The exit of mouse oocytes from meiotic M-phase requires an intact spindle during intracellular calcium release N.J Winston

Wielkość: px

Rozpocząć pokaz od strony:

Download "The exit of mouse oocytes from meiotic M-phase requires an intact spindle during intracellular calcium release N.J Winston"

Piotr Wasilewski
6 lat temu
Przeglądów:

1 The exit of mouse oocytes from meiotic M-phase requires an intact spindle during intracellular calcium release N.J Winston Prezentacja Michała Piątka

2 Wprowadzenie Dojrzałe owulwoane oocyty są w bloku metafazy II podziału Oocyty wychodzą z bloku gdy zostaną aktywowane przez zapłodnienie lub partenogenetycznie co wyzwala szereg przejściowych zmian stężenia jonów wapnia wewnątrz komórki Inhibitor wrzecion NOCODAZOL powoduje depolaryzacje mikrotubul.---> degeneracja wrzeciona Cyklina B i enzym ją rozkładający znajdują się na wrzecionie

3 Wpływ nocodazolu na wrzeciona barwienie immunocytochemiczne (na zielono tubuliny na czerwono chromosomy) Widok z boku kontrolna po 1min w nocodazolu po 3 min w nocodazolu po 6min w nocodazolu Widok z góry kontrolna po 1min w nocodazolu po 3 min w nocodazolu po 6min w nocodazolu

4 CEL: Zbadać czy wyjście oocyty z M fazy wymaga niezniszczonego wrzeciona Zbadać czy wyrzuty jonów wapniowych wewnątrz komórki wpływają na wyjście oocytu z M fazy

5 Materiały i metody użyte w dośwaidczeniach 6-10 tygodniowym samicą podano 5ul surowicy gonadotropowej ciężarnej klaczy(pmsg) i ludzka gonadotropinę kosmówkową(hcg) 48 godzin przed śmiercią Oocyt uzyskano z cummulusów przez nakłucie bańki jajowodu w 13 godzinie po podaniu hcg

6 Oocyty użyte do aktywacji alkoholem Cummulus z pecherzyka jajowodu został przepłukany z komórek folikularnych i usunięto osłonki przejrzyste Hodowla przez 4-5 godzin w kropli pożywki M2+BSA pod kropla parafiny w 37stC Po 18 godzinach od padania hcg część oocytów poddana została aktywacja etanolem BEZ obecności NOCODAZOLU W obecności NOCODAZALU pozostałe oocyty podzielono na 3 grupy które były trzymane w pożywce z NOCODAZOLEM na 15min przed aktywacja etanolem w obecności NOCODAZOLU 30 min przed aktywacja etanolem w obecności NOCODAZOLU 60 min przed aktywacja etanolem w obecności NOCODAZOLU następnie oocyty przemyto z etanolu i umieszczono hodowli w pożywce M2+BSA inkubujac 6 godzin

7 Oocyty użyte do aktywacji przez zapłodnienie in vitro Pochodziły z cummulusów z jajowodów tych samych myszy co oocyty użyte do aktywacji etanolem Były oczyszczone lub bez osłonki przejrzystej Inkubowano je przez godzinę W 13,5 godzinie po podaniu hcg oocyty były zapładniane w kroplach pożywki zawierającej płodowa surowicę cielęcą FCS w obecności albo braku obecności nocodazolu Zapłodnione w obecności NOCODAZOLU zapłodnione bez obecności NOCODAZOLU 3razy przemyte poż. z Ca2+ poż. z Ca2+ po 3h do M2+BSA + BAPTAAM bez BAPTAM +1.78nM Ca2+ (iii) (ii) (i)

8 Oocyty użyte do aktywacji przez zapłodnienie in vitro c.d. Pozostałą część oocytów zapładnianych w obecności NOCODOZOLU umieszczono w pożywkach M2-BSA bez Ca2+ ale z nocodazolem. Po 30 minutach osunięto inhibitor i polowe umieszczono w pożywce bez Ca2+ a druga połowę w pożywce zawierającej jony wapnia. W ten sposób otrzymano 5 grup komórek badanych (i)kontrolna (ii)akt. z nocodazolem bez BAPTAM (iii)akt. z nocodazolem i z BAPTAM (iv)akt. z nocodazolem potem w poż. bez Ca2+ i bez inhibitora (v)akt z nocodazolem potem w pozwyce bez Ca2+ i bez inhibiotra a potem do poż. Z Ca2+

9 Rozwój oocytów był badany barwieniem immunocytochemicznym i zdefiniowano go na 2 grupy AKTYWNE u oocytów aktywowanych etanolem 1 przedjądrze u oocytów zapłodnionych 2 przedjądrza u oocytów zapłodnionych w obecność nocodozolu 3 lub więcej przedjądrzy NIEAKTYWNE u oocytów poddanych działaniu NOCODAZOLU które mają jedną lub więcej grup skondensowanych chromosomów połączonych z wrzecionami metafazowymi

10 NOCODAZOL zapobiega aktywacji oocytów stymulacji etanolem podczas Table 1. Incidence of activation in groups of oocytes activated parthenogenetically in the presence or absence of nocodazole or after pre-treatment with nocodazole Nocodazole Activation pre-treatment Incidence of Number of medium (6 min) (min) activation (%) experiments (i) Control 0 0/193 (0) 7 (ii) Ethanol only 0 141/184 (71) 7 (iii) Ethanol and nocodazole 0 60/175 (36) 6 (iv) Ethanol and nocodazole 15 0/49 (0) 1 (v) Ethanol and nocodazole 30 0/66 (0) 2 (vi) Ethanol and nocodazole 60 0/65 (0) 3

11 NOCODAZOL zapobiega aktywacji oocytów Oocyty aktywowane w obecności przy braku obecności Nocodazolu nocodazolu -aktywowane Etanolem 36% aktywnych 71% aktywnych - aktywowane Jonoforem A % aktywnych 51% aktywnych Poziom aktywnosci wysoki niski Kinazy histonów H1 Aktywność kinazy histonów H1 wysoka jest w oocytach kontrolnych które nie uległy aktywacji więc można stwierdzić że oocyty nie przechodzą do interfazy jeśli maja wysoką aktywność tego enzymu

NOCODAZOL zapobiega aktywacji oocytów Aktywność kinazy histonów H1 wysoka jest w oocytach kontrolnych które nie uległy aktywacji więc można stwierdzić że oocyty nie przechodzą do interfazy jeśli maja

12 NOCODAZOL zapobiega aktywacji oocytów Aktywność kinazy histonów H1 wysoka jest w oocytach kontrolnych które nie uległy aktywacji więc można stwierdzić że oocyty nie przechodzą do interfazy jeśli maja wysoką aktywność tego enzymu W obu przypadkach ( aktywacji z lub bez nocodozolu) stwierdzono wystąpienie pojedynczych wyrzutów jonów wapnia po których W nocodazolu bez nocodazolu fig2a Nie przeszły do inetrfazy przeszły do interfazy

13 NOCODAZOL zapobiega aktywacji oocytów Postanowiono sprawdzić czy oocyty aktywowane partenogenetycznie w nocodazolu po usunieciu inhibitora przejdą do interfazy? Fig2c Po godzinie od usniecia z nocodazolu wrzeciona miały czas na odbudowanie się i mogły przejsc do interfazy jeśli były poddane aktywacji po raz drugi bez obecnosci inhibitora!!!!!!!

Zapłodnienie oocytu indukuje wyrzuty wapnia

w obecność nocodazolu dokańczają podział

wyrzucając kilka ciałek kierunkowych, tworząc

14 Zapłodnienie oocytu indukuje wyrzuty wapnia nawet w obecności nocodozolu Oocyty zapłodnione w obecność nocodazolu dokańczają podział mejotyczny dopiero po usunięciu inhibitora wyrzucając kilka ciałek kierunkowych, tworząc przedjądrza i siec interfazowych mikrotubul zapłodniony bez obecności nocodozolu niezapłodnione bez obecności nocodazolu niezapłodnione w obecności nocodazolu

15 Zapłodnienie oocytu indukuje wyrzuty wapnia nawet w obecnsoci nocodozolu Table 2. Incidence of activation in groups of oocytes inseminated in the presence of nocodazole and then removed to medium with or without calcium or the calcium buffering agent BAPTA-AM Incidence of Number of Mean Treatment group activation (%) experiments ± s.d. (i)control 185/447 (41) ±16.5 (ii)nocodazole, then control 105/429 (24) ±7.6 (iii)nocodazole, then BAPTA-AM 2/249 (1) 3 0.9±1.0 (iv)nocodazole, then Ca (-)* 12/226 (5) 4 5.4±2.7 (v)nocodazole, then Ca (-)* 63/217 (29) ±10.6 then Ca (+) *Ca (-), calcium-free medium. Ca (+), calcium-containing medium.

16 Zapłodnienie oocytu indukuje wyrzuty wapnia nawet w obecnsoci nocodozolu Fig 5 a Fig 5b stwierdzono ze oocyty zapłodnione w obecności nocodazalu jak i bez obecności inhibitora wyrzucają jony wapnia a wzory tych wyrzut są niemal identyczne i nie zmieniają się po usunięciu inhibitora

Zapobieganie wyrzutów jonów wapnia blokuje aktywacje oocytów po zapłonieniu Fig6A Oocyty zapłodnione w nocodazolu a następnie usunięte z inhibitora i przeniesione do pożywki z BAPTAAM gr(iii)

17 Zapobieganie wyrzutów jonów wapnia blokuje aktywacje oocytów po zapłonieniu Fig6A Oocyty zapłodnione w nocodazolu a następnie usunięte z inhibitora i przeniesione do pożywki z BAPTAAM gr(iii) wykazują zanik wyrzutów jonów wapniowych w chwili gdy w pożywce znalazł się BAPTAAM->żaden oocyt nie wchodzi w interfazę Chromosomy kondensują grupując się w od 2-6 gródek blisko cortexu, ale nie tworzą w pełni normalnych wrzecion metafazowych

Zapobieganie wyrzutów jonów wapnia blokuje aktywacje oocytów po zapłonieniu 29% Oocytów zapłodnionych w obecności nocodazolu przeniesione

(iv) czyli oocytów które były zapładniane w obecności nocodazolu a następnie umieszczone w pożywce bez jonów Ca2+ aktywacji uległo tylko 5%

18 Zapobieganie wyrzutów jonów wapnia blokuje aktywacje oocytów po zapłonieniu 29% Oocytów zapłodnionych w obecności nocodazolu przeniesione najpierw do pożywki bez jonów wapnia a potem do pożywki z Ca2+ <grupa(v)> wyrzuciło wiele ciałek kierunkwoych wyszły z bloku M FAZY W grupie (iv) czyli oocytów które były zapładniane w obecności nocodazolu a następnie umieszczone w pożywce bez jonów Ca2+ aktywacji uległo tylko 5% pozostałe nie dokończyły podziału i zostały w bloku M fazy Ich chromosomy były skondensowane I rozdzielone na grupki do których przymocowana były wrzeciona

19 Zapobieganie wyrzutów jonów wapnia blokuje aktywacje oocytów po zapłonieniu Oocyty gr (iv) zapłodnione w obecności nocodazolu a następnie przeniesione do pożywki nie zawierającej Ca2+ nie wykazują uwalniania jonów wapniowych. Uwalnianie jonów następuje dopiero wtedy gdy przeniesiemy te oocyty do pożywki zawierającej wapń 8 badanych oocytów wykazywało uwalnianie wapnia w ten sposób ze 5 oocytów miało pojedynczy wyrzut jonów fig6b A 3 miało wiele wyrzutów jonów wapniowych fig 6c po jednym oocycie z każdej grup ( z wieloma i pojedynczym wyrzutem wapnia) wyrzuciło ciałko kierunkowe

20 Wnioski Uwalnianie jonów wapniowych sprzyja degradacji cykliny b Inhibitor wrzecion NOCODAZOL powoduje przedłużanie bloku M fazy poprzez degradacje wrzecion które muszą być nienaruszone aby cyklina B uległa degradacji która prowadzi do innaktywacji MPF Oocyty aktywowane partenogenetycznie w obecność nocodazolu po usunięciu inhibitora nie wchodzą do interfazy w przeciwieństwie do do tych samych oocytów ale aktywowanych przez zapłodnienie co jest tłumaczone rożnymi wzorami w oscylacji jonów Ca2+ Zapłodnione oocyty wykazuja zdolnosc do aktywacji nawet po czasie jeśli warunki beda psprzyjajace W aktywacji partenogentycznej w obecnosci nocodozolu dopiero durga aktywacja etanolem lub innym czynnikem bez obecnosci nocodazlu prowadzi do wyjscia z m fazy

Podobne dokumenty

Oocyty myszy stopniowo rozwijają zdolność do aktywacji podczas bloku w metafazie II. Jacek Z. Kubiak

Oocyty myszy stopniowo rozwijają zdolność do aktywacji podczas bloku w metafazie II Jacek Z. Kubiak Wprowadzenie W normalnych warunkach oocyty myszy są zapładniane podczas bloku metafazy II Wniknięcie