Błona komórkowa neuronu w TEM

Transkrypt

1 Błona komórkowa neuronu w TEM Grubość: 5 nm 1

2 Błona komórkowa neuronu (x436 tys.) 2

3 Struktura fosfolipidów fosfatydylocholina 3

4 Diagram dwuwarstwy lipidowej 4

5 Cholesterol w błonie komórek zwierzęcych 5

6 Cholesterol 6

7 7

8 Stężenie jonów w mm wewnątrz kom. zewnątrz kom. Na K Mg2 + 0,5 1-2 Ca H ,2 M 10-7,4 M Cl

9 Obraz błony w metodzie freeze-fracture 9

10 Metoda freeze-fracture 10

11 Metoda freeze-fracture zamrożenie tkanki rozłupnie preparatu pokrycie odsłoniętej powierzchni warstwą węgla trawienie tkanki kwasem osadzenie repliki na siatce i pokrycie jej warstwą złota obserwacja w TEM i wykonanie zdjęć 11

12 Połączenia międzykomórkowe 12

13 Obraz połączenia szczelinowego w TEM 13

14 Model połączenia szczelinowego 14

15 Struktura koneksyn 15

16 Typy koneksonów 16

17 Połączenia szczelinowe w mięśniówce macicy świni (Cx-43 z Cy3) circ long 17

18 18

19 Połączenia szczelinowe w siatkówce myszy 19

20 Połączenie zamykające w TEM 20

21 Model połączenia zamykającego 21

22 Erytrocyty 22

23 EDTA (kwas wersenowy) Sól disodowa: wersenian sodu Środek kompleksujący kationy metali np.: Ca 2+, Mg 2+ Fe 3+ Kompleks chelatowy EDTA z jonem metalu Me 23

24 Rozpuszczanie błony komórkowej erytrocytów myszy 24

25 Transport przez błonę komórkową 25

26 26

27 27

28 Dyfuzja prosta 28

29 Ciśnienie osmotyczne P = crt R = 8,314 [J/(K mol)] = 0,0821 [dm3 atm/(k mol)] T = 309 [K], c stężenie molowe Stężenie molowe Wody destylowanej: 55,56 mol/dm3 Wody w roztworze soli fizjologicznej: 55,06 mol/dm3 Więc: P = 12,68 atm 29

30 30

31 Micele i liposomy 31

32 Liposomy PEG-Po 5-(4 -acryloyloxyphenyl)-10,15,20-tri(p-tolyl) porphyrin 32

33 Struktura kropli lipidowych TEM Fujimoto i wsp. 2011

34 Skład kropli lipidowych Rdzeń: Tri - trójglicerydy ech - estry cholesterolu Monowarstwa lipidowa: Ph - fosfolipidy fosfatydylocholina Ch - cholesterol

35 Struktura triglicerydu

36 Białka kropli lipidowych Strukturalne białka PAT: perylipiny, adipofilina, TIP47 Enzymy syntezy lipidów: syntaza acylo-coa acylotransferaza diacyloglicerolu Lipazy: hormonalnie zależna lipaza adipocytowa lipaza triglicerydów Białka transportu pęcherzyków: Rab, ARF1, SNARE, białka motoryczne

37 Funkcje kropli lipidowych 1. magazynowanie lipidów 2. magazynowanie białek (np. histonów) 3. wewnątrzkomórkowy transport lipidów i białek 4. kontrola metabolizmu lipidów

38 Komórka tłuszczowa - adipocyt

39 LD w komórkach wysp Langerhansa trzustki LD w hepatocytach

40 Krople tłuszczu w zarodkach świni 40

41 Oil red O 41

42 Drożdże Bodipy FL Nicień Czerwień Nilu Goodman i wsp Ruwkun 2009

43 Przygotowanie materiału do mikroskopu świetlnego 1. Uśmiercenie zwierząt i preparacja wycinków (szybko) 2. Utrwalanie tkanek i komórek (zwykle w temp. 4ºC lub pokojowej, od kilkudziesięciu minut do paru dni w zależności od użytego utrwalacza i wielkości wycinka) 3. Odwodnienie utrwalonego materiału (w etanolu lub w acetonie, od kilkunastu minut do kilku godzin) 4. Przepojenie 5. Zatopienie w parafinie (lub w innych mediach) 6. Skrawanie skrawków 8. Odparafinowanie skrawków 9. Uwodnienie skrawków 10. Barwienie 11. Odwodnienie skrawków 12. Zabezpieczenie preparatów 43

44 Metody barwienia (kontrastowania) 1. Histologiczne 2. Histochemiczne 3. Reakcje enzymatyczne 4. Immunocytochemiczne 44

45 Trzustka psa, pęcherzyki końcowe części egzokrynowe. Powiększenie: 960. Barwienie: H+E 45

46 RER komórka pęcherzykowa trzustki nietoperza 46

47 Komórki nerwowe zwoju rdzenowego kota. Powiększenie: 960. Barwienie: osmowanie wg. Kolatscheva + safranina 47

48 Komórki nabłonkowe kanalików nerwowych. Powiększenie: 960 Barwienie: met. Fernandez-Galiano 48

49 Ad. 2. Reakcje histochemiczne Wykrywanie ściśle określonych składników komórkowych 1. kationów (AS, Zn, Al., Mg, Cu, K, Na, Ca, Fe) 2. anionów, węglanów i fosforanów 3. białek i aminokwasów 4. histonów 5. kwasów nukleinowych 6. lipidów 7. wielocukrów 8. hormonów Przykład: reakcja PAS na glikogen 49

50 Reakcja PAS (Periodic Acid Schiff) Reakcja polega na utlenieniu kwasem nadjodowym sąsiadujących ze sobą grup OH. Powstałe w łańcuchu wielocukrów grupy aldehydowe reagują z odczynnikiem Shiffa dając purpurowy produkt reakcji. WYKONANIE REAKCJI: 1. Odparafinowane skrawki płukać w 70% alkoholu 2. 5 min. w roztworze kw. Nadjodowego 3. Przemyć w 70% alkoholu 4. 1 min. w płynie redukującym 5. Płukanie w 70% alkoholu 6. Barwienie w odczynniku Schiffa 7. Płukanie w bieżącej wodzie 8. Odwodnienie 50

51 Tkanka łączna prowadząca naczynia krwionośne w śliniance podżuchwowej. Powiększenie: 200. Barwienie: PAS. 51

52 52

53 Oil red O 53

54 Czterotlenek osmu 54

55 Histochemiczna analiza lipidów w zarodkach świni Czerwień oleista Siarczan błękitu Nilu zygota późna blastocysta rozwój in vivo i in vitro cytoplazma: wolne kwasy tłuszczowe krople tłuszczu: wolne kwasy tłuszczowe lipidy nasycone lipidy nienasycone nienasycone estry Osm - etanol Sudan czarny B Romek M, Gajda B, Krzysztofowicz E, Smorag Z. (2010) Theriogenology 74:

56 Reakcje enzymatyczne - kwaśna fosfataza 56

57 Reakcje immunocytochemiczne 57

58 Cytokeratin 7, nowotwór embrionalny 58