(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2014/07 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. C12N 5/0775 ( ) C12N 5/071 ( ) A61K 35/28 ( ) A61K 35/44 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Powstawanie naczyń krwionośnych indukowane okołonaczyniowymi mezenchymalnymi komórkami prekursorowymi (30) Pierwszeństwo: AU P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2006/02 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2014/09 (73) Uprawniony z patentu: Mesoblast, Inc., New York, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 STAN GRONTHOS, Colonel Light Gardens, AU ANDREW ZANNETTINO, Highbury, AU (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Alicja Rumpel RUMPEL SP. K. Al. Śmigłego-Rydza 29 m Łódź Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 1 POWSTAWANIE NACZYŃ KRWIONOŚNYCH INDUKOWANE OKOŁONACZYNIOWYMI MEZENCHYMALNYMI KOMÓRKAMI PREKURSOROWYMI. Opis DZIEDZINA WYNALAZKU [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy mezenchymalnych komórek prekursorowych, niosących okołonaczyniowy marker i zdolnych do indukcji tworzenia naczyń krwionośnych, składu substancji zawierającego takie komórki prekursorowe i sposobu indukcji naczyń krwionośnych. Wynalazek odnosi się również do leczenia chorób układu sercowo-naczyniowego, w szczególności niedokrwienia. PODSTAWY WYNALAZKU [0002] Choroby układu naczyniowego stanowią poważny problem zdrowotny, zwłaszcza w krajach zachodnich. Choroby układu naczyniowego obejmują choroby serca, chorobę naczyń obwodowych i choroby naczyniowomózgowe. [0003] Największa część tych chorób wynika z braku dopływu krwi do odpowiednich tkanek, które w ten sposób są przewlekle lub gwałtownie pozbawione potrzebnego poziomów tlenu i składników odżywczych. Takie okoliczności powodują zazwyczaj niedokrwienia, w przypadku których naczynie krwionośne zostaje zablokowane przez nagromadzenie się np. blaszek miażdżycowych lub przez fizyczne uszkodzenie naczynia krwionośnego, przez zablokowanie lub zwężenie. [0004] Choroby serca są postrzegane jako czołowe choroby naczyń krwionośnych. Spośród około 60 milionów dorosłych pacjentów z chorobą sercowo-naczyniową w Stanach Zjednoczonych Ameryki (1995) tylko około 11 milionów miało chorobę niedokrwienną serca. Dlatego też inne choroby układu naczyniowego dotykają większą liczbę dorosłych. [0005] Stosunkowo często spotykana choroba mózgowo-naczyniowa może objawiać się udarem mózgu, gdzie niedrożność może prowadzić do ostrego ataku. Stopniowe zmniejszanie dopływu może również prowadzić do

3 2 zmniejszenia zdolności funkcjonowania mózgu i uważa się, że choroby te mogą być związane z początkiem niektórych demencji. [0006] Choroba tętnic obwodowych jest związana z szeregiem stanów chorobowych, na przykład z powikłaniami cukrzycy, w których typowe niedostatki mikrokrążenia obniżają dopływ tlenu i składników odżywczych do oddalonych części ciała, zwłaszcza nóg i stóp. [0007] Innym przykładem zmniejszonego miejscowego dostarczania tlenu i składników odżywczych może być leczenie ciężkich ran, w tym poważnych poparzeń lub ran przewlekłych, takich jak odleżyny. Przewlekłe rany są trudne do wyleczenia, częściowo z powodu niewystarczającego dostarczania związków odżywczych i leczniczych. [0008] Pogarszać może się również bliznowacenie, ponieważ proces gojenia często wymaga tworzenia się bardzo włóknistej tkanki przy jednoczesnym minimalnym tworzeniu naczyń krwionośnych. Bliznowacenie jest związane z trudnościami z uzyskaniem odpowiedniego unaczynienia w sytuacji, gdy proteza lub inny implant jest umieszczony operacyjnie w tkance ludzkiej. Niedostateczny dopływ krwi do granicy między implantem i otaczającą tkanką może prowadzić do powikłań medycznych i martwicy. Ma to znacznie większe znaczenie w przypadku, gdy przeznaczeniem implantu jest długoterminowe powolne uwalnianie na przykład środka farmaceutycznego. [0009] Leczenie niedokrwienia mięśnia sercowego jest prawdopodobnie najbardziej zaawansowanym sposobem leczenia chorób naczyniowych. Obecne formy leczenia obejmują terapie farmakologiczne, operacyjne pomostowanie aortalno-wieńcowe i metodę przezskórnej rewaskularyzacji za pomocą technik takich jak angioplastyka balonowa. Standardowa terapia farmakologiczna ma na celu zwiększenie dopływu krwi do mięśnia sercowego lub zmniejszenie zapotrzebowania mięśnia sercowego na tlen i substancje odżywcze. Zwiększony dopływ krwi do mięśnia sercowego przez rozluźnienie mięśni gładkich uzyskuje się podawanie środków takich jak blokery kanałów wapnia lub nitroglicerynę. Zmniejszenie zapotrzebowanie mięśnia sercowego na tlen i składniki odżywcze jest osiągnięte przez środki zmniejszające hemodynamiczne przeciążenie serca, jak środki rozszerzające

4 3 naczynia tętnicze, lub środki zmniejszające kurczliwości serca w odpowiedzi na dane przeciążenie hemodynamiczne, jak antagoniści receptora adrenergicznego typu β. Leczenie chirurgiczne choroby niedokrwiennej serca opiera się na odgałęzieniu odcinków chorych tętnic poprzez strategicznie rozmieszczenie pomostów naczyniowych. Przezskórna neowaskularyzacja opiera się na zastosowaniu cewnika w celu zmniejszenia przewężenie w chorych tętnicach wieńcowych. Wszystkie te strategie są stosowane w celu zmniejszenia ilości lub wyeliminowania przypadków niedokrwienia, ale wszystkie mają różne ograniczenia, w szczególności leczenie farmakologiczne może powodować poważne efekty uboczne. [0010] Wstępne doniesienia opisują rozwój nowych naczyń w sercu przez bezpośrednie wstrzyknięcie angiogenicznych białek lub peptydów. Kilku członków rodziny czynnika wzrostu fibroblastów (FGF) (tj. kwaśny czynnik wzrostu fibroblastów, afgf; zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów, bfgf; czynnik wzrostu fibroblastów 5, FGF -5 i innych) zostało wskazanych jako biorących udział w regulacji angiogenezy podczas wzrostu i rozwoju. Hammond i in. w opisie US zaproponowali terapię genową jako sposób podawania tych związków angiogennych. [0011] Innym proponowanym sposobem indukcji tworzenia nowych naczyń krwionośnych w leczeniu schorzeń naczyniowych jest podawanie komórek macierzystych, które mogą się różnicować i doprowadzać do powstania komórek potrzebnych do formowania naczyń krwionośnych. Problemem związanym z takim podejściem jest fakt, że nie jest znane, które komórki prekursorowe są odpowiedzialne za powstawanie naczyń krwionośnych, lub czy rzeczywiście więcej niż jeden typ komórek jest potrzebny, lub czy potrzebne są inne promotory angiogenezy. [0012] Jedyna próba, ujawniona w opisie patentowym US (Isner i in.), wynikała z izolowania komórki progenitorowej śródbłonka i odkryciu, że komórki takie odgrywają ważną rolę w tworzeniu naczyń krwionośnych. [0013] Liczne próby izolowania i wzbogacania mezenchymalnych komórek prekursorowych zostały przeprowadzone ze względu na możliwość medycznego stosowania tych komórek. Pittinger i in. (1999) wykazują

5 4 namnażanie komórek klonogennych ze szpiku kostnego i opisują preparat namnożonych mezenchymalnych komórek macierzystych. Nowszy przykład takiego sposobu, zapewniającego stosunkowo wysoką wydajność ze szpiku kostnego został ujawniony w publikacji WO01/04268 przez Simmonsa i in. Żadne z tych opisanych mezenchymalnych komórek nie zostały uznane za zdolne do regeneracji linii komórek naczyniowych, które mogą prowadzić do tworzenia się naczyń krwionośnych. [0014] Jak dotąd brak jest przykładów izolowanych mezenchymalnych komórek prekursorowych, zdolnych do tworzenia tkanki naczyniowej w warunkach in vivo. SKRÓT OPISU WYNALAZKU [0015] W pierwszym aspekcie wynalazek dotyczy zastosowania skutecznej ilości populacji komórek do wytwarzania leku do leczenia niedokrwienia u pacjenta, przy czym populacja komórek pochodzi z jednojądrzastych komórek szpiku kostnego i jest wzbogacona w komórki, które wykazują ekspresję markera STRO-1, przy czym wspomniana populacja zawiera co najmniej 0.1% mezenchymalnych komórek prekursorowych (MPC), zdolnych do tworzenia CFU-F (jednostek tworzących kolonie- fibroblastów), przy czym wspomniane MPC są ujemne wobec markerów CD34, CD45 i glikoforyny-a. [0016] W drugim aspekcie wynalazek dotyczy populacji komórek do zastosowania w leczeniu niedokrwienia u pacjenta, przy czym populacja komórek pochodzi z jednojądrzastych komórek szpiku kostnego i jest wzbogacona w komórki, które wykazują ekspresję markera STRO-1, przy czym wspomniana populacja zawiera co najmniej 0.1% MPC, zdolnych do tworzenia CFU-F (jednostek tworzących kolonie-fibroblastów), przy czym wspomniane MPC są ujemne wobec markerów CD34, CD45 i glikoforyny-a. [0017] W trzecim aspekcie wynalazek dotyczy zastosowania populacji komórek do wytwarzania leku do leczenia choroby sercowo-naczyniowej, obejmującej chorobę niedokrwienną serca, chorobę tętnicy wieńcowej, ostry zawał mięśnia sercowego, zastoinową niewydolność serca, kardiomiopatię lub anginę u pacjenta, przy czym populacja komórek pochodzi z jednojądrzastych komórek szpiku kostnego i jest wzbogacona w komórki,

6 5 które wykazują ekspresję markera STRO-1, przy czym wspomniana populacja zawiera co najmniej 0.1% MPC, zdolnych do tworzenia CFU-F (jednostek tworzących kolonie-fibroblastów), przy czym wspomniane MPC są ujemne wobec markerów CD34, CD45 i glikoforyny-a. [0018] W czwartym aspekcie wynalazek dotyczy zastosowania populacji komórek w leczeniu choroby sercowo-naczyniowej, obejmującej chorobę niedokrwienną serca, chorobę tętnicy wieńcowej, ostry zawał mięśnia sercowego, zastoinową niewydolność serca, kardiomiopatię lub anginę u pacjenta, przy czym populacja komórek pochodzi z jednojądrzastych komórek szpiku kostnego i jest wzbogacona w komórki, które wykazują ekspresję markera STRO-1, przy czym wspomniana populacja zawiera co najmniej 0.1% MPC, zdolnych do tworzenia CFU-F (jednostek tworzących kolonie-fibroblastów), przy czym wspomniane MPC są ujemne wobec markerów CD34, CD45 i glikoforyny-a. [0019] Niniejszy wynalazek wynika z odkrycia, że populacja mezenchmalnych komórek prekursorowych (MPC) jest obecna w niszy okołonaczyniowej. Doprowadziło to do wykazania, że zakres źródeł MPC typu tkankowego jest znacznie szerszy niż jedna tkanka, szpik kostny, jak ujawniono w WO01/ Niniejszy wynalazek wynika z dodatkowego ustalenia, że wzbogacona populacja MPC może być rozdzielona na dwie populacje, rozróżnione przez marker 3G5. MPC, które są dodatnie wobec 3G5 uważa się za szczególnie interesujące do zastosowania w neowaskularyzacji, chociaż wyraźnie są one również zdolne do różnicowania w inne typy tkanek. Dododatkowym wynikiem obecnego wynalazku jest fakt, że poziomy MPC występujące w korzystnie wzbogaconych populacjach wegług niniejszego wynalazku mogą prowadzić do odpowiedniej liczby komórek zaangażowanych, prowadzących do różnych typów tkanek. Dododatkowym wynikiem niniejszego wynalazku jest odkrycie, że pewne poziomy MPC są korzystne przy wprowadzaniu pacjentowi w celu wymiernej poprawy unaczynienia. Stwierdzono w szczególności, że poziom szacunkowo około 10 5 MPC jest wystarczający, aby zapewnić wymierną korzyść w postaci poprawy w niedokrwieniu mięśnia sercowego szczura.

7 6 Fakt ten stanowi punkt odniesienia, względem którego można liczbowo ocenić ilość MPC, wymaganą dla zapewnienia korzystnego efektu. Jest to również pierwsze doniesienie dotyczące korzyści dla serca przy podawaniu mezenchymalnych komórek prekursora do serca. [0020] Ujawniono również sposób indukcji tworzenia lub naprawy naczyń krwionośnych w tkance docelowej pacjenta,obejmujący etapy podawania pacjentowi skutecznej ilości wzbogaconej populacji okołonaczyniowych mezenchymalnych komórek macierzystych (MPC) w celu wywołania tworzenia nowych naczyń krwionośnych w tkance docelowej. [0021] Ujawniono również sposób naprawy uszkodzonej tkanki wymagającej naprawy u pacjenta, obejmujący: a) uzyskanie wzbogaconej populacji MPC, i b) zetknięcie się skutecznej ilości wzbogaconej populacji MPC z uszkodzoną tkanką tego pacjenta [0022] Ujawniono również sposób naprawy uszkodzonej tkanki wymagającej naprawy u pacjenta, obejmujący : a) namnożenie wzbogaconegych MPC w hodowli, według zastrzeżenia 41, i b) zetknięcie się skutecznej ilości wzbogaconej populacji MPC z uszkodzoną tkanką tego pacjenta [0023] Ujawniono również sposób indukcji tworzenia się lub naprawy naczyń krwionośnych,obejmujący etapy dostarczania wzbogaconej populacji okołonaczyniowych mezenchymalnych komórek macierzystych (MPC), zetknięcia się wspomnianych komórek z pożywką wzrostową, i hodowli wspomnianych komórek w warunkach do indukcji ich różnicowania się w nowe naczynia krwionośne. [0024] Ujawniono również skład substancji do zastosowania w indukowaniu tworzenia się naczyń serca, obejmujący populację mezenchymalnych komórek prekursorowych (MCP) w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, przy czym MPC niesie marker okołonaczyniowy i jest progenitorem naczyń. KRÓTKI OPIS FIGUR [0025]

8 7 Figura 1. Właściwości STRO-1 + MACS-wyizolowanych komórek oznaczonych wspólnie z anty-cd146 (CC9). (A) Region sortowania R1 oznacza podwójne dodatnią populację STRO-1 JASNE /CD ( B) częstość namnażania kolonii komórek (> 50 komórek) na podstawie ekspresji STRO-1 JASNE /CD146 +, określone przez metodę seryjnych rozcieńczeń z 24 powtórzeniami w przypadku każdego stężenia komórek przy użyciu analizy Poissona z 5 niezależnych eksperymentów. Podłużna (rozmiar ) i poprzeczna (ziarnistość ) charakterystyka rozpraszania światła przez BMMNCs (C), komórki STRO- 1 int /CD146 - (D) i komórki STRO-1 JASNE /CD146 + (E). (F) Analiza RT-PCR STRO-1 JASNE /CD146 + sortowanych komórek szpiku dla transkryptów CBFA1 (ścieżka 2), osteokalcyny (ścieżka 4) i GAPDH (ścieżka 6). Pokazano również komórki kontrolne (kultury BMSSC hodowane w obecności deksametazonu), wykazujące ekspresję CBFA1 (ścieżka 1), osteokalcyny (ścieżka 3) i GAPDH (ścieżka 5). Mieszaniny reakcyjne poddano elektroforezie w 1.5% żelu agarozowym i uwidoczniono barwieniem bromkiem etydyny. (G) Ekspresja in situ CD146 na ścianach naczyń krwionośnych (BV) (strzałki) w wycinkach szpiku kostnego człowieka (BM) w pobliżu powierzchni kości (b) 20X. Przekroje barwiono Hematoksyliną. (H) Podwójne barwienie immunofluorescencyjne wykazujące reaktywność przeciwciała STRO-1 znakowanego barwnikiem Texas Red i przeciwciała CC9 znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny, reagującymi ze ścianami naczyń krwionośnych w zamrożonych wycinkach szpiku kostnego człowieka. Figura 2. Immunofenotypowa analiza DPSCs in vivo. Wykres słupkowy przedstawia liczbę kolonii klonogennych, pobranych z zawiesiny pojedynczych komórek miazgi zęba, po selekcji immunomagnetycznymi perełkami w oparciu o reaktywność z przeciwciałami, które rozpoznają STRO-1, CD146 i 3G5 i dopasowanych izotypowo przeciwciał jako negatywnej próby kontrolnej. Dane są wyrażone jako liczba jednostek tworzących kolonie, uzyskanych z frakcji komórek perełkowych dodatnich jako procent całkowitej liczby kolonii w niefrakcjonowanych komórkach pulpy, uśredniony z trzech oddzielnych

9 8 eksperymentów. Poziom istotności statystycznej (*) został określony za pomocą testu t-studenta (p 0.01), porównując procent całkowitej liczby kolonii dla każdego przeciwciała z odpowiednią próbą kontrolą dopasowaną izotypowo. Figura 3. Reaktywność okołonaczyniowych markerów miazgi zęba. (A) Immunolokalizacja antygenu STRO-1 w naczyniach krwionośnych (małe strzałki) w ludzkiej miazdze zęba (p), i wokół onerwia (duża strzałka) otaczającego pęczki nerwów (nb) 20X. (B) Podwójne barwienie immunofluorescencyjne wykazujące reaktywność przeciwciała ASTRO-1 znakowanego Texas Red z onerwiem miazgi zęba (strzałka), w kombinacji z anty-neurofilamentowym przeciwciałem znakowanym barwieniem izotiocyjanianem fluoresceiny wewnętrznej części pęczka nerwów (nb), 40X. (C) Immunolokalizacja antygenu CD146 do ścian naczyń krwionośnych w tkance ludzkiej miazgi zęba 20X. (D) Podwójne barwienie immunofluorescencyjne wykazujące reaktywność przeciwciała STRO-1 znakowanego Texas Red względem naczynia krwionośnego i przeciwciała CC9 znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny. (E) Barwienie immunohistochemiczne tkanki miazgi z króliczym poliklonalnym przeciwciałem anty-dsp (strzałka) do warstwy zewnętrznej odontoblasta (od). 20X. (F) Reaktywność 3G5 wzgledem pojedyńczego perycytu (strzałka) w ścianie naczynia krwionośnego (bv) 40X. Przekroje tkanek wybarwiono Hematoksyliną. Figura 4. Rreaktywność 3G5 względem BMSSCs. (A) Reprezentatywny histogram przedstawia typowy profil dwukolorowej analizy FACS całych jednojądrzastych komórek szpiku kostnego (BMMNCs), wykazujących ekspresję CD146 (PE) i 3G5 (FITC). (B) Testy sprawności kolonii przeprowadzono dla wszystkich wszystkich obserwowanych wzorców ekspresji (regiony "R" 1-6). Dane wyrażono jako średnią częstość jednostek tworzących kolonie dla każdej frakcji komórkowej, uśrednione z trzech oddzielnych eksperymentów.

10 9 Figura 5. Potencjał rozwojowy oczyszczonych BMSSCs i DPSCs in vivo. Preparaty cytospinowe wyizolowane metodą MACS/FACS komórek szpiku STRO- 1 JASNE /CD146 + (strzałka) wybarwionych przeciwciałem specyficznym do α- aktyny mięśni gładkich (A) i czynnikiem von Willebranda (B). Komórki miazgi CD146 + (duża strzałka) wyizolowane metodą immunomagnetycznej selekcji perełkami (perełki magnetyczne przedstawione małymi strzałkami), wybarwiono przeciwciałem specyficznym do α-aktyny mięśni gładkich (C) i czynnikiem von Willebranda. (D). (E) Ektopowe tworzenie kości (b) układu hemopoezy/adipogenezy szpiku (bm) przez komórki namnożone ex vivo, pochodzące od STRO-1 JASNE /CD146 + BMSSCs przeszczepionych z HA/TCP do myszy z upośledzoną odpornością na trzy miesiące (E). (F) Ektopowe tworzenie zębiny (d) i włóknistej tkanki miazgi (p) przez komórki powiększone ex vivo, pochodzące od CD146 + DPSCs przeszczepionych z HA/TCP do myszy z upośledzoną odpornością przez trzy miesiące. Przekroje wybarwiono Hematoksyliną i Eozyną. Figura 6 Ekspresja CD34, CD45 i Glikoforyny-A na STRO-1 dodatnich komórkach jednojądrzastych szpiku kostnego. Reprezentatywne histogramy przedstawiające typowe dwukolorowe profile cytometrii przepływowej STRO- 1 dodatnich komórek jednojądrzastych szpiku kostnego, wyizolowanych początkowo poprzez magnetyczne aktywowane sortowanie i wybarwionych przeciwciałami specificznymi wobec CD34 (A), CD45 (B) lub Glikoforyny-A (C). Przeciwciało STRO-1 zostało zidentyfikowane za pomocą kozich antymysich przeciwciał IgM-izotiocyjanianu fluoresceiny, podczas gdy CD34, CD45 i Glikoforynę-A zidentyfikowano za pomocą kozich kozich anty-mysich przeciwciał IgG-fikoerytryny. Frakcja o wysokiej ekspresji STRO-1 zawierała klonogenną populację MPC, wyizolowaną przez aktywowane fluorescencją sortowanie komórek, na podstawie regionów R1 i R2. Figura 7 MPC szpiku kostnego są STRO-1 jasne, CD34-ujemne, CD45-ujemne i Glikoforyna-A ujemne. Wykres przedstawia wyniki testów in vitro tworzenia

11 10 adherentnej kolonii, przeprowadzonych dla każdej z różnych sortowanych STRO-1 jasnych populacji, wybranych przez ich ko-ekspresję lub brak antygenów CD34, CD45 lub Glikoforyny-A, w oparciu o regiony R1 i R2, jak pokazano na Rysunku 6. Dane wyrażano jako średnie częstości jednostek tworzących kolonie dla każdej frakcji komórkowej, uśrednione z dwóch oddzielnych eksperymentów. Figura 8 Reaktywność okołonaczyniowych markerów w różnych tkankach ludzkich. Podwójne barwienie immunofluorescencyjne wykazujące reaktywność (A) STRO -1 i CD146, (B) STRO-1 i alfa-aktyny mięśni gładkich, i (C) 3G5 i CD146 na naczyniach krwionośnych i tkance łącznej obecnych w śledzionie, trzustce (Panel 1), mózgu, nerce (Panel 2), wątrobie, sercu (Panel 3) i skórze (Panel 4) 20X. Przeciwciała STRO-1 i 3G5 zidentyfikowano za pomocą kozich anty-mysich IgM-Texas Red natomiast CD146 i alfa-aktyna mięśni gładkich zostały zidentyfikowane za pomocą kozich anty-mysich lub IgG - izotiocyjanianu fluoresceiny. Kolokalizacja jest wskazana przez nakładające się obszary fluorescencji, żółty i pomarańczowy (białe strzałki ). Figura 9 Izolacja MPC z tkanki tłuszczowej przez FACS. Reprezentatywne histogramy cytometrii przepływowej, przedstawiające ekspresję STRO-1, CD146 i 3G5 w świeżych preparatach zawiesin pojedyńczych komórek, pochodzących z obwodowej tkanki tłuszczowej, uzyskanych po trawieniu kolagenazą/dispazą jak opisano poprzednio (Shi i Gronthos 2003). Przeciwciała zidentyfikowano za pomocą kozich anty-mysich IgM lub IgG-fikoerytryny. Populacje komórkowe selekcjonowano za pomocą FACS na podstawie ich dodatniości (region R3) lub ujemności (region R2) dla każdego markera, a następnie wysiewano na zwykłej pożywce wzrostowej w celu oceny występowania adherentnych komórek tworzących kolonie w każdej frakcji komórkowej. Figura 10 Klonogenne MPC pochodzące z tkanki tłuszczowej są pozytywne dla STRO- 1/3G5/CD146. Wykres słupkowy przedstawiający liczbę klonogennych kolonii, pobranych z zawiesiny pojedynczych komórek ludzkiej obwodowej

12 11 tkanki tłuszczowej trawionej enzymatycznie, fluorescencyjne aktywowanego sortowania komórek w oparciu o ich reaktywność z przeciwciałami, które rozpoznają STRO -1, CD146 i 3G5 (Rys. 9), a następnie hodowli w standardowej pożywce hodowlanej w sposób opisany poprzednio dla szpiku kostnego i miazgi zęba (Shi i Gronthos 2003). Dane są wyrażone jako liczba jednostek tworzących kolonie, uzyskane na 10 5 komórek, wysianych we frakcjach dodatnich i ujemnych, uśrednione z dwóch oddzielnych eksperymentów. Figura 11 Immunofenotypowa analiza MPC pochodzących z tkanki tłuszczowej. Reprezentatywne histogramy cytometrii przepływowej przedstawiające koekspresję STRO-1 i CD146 (A) oraz 3G5 i CD146 w świeżych preparatach zawiesin jednokomórkowych pochodzących z obwodowej tkanki tłuszczowej, uzyskanych po trawieniu kolagenazą /dispazą. Przeciwciała STRO-1 i 3G5 zidentyfikowano za pomocą kozich anty-mysich IgM-fikoerytryny natomiast CD146 zidentyfikowano z użyciem kozich anty-mysich IgG-izotiocyjanianu fluoresceiny. Figura 12 Potencjał rozwojowy in vitro oczyszczonych MPC, pochodzących z Adipocytów. Preparaty pierwotnych kultur MPC, pochodzących z STRO- 1 + /CD146 + komórek tłuszczowych hodowanych ponownie w standardowych warunkach hodowli (A), na podłożu indukującym osteogenezę (B), podłożu indukującym adipogenezę (C) lub w warunkach chondrogenezy (D), jak opisano poprzednio przez Gronthos i in Po dwóch tygodniach indukcji wielo-różnicowania, MPC pochodzące z adipocytów wykazały zdolność do tworzenia kości (B; Alizarin dodatnie złoża mineralne), tłuszcz (C; Oil Red O dodatni lipid) i chrząstki (D; matryca kolagenu typu II). Figura 13 Izolacja MPC pochodzących ze skóry przez FACS. Reprezentatywne histogramy cytometrii przepływowej, przedstawiające ekspresję STRO-1, CD146 i 3G5 w świeżych preparatach zawiesiny pojedynczych komórek, pochodzących ze skóry pełnej grubości, wytworzonych po trawieniu

13 12 kolagenazą /dispazą. Przeciwciała zidentyfikowano stosując kozie antymysie IgM lub IgG- fikoerytrynę. Populacje komórkowe selekcjonowano za pomocą FACS na podstawie ich dodatniości (region R3) lub ujemności (region R2) dla każdego markera, które następnie wysiewano na zwykłej pożywce wzrostowej w celu oceny występowania adherentnych komórek tworzących kolonie w każdej frakcji komórkowej. Figura 14 Klonogenne, pochodzące ze skóry MPC są pozytywne dla STRO- 1/3G5/CD146. Wykres słupkowy przedstawiający liczbę kolonii adherentnych, odzyskanych z zawiesiny pojedynczych komórek enzymatycznie trawionej skóry ludzkiej, następnie sortowanych aktywowaną fluorescencją na podstawie ich reaktywności z przeciwciałami rozpoznającymi STRO-1, CD146 i 3G5 (Figura 6), następnie hodowanych na standardowyche podłożu wzrostowym, jak opisano powyżej dla szpiku kostnego i tkanki miazgi zęba (Shi i Gronthos 2003). Dane są wyrażone jako liczba jednostek tworzących kolonie, uzyskane na 10 5 wysianych komórek we frakcjach komórek dodatnich i ujemnych, uśrednione z dwóch oddzielnych eksperymentów. Figura 15 Widoczne przeżycie in vivo hodowanych komórek STRO1 jasne adherentnych do naczyń krwionośnych. Figura 16 Aarteriogeneza guza wywołana przez hodowane komórki STRO1 jasne Figura 17 Aarteriogeneza guza wywołana przez komórki potomne STRO1 jasne Figura 18 Arteriogeneza serca zależna od dawki hodowanych komórek STRO1 jasne. Figura 19 Poprawa frakcji wyrzutowej lewej komory (EF) przez wstrzyknięcie do mięśnia sercowego hodowanych komórek STRO1 jasne. Figura 20

14 13 Poprawa w kurczeniu obszaru frakcyjnego lewej komory (FAS) przez wstrzyknięcie do mięśnia sercowego hodowanych komórek STRO1 jasne. Figura 21 Poprawa ogólnej funkcji mięśnia sercowego przez wstrzyknięcie hodowli komórek STRO1 jasne. Figura 22. Powiększone ex vivo STRO-1 bri MPC mogą przekształcić się w tętniczki in vitro. Zawiesiny pojedynczych komórek szpiku kostnego STRO-1 bri MPC namnożone ex vivo wytworzono przez traktowanie trypsyną/edta, a następnie wysiano na płytki z 48 studzienkami, zawierającymi 200 µl Matrigel. STRO-1 bri MPC wysiano w stężeniu 20,000 komórek na studzienkę w pożywce wolnej od surowicy (Gronthos i in. 2003), uzupełnionej czynnikami wzrostu EGF, PDGF, VEGF w stężeniu 10ng/ml. Po 24 godzinach hodowli w temperaturze 37 C w 5% CO 2 studzienki przemywano, a następnie utrwalano 4 % paraformaldehydem. Następnie przeprowadzono badania immunohistochemiczne, które wykazały, że struktury przewodowopodobne wykazały ekspresję alfa-aktyny mięśni gładkich, zidentyfikowaną przez kozie anty-mysie przeciwciała IgG-peroksydazę z rzodkwi. [0026] Figura 23 A. immunofenotypowy wzór ekspresji namnożonych ex vivo MPC szpiku kostnego. Zawiesiny pojedynczych namnożonych ex vivo komórek MPC szpiku kostnego przygotowano przez traktowanie trypsyną/edta, a następnie inkubowano z przeciwciałami identyfikującymi markery związane z liniiami komórek. W celu identyfikacji przeciwciał wewnątrzkomórkowych antygenami, preparaty komórkowe utrwalono zimnym 70% etanolem w celu permeabilizacji błony komórkowej przed barwieniem identyfikującym wewnątrzkomórkowe markery. Izotypowo zgodne przeciwciała kontrolne traktowano w jednakowych warunkach. Cytometrię przepływową przeprowadzano za pomocą przyrządu COULTER EPICS. Wykresy punktowe reprezentują 5000 zdarzeń, wskazując poziom intensywności fluorescencji dla każdego markera linii komórek (linia

15 14 pogrubiona) w odniesieniu do zgodnych izotypowo ujemnych przeciwciał kontrolnych (cieńka linia). [0027] Figura 23 B. Profilu ekspresji genu hodowanego MPC. Zawiesiny pojedynczych namnożonych ex vivo komórek MPC szpiku kostnego przygotowano przez traktowanie trypsyną/edta, po czym przygotowano całkowite RNA komórkowe. Całkowite RNA komórkowe zostało wyizolowane za pomocą metody ekstrakcji RNAzo1B i zastosowano je jako matrycę do syntezy cdna, stosując standardową procedurę. Ekspresję różnych transkryptów oceniono przez amplifikację PCR, z użyciem standardowego protokołu, jak opisano wcześniej (Gronthos i in. 2003). Zestawy primerów stosowanych w tym badaniu są przedstawione w Tabeli 2. Po amplifikacji analizowano każdą mieszaninę reakcyjną za pomocą elektroforezy w 1.5% żelu agarozowym i wizualizowano przez barwienie bromkiem etydyny. Względną ekspresję genu dla każdego markera komórek oceniano w odniesieniu do ekspresji konstytutywnego genu podstawowego metabolizmu komórkowego GAPDH, przy użyciu oprogramowania ImageQuant. SZCZEGÓŁOWY OPIS ZILUSTROWANYCH I PRZYKŁADOWYCH WYKONAŃ WYNALAZKU [0028] Zastosowania i populacje komórek do stosowania zgodnie z wynalazkiem mogą być stosowane w sposobie indukowania neowaskularyzacji przez zastosowanie kompozycji komórek prekursorowych. Posiada to wiele zastosowań. [0029] Zastosowania i populacje komórek do stosowania według wynalazku mają zastosowanie w indukcji naprawy lub wytwarzania naczyń krwionośnych, na przykład w leczeniu niedokrwienia naczyń mózgowych, niedokrwienia nerek, niedokrwienia płuc, niedokrwienia kończyn dolnych, niedokrwienia mięśnia sercowego i kardiomiopatii, podaje się śródbłonkowe komórki prekursorowe. [0030] Szeroki zakres tkanek może być leczony i tkanki te mogą obejmować, na przykład, mięśnie, mózg, nerki i płuca. Choroby niedokrwienne obejmują na przykład niedokrwienie naczyń mózgowych, niedokrwienie nerek,

16 15 niedokrwienie płuc, niedokrwienie kończyn dolnych, kardiomiopatię niedokrwienną i niedokrwienie mięśnia sercowego. [0031] Leczenie tych schorzeń może obejmować etap izolacji mezenchymalnych komórek progenitorowych z tkanki pochodzącej od pacjenta, a następnie podawanie ich pacjentowi. Pacjent może być także leczone związkiem promującym tworzenie lub naprawę naczyń krwionośnych lub zwiększającym wzrost mezenchymalnych komórek i lub różnicowanie naczyń. W tym celu MPC mogą być podawane pacjentowi w dowolny odpowiedni sposób, w tym na przykład infuzję dożylną, wstrzyknięcia w bolusie i miejscowe dostarczanie cewnikiem. [0032] Zastosowania i populacje komórek do stosowania według wynalazku mogą mieć również zastosowanie do leczenia oparzeń i ran, w tym owrzodzeń przewlekłych takich chroniczne rany, w tym odleżyny i pewne rodzaje owrzodzeń. W takich przypadkach MPC mogą być stosowane miejscowo, zawieszone w kremie lub razem z odpowiednim środkiem do pomocy w migracji komórek pod powierzchnię. Alternatywnie, MPC mogą być utrzymane w obrębie bandaża, w ochronnej macierzy, która jest rozpuszczalna przy dłuższym kontakcie z raną lub inną powierzchnią. [0033] Zastosowania i populacje komórek do stosowania według wynalazku mogą mieć również zastosowanie w przypadkach, w których zmniejszony dopływ krwi prowadzi na przykład do łysienia. Związek MPC może być wstrzyknięty podskórnie lub w skórę w obszarze zaatakowanym chorobą. [0034] Szczepy unaczynionych tkanek hodowane in vitro są również rozważane przez wynalazek, przy czym MPC są hodowane w pożywce, w obecności znanych związków pobudzających różnicowanie do komórek naczyniowych, w celu wytworzenia szczepu, który obejmuje niezróżnicowane, częściowo zróżnicowane i niektóre zróżnicowane komórki. [0035] W przypadku implantu lekarz może stosować związek zawierający MPC podczas implantacji protezy, do wspierania unaczynienia w miejscu styku protezy z otaczającą tkanką. Alternatywnie można umieścić częściowo lub całkowicie zróżnicowane szczepy MPCs na implancie. Mogą one być utrzymane w obrębie matrycy ochronnej. Korzyścią wynikającą z

17 16 umieszczenia szczepu jest unaczynienie, a tym samym proces gojenia może być przyspieszony. [0036] Naczynia krwionośne są idealne miejscem dostawy produktu leczniczego. Odkrycie MPC i ich właściwości tworzenia nowych naczyń krwionośnych stanowi możliwość dostarczania produktów leczniczych przez dłuższy okres. [0037] MPC może być modyfikowany i zawierać różny materiał genetyczny. Materiał genetyczny może zawierać geny, które kodują różne białka, w tym środki przeciwnowotworowe, hormony, takie jak insulina, enzymy czynników wzrostu cytokin i podobne. [0038] Alternatywnie, MPC mogą być modyfikowane w celu ekspresji promotora tworzenia się naczyń krwionośnych, które mogą pomagać w indukcji MPC do tworzenia naczyń krwionośnych i dodatkowo pomagać w utrzymaniu dobrego ukrwienia danej tkanki. [0039] MPC mogą być dostarczane do mięśnia sercowego w celu leczenia choroby sercowo-naczyniowej przez bezpośrednie wstrzyknięcie (lub przeszczep naczynia) przez skórę za pomocą standardowych metod opartych na cewnikach pod kontrolą fluoroskopii, w ilości dostatecznej do skutecznego leczenia. Ilość MPC może wynosić od 10 4 do Wstrzyknięcie powinno być przeprowadzone głęboko do światła tętnic wieńcowych (około 1 cm w obrębie prześwitu tętnicy lub przeszczepu naczynia), korzystnie w obydwu tętnicach wieńcowych. Poprzez wstrzyknięcie materiału bezpośrednio do światła tętnicy wieńcowej przez cewnik, możliwe jest kierowanie MPC tak aby skutecznie zminimalizować straty podczas wstrzykiwania. Można stosować dowolnie wybrany cewnik do perfuzji wieńcowej. [0040] W celu leczenia choróby naczyń obwodowych, charakteryzującej się niedostatecznym dopływem krwi do kończyn dolnych, MPC mogą być dostarczane przez cewnik, który zostanie wstawiony do części bliższej tętnicy lub tętnic udowych, powodując tym samym migrację MPC kapilar mięśni szkieletowych otrzymujących krew z tętnic udowych. Będzie to

18 17 stanowić bodziec angiogeny powodujący unaczynienie i/lub naprawę naczyń krwionośnych w mięśniach szkieletowych nóg. [0041] Kompozycje lub produkty według wynalazku do zastosowania w chorobie naczyń wieńcowych lub obwodowych mogą być dogodnie dostarczane w postaci preparatów odpowiednich dla podawania wszczepieniem. Odpowiednia forma podawania może być określona przez lekarza dla każdego pacjenta indywidualnie. Odpowiednie, farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i ich skład są opisane w standardowych wytycznych składu, np. Remington Pharmaceuticals Sciences EW Martin. Kompozycje można tworzyć w postaci roztworu w obojętnym ph, na przykład ph około 6.5 do ph około 8.5, korzystnie od około ph 7 do 8, przy czym substancją pomocniczą doprowadzającą roztwór do około izotoniczności są na przykład 4.5% mannitol lub 0.9% chlorek sodu, buforowane znzanymi roztworami buforowymi, takimi jak fosforan sodu, które na ogół uważane są za bezpieczne. Pożądana izotoniczność może być uzyskana za pomocą chlorku sodu lub innych dopuszczalnych farmaceutycznie czynników, takich jak dekstroza, kwas borowy, winian sodowy, glikol propylenowy, alkohole polihydroksylowe (takie jak mannitol i sorbitol) lub inne nieorganiczne lub organiczne substancje rozpuszczone. Chlorek sodu jest szczególnie korzystny w przypadku buforów zawierających jony sodu. W razie potrzeby roztwory powyższych kompozycji mogą być również przygotowane w sposób zwiększający stabilność przy przechowywaniu. Terapeutycznie użyteczne kompozycje według wynalazku wytwarza się przez zmieszanie składników, zgodnie z ogólnie przyjętymi procedurami. Na przykład, wybrane składniki mogą być mieszane w celu wytworzenia stężonej mieszaniny, która następnie może być dostosowana do uzyskania końcowego stężenia i lepkości przez dodatek wody i/lub buforu w celu kontroli ph lub dodatkowej substancji rozpuszczonej do kontroli izotoniczności. [0042] W przypadku użycia przez lekarza, kompozycje będą w postaci dawek zawierających ilość MPC, która będzie skuteczna w jednej lub wielu dawkach, indukując angiogenezę na wybranym poziomie. Jak zostanie rozpoznane przez specjalistów z tej dziedziny, skuteczna ilość środka

19 18 terapeutycznego będzie się różnić w zależności od wielu czynników, takich jak wiek i waga pacjenta, stan fizyczny pacjenta, pożądany poziom angiogenezy i inne. [0043] Skuteczna dawka leku lub komórek według wynalazku będzie typowo w zakresie od co najmniej około 10 4 MPC, korzystnie około 10 6 MPCs, a bardziej korzystnie około 10 7 MPC. Jak już wspomniano,dokładna dawka do podawania jest określona przez lekarza prowadzącego, ale jest korzystnie podawana w 1 ml roztworu solanki buforowanej fosforanem. [0044] Preferowanym obecnie sposobem podawania w przypadku choroby serca jest wstrzyknięcie do jednej lub obu tętnic wieńcowych (lub jednej albo więcej wewnętrznych odpiszczelowych żył lub przeszczepu tętnicy piersiowej wewnętrznej) z zastosowaniem odpowiedniego cewnika wieńcowego. Obecnie korzystnym sposobem podawania w przypadku choroby naczyń obwodowych jest wstrzyknięcie do części bliższej tętnicy lub tętnic udowych przy użyciu odpowiedniego cewnika tętniczego. [0045] Korzystnie, MPC są podawane jednocześnie ze związkiem wzbudzającym tworzenie naczyń krwionośnych. Mogą to być kwaśne i zasadowe czynniki wzrostu fibroblastów, czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego, czynnik wzrostu naskórka, transformujący czynnik wzrostu α i β, płytkopochodnegy czynnik wzrostu śródbłonka, płytkopochodny czynnik wzrostu, czynnik martwicy nowotworu α, czynnik wzrostu hepatocytów, insulinopodobny czynnika wzrostu, erytropoetyna, czynnia stymulujący kolonie makrofagów-csf, GM-CSF i syntaza tlenku azotu. [0046] Śródbłonkowe komórki progenitorowe, zmodyfikowane do ekspresji mitogenu komórek śródbłonka mogą być stosowane w celu dalszego zwiększenia angiogenezy. Dodatkowo można podawać mitogen okołonaczyniowy komórek lub kwas nukleinowy, kodujący okołonaczyniowy mitogen komórek. [0047] MPC mogą być również podawane domięśniowo w sąsiedztwie miejsca uszkodzonego naczynia krwionośnego. [0048] Kompozycja może obejmować preparaty podawane miejscowo do rany, a więc mogą być składnikiem lotonów, kremów i tym podobnych.

20 19 [0049] MPC mogą być dostarczane w kompozycji, która ma postać preparatu do wstrzykiwania, zawierającego farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, taki jak na przykład roztwór soli. Preparat może wymagać sterylizacji i może zawierać stabilizator w celu utrzymania jednolitego rozkładu komórek. Końcowa dawka MPC jest korzystnie w zakresie od około komórek. [0050] Niniejszy wynalazek dotyczy mezenchmalnych komórek prekursorowych w szczególności tych, które mogą znajdować się w przedziale okołonaczyniowym tkanek unaczynionych. Takie mezenchymalne komórki można zidentyfikować przez obecność markera powierzchniowego 3G5, i dodatkowo lub oddzielnie przez inne markery wczesno-rozwojowe, takie jak CD146 (MUC18), VCAM-1 i STRO-1. [0051] Komórki prekursorowe są komórkami na wczesnym etapie rozwoju przed ekspansją. Są to komórki, które nie zostały jeszcze w pełni zróżnicowane, jednak nie muszą być one komórkami macierzystymi w ścisłym tego słowa znaczeniu, to jest nie muszą być zdolne do różnicowania się do wszelkiego rodzaju komórek. Częściowo zróżnicowane komórki prekursorowe są korzystne tym, że mają większy potencjał proliferacyjny niż komórki macierzyste. [0052] Niniejsze komórki prekursorowe są pewnym stopniu zróżnicowane do tkanek mezenchymalnych, w przeciwieństwie, na przykład do tkanek krwiotwórczych. Jak wynika z dostarczonych danych, wyizolowane MPC wykazują brak markerów związanych z komórkami krwiotwórczymi, takich jak CD34, a dodatkowo ich potencjalne zróżnicowanie nie obejmuje linii krwiotwórczych. Dodatkowo, nie muszą one koniecznie mieć potencjału różnicowania do wszystkich rodzajów komórek mezenchymalnych, ale mogą one być zdolne do różnicowania do jednego, dwóch, trzech lub więcej rodzajów komórek. [0053] Przewiduje się, że te komórki prekursorowe otrzymane ze wspomnianych tkanek mogą być użyteczne do regenerowania tkanki dla typów komórek, z których zostały pozyskane. Zatem komórki prekursorowe izolowane z serca mogą być ponownie wprowadzone do regeneracji tkanki serca, ale ich potencjał nie musi być w ten sposób ograniczony, gdyż

21 20 komórki prekursorowe wyizolowane z jednego typu tkanki mogą być użyteczne w regeneracji tkanek innego typu. Mikrośrodowisko, w którym znajdują się niezróżnicowane komórki jest znane z wywierania wpływu na drogi różnicowania i dlatego ponowne wprowadzenie nie musi być tkankowo specyficzne. [0054] Przedstawione dane pokazują, że MPC zostały zebrane, a następnie ponownie wprowadzone do produkcji odpowiednio kości i szpiku kostnego oraz zębiny i miazgi zęba, i dodatkowo, po namnożeniu ex vivo wyizolowanych MPC, powstały ateriole i strutkury przewodowe. [0055] Przewiduje się, że wiele komórek może być wytworzonych w oparciu o ekspresję genów markerów, charakterystycznych dla pewnych typów komórek. Należy się zatem spodziewać, że w odpowiednich warunkach hodowli zakres typów komórek, które mogą być generowane z okołonaczyniowych MPC według niniejszego wynalazku obejmuje, ale nie są ograniczony do osteoblastów, odontoblastów, wytwarzających zębinę, chondrocytów, więzadeł, ścięgien, chrząstek, adipocytów, fibroblastów, zrębu szpiku, zrębu komórek krwiotwórczych i osteoklastów, mięśnia sercowego, mięśni gładkich, mięśni szkieletowych, perycytu, komórek naczyniowych, nabłonka, glejowych, neuronów, astrocytów i oligodendrocytów. [0056] Jedną z korzyści płynących z ustalenia, że MPC mogą być wyizolowane z komórek okołonaczyniowych jest fakt, że w znacznym stopniu rozszerza to zakres tkanek źródłowych, z których można wyizolować lub wzbogacać MPC, nie ograniczając się już do szpiku kostnego. Tkanki, z których MPC zostały wyizolowane w ujawnionych tu przykładach wykonania pochodzą z ludzkiego szpiku, miazgi zęba, tkanki tłuszczowej i skóry. Ponadto, barwienie in situ i analizy histologiczne ujawniły, że MPC występują w przestrzeni okołonaczyniowej śledziony, trzustki, mózgu, nerki, wątroby i serca. Biorąc pod uwagę ten szeroki i zróżnicowany zakres rodzajów tkanek, w których obecne są okołonaczyniowe MPC, uważa się, że MPC będzie również obecny w jeszcze szerszym zakresie tkanek, które mogą obejmować tkankę tłuszczową, zęby, miazgę zęba, skórę, wątrobę, nerkę, serce, siatkówkę, mózg, mieszki włosowe, jelito, płuco, śledzionę, węzły chłonne,

22 21 grasicę, trzustkę, kości, więzadła, szpik kostny, ścięgno i mięsień szkieletowy. [0057] Ujawnione komórki prekursorowe są różne od innych znanych MPC tym, że są dodatnie wobec 3G5 i mogą nosić również inne okołonaczyniowe markery. Mogą zostać wyizolowane przez wzbogacenie wczesnorozwojowym markerem powierzchniowym, obecnym na komórkach okołonaczyniowych, w szczególności jednym lub więcej CD146 (MUC18), VCAM-1 i alternatywnie lub dodatkowo wysokim poziomem ekspresji markera, rozpoznawanego przez przeciwciało monoklonalne STRO-1. Alternatywnie lub dodatkowo, wzbogacenie można prowadzić stosując 3G5. [0058] Markery związane z komórkami okołonaczyniowymi, na przykład w alfa-aktyna mięśni gładkich (αsma), mogą być również obecne w MPC. [0059] Inne wczesnorozwojowe markery związane z MPC mogą być również obecne. Mogą one obejmować, ale nie są ograniczone do grupy składającej się z Thy-1, VCAM-1, ICAM-1, PECAM-1, CD49a/CD49b/CD29, CD49c/CD29, CD49d/CD29, CD29, CD61, integryny beta 5, 6-19, trombomoduliny, CD10, CD13, SCF, STRO-1bri, PDGF-R, EGF-R, IGF1-R, NGF R, FGF-R, R Leptyny (STRO-2). Dodatnia ekspresja jednego lub więcej z tych markerów może być stosowana w sposobach wzbogacaniania MPC z tkanki źródłowej. [0060] MPC według niniejszego wynalazku mogą być także dalej scharakteryzowane przez nieobecność markerów, obecnych w zróżnicowanych tkankach i wzbogacanie może opierać się na braku takich markerów. [0061] Podobnie, korzystne jest, gdy wzbogacona populacja komórek nie jest pochodzenia krwiotwórczego, a zatem korzystne jest, że ten typ komórek nie występuje. Markery charakterystycznie zidentyfikowane jako niewystępujące, obejmują, ale nie ograniczają się do CD34, CD45 i Glikoforyny-A. Dodatkowe inne markery do tego celu mogą obejmować CD20 i CD19 (markery limfocytów B), CD117 (c -kit onkoproteiny), znajdujące się na krwiotwórczych komórkach macierzystych i angioblastach, CD14 (makrofagi), CD3 i CD4 (komórki T).

23 22 [0062] Stosowanie stosunkowo spoczynkowych, bezpośrednio wzbogaconych lub wyizolowanych okołonaczyniowych MCP może być pożądane. Alternatywnie, stwierdzono, że namnażanie populacji wzbogaconej może być realizowe i mieć wpływ na znacznie większą liczbę komórek. Pod wpływem namnażania bezpośrednio wzbogaconej puli komórek może pojawić się pewne zróżnicowanie początkowych MCP. Namnażanie w ciągu 5 tygodni może spowodować wzrost krotny. Inne wybrane okresy mogą prowadzić do ekspansji populacji między 10 2 do 10 5 razy. Potencjał ten może być skierowany przez hodowanie ich na podłożach zawierających cytokiny i inne czynniki kierujące różnicowanie do konkretnego rodzaju tkanki, na przykład PDGF i VEGF, tworzących przewody alfa mięśni gładkich. Można je następnie wprowadzić na przykład do tkanki z czynnikiem chorobotwórczym w celu jej naprawy. Alternatywnie, ponowna selekcja komórek po namnażaniu w oparciu o marker wczesnego rozwoju, którym może być STRO-1 bri do zwiększenia proporcji MPC w populacji może być pożądana. [0063] Stwierdzono, że zasadniczo czysta populacja MCP nie jest konieczna w celu zapewnienia tworzenia zróżnicowanych komórek do tworzenia pożądanych struktur tkankowych. Wzbogacona populacja może mieć poziomy MCP wyższe niż około 0.001, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 lub 1% lub wyższe w stosunku do całkowitej liczby komórek w populacji wzbogaconej. Taki poziom wzbogacenia można osiągnąć przez stosowanie jednego markera do selekcji wzbogaconej populacji MCP. Jest tak zwłaszcza w przypadku, gdy tkanka źródłowa ma z natury wysoki poziom okołonaczyniowych MCP. Dowiedziono, że znacznie więcej 3G5 dodatnich okołonaczyniowych MCP występuje w pewnej tkance, na przykład miazgi, niż w szpiku kostnym. Zatem w szpiku kostnym 3G5 dodatnie MPC stanowią około 15% w oparciu o STR1 bri komórki tworzące kolonie, natomiast w miazdze znaleziono ich 65%, a w tkankach tłuszczu i skóry ponad 90%. Namnożenie populacji, a następnie ponowne wzbogacenie przy użyciu pojedynczego markera prowadzi do wyższych poziomów MPC, być może wyższych niż około 0.1, 0.5, 1, 2.5 lub 10%.

24 23 [0064] Chociaż uważa się za pożądane, aby część, korzystnie znaczna większość komórek prekursorowych była okołonaczyniowymi MPC, nie jest uważane za niezbędne w niektórych postaciach wynalazku, aby okołonaczyniowe MPC były jedyną formą komórek prekursorowych. Inne prekursory mogą być obecne bez zbytniego zakłócania zdolności okołonaczyniowego MPC do pożądanego różnicowania. Takie inne formy mogą obejmować krwiotwórcze prekursory lub nie- okołonaczyniowe MPC, które mogą być ujemne dla 3G5. [0065] Pewne postacie wykonania niniejszego wynalazku dostarczają okołonaczyniowe MFC zasadniczo wolne od komórek śródbłonka. W tym kontekście, zasadniczo wolne może oznaczać mniej niż około 5, 2, 1 lub 0.1% komórek śródbłonka. Alternatywnie można ocenić, że wzbogacona populacja jest ujemna z czynnikiem von Willebranda. [0066] Należy rozumieć, że rozpoznawanie komórek niosących markery powierzchniowe, które stanowią podstawę rozdzielenia można zrealizować na wiele różnych sposobów, ale wszystkie te sposoby polegają na wiązaniu środka wiążącego dla danego markera, następnie oddzielenie tych, które wykazują wiązanie, przy czym poziom wiązania może być wysoki, niski lub może występować brak wiązania. Najbardziej dogodne środki wiążące są przeciwciałami lub cząsteczkami opartymi na przeciwciałach, korzystnie przeciwciałami monoklonalnymi lub opartymi na przeciwciałach monoklonalnych ze względu na specyficzność tych ostatnich. Przeciwciała mogą być stosowane dla obu etapów, jednakże inne czynniki mogą być również stosowane, a zatem ligandy tych markerów mogą być również stosowane do wzbogacenia w komórki niosące je lub ich brak. [0067] Przeciwciała mogą być przyłączone do stałego nośnika, aby umożliwić surowe rozdzielenie. Techniki roddzielania powinny zwiększyć retencję żywotności zebranej frakcji. Różne techniki mogą być stosowane z różną skutecznością w celu uzyskania stosunkowo surowej frakcji. Stosowanie danej techniki będzie zależało od wydajności rozdzielania, związanej z nią cytotoksyczności, łatwości i prędkości działania oraz konieczność posiadania skomplikowanego sprzętu i / lub umiejętności

25 24 technicznych. Procedury rozdzielania mogą obejmować, ale nie są ograniczone do rozdzielania magnetycznego przy użyciu perełek magnetycznych pokrytych przeciwciałami, chromatografii powinowactwa i "płukania" przeciwciałem przyłączonym do stałego podłoża. Techniki zapewniające dokładne rozdzielenie obejmują, ale nie są ograniczone do FACS. [0068] To właśnie w związku z tymi sposobami, komórki mogą być dodatnie lub ujemne. Dodatnie komórki mogą być słabo (lo) lub mocno (jasne) jasne, zależnie od stopnia, w którym znacznik jest obecny na powierzchni komórek. Nazwa odnosi się do intensywności koloru fluorescencji lub innego koloru, stosowanego w procesie sortowania komórek. Rozróżnienie lo i bri będzie rozumiane w kontekście markera użytego w konkretnej populacji sortowanych komórek. [0069] Sposób wzbogacania okołonaczyniowych MPC może obejmować etap tworzenia pierwszej, częściowo wzbogaconej puli komórek przez wzbogacanie ekspresji pierwszego z markerów, a następnie etap wzbogacania ekspresji drugiego markera częściowo wzbogaconej puli komórek. [0070] Korzystne jest, aby sposób obejmował pierwszy etap, który obejmuje sortowanie w fazie stałej, na podstawie rozpoznawania jednego lub więcej markerów. Etap sortowania w fazie stałej w zilustrowanych przykładach wykonania wykorzystuje sortowanie MACS, rozpoznające wysoki poziom ekspresji STRO-1. Sortowanie MACS prowadzi do wzbogaconej puli z większą liczbą komórek niż w przypadku zastosowania sortowania wysokiej dokładności w pierwszym etapie. Jeśli na przykład FACS jest zaqstosowany w pierwszy etapie, wiele komórek prekursorowych jest odrzucanych z powodu ich powiązań z innymi komórkami. Drugi etap sortowania może nastąpić z pomocą dokładnej metody separacji. Ten drugi etap sortowania może angażować dwa albo więcej markerów. Tak więc, w przedstawionym przykładzie wykonania, dwukolorowy FACS służy do rozpoznania wysokiego poziomu ekspresji antygenu rozpoznawanego przez STRO-1 oraz ekspresji CD146. Okna stosowane do sortowania w drugim etapie mogą być

26 25 korzystnieregulowane, ponieważpopulacja wyjściowa jest już częściowo wzbogacona. [0071] Sposób wzbogacania okołonaczyniowych MPC może również obejmować pobieranie źródła komórek macierzystych przed pierwszym etapem wzbogacania z zastosowaniem znanych technik. W ten sposób tkanka zostanie usunięta chirurgicznie. Komórki zawarte w tkance źródłowej zostaną oddzielone tworząc tak zwaną zawiesinę pojedynczych komórek. Rozdział ten może być osiągnięty za pomocą środków fizycznych i/lub enzymatycznych. [0072] Korzystnym źródłem takich okołonaczyniowych MPC jest człowiek, ale oczekuje się, że wynalazek można również stosować u zwierząt, a te mogą obejmować zwierzęta rolnicze, takie jak krowy, owce, świnie i podobne, zwierzęta domowe, takie jak psy, zwierzęta laboratoryjne, takie jak myszy, szczury, chomiki i króliki, i zwierzęta, które mogą być wykorzystywane do uprawiania sportu, takie jak konie. [0073] Jest również ujawniony sposób wytwarzania tkanki u ssaka, obejmujący etap wzbogacania populacji komórek prekursorowych, jak w zastosowaniu według pierwszego aspektu tego wynalazku, wprowadzenie wzbogaconej populacji do ssaka i umożliwienie wzbogaconej populacji generowania tkanek u ssaka. [0074] Innym potencjalnym zastosowaniem wzbogaconych komórek według niniejszego wynalazku jest terapia genowa przez wprowadzenie egzogennego kwasu nukleinowego do ekspresji substancji leczniczych w typach tkanek, których to dotyczy. [0075] W kontekście niniejszego wynalazku określenie wyizolowana komórka może oznaczać, że okołonaczyniowe MPC zawierają co najmniej 30, 40, 50, 60, 70, 80 lub 95% całkowitej ilości komórek w populacji, w której są obecne. PRZYKŁAD 1: Izolacja i ekspansja komórek prekursorowych [0076] Nisze komórek macierzystych, określone w wielu różnych tkankach u dorosłych, w tym skóry, mieszków włosowych, szpiku kostnego, mózgu, jelita, trzustki, a ostatnio miazgi zęba, są często miejscami wysoce unaczynionymi. (1) Utrzymywanie i regulacja zazwyczaj nieaktywnch populacji