(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2016/29 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. A23L 2/52 ( ) A23L 33/15 ( ) A61K 8/67 ( ) A61K 31/375 ( ) A61K 31/4188 ( ) A61K 31/455 ( ) A61K 31/51 ( ) A61K 31/519 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Nanożel zawierający składniki aktywne rozpuszczalne w wodzie (30) Pierwszeństwo: WO PCT/CN2012/ EP (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2015/19 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2017/01 (73) Uprawniony z patentu: DSM IP Assets B.V., Heerlen, NL (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 XUZHE DING, Shanghai, CN OLIVIA VIDONI, Basel, CH PING YAO, Shanghai, CN (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Piotr Godlewski JWP RZECZNICY PATENTOWI DOROTA RZĄŻEWSKA SP. J. ul. Żelazna 28/30 Sienna Center Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 27615/16/ZWA/PG EP Opis Nanożel zawierający składniki aktywne rozpuszczalne w wodzie [0001] Wynalazek dotyczy kompozycji nanożelowej zawierającej co najmniej jeden rozpuszczalny w wodzie składnik aktywny, jedno lub większą liczbę białek roślinnych i jeden lub większą liczbę rozpuszczalnych polisacharydów soi. Te kompozycje można zastosować do wzbogacania i/lub uzupełniania żywności, napojów, pasz dla zwierząt i/lub kosmetyków i umożliwiają one stabilizację składnika aktywnego. Wynalazek dotyczy również sposobu otrzymywania takich kompozycji nanożelowych. Wynalazek dotyczy ponadto sposobu wytwarzania napojów przez zmieszanie kompozycji ze składnikami napojów. Wynalazek dotyczy również napojów możliwych do otrzymania przy zastosowaniu tego sposobu. [0002] W stanie techniki znane są kompozycje do wzbogacania lub uzupełniania żywności, napojów, pasz dla zwierząt lub kosmetyków, które zawierają składniki aktywne rozpuszczalne w wodzie, na przykład kwas foliowy (S.M. Lopera i in. (2009), Vitae 16, str ). Do mikroenkapsulacji folianów stosuje się kulki alginianowe, ponieważ łatwo jest je otrzymać na skalę laboratoryjną, jest to sposób delikatnie hydrożelujacy i względnie bezpieczny do zastosowania w formulacjach spożywczych (K. Kasipathy, 2008, Delivery and controlled release of bioactives in foods and nutraceuticals, Rozdział 13, str ). Niemniej jednak, mikrokapsułki alginianowe są porowate co prowadzi do wycieków kwasu foliowego i średniej stabilności kwasu foliowego w przypadku wystawienia na światło i kwaśne warunki typowe dla napojów (ph 3 do 5). Faktycznie, kwas foliowy jest dobrze znany ze swojej niestabilności (przerwanie wiązania C9-N10) po wystawieniu na promieniowanie ultrafioletowe. Kwas foliowy jest ponadto słabo rozpuszczalny w zakresie ph kwaśnych napojów w zakresie ph 2 do 4. [0003] Kompozycje nanożelowe do dostarczania substancji aktywnych, które są oparte na materiałach białkowych i ewentualnie na polisacharydach ujawniono w US 2012/ i CN [0004] Stąd, w dalszym ciągu istnieje zapotrzebowanie na kompozycje zawierające składniki aktywne rozpuszczalne w wodzie dla wzbogacania i/lub uzupełniania żywności, napojów, pasz dla zwierząt lub kosmetyków, które nie mają powyższych problemów. [0005] Przedmiotem tego wynalazku jest zatem zapewnienie kompozycji składników aktywnych rozpuszczalnych w wodzie o pożądanych właściwościach wskazanych powyżej, np. o bardzo dobrych właściwościach odnośnie stabilności składnika aktywnego w kwaśnym ph (3 do 5), stabilności składnika aktywnego po wystawieniu na światło (fotostabilności) i przejrzystości optycznej przy zastosowaniu w napoju. Przedmiotem wynalazku jest również ulepszenie sposobu otrzymywania kompozycji składników aktywnych rozpuszczalnych w wodzie. [0006] Ten cel osiągnięto przez zastosowanie kompozycji nanożelowej zawierającej:

3 -2- a) 0,1 do 5% masowych względem suchej masy kompozycji co najmniej jednego składnika aktywnego rozpuszczalnego w wodzie wybranego spośród kwasu askorbinowego, biotyny, kwasu foliowego, kwasu nikotynowego, tiaminy i witaminy B6. b) 9 do 40% masowych względem suchej masy kompozycji jednego lub większej liczby białek roślinnych wybranych z grupy białek odpowiednich do wprowadzania do żywności; i c) 50 do 90% masowych względem suchej masy kompozycji jednego lub większej liczby rozpuszczalnych polisacharydów soi; przy czym stosunek masowy białka/białek do polisacharydu/polisacharydów w oparciu o kompozycję suchej masy wybrano jako 1 : b z uwzględnieniem, że b mieści się między 1 a 6. [0007] Określenie nanożel w tym wynalazku dotyczy nanocząsteczki złożonej z usieciowanej hydrofilowej sieci heteropolimerowej (hydrożel). [0008] Rozpuszczalne w wodzie składniki aktywne odpowiednie do kompozycji według wynalazku są rozpuszczalnymi w wodzie składnikami aktywnymi o pka mieszczącym się w zakresie od 4 do 6 i wybrano je z kwasu askorbinowego (Witamina C, pka 4,17); biotyny (Witamina B8, pka 5,33); kwasu foliowego (Witamina B9, pka 4,7); kwasu nikotynowego (niacyna lub witamina B3, pka 4,9); tiaminy (witamina B1, pka 4,8); witaminy B6, pka 5,33, jak również ich mieszanin. Najbardziej korzystnym składnikiem aktywnym rozpuszczalnym w wodzie dla wszystkich przykładów wykonania według tego wynalazku jest kwas foliowy. [0009] Według tego wynalazku korzystne białko/białka roślinne pochodzą z soi, łubinu (np. L. albus, L. angustifolius lub ich odmian), grochu i/lub ziemniaków. Białka mogą być wyizolowane z dowolnej części rośliny, włącznie z owocami (np. ziarnami soi), nasionami (włącznie z nasionami poddanymi przygotowaniu lub przetwarzaniu) i tym podobnych lub z mąki pełnej lub produktów odtłuszczonych takich jak strzępy, płatki itd. [0010] Dla kompozycji według tego wynalazku, szczególnie korzystne są białka soi i grochu, a jeszcze korzystniejszym białkiem soi jest białko sojowe rozpuszczalne w kwasach (Soyasour 4000K z zawartością białek większą lub równą 60% masowych). Najkorzystniejszym jest Soyasour 4000K z zawartością białek większą lub równą 80% masowych, wilgotnością niższą niż lub równą 7,5% masowych, zawartością tłuszczu niższą niż lub równą 1,5% masowych, ph 3,6 do 6,4). Może być zakupiony od Jilin Fuji Protein Co. Ltd. Korzystnym źródłem białek grochu jest Cosucra SA (Warcoing, Belgia) [0011] Stosowane tu określenie rozpuszczalny polisacharyd sojowy oznacza rozpuszczalny polisacharyd sojowy z zawartością polisacharydów większą lub równą 60% masowych. Najkorzystniejszym rozpuszczalnym polisacharydem sojowym jest rozpuszczalny polisacharyd sojowy z zawartością polisacharydów większą lub równą 70% masowych, zawartością białek mniejszą lub równą 10% masowych, zawartością tłuszczy mniejszą lub równą 1% masowy, zawartością wilgoci mniejszą lub równą 8% masowych, zawartością popiołu mniejszą lub równą 8% masowych i o ph między 3 a 6. Może być pozyskany z Fuji Co., Ltd.

4 -3- [0012] Dla kompozycji według tego wynalazku, korzystne jest wybranie stosunku masowego białka/białek do polisacharydu/polisacharydów w oparciu o kompozycję w suchej masie takiego jak 1 : b z zastrzeżeniem, że b mieści się w zakresie między 1 a 5, szczególnie korzystnie b mieści się w zakresie między 2 a 4, a jeszcze korzystniej b wynosi 3. [0013] W szczególnie korzystnym przykładzie wykonania według tego wynalazku, średnia wielkość cząstki nanożelu mieści się w zakresie między 120 a 250 nm, co jest mierzone z wykorzystaniem dynamicznego rozpraszania światła. [0014] Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania przedstawionej powyżej stabilnej kompozycji nanożelowej, który obejmuje następujące etapy (sposób można przeprowadzać stosując składniki w podanych tu ilościach): I) zmieszania z wodą jednego lub większej liczby rozpuszczalnego polisacharydu/polisacharydów soi jako roztworów w ph około 7,4 z roztworem co najmniej jednego składnika aktywnego rozpuszczalnego w wodzie wybranego spośród kwasu askorbinowego, biotyny, kwasu foliowego, kwasu nikotynowego, tiaminy i witaminy B6; i roztworu białka/białek roślinnych, przy czym stężenie białka sojowego wynosi od 1 do 10 g/l, stosunek masowy białka do polisacharydu wynosi od 1:1 do 1:6, a stężenie składnika aktywnego rozpuszczalnego w wodzie mieści się w zakresie między 0,02 a 0,2 g/l. II) ewentualnego zmieszania mieszaniny z etapu I) przez 1 minutę do 8 godzin; III) doprowadzania ph mieszaniny z etapu I) lub II) do ph około 4 i ponownego doprowadzania ph po 2 do 3 godzinach; IV) homogenizacji mieszaniny z etapu III) stosując standardowy proces homogenizacji znany znawcy z późniejszym utrzymywaniem w temperaturze 90 C przez 1 godzinę; V) utrzymywania nanożelu w temperaturze między 70 a 95 C przez co najmniej 45 minut; VI) ewentualnego suszenia nanożelu uzyskanego w etapie V). [0015] Według wynalazku korzystnymi białkami są opisane powyżej białka roślinne. [0016] W korzystnym przykładzie wykonania, stężenie białka/białek roślinnych wynosi od 4 do 6 g/l. Korzystny stosunek masowy białka do polisacharydu wynosi od 1:2 do 1:4, jeszcze korzystniej 1:3. Stężenie składnika aktywnego rozpuszczalnego w wodzie korzystnie mieści się w zakresie między 0,01 i 0,15 g/l, i korzystnym składnikiem aktywnym rozpuszczalnym w wodzie jest kwas foliowy. [0017] Powtórne doprowadzanie ph do ph około 4 w etapie III) można przeprowadzić stosując dowolny kwas dopuszczony do żywności, a korzystnie stosuje się kwas chlorowodorowy. [0018] Homogenizację etapu IV) można przeprowadzić stosując dowolny sposób homogenizacji znany znawcy stanu techniki, taki jak ultrasonifikacja lub homogenizacja wysokociśnieniowa. [0019] Ultrasonifikacja generuje w cieczach zmienne fale niskiego i wysokiego ciśnienia, co prowadzi do tworzenia i gwałtownego zapadania się niewielkich pęcherzyków próżni. To

5 -4- zjawisko zwane kawitacją tworzy strumienie cieczy zderzające się ze sobą z wysoką prędkością i silne siły tarcia hydrodynamicznego połączone ze sprężaniem, przyspieszaniem, spadkiem ciśnienia i zderzaniem, co powoduje dezintegrację cząstek i ich rozproszenie po całym produkcie, jak również zmieszanie substratów. (Encyclopedia of emulsion technology, 1983, Tom 1, P. Walstra, strona 57, Ed P. Becher, ISBN: ) [0020] W przypadku procesu homogenizacji wysokociśnieniowej, mieszanina jest przeprowadzana przez szczelinę w zaworze homogenizacyjnym; to tworzy warunki wysokiej turbulencji i ścinania, co w połączeniu ze sprężeniem, przyspieszeniem, spadkiem ciśnienia i zderzaniem powoduje dezintegrację cząstek i ich rozproszenie po całym produkcie. Rozmiar cząstek zależy od ciśnienia roboczego stosowanego w trakcie procesu i typu wybranej szczeliny. (Food and Bio Process Engineering, Dairy Technology, 2002, H.G. Kessler, Ed A. Kessler, ISBN ). [0021] Najkorzystniejszą homogenizacją przeprowadzaną w tym wynalazku pod kątem uzyskania nanoemulsji jest homogenizacja wysokociśnieniowa według (Donsi i in. J. Agric. Food Chem., 2010, 58: ) odnośnie wydajności i wysokiej przepustowości tej technologii. Korzystniej, jest ona przeprowadzana przy 500 do 700 barów przez co najmniej 1 minutę, a jeszcze korzystniej przy 600 barach przez co najmniej 2 minuty. [0022] Nanożel z etapu V) może być stosowany w niezmodyfikowanej postaci lub może być suszony dla poźniejszego wykorzystania. Etap suszenia można przeprowadzać za pomocą dowolnego, standardowego procesu suszenia znanego znawcom stanu techniki, korzystne jest suszenie rozpyłowe i/lub proces wyłapywania proszkowego, w którym rozpylane krople zawiesiny są wyłapywane przez złoże adsorbentu, takiego jak skrobia lub krzemian wapnia lub kwas krzemowy lub węglan wapnia lub ich mieszaniny, a następnie są osuszane. [0023] Wynalazek dotyczy również nanożelu, który można otrzymać przez sposób opisany powyżej i korzystnie gdy białkami roślinnymi są białka soi lub grochu, a składnikiem aktywnym rozpuszczalnym w wodzie jest kwas foliowy. [0024] Wynalazek dotyczy również zastosowania nanożeli takich jak opisano powyżej do wzbogacania i/lub uzupełniania żywności, napojów, pasz dla zwierząt i/lub kosmetyków, korzystnie do wzbogacania i/lub uzupełniania napojów, a jeszcze korzystniej kwaśnych napojów (ph 3 do 5). [0025] Innymi aspektami wynalazku są żywność, napoje, pasza dla zwierząt, kosmetyki zawierające kompozycję opisaną powyżej. [0026] Napojami, gdzie postacie produktu według wynalazku można stosować jako składnik dodatkowy, mogą być napoje gazowane, np. smakowe wody sodowe, napoje bezalkoholowe lub napoje zawierające minerały, jak również napoje niegazowane, np. wody smakowe, soki owocowe, poncze owocowe i skoncentrowane postacie tych napojów. Mogą bazować na naturalnych sokach owocowych lub warzywnych lub na aromatach sztucznych. Obejmuje to również napoje alkoholowe i napoje w proszku typu instant. Dotyczy to również napojów zawierających cukier i napojów dietetycznych ze słodzikami sztucznymi i bez wartości kalorycznych.

6 -5- [0027] Ponadto, produkty mleczne uzyskiwane ze źródeł naturalnych lub sztucznych mieszczą się w zakresie produktów spożywczych, przy czym postacie produktów według wynalazku można zastosować jako składnik odżywczy. Typowymi przykładami takich produktów są napoje mleczne, lody, ser, jogurt i tym podobne. Zakresem tego zgłoszenia objęte są również produkty zastępujące mleko, takie jak napoje z mleka sojowego i produkty z tofu. [0028] Objęte są również słodycze, które zawierają postacie produktów według wynalazku jako składnik dodatkowy, takie jak produkty cukiernicze, cukierki, gumy, desery, np. lody, żelki, budynie, proszki budyniowe typu instant i tym podobne. [0029] Objęte są również płatki zbożowe, przekąski, ciastka, makaron, zupy i sosy, majonez, dressingi sałatkowe i tym podobne, które zawierają postacie produktu według wynalazku jako barwnik lub składnik odżywczy. Objęte są również preparaty owocowe stosowane do nabiału i płatków zbożowych. [0030] Ostateczne stężenie jednego lub większej liczby składników aktywnych rozpuszczalnych w wodzie, korzystnie kwasu foliowego, które dodaje się do produktów żywnościowych przez kompozycje według wynalazku, może korzystnie wynosić od 0,1 do 50 ppm, szczególnie od 1 do 30 ppm, korzystniej od 3 do 20 ppm, np. około 6 ppm, względem masy całkowitej kompozycji spożywczej i w zależności od konkretnego produktu spożywczego, który ma być uzupełniony i pożądanego stopnia uzupełnienia. [0031] Kompozycje spożywcze według tego wynalazku uzyskuje się korzystnie przez dodawanie składnika aktywnego rozpuszczalnego w wodzie do produktu spożywczego w postaci kompozycji według tego wynalazku. Dla uzupełniania produktu spożywczego kompozycję według tego wynalazku można zastosować według sposobów znanych ze stosowania stałych postaci produktów, które można rozpraszać w wodzie. [0032] Kompozycję można na ogół dodawać jako wodny roztwór bazowy, suchą mieszankę proszkową lub wstępną mieszankę z innymi, odpowiednimi składnikami żywności w zależności od określonego zastosowania. Mieszanie można przeprowadzić np. stosując mikser do proszków suchych, mikser wolnoobrotowy, homogenizator wysokociśnieniowy lub mikser wysokoobrotowy w zależności od formulacji produktu końcowego. Takie szczegóły techniczne oczywiście mieszczą się w zakresie kompetencji znawcy. [0033] Wynalazek dotyczy również sposobu produkcji napoju obejmującego etapy homogenizacji kompozycji według tego wynalazku, oraz mieszania 1 do 50 ppm zawartości w oparciu o rozpuszczalne w wodzie składniki aktywne, korzystnie 5 ppm emulsji z kolejnymi typowymi składnikami napojów. [0034] Ponadto, wynalazek dotyczy napojów, których uzyskanie jest możliwe przez opisany powyżej sposób wytwarzania napojów. Korzystnie napój ma ph między 2 a 8, a korzystniej między 3 a 5,5. Krótki opis figur: [0035]

7 -6- Figura 1 przedstawia widma UV dla roztworów samych białek (Assp), dla roztworów samego polisacharydu (SSP) i kompleksu nanożelowego białko/polisacharyd (Nps) po ultrafiltracji. Figura 2 przedstawia widma UV kwasu foliowego uwolnionego z nanożeli kwas foliowy/białko/polisacharyd, nanożeli kwas foliowy/polisacharyd i nanożeli kwas foliowy/białko w ph 7,4. Uwolniony kwas foliowy wyizolowano stosując ultrafiltrację. Roztwory kwasu foliowego otrzymane bezpośrednio w ph 7,4 są stosowane jako kontrole. [0036] Wynalazek jest dodatkowo zilustrowany przez następujące przykłady, które w zamierzeniu nie są ograniczające. Przykłady Przykład 1: Oddziaływanie kwasu foliowego z nanożelem białka soi, nanożelem polisacharydu soi lub nanożelem kompleksu białko soi/ polisacharyd soi w ph 7,4 [0037] Białko soi pochodzi z Jilin Fuji Protein Co. Ltd. (Soyasour 4000K, białko soi rozpuszczalne w kwasach; ASSP) z 88% zawartością białek (względem suchej masy). Ma punkt izoelektryczny około ph 4,7. Rozpuszczalne polisacharydy soi (SSP) o 70 do 80% masowych polisacharydów pozyskano od Fuji Co., Ltd. [0038] Biorąc pod uwagę rozpuszczalność kwasu foliowego, oddziaływania zbadano przy ph 7,4. Roztwór z samym białkiem, roztwór z samym polisacharydem i roztwór nanożelu kompleksu białko/polisacharyd doprowadzono najpierw do ph 7,4. Następnie dodano kwas foliowy rozpuszczony w 10 mm buforze fosforanowym, ph 7,4, a mieszaninę inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej z mieszaniem. Końcowe stężenie białka w mieszaninie wynosiło 4 mg/ml, a stężenie polisacharydu wynosiło 12 mg/ml. Wolny kwas foliowy w mieszaninie wyizolowano stosując błonę ultrafiltracyjną o dużej przepustowości (masa cząsteczkowa odcięcia 3 kda, MicroconYM-3, Millipore) i zebrano w ultrafiltracie. Roztwór z samym kwasem foliowym również przepuszczono przez błonę ultrafiltracyjną; 97% kwasu foliowego w ultrafiltracie (Tabela 1) potwierdza odzysk kwasu foliowego. Roztwory nanożelu z samym białkiem, samym polisacharydem i kompleksu białko/polisacharyd również przepuszczono przez błonę ultrafiltracyjną; ich widmo UV dla ultrafiltratów (Figura 1) przedstawia absorbancję w regionie UV, wykazując obecność małych peptydów w ultrafiltratach. Stężenie FA w ultrafiltracie obliczono odejmując absorbancję dla 280 nm przedstawioną na Figurze 1 od absorbancji dla 280 nm dla ultrafiltratu. Tabela 1 przedstawia, że około 10% FA wiąże się z białkiem lub nanożelem; kwas foliowy prawie w ogóle nie wiąże się z polisacharydem w ph 7,4. Tabela 1. Stężenie wolnego kwasu foliowego (FA) w różnych mieszaninach w ph 7,4. Wolny kwas foliowy w mieszaninie wyizolowano stosując ultrafiltrację. Próbka Białko + FA Stężenie FA w żywności (mm) Stężenie FA w ultrafiltracie (mm) Odzyskane FA w ultrafiltracie (%) 0,25 0,215±0,005 86±2 0,5 0,435±0,005 87±2

8 -7- Próbka Polisacharyd + FA Nanożel białko/polisacharyd + FA Stężenie FA w żywności (mm) Stężenie FA w ultrafiltracie (mm) Odzyskane FA w ultrafiltracie (%) 0,25 0,241±0,01 96±4 0,5 0,506±0,01 101±2 0,25 0,228±0,005 89±2 0,5 0,447±0,01 89±2 FA 0,5 0,485±0,01 97±2 Przykład 2: Oddziaływanie kwasu foliowego z nanożelem białka soi, nanożelem polisacharydu soi lub nanożelem kompleksu białko soi/ polisacharyd soi w ph 4 [0039] Nanożele są względnie hydrofobowe w ph 4, co stwierdzono za pośrednictwem fluorescencji pirenu, a kwas foliowy jest również związkiem hydrofobowym w ph 4. Nanożele mogą zatem wiązać kwas foliowy przez oddziaływania hydrofobowe. Uwzględniając zależność rozpuszczalności od ph, kwas foliowy dodano do roztworu nanożelu o stosunku masowym 1:3 na trzy różne sposoby tak jak przedstawiono poniżej. (1) Roztwór nanożelu o stosunku masowym 1:3 doprowadzono do ph 7,4, a następnie dodano stały kwas foliowy, aby osiągnąć stężenie końcowe kwasu foliowego wynoszące 1 mm, stężenie białka 4 mg/ml i stężenie polisacharydu wynoszące 12 mg/ml. Po mieszaniu przez noc dla rozpuszczenia kwasu foliowego, zmieniono ph mieszaniny na 4,0. (2) Kwas foliowy rozpuszczono w 10 mm buforze fosforanowym, ph 7,4. Roztwór kwasu foliowego dodano kroplami do roztworu nanożelu o ph 4,0, aby uzyskać stężenie kwasu foliowego wynoszące 0,25, 0,5 lub 1 mm, a następnie mieszano przez noc. Mieszanina miała ph równe około 4,0. (3) Kwas foliowy rozpuszczono w 10 mm buforze fosforanowym, ph 7,4. Roztwór nanożelu doprowadzono do ph 7,4. Roztwór kwasu foliowego zmieszano z roztworem nanożelu dla uzyskania stężenia kwasu foliowego wynoszącego 0,1, 0,5 lub 1 mm, a po całonocnym mieszaniu, ph mieszaniny doprowadzono do 4,0. Żółty osad kwasu foliowego po krótkim przechowywaniu pojawił się przy ph 4,0 dla wszystkich z powyższych mieszanin. Ten sam żółty osad zaobserwowano również dla mieszanin kwasu foliowego z samym białkiem i samym polisacharydem. Dla samego białka, supernatant uzyskał żółty kolor, podczas gdy inne pozostały bezbarwne. Te wyniki wskazują, że w ph 4,0 białko może wiązać/stabilizować część kwasu foliowego, natomiast nanożel i polisacharyd soi prawie nie wiążą/stabilizują kwasu foliowego. Przykład 3: Otrzymywanie nanożelu kwas foliowy/białko soi/polisacharyd soi. [0040] Ponieważ w odróżnieniu od nanożeli białko soi może wiązać część kwasu foliowego w ph 4, nanożele kwas foliowy/białko/polisacharyd otrzymano przez zmieszanie kwasu

9 -8- foliowego z białkiem i polisacharydem w ph 7,4 przez doprowadzanie ph, homogenizację wysokociśnieniową i ogrzewanie. Poniżej przedstawiono szczegóły otrzymywania: 7,88 g roztworu polisacharydu soi o stężeniu 50 mg/ml dodano do 5 ml wody, następnie dodano 6,25 ml 1 mm roztworu kwasu foliowego o ph 7,4 i 6,25 ml roztworu białka sojowego o stężeniu 20 mg/ml przy jednoczesnym mieszaniu. W mieszaninie, stężenie końcowe białek wyniosło 5 mg/ml, stężenie polisacharydów wyniosło 15 mg/ml, stężenie kwasu foliowego wyniosło 0,25 mm, a objętość wyniosła 25 ml. ph mieszaniny doprowadzono do 4,0 po 3 h mieszania, ph doprowadzono ponownie do 4,0. Mieszaninę homogenizowano stosując homogenizację wysokociśnieniową przy 600 bar przez 2 minuty, a następnie utrzymywano w temperaturze 90 C przez 1 h dla uzyskania nanożeli białko soi/polisacharyd soi/ kapsułkowanych kwasem foliowym. Stosując ten sposób wykorzystano również samo białko i sam polisacharyd do otrzymania nanożeli kwas foliowy/białko i nanożeli kwas foliowy/polisacharyd. [0041] W uzyskanym roztworze nanożelu kwas foliowy/białko/polisacharyd, roztworze nanożelu kwas foliowy/białko i roztworze nanożelu kwas foliowy/polisacharyd zmieniono ph na 7,4 dla uwolnienia kwasu foliowego z nanożeli; uwolniony kwas foliowy wyizolowano stosując ultrafiltrację. Stężenie kwasu foliowego w ultrafiltracie zmierzono tak jak opisano powyżej, a bezpośrednio przed wykorzystaniem otrzymano roztwory 0,25 i 0,5 mm kwasu foliowego o ph 7,4 jako kontrole. Wynik na Figurze 2 wskazuje na to, że widma kwasu foliowego nie uległy zmianie po zmieszaniu, doprowadzaniu ph, homogenizacji i procesie ogrzewania. Intensywność spada dla mieszaniny zawierającej białko lub nanożele, co jest zgodne z wynikami wiązania kwasu foliowego w ph 7,4 (Tabela 1), tj. o około 10% FA związanego z białkiem i nanożelami. Przykład 4: Stabilność nanożeli kwas foliowy/białko soi/polisacharyd soi. [0042] Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) wykorzystano do pomiaru rozmiaru nanożeli kwas foliowy/białko/polisacharyd w ph 4,0. Dane w Tabeli 2 wskazują, że nanożele o stężeniu kwasu foliowego między 0,25 a 0,5 mm mają podobny rozmiar co nanożele bez kwasu foliowego. Po jednym miesiącu przechowywania, nanożele nie zmieniły rozmiarów. Tabela 2. Wyniki DLS nanożeli FA/białko/polisacharyd z kwasem foliowym (FA) w stężeniu 0,25 i 0,5 mm. Nanożele białko/polisacharyd zastosowano jako kontrole. Próbka nanożelu Stężenie FA w nanożelach (mm) Czas przechowywania Dh (nm) Białko/polisacharyd 0 178±2 0,16±0,01 FA/białko/polisacharyd 0,25 Przygotowany na świeżo 170±4 0,13±0,02 FA/białko/polisacharyd 0,5 175±1 0,12±0,02 Białko/polisacharyd 0 183±1 0,17±0,01 2 tygodnie FA/białko/polisacharyd 0,25 173±2 0,14±0,03 FA/białko/polisacharyd 0,5 175±1 0,12±0,02 PDI

10 -9- Próbka nanożelu Stężenie FA w nanożelach (mm) Białko/polisacharyd 0 Czas przechowywania Dh (nm) FA/białko/polisacharyd 0,25 1 miesiąc 181±1 0,17±0,01 PDI 181±1 0,14±0,01 FA/białko/polisacharyd 0,5 177±2 0,14±0,01 Przykład 5: Ochrona kwasu foliowego przed degradacją UV w nanożelach kwas foliowy/białko soi/polisacharyd soi. [0043] Tak jak przedstawiono powyżej, kwas foliowy jest wrażliwy na promieniowanie UV. Z powodu wewnątrzcząsteczkowego wygaszania fluorescencji, kwas foliowy ma ekstremalnie niską wydajność kwantową fluorescencji wynoszącą w przybliżeniu 0,005. Pteryny powstające po cięciu wiązania C9-N10 w cząsteczce kwasu foliowego mają pik wzrostu fluorescencji około 445 nm. Kwantowa wydajność fluorescencji 6-formylopteryny (FPT) wynosi około 0,1, i kwasu pteryno-6-karboksylowego (PCA) wynosi około 0,2. Fluorescencja w regionie 445 nm wzrasta wraz z tworzeniem się FPT jako wynik cięcia wiązania C9-N10, po którym następuje fotoindukowana konwersja FPT do PCA [M.K. Off i in., Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 80 (2005) 47-55]. [0044] W tym badaniu określono degradację UV kwasu foliowego. Roztwór nanożelu kwas foliowy/białko/polisacharyd w ph 4,0 zawierający 0,25 lub 0,5 mm kwasu foliowego wprowadzono do 7 ml butelki szklanej w odległości 30 cm od radiometru UV (500 W, pik λ= 365 nm) na 1 h. Zbadano również sam kwas foliowy rozcieńczony w 10 mm buforze fosforowym, ph 7,4 przy stężeniu FA wynoszącym 0,25 lub 0,5 mm. Zbadano również mieszaninę 5 mg/ml białka i 0,25 mm kwasu foliowego w ph 7,4 i mieszaninę 15 mg/ml polisacharydu i 0,25 mm kwasu foliowego w ph 7,4. Po naświetlaniu UV, roztwór nanożelu kwas foliowy/białko/polisacharyd doprowadzono do ph 7,4 dla uwolnienia kwasu foliowego. Kwas foliowy uwolniony do roztworu wyizolowano stosując ultrafiltrację i poddano analizie tak jak opisano poniżej. Po odpowiednio 10-krotnym i 20-krotnym rozcieńczeniu 0,25 i 0,5 mm kwasu foliowego, zmierzono intensywność fluorescencji przy 450 nm dla ultrafiltratu wzbudzanego przy 348 nm. Wszystkie próbki poddawane badaniu pod kątem degradacji kwasu foliowego nie zawierają azydku sodu. [0045] Tabela 3 przedstawia stosunek intensywności fluorescencji kwasu foliowego przed i po naświetlaniu UV. Dla roztworu samego kwasu foliowego, po naświetlaniu UV, intensywność fluorescencji przy 450 nm wzrasta odpowiednio 89 i 85 krotnie, gdy stężenie kwasu foliowego wynosi 0,25 i 0,5 mm. Średnio 87-krotny wzrost intensywności fluorescencji po naświetlaniu UV oznacza degradację kwasu foliowego wewnątrz szklanej butelki. Zwiększanie stężenia kwasu foliowego z 0,25 do 0,5 mm nie wpływa w sposób znaczący na degradację. Pomimo tego, że samo białko może wiązać jedynie około 10% kwasu foliowego, a sam polisacharyd nie wiąże się z kwasem foliowym w ph 7,4 (Tabela 1), wynik w Tabeli 3 świadczy o tym, że w przypadku samego białka lub samego polisacharydu może dojść do znacznej redukcji

11 -10- degradacji kwasu foliowego. W porównaniu z samym kwasem foliowym, degradacja kwasu foliowego jest redukowana do 30% i 22% odpowiednio w obecności polisacharydu i białka w ph 7,4. Nanożele kwas foliowy/białko/polisacharyd mogą skutecznie chronić kwas foliowy przed degradacją w ph 4,0; jedynie 12% wprowadzonego kwasu foliowego uległo degradacji po identycznym napromieniowaniu UV. Zbadaliśmy również nanożele kwas foliowy/białko/polisacharyd po 1 miesiącu przechowywania; intensywność fluorescencji kwasu foliowego nie ulega zmianie po uwolnieniu i izolacji kwasu foliowego w porównaniu z nanożelami kwas foliowy/białko/polisacharyd przygotowywanymi na świeżo. Uwolniony i wyizolowany kwas foliowy z nanożeli kwas foliowy/białko/polisacharyd poddano naświetlaniu z wykorzystaniem światła UV. Po takim samym naświetlaniu, fluorescencja kwasu foliowego uległa zmianie przy otrzymywaniu kwasu foliowego bezpośrednio w roztworze o ph 7,4. Ten wynik przedstawia ponadto, że nanożele kwas foliowy/białko/polisacharyd mogą skutecznie chronić kwas foliowy przed degradacją UV w ph 4,0. Tabela 3. Stopień degradacji kwasu foliowego (FA) w różnych próbkach po naświetlaniu UV. Stopień degradacji określono mierząc intensywność widma emisyjnego fluorescencji kwasu foliowego przy 450 nm przed i po naświetlaniu UV. Kwas foliowy uwolniono przy ph 7,4 i wyizolowano stosując ultrafiltrację. Długość fali wzbudzenia fluorescencji to 348 nm Próbka Stężenie FA w żywności (mm) i ph przy naświetlaniu UV IUV/I 1) Stopień degradacji (%) FA 0,25, ph 7,4 89±3 100 FA 0,5, ph 7,4 85±2 100 Polisacharyd + FA 0,25, ph 7,4 27±4 30±5 Białko + FA 0,25, ph 7,4 20±2 22±3 Nanożele FA/białko/polisacharyd Nanożele FA/białko/polisacharyd 0,25, ph 4,0 11±1 12±1 0,5, ph 4,0 9±2 11±2 1) stosunek intensywności fluorescencji FA po naświetleniu UV względem intensywności przed naświetleniem UV. Przykład 6: Otrzymywanie nanożelu kwas foliowy/białko grochu/polisacharyd soi i ochrona kwasu foliowego przed degradacją UV. [0046] Białko grochu rozpuszczono w wodzie i ph doprowadzono do ph 3,25. Po doprowadzaniu do stanu równowagi przez noc, roztwór wirowano z 5000 obr./min. przez 30 minut dla usunięcia nierozpuszczonego białka. Supernatant zawierał 15 mg/ml białka grochu. Nanożele kwas foliowy/białko grochu/polisacharyd soi otrzymano mieszając roztwór polisacharydu soi z roztworem kwasu foliowego i roztworem białka grochu z mieszaniem w ph 7,4. W mieszaninie, stężenie końcowe białka grochu wyniosło 5 mg/ml, stężenie

12 -11- polisacharydów wyniosło 15 mg/ml, stężenie kwasu foliowego wyniosło 0,25 mm, a objętość wyniosła 25 ml. ph mieszaniny doprowadzono do 4,0, po 3 h mieszania, ph ponownie doprowadzono do 4,0. Mieszaninę homogenizowano stosując homogenizację wysokociśnieniową pod 600 bar przez 2 minuty, a następnie utrzymywano w temperaturze 90 C przez 1 h dla uzyskania nanożeli białko grochu/polisacharyd soi/ kapsułkowanych kwasem foliowym. Uzyskane nanożele mają wielkość 203 nm i PDI 0,23 (Tabela 5). [0047] Zbadano degradację UV kwasu foliowego. W porównaniu z samym kwasem foliowym, degradacja kwasu foliowego jest redukowana do 19% w przypadku obecności białka grochu (Tabela 4). Nanożele kwas foliowy/białko grochu/polisacharyd mogą skutecznie chronić kwas foliowy przed degradacją w ph 4,0; jedynie 13% wprowadzonego kwasu foliowego uległo degradacji po takim samym napromieniowaniu UV. Tabela 4. Stopień degradacji kwasu foliowego (FA) w różnych próbkach po naświetlaniu UV. Stopień degradacji określono mierząc intensywność widma emisyjnego fluorescencji kwasu foliowego przy 450 nm przed i po naświetlaniu UV. Kwas foliowy uwolniono w ph 7,4 i wyizolowano stosując ultrafiltrację. Długość fali wzbudzenia fluorescencji to 348 nm Próbka Stężenie FA w paszy (mm) i ph przy naświetlaniu UV IUV/I 1) Stopień degradacji (%) FA 0,25, ph 7, Nanożele FA/białko grochu 0,25, ph 4,0 17,5 19 Nanożele FA/białko grochu/polisacharyd 0,25, ph 4,0 11,5 13 1) stosunek intensywności fluorescencji FA po naświetleniu UV względem intensywności przed naświetleniem UV. Przykład 7: Stabilność roztworu nanożelu kwas foliowy/białko grochu/polisacharyd soi i roztworu nanożelu kwas foliowy/białko soi/polisacharyd soi w ph 3,0, 3,5 i 4,0 i zdolności do ponownego zawieszenia nanożeli po liofilizacji. [0048] Roztwór nanożelu kwas foliowy/białko grochu/polisacharyd soi i roztwór nanożelu kwas foliowy/białko soi/polisacharyd soi otrzymane w ph 4,0 zmieniono oddzielnie na ph 3,5 i 3,0 dla zbadania stabilności. Dane w Tabeli 5 pokazują, że rozmiary nanożelu nie ulegają zmianie po jednym tygodniu przechowywania w mediach o ph 3 i 3,5 co świadczy o tym, że nanożele są stabilne w warunkach ph napojów. Nanożele mogą być ponadto liofilizowane, a następnie ponownie zawieszane w wodzie. Po ponownym zawieszeniu, rozmiary nanożelu nie uległy znacznej zmianie, co sugeruje, że nanożele można przechowywać i wykorzystywać w postaci suchego proszku. Tabela 5. Wyniki DLS dla nanożeli kwas foliowy/białko grochu/polisacharyd soi i nanożeli kwas foliowy/białko soi/polisacharyd soi w ośrodkach o ph 3,0, 3,5 i 4,0 i po ponownym zawieszeniu po liofilizacji w ośrodku o ph 4,0. Stężenie kwasu foliowego wynosi 0,25 mm.

13 -12- Przygotowany na świeżo Przechowywanie przez jeden tydzień Po liofilizacji i ponownym zawieszeniu Próbka FA/białko soi/polisacharyd FA/białko grochu/polisacharyd FA/białko soi/polisacharyd FA/białko grochu/polisacharyd ph roztworu Dh (nm) PDI 4, ,11 3, ,15 3, ,16 4, ,23 3, ,19 3, ,19 4, ,15 3, ,21 3, ,18 4, ,23 3, ,23 3, ,20 FA/białko soi/polisacharyd 4, ,18 FA/białko grochu/polisacharyd 4, ,16 Piotr Godlewski Rzecznik patentowy

14 Kompozycja nanożelowa zawierająca: Zastrzeżenia patentowe a) 0,1 do 5% masowych względem suchej masy kompozycji co najmniej jednego składnika aktywnego rozpuszczalnego w wodzie wybranego spośród kwasu askorbinowego, biotyny, kwasu foliowego, kwasu nikotynowego, tiaminy i witaminy B6; b) 9 do 40% masowych względem suchej masy kompozycji jednego lub większej liczby białek roślinnych wybranych z grupy białek odpowiednich do wprowadzania do żywności; i c) 50 do 90% masowych względem suchej masy kompozycji jednego lub większej liczby rozpuszczalnych polisacharydów soi; przy czym stosunek masowy białka/białek do polisacharydu/polisacharydów w oparciu o kompozycję suchej masy wybrano jako 1 : b z uwzględnieniem, że b mieści się między 1 a Kompozycja nanożelowa według zastrzeżenia 1, przy czym rozpuszczalnym w wodzie składnikiem aktywnym jest kwas foliowy. 3. Kompozycja nanożelowa według dowolnego z zastrzeżeń 1 albo 2, przy czym jedno lub większą liczbę białek roślinnych wybrano z grupy składającej się z białka soi, białka łubinu, białka grochu i białka ziemniaka. 4. Kompozycja nanożelowa według dowolnego z zastrzeżeń 1 do 3, przy czym jednym lub większą liczbą białek roślinnych są białka soi i/lub grochu. 5. Kompozycja według dowolnego z poprzednich zastrzeżeń, przy czym średni rozmiar cząstek mieści się między 120 a 250 nm i jest mierzony przy zastosowaniu dynamicznego rozpraszania światła. 6. Sposób wytwarzania stabilnego nanożelu zawierającego co najmniej jeden składnik aktywny rozpuszczalny w wodzie wybrany spośród kwasu askorbinowego, biotyny, kwasu foliowego, kwasu nikotynowego, tiaminy, i witaminy B6; który obejmuje następujące etapy: I) mieszania z wodą jednego lub większej liczby rozpuszczalnego polisacharydu/polisacharydów soi jako roztworu w ph około 7,4 z roztworem co najmniej jednego składnika aktywnego rozpuszczalnego w wodzie wybranego spośród kwasu askorbinowego, biotyny, kwasu foliowego, kwasu nikotynowego, tiaminy i witaminy B6 i roztworu białek roślinnych, przy czym stężenie białka sojowego wynosi od 1 do 10 g/l, stosunek masowy białka do polisacharydu wynosi od 1:1 do 1:6, i stężenie składnika aktywnego rozpuszczalnego w wodzie mieści się w zakresie między 0,001 a 0,2 g/l, II) ewentualnego mieszania mieszaniny z etapu I) przez 1 minutę do 8 godzin, III) doprowadzania ph mieszaniny z etapu I) lub II) do ph około 4, i ponownego doprowadzania ph po 2 do 3 godzinach;

15 -14- IV) homogenizowania mieszaniny z etapu III) z zastosowaniem standardowego procesu homogenizacji znanego znawcy z późniejszym utrzymywaniem w temperaturze 90 C przez 1 godzinę; V) utrzymywania nanożelu w temperaturze zawartej między 70 a 95 C, przez co najmniej 45 minut; VI) ewentualnego suszenia nanożelu otrzymanego w etapie V). 7. Sposób wytwarzania stabilnego nanożelu według zastrzeżenia 6, przy czym stężenie białek roślin wynosi od 4 do 6 g/l. 8. Sposób wytwarzania stabilnego nanożelu według zastrzeżenia 6 albo 7, przy czym stosunek masowy białka do polisacharydu wynosi od 1:2 do 1:4. 9. Sposób wytwarzania stabilnego nanożelu według zastrzeżeń 6 do 8, przy czym stężenie składnika aktywnego wynosi między 0,01 a 0,15 g/l. 10. Nanożel, który można uzyskać sposobem według dowolnego z zastrzeżeń od 6 do Nanożel według zastrzeżenia 10, przy czym białkiem roślinnym jest białko soi lub białko grochu, a składnikiem aktywnym jest kwas foliowy. 12. Zastosowanie kompozycji nanożelowej jak zastrzeżono w dowolnym z zastrzeżeń od 1 do 5 dla wzbogacenia i/lub uzupełnienia kompozycji spożywczych, napojów, pasz dla zwierząt, kosmetyków. 13. Sposób wytwarzania napoju obejmujący etap mieszania kompozycji nanożelowej według dowolnego z zastrzeżeń od 1 do 5 z dalszymi standardowymi składnikami napojów. 14. Napój możliwy do otrzymania sposobem według zastrzeżenia Napój według zastrzeżenia 14, przy czym ph napoju wynosi między 3 a 5,5. Piotr Godlewski Rzecznik patentowy

16 -15-

17 -16-