PORÓWNANIE BAKTERIOBÓJCZEGO DZIAŁANIA RÓŻNYCH PREPARATÓW DO HIGIENY JAMY USTNEJ I GARDŁA NA MIKROORGANIZMY IZLOLOWANE Z NABŁONKA JAMY USTNEJ

Transkrypt

1 PORÓWNANIE BAKTERIOBÓJCZEGO DZIAŁANIA RÓŻNYCH PREPARATÓW DO HIGIENY JAMY USTNEJ I GARDŁA NA MIKROORGANIZMY IZLOLOWANE Z NABŁONKA JAMY USTNEJ Mika Bożena, Uszok Katarzyna, Ziembińska Aleksandra Studenckie Koło Naukowe Biotechnologów przy Centrum Biotechnologii Politechnika Śląska Ul. Krzywoustego Gliwice Wprowadzenie Jama ustana stanowi zróżnicowane środowisko bytowania drobnoustrojów. Na wargach, policzkach, podniebieniu, języku, dziąsłach oraz zębach znajdują się charakterystyczne dla nich zbiorowiska bakterii [7]. To zróżnicowanie miejsc bytowania drobnoustrojów spowodowane jest odmiennością powierzchni w jamie ustnej. Jej elementy stanowią czasami w dużym stopniu różniące się od siebie środowiska przy niewielkich odległościach między sobą. Przykładem obrazującym tę właściwość jest powierzchnia zęba, na której panują warunki tlenowe oraz miejsca przy kieszonkach przyzębnych gdzie prawie całkowicie brakuje tlenu. Dzięki temu bakterie o skrajnie różniących się wymaganiach mogą zasiedlić odpowiednią powierzchnię jamy ustnej, na której znajdują się warunki umożliwiające ich wzrost i rozwój [4]. W sprzyjających warunkach ilość mikroflory bakteryjnej w jamie ustnej wzrastałaby. Jednak homeostaza jest zapewniona dzięki czynnikom obronnym. Należy do nich np. ślina. Dzięki zawartości jonów sodu, potasu, wapnia oraz chlorków, węglanów i fosforanów zapewnia ph jamy ustnej bliskie obojętnemu (ph śliny spoczynkowej wynosi 6,75-7,25) [7, 8]. Ślina zawiera lizozymy, laktoferyny i polipeptydy bogate w histydynę (histatyny), które działają przeciwbakteryjnie. Poprzez opłukiwanie błon śluzowych następuje samooczyszczanie jamy ustnej. Również tworzenie flory fizjologicznej przez część drobnoustrojów zapewnia nieswoisty mechanizm obronny. Odporność kolonizacyjna zapobiega gromadzeniu się egzogennych gatunków. Natomiast do czynników obronnych swoistych zalicza się np. limfocyty wewnątrznabłonkowe [8]. Pomimo działania systemów obronnych, przez pewien okres zawartość stałej mikroflory może ulec zmianie. Bakterie wchodzące w skład stałej i przejściowej mikroflory jamy ustnej wraz z ich rozmieszczeniem zamieszczono w tabeli 1. Powodem tego zróżnicowania jest m.in. wiek. W ciągu życia człowieka zachodzą zmiany w poszczególnych środowiskach jamy ustnej, czego konsekwencją jest zmienny skład drobnoustrojów. Rozwój uzębienia u niemowlaków stwarza nowe miejsca i warunki bytowania rozwijającej się mikroflory. Przyczynami zaburzeń równowagi flory bakteryjnej są przebyte choroby oraz antybiotykoterapia, która sprzyja niszczeniu flory bakteryjnej. Stosowanie protez i implantów stomatologicznych, uwarunkowania genetyczne (rasa, płeć), dieta, higiena osobista i wiele innych czynników również ma wpływ na skład mikroflory jamy ustnej [3, 7, 8].

2 Tab. 1 Skład bakteryjny jamy ustnej zdrowego, dorosłego człowieka [7, 8] Grupa bakterii Ziarenkowce gramdodatnie Ziarenkowce gramujemne Pałeczki gramdodatnie Pałeczki gramujemne Miejsce bytowania bakterii Wargi Przedsionek jamy ustnej Podniebienie nabłonka podniebienia) Policzek nabłonka policzka) Język ( 100 bakterii/ komórkę) Bakterie Peptostreptococcus spp., Staphylococcus spp., Micrococcus spp. Streptococcus vestibularis Streptococcus spp. Streptococcus salivarius, S. mitis, S. sanguis, S. anginosus Streptococcus mutans, S. mitis, S. salivarius, S. anginosus, Peptostreptococcus spp., Stomatococcus mucilaginosus Neisseria spp., Veillonella spp. Wargi Przedsionek jamy ustnej - Podniebienie nabłonka podniebienia) Policzek nabłonka policzka) Język ( 100 bakterii/ komórkę) Wargi Przedsionek jamy ustnej Podniebienie nabłonka podniebienia) Policzek nabłonka policzka) Język ( 100 bakterii/ komórkę) Wargi Przedsionek jamy ustnej Podniebienie nabłonka podniebienia) Policzek nabłonka policzka) Język ( 100 bakterii/ komórkę) Veillonella spp. - Veillonella spp. Corynebacterium spp. Actinomyces spp., Lactobacillus spp. Actinomyces viscosus, A. naeslundii, A. odontolyticus Lactobacillus spp., Actinomyces viscosus, A. naeslundii, A. odontolyticus Prevotella spp., Fusobacterium spp., Porphyromonas spp. Haemophilus spp., Bacterioides spp. Fusobacterium spp., Haemophilus spp. (głównie H. parainfluenzae), Capnocytophaga spp., Prevotella melaninogenica ( czarno pigmentowane), P. intermedia ( czarno pigmentowane) Haemophilus spp., Fusobacterium spp., Capnocytophaga spp., Fusobacterium spp.

3 Krętki Wargi - Przedsionek jamy ustnej - Podniebienie - nabłonka podniebienia) Policzek - nabłonka policzka) Język Treponema spp. ( 100 bakterii/ komórkę) Charakterystyka wybranych preparatów do higieny jamy ustnej i gardła W badaniach w tym eksperymencie wybrano zarówno zioła, tradycyjnie stosowane jako napary w leczeniu schorzeń jamy ustnej i gardła (szałwia i rumianek), jak i środki dostępne komercyjnie (Elmex, Eludril i Hascosept). Wybór takich środków był podyktowany celem eksperymentu, czyli badaniem efektywności różnych preparatów higieny i leczenia jamy ustnej na jej mikroflorę. Rumianek to roślina roczna, tworząca łodygi wzniesione, dorastające do 5 30 cm i rozgałęziające się. Są one pokryte 2-3 krotnie pierzastodzielnymi, drobnymi i niepozornymi liśćmi. Koszyczki kwiatowe pojawiają się na szczytach pędów. Są małe, złożone wyłącznie z żółtozielonkawych kwiatów rurkowych. W lecznictwie używany jest jedynie koszyczek rumianku, zebrany na początku kwitnienia i bezpośrednio po zbiorze wysuszony w cienkiej warstwie w warunkach naturalnych. Roślina zawiera olejek eteryczny o silnym, przyjemnym aromacie, glikozydy, gorycze i garbniki. Szałwia lekarska to półkrzew o szarawozielonych liściach. Na szczytach pędów tworzy pozornie kłosowate kwiatostany, złożone z kwiatów barwy od białej do fioletowej. W lecznictwie stosowany jest liść szałwii. Jego wyciągi działają antyseptycznie i grzybobójczo. Surowiec zbiera się dwukrotnie: w V- VI oraz IX- X i suszy w przewiewie w temperaturze do 35 C. W skład szałwii lekarskiej wchodzą: olejek eteryczny (a w nim chamazulen), flawonoidy, kumaryny, terpeny, kwasy organiczne, gorycze [5, 6]. Komercyjny płyn Elmex posiada działanie antybakteryjne i przeciwpróchnicze. Ochrona przed działaniem kwasów, a zarazem przed próchnicą zapewniona jest dzięki aminofluorkowi, który utwardza szkliwo zębów. Szczególnie polecany jest osobom noszącym aparaty ortodontyczne, mostki oraz podczas podróży, kiedy nie ma możliwości szczotkowania zębów [11, 12]. Eludril to płyn do płukania jamy ustnej, który stosuje się przy podrażnieniu i zaczerwienieniu dziąseł, do utrzymania higieny jamy ustnej oraz po zabiegach stomatologicznych. Bakteriobójcze, grzybobójcze działanie zapewnia chlorheksydyna. W Eludrilu występuje w postaci dwuglukonianu chlorheksydyny o stężeniu 10%. Dodatkowo chlorobutanol o stężeniu 0,50% działa miejscowo przeciwbólowo oraz wspomaga działanie chlorheksydyny [13]. Hascosept to lek przeciwzapalny w postaci płynu do płukania ust i gardła. Substancją czynną jest benzydamina, która oprócz działania przeciwzapalnego i przeciwbólowego wykazuje właściwości odkażające poprzez działanie na liczne gatunki bakterii i grzybów. Preparat jest zalecany do stosowania w stomatologii i laryngologii [10]. po zabiegach operacyjnych

4 Materiały i metodyka Porównano bakteriobójcze działanie różnych preparatów do higieny jamy ustnej i gardła, komercyjnie dostępnych i używanych w leczeniu domowymi sposobami na mikroorganizmy wyizolowane z nabłonka jamy ustnej. Preparaty do higieny jamy ustnej zostały przygotowane według zaleceń producentów. Szałwia powinna być podawana bezpośrednio na błonę śluzową jamy ustnej i gardła w postaci 2,5-3% naparu. Do jego wykonania wykorzystano 2 saszetki szałwii ( 3 g liści szałwii) i zalano je 100 ml wrzącej wody. Naparzano pod przykryciem przez 15 minut. Przygotowanie naparu z rumianku przebiegało analogicznie, tylko czas naparzania wynosił 5 minut. Eludril podaje się w postaci roztworu. Do jego wykonania odmierzono 15 ml preparatu i dopełniono ciepłą wodą do odpowiedniego miejsca w miarce dołączonej do płukanki. Elmex i Hascosept podano w gotowej postaci. zawiesina bakterii z solą fizjologiczną 0,1 ml kontrola naparu z szałwii naparu z rumianku Elemxu roztworu Eludrilu Hascoseptu 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml Rys. 1. Etapy przygotowania próbek i wykonania posiewu powierzchniowego Materiał do badań został pobrany od pięciu osób badanych za pomocą jałowego patyczka do wymazów, z nabłonka wewnętrznej strony policzka oraz języka. Następnie każdy patyczek zanurzono osobno w 10 ml sterylnej soli fizjologicznej i worteksowano przez około 2 minuty. Kolejnym krokiem było umieszczenie równych objętości zawiesiny w 6 sterylnych probówkach. Pozostałą objętość potraktowano jako kontrolę. Do kolejnych próbówek zawierających zawiesiny bakteryjne dodano odpowiednio przygotowane preparaty w stosunku 1:1. Następnie zawiesiny zworteksowano i posiano murawowo w 3 powtórzeniach na płytki z podłożem stałym bulionowym (skład: wyciąg mięsny, pepton, chlorek sodu, agar, BTL Łódź). Kontrolę posiano w ten sam sposób, również w 3 powtórzeniach. Na podstawie różnic wzrostu kolonii drobnoustrojów określono

5 bakteriobójczość preparatów. Na rysunku 1 przedstawiono schemat wyżej opisanych czynności. Płytki inkubowano 96 godzin w temperaturze pokojowej. Ze względu na duże wymagania pokarmowe bakterii jamy ustnej, posiew powierzchniowy wykonano dodatkowo na dwóch wzbogaconych podłożach. Podłoże TSA z 5% wyciągiem z krwi baraniej (BTL, Łódź) zawiera dodatkowo pepton K (5 g/l) i pepton SP (5 g/l). Podłoże agarowe z wyciągiem mózgowo-sercowy (BTL, Łódź) wzbogacono poprzez pepton (10 g/l), wyciąg z mózgu cielęcego (12,5 g/l) i serc wołowych (5g /l), glukozę i wodofosforan disodu (2,5 g/l). Inkubacja płytek trwała 24 godziny w temperaturze 37 C. Najciekawsze pod względem morfologicznym monokolonie identyfikowano z zastosowaniem barwienia metodą Grama. Za pomocą ezy pobrano niewielką ilość materiału kolonii i przeprowadzono posiewy redukcyjne. Wykonano barwienie Grama wyizolowanych szczepów. Na utrwalonym materiale bakteryjnym na szkiełku podstawowym nakładano kolejno: fiolet krystaliczny na 2 minuty, płyn Lugola na 2 minuty, alkohol etylowy na 30 sekund i fuksynę na 2 minuty. Po każdym etapie przepłukano szkiełka z materiałem wodą destylowaną. Po wyschnięciu preparatów, poprzez obserwowanie ich po mikroskopem dokonano oceny morfologicznej i określono przynależność wyizolowanych kolonii do bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych. Dyskusja wyników Z analiz wynika, że zarówno na podłożu bulionowym, jak i na podłożach TSA i agarze mózgowo-sercowym szałwia działa bardziej bakteriobójczo, niż rumianek (tabela 2). W przypadku rumianku w większości powtórzeń bakterie były niepoliczalne. Tabela 2. Wartości liczebności bakterii na podłożach bakteriologicznych dla próbek mikroorganizmów jamy ustnej po zastosowaniu szałwii i rumianku Typ podłoża Numer próbki Liczebność bakterii rosnących na podłożu po zastosowaniu szałwii rumianku bulionowe TSA z 5% krwi baraniej agarowe z wyciągiem mózgowo-sercowym Np. niepoliczalne I Np. Np. II Np. Np. I Np. Np. II Np. Np. III Np. Np. IV Np. 776 V 232 Np. I Np. Np. II 408 Np. III 488 Np. IV V 700 Np. Na podłożu bulionowym dla wszystkich trzech preparatów wyrosły jedynie pojedyncze szczepy bakteryjne zdolne do wzrostu w uboższym środowisku (Rysunek 2). Prawdopodobnie wynika to z faktu, że bakterie jamy ustnej mają wysokie wymagania

6 CFU/ml odżywcze i potrzebują bardziej złożonego medium do wzrostu. Zwraca tu również uwagę fakt, że preparat Hascosept działa najsłabiej bakteriobójczo. 20,00 18,00 16,00 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 ELMEX ELUDRIL HASCOSEPT badane preparaty komercyjne Rys. 2. Wartości liczebności bakterii na stałym podłożu bulionowym dla próbek mikroorganizmów jamy ustnej po zastosowaniu preparatów komercyjnych Zarówno na podłożu TSA, jak i agarze mózgowo-sercowym bakterie rosną bardzo licznie. Jednak podłoże TSA wydaje się być medium, na którym rośnie większość bakterii jamy ustnej o wysokich wymaganiach odżywczych (wszystkie płytki kontrolne charakteryzowały się niepoliczalną liczebnością bakterii). W przypadku kontroli dla agaru mózgowo-sercowego dla IV próbki kolonie bakteryjne były policzalne (dane nieprzedstawione w tej pracy). Na podłożu TSA z 5% krwi baraniej oraz agarze z wyciągiem mózgowo-sercowym wyniki układają się w sposób charakterystyczny dla każdej z badanych osób (Rysunek 3 i 4). Świadczy to o tym, że preparaty do higieny jamy ustnej należy dobierać indywidualnie a ich efektywność będzie zależeć zarówno od charakterystyki indywidualnej mikroflory, jak i od stanu zdrowia zębów i jamy ustnej. Na rysunkach 5 i 6 przedstawiono zdjęcia wyizolowanych szczepów z różnych próbek. Dzięki zawartości krwi w podłożu, możliwe było określenie właściwości hemolizujących bakterii (Rysunek 7). Z trzech preparatów komercyjnych Hascosept wykazał najniższą skuteczność (Rysunki 2-4). Badania prowadzone pod kierownictwem Ziętka [9] na temat klinicznej oceny preparatu Hascosept, dowiodło wysoką skuteczność tego preparatu u badanych osób, leczonych z powodu różnych chorób jamy ustnej (afty, liszaju płaskiego, zespołu pieczenia jamy ustnej oraz opryszczki). Potwierdzono również działanie przeciwbólowe preparatu. Rozbieżności obserwacji obu doświadczeń wynikają z różnic pomiędzy badanymi grupami. W eksperymencie brały udział osoby, u których nie stwierdzono żadnych chorób jamy ustnej. Na tej podstawie można wnioskować, że działanie Hascoseptu nakierowane jest głównie na bakterie chorobotwórcze, nie powodując całkowitego wyjałowienia jamy ustnej (zachowuje naturalną mikroflorę). Elmex i Eludril działają porównywalnie skutecznie (Rysunki 2-4). W doświadczeniu badającym metodą in vitro działanie bakterio- i grzybobójcze wybranych płukanek stosowanych do higieny jamy ustnej ( -Corsodyl, Eludril 1:2 i 1:3, Hextril/Oralden, Meridol,

7 CFU/ml CFU/ml Tantum verde, Alodont, Lacalut, Plak out), największą skuteczność obserwowano w preparatach zawierających chlorheksydynę (-w tym Eludril). Działanie bakteriobójcze i grzybobójcze preparatów z chlorheksydyną pozostaje bez zmian, niezależnie od jej stężenia [2]. 4,00 3,50 3,00 ELMEX ELUDRIL HASCOSEPT 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 I II III IV V próbka Rys. 3. Wartości liczebności bakterii na podłożu TSA z 5% krwi baraniej dla próbek mikroorganizmów jamy ustnej po zastosowaniu preparatów komercyjnych 12,00 10,00 8,00 ELMEX ELUDRIL HASCOSEPT 6,00 4,00 2,00 0,00 I II III IV V próbka Rys. 4. Wartości liczebności bakterii na podłożu agarowym z wyciągiem mózgowosercowym dla próbek mikroorganizmów jamy ustnej po zastosowaniu preparatów komercyjnych

8 A B HEMOLIZA C Rys. 5. Wyizolowane na podłożu TSA z 5% krwi baraniej bakterie jamy ustnej: A- osoby II, po zastosowaniu szałwii, B-osoby III, po zastosowaniu Hascoseptu, C- osoby IV, po użyciu Elmexu A B C D Rys. 6. Wyizolowane na podłożu agarowym z wyciągiem mózgowo- sercowym bakterie jamy ustnej: A- osoby I, po zastosowaniu Hascoseptu, B- osoby II, po użyciu Eludrilu, C- osoby V, po użyciu rumianku, D- osoby I, po użyciu Elmexu Rys. 7. Wyizolowane bakterie powodujące hemolizę na podłożu TSA z 5% krwi baraniej po 24-godzinnej inkubacji w temperaturze 37 C

9 Ze względu na sposób pobierania materiału do badań, w eksperymencie obserwowano jedynie skuteczność preparatów w zwalczaniu bakterii tlenowych lub tlenowców względnych. Barwienie Grama umożliwiło przyporządkowanie wybranych kolonii do odpowiednich grup bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych. Przed przeprowadzeniem barwienia wykonano posiewy redukcyjne wybranych kolonii. Opis charakterystyki morfologicznej makro- i mikroskopowej wyizolowanych bakterii przedstawiono w tabeli 3. Na podstawie wyników barwienia zaobserwowano, że na większości preparatach wykonanych po działaniu szałwii, Hascoseptu i Elmexu wyizolowane kolonie to bakterie Gram-dodatnie. Taki wynik mógłby świadczyć o wyższej skuteczności tych preparatów w stosunku do bakterii Gramujemnych. Wniosek ten wymagałby jednak dalszych badań, ponieważ barwienia wykonywano jedynie na wybranych szczepach. Tab. 3. Zestawienie preparatów po barwieniu Grama i ich charakterystyka Pochodzenie kolonii (osoba, zastosowany preparat) IV, Hasco sept III, Hasco Sept II, Elmex IV, Szałwia IV, Szałwia IV, Szałwia Grupa bakterii Charakterystyka wyrosłych kolonii na podłożach żółta, wypukła pomarszczona, sucha zielonkawa, hemolizująca żółtawa, gładka, lśniąca kremowa, lekko pokarbowana na wierzchu biała, gładka, lśniąca Wnioski Na podstawie przeprowadzonych badań wyciągnięto następujące wnioski: Bakterie występujące w jamie ustnej mają wysokie wymagania odżywcze. Tradycyjne metody oczyszczania jamy ustnej okazały się mniej skuteczne, niż preparaty chemiczne. Przy czym szałwia działa bardziej bakteriobójczo na mikroorganizmy tlenowe i tlenowce względne, niż rumianek. Środki do higieny jamy ustnej powinny być dobierane indywidualnie. Hascosept powinien być przeznaczony głównie do leczenia stanów zapalnych i innych chorób, a nie do codziennej higieny jamy ustnej. Elmex i Eludril wykazują dużą skuteczność w utrzymaniu higieny jamy ustnej.

10 Bibliografia [1] Irving W., Boswell T., Ala Aldeen D.: Krótkie wykłady Mikrobiologia medyczna, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa [2] Luc J., Dybiżbańska E., Roques Ch.: Działanie bakterio- i grzybobójcze wybranych płukanek stosowanych w pielęgnacji jamy ustnej badanie in vitro, [3] Marsh Philip, Martin Michael: Mikrobiologia jamy ustnej, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa [4] Salyers Abigail A., Whitt Dixie D.: Mikrobiologia. Różnorodność, chorobotwórczość i środowisko, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa [5] Sarwa Andrzej: Wielki leksykon roślin leczniczych, Wydawnictwo Książka i Wiedza, Warszawa [6] Strzelecka Halina, Kowalski Józef: Encyklopedia zielarstwa i ziołolecznictwa, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa [7] Szewczyk E. M., Dudkiewicz B., Lisiecki P., Różalska M., Sobiś-Glinkowska M., Szarapińska- Kwaszewska J.: Diagnostyka bakteriologiczna, Wydawni Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa [8] Zaremba Maria Lucyna, Borowski Jerzy: Mikrobiologia lekarska, Wydawnictwom Lekarskie PZWL, Warszawa [9] Ziętek M., Kozłowski Z., Konopka T., Radwan Oczko M., Noga L.: Kliniczna ocena preparatu Hascosept (chlorowodorek benzydaminy). Czas. Stomat. 2001, 54, [10] [11] html?cid=2060&attr= [12] [13] ml-815.html