przykład myszy, jak podano tu przykładowo. Leczenie trwa proporcjonalnie do długości procesu chorobowego i skuteczności środka czynnego. Reżim terapeutyczny polega na pojedynczych albo wielokrotnych dawkach w ciągu okresu kilku dni albo dłużej. Leczenie na ogół trwa odpowiednio do przebiegu procesu chorobowego, zależy od skuteczności środka czynnego i leczonego pacjenta. Gdy kompozycje według niniejszego wynalazku podaje się pozajelitowo, to na ogół przygotowywane są w postaci dawki jednostkowej do iniekcji (roztwór, zawiesina, emulsja). Kompozycja farmaceutyczna odpowiednia do iniekcji obejmuje sterylne roztwory wodne albo dyspersje oraz sterylne proszki do zawieszenia lub rozpuszczenia do postaci sterylnych roztworów albo zawiesin do iniekcji. Stosowany nośnik może być rozpuszczalnikiem, ośrodkiem dyspergującym zawierającym na przykład wodę, etanol, poliol (na przykład glicerynę, glikol propylenowy, lipidowy poliglikol etylenowy, itp.), lub ich odpowiednie mieszaniny i oleje roślinne. Jako układy rozpuszczalnikowe dla składnika czynnego można stosować czasami nośniki niewodne, takie jak olej z nasion bawełny, olej sezamowy, oliwę, olej sojowy, olej kukurydziany, olej słonecznikowy albo olej z orzechów ziemnych i ester, taki jak mirystynian izopropylu. Poza tym można dodawać różne dodatki, które zwiększają trwałość, sterylność i właściwości izotoniczne kompozycji, obejmujące przeciwbakteryjne środki konserwujące, przeciwutleniacze, środki chelatujące i bufory. Zapobieganie działaniu drobnoustrojów można zapewnić za pomocą różnych środków przeciwbakteryjnych i przeciwgrzybowych, na przykład parabenów, chlorobutanolu, fenolu, kwasu sorbowego, itp. W przypadku podawania doustnego składnik czynny można przygotować w postaci tabletek, przy czym użyteczne są zawiesiny, roztwory, emulsje, kapsułki, proszki, syropy, itp. i można je otrzymać technikami dobrze znanymi farmaceutom. O ile opis przedstawia szczegółowo tylko kilka specyficznych rozwiązań według wynalazku, to specjaliści w tej dziedzinie będą rozumieć, że wynalazek nie jest do nich ograniczony i możliwe są inne zmiany postaci i szczegółów bez odchodzenia od zakresu i idei ujawnionego tu wynalazku. Aby ułatwić zrozumienie idei wynalazku i przedstawić, jego realizację w praktyce, poniżej zostanie on opisany na przykładzie korzystnego rozwiązania, w odniesieniu do załączonego rysunku. Wynalazek został przedstawiony na rysunku, na którym Fig. 1 przedstawia wykres słupkowy pokazujący wyniki testu in vitro, w którym badano wpływ na wytwarzanie G-CSF adenozyny (Ad), DPCPX (A1RAn), CPA i CCPA (obydwa A1RAg) albo IB-MECA (A3RAg). Jako kontrolę wykorzystano hodowle traktowane modyfikowanym RPMI. Wyniki przedstawiono w procentach kontroli (kontrola = 100%). Fig. 2 przedstawia wykres słupkowy pokazujący wyniki uzyskane w teście wbudowywania [ 3 H]-tymidyny, w którym badano pobudzanie namnażania komórek szpiku kostnego za pomocą adenozyny, CPA albo IB-MECA z ((+) G-CSF Ab -kolumny jasne) albo bez przeciwciał względem G-CSF ((-) G-CSF Ab kolumny ciemne). Wyniki wskazują na efekt neutralizacji przeciwciał anty-g-csf. Wyniki przedstawiono w postaci procentowego wzrostu w porównaniu z kontrolą (kontrola = 0%). Fig. 3A i 3B przedstawiają dwa wykresy słupkowe pokazujące wyniki uzyskane w teście wbudowywania [ 3 H]-tymidyny, w którym namnażanie komórek szpiku kostnego badano w obecności adenozyny, agonistów receptorów adenozyny (fig. 3A) albo adenozyny w połączeniu z antagonistami receptorów adenozyny (fig. 3B). Badanymi agonistami receptorów (fig. 3A) są CPA (A1RAg) i IB-MECA (A3RAg), a badanymi antagonistami receptorów (Fig. 3B) były DPCPX (A1RAn), DMPX (A2RAn) i MRS (A3RAn). Wyniki przedstawiono w postaci procentowego wzrostu wprowadzenia tymidyny w porównaniu z kontrolą (kontrola = 0%).

10 10 PL B1 Na fig. 4 przedstawiono wykres słupkowy pokazujący wyniki doświadczenia in vitro, w którym badano namnażanie komórek szpiku kostnego przy trzech różnych stężeniach IB-MECA (0,01 μm, 0,1 μm i 1,0 μm). Te wyniki przedstawiono w postaci procentowego wzrostu wbudowywania [ 3 H]-tymidyny w porównaniu z kontrolą (kontrola = 0%). Liczby pod słupkami oznaczają stężenia IB-MECA (μm). Na fig. 5A i 5B przedstawiono wykresy słupkowe pokazujące wyniki dwóch doświadczeń, przeprowadzonych in vitro i opartych na testach zliczania komórek, w których badano efekt wpływu adenozyny i jej związków antagonistycznych na namnażanie komórek chłoniaka (Nb2-11C). W doświadczeniu przedstawionym na fig. 5A badano wpływ adenozyny, CPA (A1RAg), DMPA (A2RAg) albo IB-MECA (A3RAg) na namnażanie komórek chłoniaka. W doświadczeniu przedstawionym na fig. 5B badano wpływ adenozyny, DPCPX (A1RAg), DPMX (A2RAn) albo MRS-1220 (A3RAn) na wzrost komórek chłoniaka, przy czym jako kontrola służyły komórki chłoniaka potraktowane RPMI. Wyniki przedstawiono w postaci procentowego zahamowania wzrostu w porównaniu z kontrolą (kontrola = 0%). Na fig. 6 przedstawiono wykres słupkowy pokazujący wyniki test in vitro, w którym badano zahamowanie namnażania różnych rodzajów komórek nowotworowych (czerniak B16, rak okrężnicy HTC-116, chłoniak Nb2-11C) po dodaniu A3RAg, IB-MECA, przy czym jako kontrola służyły komórki traktowane RPMI. Wyniki przedstawiono w postaci procentu zahamowania namnażania w porównaniu z kontrolą (kontrola = 0%). Na fig. 7A i 7B przedstawiono wykresy słupkowe pokazujące wyniki testu in vitro, w którym badano wpływ adenozyny albo A3RAg, IB-MECA, na namnażanie komórek nowotworowych (chłoniak Nb2-11C, fig. 7A) albo komórek szpiku kostnego (fig. 7B). Wyniki na fig. 7A i 7B przedstawiono odpowiednio w postaci procentowego zahamowania wzrostu i procentowego pobudzenia w porównaniu z kontrolą (kontrola = 0%). Na fig. 8 przedstawiono wykres słupkowy pokazujący wyniki doświadczenia in vivo, w którym badano liczbę białych krwinek w krwi obwodowej (WBC) po 5 i 9 dniach leczenia za pomocą leku chemoterapeutycznego (cyklofosfamid). Cyklofosfamid podawano albo samodzielnie (szare kolumny) albo podawano doustnie w połączeniu z IB-MECA (w 1 ml roztworu) codziennie, rozpoczynając po 24 godzinach po podaniu leku chemoterapeutycznego, przy czym jako kontrola służyły myszy traktowane PBS. Poziom WBC (poziomy WBC) podano w procentach w porównaniu z kontrolą (kontrola =0%). Na fig. 9 przedstawiono wykres słupkowy pokazujący wyniki doświadczenia in vivo, w którym liczba ognisk czerniaka rozwiniętych u myszy po wszczepieniu myszom 2x10 5 komórek czerniaka, leczonych chemoterapeutycznie za pomocą cyklofosfamidu (CHEMO), IB-MECA, A3SRAg w połączeniu z IB- MECA i CHEMO albo za pomocą buforowanego fosforanem roztworu soli (PBS), który służył jako kontrola. Na fig. 10A i 10B przedstawiono wykresy słupkowe pokazujące wyniki doświadczenia in vivo wykazującego aktywność chemoterapeutyczną IB-MECA. Przedstawiono poziom białych krwinek (WBC, fig. 10A) i białych krwinek obojętnochłonnych (fig. 10B) w zależności od czasu (godziny po podaniu) chemoterapeutycznego leku cyklofosfamidu (CHEMO) z (CHEMO + IB-MECA) i bez IB-MECA. Liczbę białych krwinek obojętnochłonnych pokazano w procentach w porównaniu z kontrolą (kontrola =0%). Na fig. 11 przedstawiono masę nagiej myszy po 7, 10 i 14 dniach po rozpoczęciu leczenia (podawanie 5-FU, C1-IB-MECA albo w połączeniu 5-FU i C1-IB-MECA) jako % kontroli (nie leczona mysz = 100%). Leczenie polegało na podawaniu 5-FU (ciemne kolumny), podawaniu 5-FU w połączeniu z C1-IB-MECA (A3RAg) - szare kolumny) i podawaniu samego C1-IB-MECA (białe kolumny). Na fig. 12A i 12B przedstawiono wyniki doświadczenia, w którym badano wpływ C1-IB-MECA na zmniejszenie indukowanego doksorubicyną toksycznego wpływu na szpik. Doświadczenie prowadzono na myszach ICR. Na fig. 12A przedstawiono liczbę krwinek białych (WBC), natomiast na fig. 12B przedstawiono liczbę jądrzastych komórek szpiku kostnego. Na fig. 12A wyniki przedstawiono dla dwóch różnych trybów leczenia w czterech różnych okresach, przy czym poziom kontroli pokazano linią przerywaną a na fig. 12B wyniki przy dwóch różnych okresach są pokazane z poziomem kontroli przedstawionym słupkiem po lewej stronie. Na fig. 13 przedstawiono wpływ przeciwciał anty-g-csf na liczbę białych krwinek (WBC) u myszy kontrolnych, myszy leczonych lekiem chemoterapeutycznym i myszy leczonych lekiem chemoterapeutycznym i C1-IB-MECA, podawanych doustnie (6 μg/kg masy ciała, w 0,2 ml PBS). Liczbę WBC po zastrzyku przeciwciał anty-g-csf przedstawiono kolumnami o jasnym zabarwieniu. Wszystkie wyniki przedstawiono jako procent kontroli (kontrola = 100%).

11 PL B1 11 Na fig. 14 przedstawiono w zależności od czasu wielkość nowotworu, który rozwinął się u nagich myszy w wyniku wstrzyknięcia ludzkich komórek raka okrężnicy HCT-116 w grupie kontrolnej i w grupie leczonej (podawanie doustne C1-IB-MECA). Na fig. 15 przedstawiono wyniki doświadczeń podobnych do doświadczeń przedstawionych na fig. 14, w których mierzono wielkość nowotworu rozwiniętego u nagich myszy po wstrzyknięciu ludzkich komórek raka okrężnicy HCT-116, przy czym badano cztery grupy: grupę kontrolną grupę otrzymującą lek chemoterapeutyczny 5-FU, grupę, której podano doustnie C1-IB-MECA i grupę otrzymującą 5-FU i C1-IB-MECA. Na fig. 16 przedstawiono wykres słupkowy pokazujący wielkość nowotworu w 30 dniu w doświadczeniu przedstawionym na fig. 15. Na fig. 17 przedstawiono wykres słupkowy pokazujący wyniki doświadczenia, w którym rozrost komórek szpiku kostnego indukowany za pomocą C1-IB-MECA mierzono przy różnych stężeniach (0,05 μg/ml i 0,5 μg/ml) przeciwciał anty-g-csf (0 - brak przeciwciał). Namnażanie komórek wyznaczano testem wbudowania [ 3 H]-tymidyny. Na fig. 18 przedstawiono wyniki doświadczenia in vitro, w którym mierzono namnażanie komórek czerniaka B-16 albo szpiku kostnego. Stopień namnożenia wyznaczano testem wbudowania [ 3 H]-tymidyny. Komórki wystawiono na działanie stężeń 0,01 μm i 0,1 μm C1-IB-MECA w połączeniu z A3RAg, MRS-1523 (białe kolumny) i bez (ciemne kolumny). Wyniki przedstawiono jako procent kontroli (kontrola = 100%). Na fig. 19A i 19B przedstawiono wyniki doświadczenia podobnego do doświadczenia pokazanego odpowiednio na fig. 10A i 10B, przeprowadzonego z C1-IB-MECA. Na fig. 20 przedstawiono wyniki doświadczenia in vitro, w którym mierzono namnażanie komórek szpiku kostnego, indukowane przez IB-MECA albo C1-IB-MECA. Te dwa A3RAg dodawano do hodowli komórek szpiku kostnego w stężeniu albo 1 nm albo 10 nm z A3RAn, MRS-1523 o stężeniu 10 nm (szare kolumny -,,(+)-agonisty") albo bez (ciemne kolumny - (-)-antagonisty"). Namnażanie wyznaczano testem wbudowania [ 3 H]-tymidyny. Wyniki podano jako procent stymulacji względem kontroli (komórki szpiku kostnego nie indukowane, kontrola = 0%). Wyniki doświadczeń Komórki nowotworowe Stosowano mysie linie komórkowe (czerniaka B-16 i chłoniaka szczura Nb2 11c). Komórki czerniaka B-16 otrzymano z American Type Tissue Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland. Komórki chłoniaka szczura Nb2-11C [Pines M. i Gertler A. J. of Cellular Biochem., 37: (1988)] zostały dostarczone dzięki uprzejmości dr A. Gertlera z Uniwersytetu Hebrajskiego, Izrael. Stosowano także komórki raka okrężnicy (HCT-116) i otrzymano je z ATCC. Komórki utrzymywano rutynowo w pożywce RPMI zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS, Biological Industries, Beit Haemek, Izrael). Dwa razy w tygodniu komórki przenoszono do świeżo przygotowanego podłoża. Komórki normalne Stosowano komórki szpiku kostnego pochodzące z kości udowej myszy C57BL/6J, przy czym komórki przygotowano w poprzednio opisany sposób [17]. Leki/związki Stosowano następujące leki: adenozynę, związki agonistyczne receptora A1 adenozyny: CCPA [2-chloro-N 6 -cyklopentylo-adenozynę], CPA (N-cyklopentyloadenozynę], A1RAn: DPCPX (1,3-dipropylo-8-cyklopentyloksantyna), związek agonistyczny receptora A2 adenozyny: DMPA (N 6 -[2-(3,5-dimetoksyfenylo)-2-(2-metylofenylo)-etylo]adenozynę, A2RAn: DMPX (3,7-dimetylo-1-propargiloksantan), A3RAg: IB-MECA (1-dezoksy-1-{6-[({3-jodofenylo}metylo)-amino]-9H-purynylo-9}-N-metylo-β-D- -rybofuranuronoamid)), CE-IB-MECA (2-chloro-N 6-3-jodobenzylo)adenozyno-5'-N-metylouronoamid i związek antagonistyczny receptora A3 adenozyny: MRS-1523 (5-propylo-2-etylo-4-propyio-3-etylosulfanylokarbonylo)-6-fenylopirydyno-5-karboksylan) i MRS-1200 (9-chloro-2-(2-furanylo)-5-[(fenyloacetylo)amino][1,2,4]-triazolo[1,5-c]-chinazolina). Stosowano przeciwciała przeciwko mysiemu G-CSF (surowica odpornościowa królika oczyszczona drogą chromatografii z białkiem A, Cytolab LTD, Weizmann Institute of Science, Izrael). Cyklofosfamid zakupiono w firmie Taro Pharmaceutical Industries Ltd., Haifa, Izrael.

12 12 PL B1 Myszy Wykorzystywano samiczki myszy ICR, C57BL/6J albo myszy pochodzące od BALB/C, w wieku 3 miesięcy, o średniej masie 25 g. Myszy zakupiono w firmie Harlan Laboratories, Jerozolima, Izrael, przy czym myszom zapewniano standardową dietę w postaci pastylek i wodę miejską. P r z y k ł a d 1: Wpływ adenozyny, antagonistów i agonistów receptora adenozyny na wytwarzanie G-CSF i namnażanie komórek szpiku kostnego W celu zbadania przypuszczenia, że adenozyna działa in vivo przez pobudzanie wytwarzania G-CSF, normalne komórki hodowano w obecności adenozyny i związków agonistycznych albo antagonistycznych adenozyny. W tym celu komórki szpiku kostnego otrzymane z kości udowej myszy C57BL/6J albo ICR rozdrabniano najpierw przepuszczając je przez igłę 25G. Następnie komórki (3 x 10 5 komórek/studzienkę, 96-dołkowe płytki mikrotitracyjne) poddawano inkubacji w podłożu RPMI zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w obecności adenozyny (25 μm). Adenozynę albo związki antagonistyczne względem receptorów A1 i A3 adenozyny - CPA (A1RAg, 0,01 μm), CCPA (A1RAg, 0,01 μm) albo IB-MECA (A3RAg, 0,01 μm) dodawano do hodowli komórek szpiku kostnego w nieobecności adenozyny, antagonistę receptora A1 adenozyny, DPCPX (0,1 μm), dodawano do hodowli komórek szpiku kostnego w obecności adenozyny (25 μm). Hodowle zawierające komórki zawieszone w podłożu RPMI i 5% FBS służyły jako kontrola powyższego doświadczenia. Do oceny namnażania komórek szpiku kostnego stosowano test wbudowania [ 3 H]-tymidyny. W tym celu po 30 godzinach inkubacji do każdego wgłębienia dodawano 1 μci [ 3 H]-tymidyny. Ogółem po 48 godzinach inkubacji komórki zbierano i wbudowanie [ 3 H]-tymidyny oznaczano za pomocą cieczowego licznika scyntylacyjnego LKB (LKB, Piscataway, NJ, USA). Wyniki przedstawiono na fig. 1, która pokazuje, że A1RAg albo A3RAg mają wpływ na wytwarzanie G-CSF, podobny do wpływu uzyskanego w przypadku adenozyny. W celu potwierdzenia, że adenozyna i jej związki agonistyczne działają poprzez pobudzanie wytwarzania G-CSF, przeprowadzono dalsze testy, w których przeciwciała anty-g-csf (62,5 ng/ml) dodawano do hodowli komórek szpiku kostnego w obecności adenozyny (25 μm), CPA (0,01 μm) albo IB-MECA (0,01 μm). Namnażanie komórek oceniano w sposób opisany wyżej. Wyniki tego doświadczenia przedstawiono na fig. 2, która pokazuje, że przeciwciała przeciwko G-CSF hamowały pobudzający wpływ adenozyny i jej agonistów na namnażanie komórek szpiku kostnego. Te wyniki sugerują że przynajmniej niektóre aktywności związane z oddziaływaniem z receptorami adenozyny mają miejsce za pośrednictwem indukcji G-CSF. Oceniano wpływ łączny na namnażanie komórek szpiku kostnego, gdy stosuje się połączenie A1RAg i A3RAg (CPA i IB-MECA). Próbę prowadzono w sposób podobny do próby z doświadczenia, którego wyniki pokazano na Fig. 1. Komórki, po rozdrobnieniu, poddawano inkubacji w obecności albo adenozyny (25 μm), CPA (0,01 μm), IB-MECA (0,01 μm) albo połączenia IB-MECA i CPA (każde o stężeniu 0,01 μm) i traktowano dalej, jak opisano wyżej. Wyniki przedstawiono na fig. 3A, która pokazuje zwiększony łączny wpływ IB-MECA i CPA. W celu porównania wpływu związków antagonistycznych receptora adenozyny na namnażanie komórek szpiku kostnego, postępując według tej samej, opisanej wyżej metodologii, komórki poddawano inkubacji z samą adenozyną albo w połączeniu z DPMX (A2RAn), DPCPX (A1RAn), MRS-1220 (A3RAn) albo w połączeniu z DPCPX i MRS-1220, a wyniki przedstawiono na fig. 3B. Jak widać, blokowanie receptora A2 przez DPMX dawało także w wyniku zwiększone namnażanie komórek szpiku kostnego, które nawet przewyższało namnażanie w przypadku podania samej adenozyny. Dla porównania namnażanie z DPCPX albo MRS-1220 powodowało obniżenie namnażania o około 50% w porównaniu z samą adenozyną natomiast namnażanie było również hamowane przez DPCPX w połączeniu z MRS Komórki potraktowane wstępnie w sposób opisany wyżej, poddawano inkubacji IB-MECA o różnych stężeniach (1 μm, 0,1 μm albo 0,01 μm). Procentowe pobudzenie oznaczano za pomocą próby wprowadzania [ 3 H]-tymidyny, a wyniki przedstawiono na fig. 3, która pokazuje, że IB-MECA pobudza namnażanie szpiku kostnego w zależności od dawki. P r z y k ł a d 2: Modulacja wzrostu komórek nowotworowych przez adenozynę i związki agonistyczne adenozyny Komórki chłoniaka szczura Nb2-11C (1,2 x 10 4 komórek/ml) poddawano inkubacji w ciągu 48 godzin na szalkach mikrotitracyjnych z 96 dołkami w 1 ml podłoża RPMI zawierającym 5% płodowej surowicy

13 PL B1 13 bydlęcej. Następnie dodano albo 25 μm adenozynę, 0,01 μm związki agonistyczne receptora adenozyny (CPA, A1RAg, DPMA, A2RAg albo IB-MECA, A3RAg) albo 0,1 μm związki antagonistyczne receptora adenozyny (DPCPX, A1RAn, A2RAn albo MRS-1220, ASRAn) w połączeniu z adenozyną (25 μm). Hodowle zawierające komórki zawieszone w podłożu RPMI z 5% FBS służyły jako kontrole dla powyższego doświadczenia. Stopień namnażania komórek wyznaczano testem zliczania komórek. Wyniki przedstawiono na fig. 5A i 5B i wykazano hamowanie porównywalne z hamowaniem w wyniku podania adenozyny. Jak widać, namnażanie komórek Nb2-11C było wyraźnie hamowane w wyniku inkubacji z IB-MECA, A3RAg. Żadnego zahamowania wzrostu nie obserwowano w obecności CPA, A1RAg, a niższe zahamowanie wzrostu obserwowano w obecności DPMA, A2RAn. Fakt, że CPA nie hamowała namnażania tych dwóch typów komórek nowotworowych sugerował, że receptor A1 adenozyny nie bierze udziału w tej aktywności. Aktywność inhibicyjna zarówno DMPA, jak i IB- MECA, sugeruje jednak rolę receptorów odpowiednio A2 i A3 adenozyny w tym działaniu hamującym. Widać ponadto, że DPCPX, należący do A1RAn, nie miał w zasadzie żadnego wpływu, natomiast w obecności MRS-1220, będący A3RAn, stwierdzono niemal całkowite zniesienie wpływu adenozyny na namnażanie komórek Nb2-11C. Mniejszy, chociaż jeszcze wciąż znaczący efekt obserwowano dla DMPX, będący A2RAn. Te odkrycia prowadzą do wniosku, że wzrost komórek nowotworowych może być skutecznie hamowany przez A3RAg albo A2RAn. W taki sam sposób jak opisano wyżej, oceniano hamowanie przez A3RAg, IB-MECA, wzrostu czerniaka B-16, raka okrężnicy HCT-116 i chłoniaka Nb2-11C. Wyniki przedstawiono na fig. 6 w postaci procentów hamowania albo namnażania. P r z y k ł a d 3: Związki agonistyczne receptora A3 adenozyny wywierają różny wpływ na komórki nowotworowe i normalne Wpływ adenozyny, związków A3RAn i A3RAg na wzrost komórek nowotworowych badano postępując według opisanej wyżej procedury doświadczalnej. Pokrótce, komórki chłoniaka Nb2-11C i szpiku kostnego poddawano inkubacji w obecności albo adenozyny albo IB-MECA. Podwójną aktywność A3RAg hamowania wzrostu komórek nowotworowych i stymulowania jednocześnie namnażanie komórek szpiku kostnego przedstawiono na fig. 7A i 7B. P r z y k ł a d 4: Badania in vivo 40 myszy C57BL6/J podzielono na 4 grupy, z których każdą traktowano według jednego z następujących protokołów: 1. Grupa kontrolna: codzienny dootrzewnowy zastrzyk 1 ml/mysz roztworu soli, od dnia wszczepienia nowotworu do dnia uśmiercenia myszy. 2. Grupa chemoterapii: jeden dootrzewnowy zastrzyk cyklofosfamidu 24 godziny po wszczepieniu komórek nowotworowych i codzienny dootrzewnowy zastrzyk 1 ml/mysz roztworu soli od dnia wszczepienia nowotworu do uśmiercenia myszy. 3. Grupa otrzymująca związek agonistyczny receptora A3 adenozyny (A3RAg): codzienne doustne podawanie IB-MECA od dnia wszczepienia nowotworu aż do dnia uśmiercenia myszy. 4. Grupa A3RAg + chemoterapia: jeden dootrzewnowy zastrzyk cyklofosfamidu 24 godziny po wszczepieniu komórek nowotworowych i codzienne doustne podawanie IB-MECA w ilości 3 μg/kg masy ciała. W 5 i 9 dniu myszy skrwawiano z żyły ogonowej i otrzymywano próbki krwi w celu oznaczenia liczby białych krwinek (WCB), wyniki przedstawiono na fig. 8. Ponadto, po 18 dniach myszy uśmiercano i zliczano ogniska nowotworu czerniaka w płucach, wyniki przedstawiono na fig. 9. Dalsze doświadczenie prowadzono w celu oceny ochronnego efektu A3RAg przy chemoterapii. Myszy traktowano cyklofosfamidem (50 mg/kg masy ciała w 0,3 ml PBS). Po 48 i 72 godzinach od podania leku cytotoksycznego myszom wstrzykiwano dootrzewnowo adenozynę (25 μg/kg masy ciała) albo IB-MECA (3 albo 6 μg/kg masy ciała w 0,2 ml PBS). Badano liczbę białych krwinek (WCB) i białych krwinek obojętnochłonnych, wyniki przedstawiono odpowiednio na fig. 10A (WBC) i 10B (krwinki białe obojętnochłonne). Jak widać, myszy traktowane cyklofosfamidem wykazywały jedynie spadek w krwi obwodowej liczby leukocytów i białych krwinek obojętnochłonnych, w porównaniu z grupą traktowaną tylko IB- MECA. Gdy podawano adenozynę albo IB-MECA, to całkowita liczba białych krwinek w 1 mm 3 ulegała odtworzeniu, przy czym IB-MECA wykazywał znaczny wpływ prowadząc od pełnego wyzdrowienia po 168 godzinach (7 dniach).