(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2009/03 EP B1 (13) T3 (51) Int. Cl. A61K39/187 A61K39/00 C12N7/04 ( ) ( ) ( ) (54) Tytuł wynalazku: Szczepionka zawierająca atenuowane pestiwirusy (30) Pierwszeństwo: DE (43) Zgłoszenie ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2007/07 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 06/2009 (73) Uprawniony z patentu: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, Ingelheim am Rhein, DE (72) Twórca (y) wynalazku: PL/EP T3 MEYERS Gregor, Walddorfhaeslach, DE EGE Andreas, Tübingen, DE MEYER Christiane, Münster, DE VON FREYBURG Martina, Heilbronn, DE (74) Pełnomocnik: Łazewska i Łazewski sp.j. rzecz. pat. Dobrzański Jan Warszawa skr. poczt. 100 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 1 EP B1 Z Szczepionka zawierająca atenuowane pestiwirusy Tło wynalazku Dziedzina techniki Bieżący wynalazek dotyczy obszaru zdrowia zwierząt i w szczególności atenuowanych pestiwirusów takich, jak wirus wirusowej biegunki bydła (BVDV). Stan techniki Pestiwirusy stanowią przyczynę istotnych z punktu widzenia ekonomicznego chorób zwierząt w wielu krajach na całym świecie. Obecnie znane izolaty wirusa zostały zgrupowane w czterech różnych gatunkach, które wspólnie utworzyły jeden rodzaj w rodzinie Fluviviridae. I/II Wirus wirusowej biegunki bydła (BVDV ang. bovine viral diarrhea virus) typu 1 (BVDV-I) i typu 2 (BVDV-2) powoduje wirusową biegunkę bydła (BVD) i choroby błon śluzowych (MD) u bydła (Baker, 1987; Moennig i Plagemann, 1992; Thiel i inni, 1996). Podział BVDV na 2 gatunki opiera się na znaczących różnicach na poziomie sekwencji genomu (podsumowane w Heinz i inni, 2000), które również w sposób oczywisty wynikają z ograniczonych reakcji krzyżowych zobojętniania przeciwciał (Ridpath i inni, 1994). III Wirus klasycznego pomoru świń (CSFV), dawniej zwany wirusem cholery świń, jest odpowiedzialny za klasyczny pomór świń (CSF) lub cholerę świń (HC) (Moennig i Plagemann, 1992; Thiel i inni, 1996). IV Wirus choroby granicznej (BDV) jest zwykle wykrywany u owiec i powoduje chorobę graniczną (BD). Po zakażeniu wewnątrzmacicznym BDV owiec, mogą się rodzić przewlekle zakażone jagnięta, które są słabe i wykazują różne nieprawidłowości, wśród których najbardziej znany jest nienormalny karakułowy włos noworodka (zespół hairy shaker ) (Moennig i Plagemann, 1992; Thiel i inni, 1996). Pestiwirusy to małe otoczone wirusy z jedną nicią RNA genomu o dodatniej polaryzacji o brakujących sekwencjach zarówno 5'cap i 3'poli(A). Wirusowy genom koduje poliproteinę o około 4000 aminokwasach dającą końcowe produkty rozpadu w wyniku obróbki w trakcie translacji i postranslacyjnej przy udziale proteaz komórkowych i wirusowych. Wirusowe białka ułożone są w poliproteinie w następującej kolejności: NH 2 - N pro -C-E ms -E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH (Lindenbach i Rice, 2001). Białko C (= białko rdzenia lub kapsydu) oraz glikoproteiny E ms, El i E2 stanowią

3 elementy strukturalne wirionu pestiwirusa jak pokazano dla CSFV (Thiel i inni, 1991). Dotyczy to również BVDV. E2 i w mniejszym stopniu E ms okazały się być celami do zobojętniania przeciwciał (Donis i inni, 1988; Paton i inni, 1992; van Rijn i inni, 1993; Weiland i inni, 1990,1992). E ms nie posiada typowej kotwicy membranowej i jest wydzielane w znacznych ilościach z zakażonych komórek; doniesiono, że białko to wykazuje aktywność RNazy (Hulst i inni, 1994; Schneider i inni, 1993; Windisch i inni, 1996). Funkcja tej aktywności enzymatycznej dla wirusowego cyklu życiowego jest obecnie nieznana. Aktywność enzymatyczna zależy od obecności dwóch konserwatywnych odcinków aminokwasowych między E ms pestiwirusa i inną znaną RNazą pochodzenia roślinnego i grzybowego. Obie te konserwatywne sekwencje zawierają reszty histydynowe (Schneider i inni, 1993). Wymiana każdej z tych reszt na lizynę w białku E ms w szczepie szczepionki CSFV spowodowało zniszczenie aktywności RNazy (Hulst i inni, 1998). Wprowadzenie tych mutacji do genomu szczepu szczepionki CSFV nie wpłynęło na żywotność wirusa lub właściwości wzrostu, ale doprowadziła do wirusa wykazującego fenotyp cytopatogeniczny (Hulst i inni, 1998). Podobnie Meyers i inni wykazali, że ujemna pod względem aktywności RNazy odmiana zjadliwego szczepu CSFV Alfort/Tübingen była w pełni żywotna. Jednakże, odpowiednie mutant wirusa nie wykazał fenotypu cytopatogenicznego (Meyers i inni, 1999). N pro stanowi pierwsze białko kodowane przez długie otwarte ramki odczytu w pestiwirusowym RNA. N pro stanowi białko niestrukturalne, które posiada aktywność proteazową i odszczepia się z tworzącej się poliproteiny (Stark i inni, 1993; Wiskerchen i inni, 1991) prawdopodobnie już w trakcie translacji. N pro jest proteazą cysteinową (Rümenapf i inni, 1998), która nie jest niezbędna do replikacji wirusa (Tratschin i inni, 1998). Ostatnio wykazano, że N pro w pewnym stopniu ingeruje w komórkową obronę przeciwwirusową tak, że można sugerować modulację układu odpornościowego w zakażonym żywicielu (Rüggli i inni, 2003). Mayer i współpracownicy przedstawili wskazania na atenuację CSFV w wyniku delecji genu N pro (Mayer i inni, 2004). Obecne szczepionki BVDV do zapobiegania i leczenia zakażeń BVDV nadal posiadają wady (Oirschot i inni, 1999). Szczepionki przeciwko klasycznemu BVDV-1 zapewniają jedynie częściową ochronę przed zakażeniem BVDV-2 i zaszczepione samice mogą dać cielęta, które będą trwale zakażone zjadliwym BVDV-2 (Bolin i inni, 1991, Ridpath i inni, 1994). Ten problem jest prawdopodobnie związany z wielką różnorodnością antygenową między typem 1 i typem 2 szczepów, która jest najbardziej wyraźna w glikoproteinie E2, głównym antygenie zobojętniania wirusa (Tijssen i inni, 1996). Większość

4 monoklonalnych przeciwciał przeciwko szczepom typu 1, nie wiążą się do wirusów typu 2 (Ridpath i inni, 1994). Szczepionki zawierające atenuowane lub zabite wirusy lub białka wirusowe ulegające ekspresji w heterologicznym systemie ekspresji zostały wygenerowane dla CSFV i BVDV i są obecnie wykorzystywane. Zabite szczepionki (cały wirus inaktywowany) lub szczepionki podjednostkowe (tradycyjnie oczyszczone lub białka wirusowe ulegające heterologicznej ekspresji) są najczęściej gorsze od żywych szczepionek w ich skuteczności wywoływania pełnej ochronnej odpowiedzi immunologicznej, nawet w obecności adiuwantów. Podstawy strukturalne atenuowania BVDV zastosowanego jako żywa szczepionka nie są znane. Szczepionki te, choć osłabione, najczęściej związane są z problemami bezpieczeństwa. Wirusy szczepionki mogą przenikać przez łożysko zwierząt ciężarnych, np. krów i prowadzić do objawów klinicznych w płodzie i/lub wywołania przewlekłego zakażenia u cieląt. Dlatego nie mogą być stosowane w odniesieniu do stad hodowlanych, które zawierają ciężarne krowy. Ciężarne krowy muszą być oddzielone od szczepionego bydła w celu ochrony płodów i nie mogą być same zaszczepione. Ponadto, rewertanty atenuowanych żywych BVDV stanowią poważne zagrożenie dla zwierząt. Dla tradycyjnie otrzymywanych atenuowanych wirusów, u których atenuacja jest osiągnięta na drodze wielokrotnych pasaży, pochodzenie drobinowe, jak również stabilność genetyczna atenuacji pozostają nieznane i powrót do zjadliwego dzikiego gatunku jest nieprzewidywalny. Ze względu na znaczenie skuteczności i bezpieczneństwa, jak również wykrywalnej profilaktyki i leczenia zakażeń pestiwirusowych, istnieje silna potrzeba poprawy atenuowanych pestiwirusów, takich jak BVDV, o wysokim potencjale indukcji odporności, jak również określonych podstaw atenuacji, które również można odróżnić od zjadliwych pestiwirusów, takich jak BVDV, jak również kompozycji i szczepionek zawierających wspomniane atenuowane pestiwirusy, takie jak BVDV. W związku z tym technicznym problemem leżącym u podstawy niniejszego wynalazku jest dostarczenie ulepszonych atenuowanych pestiwirusów, w odniesieniu do atenuowanych BVDV, do wykorzystania jako żywe atenuowane szczepionki. Takie ulepszone atenuowane pestiwirusy, korzystnie BVDV, powinny w szczególności (i) same nie przenikać przez łożysko i (ii) indukować odporność, która uniemożliwia wirusowej transmisji przez łożysko, a tym samym zapobiega problemom ciążowym takim jak aborcja płodu lub urodzenia przewlekle zakażonego żywiciela takiego jak cielęta w przypadku zakażenia BVDV.

5 Krótki opis rysunków Fig. 1 Zobojętnianie surowicy przeciwko NY93/C (BVDV typu 2) Fig. 2 Test zobojętniania surowicy przeciwko KE9 (BVDV typu 1) Fig. 3 Test zobojętniania surowicy przeciwko NY93/C (BVDV typu 2) Wszystkie kolejne sekwencje pokazują usunięte obszary wskazane myślnikami (-), które są również ponumerowane, natomiast sekwencje w kolejności załączonego tutaj zestawienia są ponumerowane w sposób ciągły bez usuniętych obszarów lub kodonów aminokwasów. Nr sekwencji: 1 sekwencja XIKE-A-cDNA Nr sekwencji: 2 sekwencja XIKE-A-NdN-cDNA Nr sekwencji: 3 sekwencja XIKE-B-cDNA Nr sekwencji: 4 XIKE-B -NdN-cDNA Nr sekwencji: 5 sekwencja aminokwasów XIKE-A Nr sekwencji: 6 sekwencja aminokwasów XIKE-A-NdN Nr sekwencji: 7 sekwencja aminokwasów XIKE-B Nr sekwencji: 8 sekwencja aminokwasów XIKE-B-NdN Nr sekwencji: 9 sekwencja aminokwasów XIKE-C-NdN Nr sekwencji: 10 sekwencja XIKE-C-NdN-cDNA Nr sekwencji: 11 sekwencja XIKE-C-cDNA Nr sekwencji: 12 sekwencja aminokwasów XIKE-C Krótkie streszczenie wynalazku Przedmiotowy wynalazek dotyczy atenuowanych pestiwirusów, korzystnie atenuowanego BVDV, w którym co najmniej jedna mutacja znajduje się w sekwencji kodującej glikoproteinę E ms i co najmniej jedna kolejna mutacja znajduje się w sekwencji kodującej N pro, która korzystnie prowadzi do złożonej inaktywacji aktywności RNazy znajdującej się w glikoproteinie E ms w dodatku do inaktywacji (hipotetycznie) aktywności immunemodulującej znajdującej się w N pro. Wynalazek dotyczy również sposobów atenuownia pestiwirusów w taki sposób, że atenuacja prowadzi do atenuowanych pestiwirusów, korzystnie atenuowanych BVDV, jak opisano powyżej. Bieżący wynalazek ponadto dotyczy cząsteczek kwasów nukleinowych kodujących wspomniane atenuowane pestiwirusy, korzystnie kodujących atenuowane BVDV, kompozycje i szczepionki obejmujące atenuowane pestiwirusy, korzystnie BVDV jak ujawniono tutaj. Szczegółowy opis wynalazku Definicje terminów używanych w opisie

6 Przed zapoznaniem się z wariantami wykonania niniejszego wynalazku należy zwrócić uwagę, że użyte tutaj i w załączonych zastrzeżeniach pojedyncze formy jakiś i ten odnoszą się do liczby mnogiej, chyba, że kontekst wyraźnie wskazuje inaczej. Tak więc, na przykład odniesienie do BVDV obejmuje wiele takich BVDV, odniesienie do komórka jest odniesieniem do jednej lub większej ilości komórek i jej odpowiedników znanych osobie biegłej w dziedzinie, i tak dalej. O ile nie określono inaczej, wszystkie techniczne i naukowe terminy użyte tutaj mają takie samo znaczenie jak powszechnie rozumiane przez osobę biegłą w dziedzinie, której dotyczy wynalazek. Pomimo tego, że w praktyce i badaniach przedmiotowego wynalazku mogą być stosowane wszelkie sposoby i materiały podobne lub równoważne do tych opisanych tutaj, opisane będą teraz korzystne sposoby, urządzenia i materiały. Wszystkie publikacje tutaj wymienione zawarte są tutaj jako odnośniki w celu opisania i ujawnienia linii komórkowych, wektorów i metodologii, jak przedstawiono w publikacjach, które mogą być wykorzystywane w związku z wynalazkiem. Niczego tutaj nie należy traktować jako przyznanie, że wynalazek nie obejmuje takiego ujawnienia w związku z wynalazkiem wcześniejszym. Termin pestiwirus stosowany tutaj odnosi się do wszystkich elementów rodzaju Pestivirus, w tym BVDV, CSFV i BDV, w rodzinie Fluviviridae. Termin CSFV stosowany tutaj odnosi się do wszystkich wirusów należących do gatunku wirusa klasycznego pomoru świń (CSFV) w rodzaju Pestivirus w rodzinie Fluviviridae. Termin BVDV stosowany tutaj odnosi się do wszystkich wirusów należących do gatunku wirusa wirusowej biegunki bydła (BVDV) typu 1 (BVDV-1) i BVDV typu 2 (BVDV-2) w rodzaju Pestivirus w rodzinie Fluviviridae (Heinz i inni, 2000). Bardziej klasyczne szczepy BVDV typu 1 i niedawno rozpoznane szczepy BVDV typu 2 wykazują niektóre ograniczone, ale charakterystyczne różnice w sekwencji nukleotydów i aminokwasów. Termin N pro jest rozumiany tutaj jako pierwsze białko kodowane przez wirusowe otwarte ramki odczytu i odszczepiające się od pozostałej syntetyzowanej poliproteiny (Stark, i inni J. Virol. 67: (1993); Wiskerchen, i inni, Virol. 65: (1991)). Wspomniany termin, w zależności od kontekstu, może odnosić się także do pozostałych aminokwasów N pro po mutacji nukleotydowej sekwencji kodującej lub do nukleotydowej sekwencji kodującej samego wspomnianego białka. Aktywność proteazowa znajdująca się w N pro odnosi się do aktywności rozszczepiania polipeptydów wspomnianego N pro.

7 E ms jak zastosowano tutaj odnosi się do glikoproteiny E ms, która stanowi element strukturalny w wirionie pestiwirusowym (Thiel i inni, 1991). E ms nie posiada typowej kotwicy błonowej i jest wydzielana w znacznych ilościach z zakażonych komórek; ujawniono, że białko to wykazuje aktywność RNazy (Hulst i inni, 1994; Schneider i inni, 1993; Windisch i inni, 1996). Należy zauważyć, że termin glikoproteina E0 jest często używany w publikacjach jednocześnie z glikoproteiną E ms. Wspomniany termin, w zależności od kontekstu, może również odnosić się do zmutowanego białka E ms po mutacji nukleotydowej sekwencji kodującej lub do nukleotydowej sekwencji kodującej samego białka. Aktywność RNazy znajdująca się w glikoproteinie E ms odnosi się do aktywności rozszczepiania RNA wspomnianej glikoproteiny, tj. zdolności glikoproteiny E ms do hydrolizy RNA. Termin inaktywacja aktywności RNazy znajdującej się we wspomnianej glikoproteinie odnosi się do niezdolności lub ograniczonej zdolności zmodyfikowanej glikoproteiny E ms do hydrolizy RNA w porównaniu do niezmodyfikowanego dzikiego typu wspomnianej glikoproteiny E ms. Atenuacja: atenuowane pestiwirusy lub cząstki BVDV jak zastosowano tutaj oznacza, że istnieją istotne statystycznie różnice pomiędzy zjadliwością atenuowanych pestiwirusów lub cząstek BVDV według wynalazku, w którym wspomniane atenuowane cząstki wirusowe poddawane są atenuacji sposobami opisanymi tutaj, i dzikim typem pestiwirusa lub izolatów BVDV, z których zostały uzyskane atenuowane pestiwirusy lub cząstki BVDV, dla dominujących parametrów klinicznych, w przypadku BVDV dla biegunki, gorączki i śmiertelności u zwierząt zarażonych taką samą dawką, korzystnie 6xl0 6 TCID 50. Tak więc, wspomniane atenuowane cząstki BVDV nie powodują biegunki, gorączki i śmiertelności, a tym samym mogą zostać wykorzystane w szczepionce. Inaktywacja E ms użyta tutaj oznacza aktywność RNazy nieznacznie powyżej poziomu zmierzonego dla niezakażonych komórek kontrolnych w analizie RNazy jak opisano w Meyers i inni, Nieznacznie powyżej poziomu zmierzonego dla niezakażonych komórek kontrolnych w analizie RNazy jak opisano w Meyers i inni, 1999, oznacza na przykład, że aktywność RNazy jest mniejsza niż 150% w porównaniu do niezakażonych komórek kontrolnych. Inaktywacja N pro jak zastosowano tutaj oznacza zapobieganie lub znaczne zmniejszenie prawdopodobnej aktywności immunomodulującej N pro poprzez mutację. W korzystnym wariancie mutacja ta uniemożliwia lub znacznie ogranicza ingerencję N pro w indukcję odpowiedzi interferonu poprzez zakażone komórki, jak opisano przez Rüggli i inni, (2003). W tym przypadku, inaktywacja N pro pozwoliłoby komórce zorganizaowć normalną odpowiedź interferonu.

8 Sygnały procesowe jak zastosowano tutaj odnoszą się do substancji, która zapewnia generację czynnościowego N-końcowego białka C pestiwirusa, korzystnie BVDV, w szczególności substancji wybranych z grupy ubikwityna, LC3, SUMO-1 NEDD8, GATE- 16 i GABA(A)RAP. Również proteazy wybrane z grupy inteina, 3C pikornawirusa, 2A caridovirusa i pl5 wirusowej krwotocznej choroby królików są rozumiane jako sygnały procesowe jak zastosowano tutaj. Wszelkie inne podobne przetwarzania sygnału znane osobie biegłej w dziedzinie, które zapewniają generację czynnościowego N-końcowego białka C powinny również zawierać się w pojęciu sygnały procesowe. Białko C lub C białko lub C-białko jak zastosowano tutaj, odnosi się do strukturalnego elementu w wirionie pestiwirusa (Thiel i inni, 1991). Białko C jest kapsydem lub białkowym rdzeniem pestiwirusa. Wspomniany termin, w zależności od kontekstu, może odnosić się także do Białka C z jednym lub kilkoma zmianami aminokwasowymi wynikającymi z mutacji w nukleotydowej sekwencji kodującej. Fragment według wynalazku jest każdą podjednostką cząsteczki polinukleotydowej według wynalazku, tj. każdy podzbiór. Dla DNA, wspomniany fragment jest znamienny tym, że jest on krótszy niż DNA obejmujący pełną długość genomu wirusowego. Odmiana czynnościowa cząsteczki nukleotydowej według wynalazku jest cząsteczką nukleotydową, która posiadają aktywność biologiczną (albo czynnościową albo strukturalną), która jest zasadniczo podobna do cząsteczki nukleotydowej według wynalazku. Termin odmiana czynnościowa obejmuje również, jakiś fragment,,,jakąś odmianę czynnościową, odmianę opartą na degeneratywnym kodzie kwasu nukleinowego lub chemicznej pochodnej. Taka odmiana czynnościowa np. może nieść ze sobą jedną lub kilka zmian nukleotydowych delecji lub insercji. Wspomniana odmiana czynnościowa przynajmniej częściowo zachowuje swoją aktywność biologiczną, np. funkcję zakaźną klonu lub szczepu szczepionki, lub nawet wykazuje poprawę aktywności biologicznej. Posiadać aktywność biologiczną, która jest zasadniczo podobna oznacza w odniesieniu do dostarczonych tutaj pestiwirusów, na przykład, że wspomniany pestiwirus jest atenuowany w sposób opisany tutaj i w rezultacie otrzymuje się niezjadliwy wirus odpowiedni do produkcji żywego atenuowanego wirusa, który traci zdolność do przechodzenia przez łożysko, ale pośredniczy w reakcji immunologicznej po szczepieniu. Odmiana oparta na degeneratywnej naturze kodu genetycznego jest odmianą wynikającą z faktu, że pewien aminokwas może być kodowany przez kilka różnych trypletów nukleotydowych. Wspomniana odmiana przynajmniej częściowo zachowuje swoją aktywność biologiczną, lub nawet wykazuje poprawę biologicznych działalności.

9 Cząsteczka jest zasadniczo podobna do innej cząsteczki, jeśli obie cząsteczki mają zasadniczo podobne sekwencje nukleotydowe lub aktywność biologiczną. Tak więc, pod warunkiem, że dwie cząsteczki posiadają podobną aktywność, są one traktowane jako odmiany tego terminu, w znaczeniu użytym tutaj, jeżeli sekwencja nukleotydowa nie jest identyczna, i dwie cząsteczki, które mają podobne sekwencje nukleotydowe są uważane za odmiany, w znaczeniu użytym tutaj, nawet, jeśli ich aktywność biologiczna nie jest identyczna. Mutacja jak zastosowano tutaj odnosi się do zmian w cząsteczkach kwasów nukleinowych kodujących białka/aminokwasy według wynalazku. Wspomniane mutacje dotyczą, ale nie ograniczają się do substytucji (wymiana jednego lub kilku nukleotydów/par zasad), delecji (usunięcie jednego lub kilku nukleotydów/par zasad) i/lub insercji (dodanie jednego lub kilku nukleotydów/par zasad). Używane w niniejszym dokumencie, mutacją może być pojedyncza mutacja lub kilka mutacji, więc często termin mutacja(e) jest używany i dotyczy zarówno pojedynczych mutacji i kilku mutacji. Wspomniane mutacje obejmują, ale nie ograniczają się do mutacji punktowych (mutacje pojedynczego nukleotydu) lub większych mutacji, w których np. część kodujących cząsteczek kwasu nukleinowego ulegają delecji, substytucji i/lub dodatkowym insercjom kodującego kwasu nukleinowego. Wspomniane mutacje mogą powodować zmodyfikowaną ekspresję polipeptydu ze względu na zmianę sekwencji kodującej. Takie zmodyfikowane polipeptydy są pożądane, jak określono w ujawnieniu wynalazku, jak określono poniżej. Termin szczepionka jak zastosowano tutaj odnosi się do kompozycji farmaceutycznej obejmującej, co najmniej jeden immunologicznie aktywny składnik, który wywołuje reakcję immunologiczną u zwierząt i ewentualnie, ale niekoniecznie, jednego lub większej liczby dodatkowych składników, które zwiększają aktywność immunologiczną wspomnianego składnika aktywnego. Szczepionka może dodatkowo obejmować dalsze składniki typowe dla kompozycji farmaceutycznych. Immunologicznie aktywny składnik szczepionki może zawierać wszystkie cząstki wirusa albo w ich oryginalnej postaci albo w postaci atenuowanych cząsteczek w tzw zmodyfikowanej żywej szczepionce (MLV) lub cząstki inaktywowane odpowiednimi sposobami w postaci tzw zabitej szczepionce (KV). W innej formie immunologiczny składnik aktywny szczepionki może zawierać odpowiednie elementy wspomnianych organizmów (szczepionki podjednostkowe), w których elementy te są generowane albo przez zniszczenie całych cząstek lub wzrastające kultury zawierające takie cząstki i ewentualnie kolejne kroki oczyszczania dają pożądaną strukturę(y), lub poprzez procesy syntetyczne obejmujące

10 odpowiednie manipulacje przez użycie odpowiedniego systemu opartego, na przykład na bakteriach, owadach, ssakach lub innych gatunkach plus ewentualnie kolejne procedury izolacji i oczyszczania, lub poprzez indukcję wspomnianych syntetycznych procesów u zwierzęcia wymagającego szczepionki przez bezpośrednie włączenie materiału genetycznego z wykorzystaniem odpowiednich kompozycji farmaceutycznych (szczepienia polinukleotydowe). Szczepionka może składać się z jednego lub jednocześnie więcej niż z jednego elementu opisanego powyżej. Termin szczepionka jest tu rozumiany jako szczepionka do użytku weterynaryjnego zawierająca substancje antygenowe i jest podawana w celu wywołania specyficznej i aktywnej odporności przeciwko chorobom wywołanym przez zakażenia pestiwirusami, korzystnie przez zakażenia BVDV. Atenuowany pestiwirus, w szczególności atenuowany BVDV jak opisano tutaj, daje aktywną odporność, która może być przenoszona biernie za pośrednictwem przeciwciał matek przeciwko immunogenom, które zawiera i czasami również przeciwko antigenicznie podobnym organizmom. Szczepionka według wynalazku odnosi się do szczepionek, jak określono powyżej, w której jedynym immunologicznie aktywnym składnikiem jest BVDV lub pochodzący od pestiwirusa lub pochodzący z nukleotydowej sekwencji, która jest więcej niż w 70% homologiczna do wszelkich znanych sekwencji pestiwirusowych (sensownych lub antysensownych). Termin żywa szczepionka odnosi się do szczepionki zawierającej żywy, w szczególności, żywy aktywny składnik wirusowy. Dodatkowymi elementami w celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej są składniki powszechnie określane jako adiuwanty, jak np. wodorotlenek glinowy, oleje mineralne lub inne lub cząsteczki pomocnicze dodawane do szczepionek lub wytwarzane przez organizm po odpowiedniej indukcji przez takie dodatkowe elementy, takie jak, ale nieograniczone do interferonów, interleukin lub czynników wzrostu. Kompozycja farmaceutyczna zasadniczo składa się z jednego lub kilku składników zdolnych do modyfikacji fizjologicznych np. funkcji immunologicznych organizmu, któremu jest on podawany lub organizmów w nim lub na nim żyjących. Termin obejmuje, ale nie jest tym ograniczony, antybiotyki lub (leki) przeciwpasożytnicze, jak również inne składniki powszechnie stosowane w celu osiągnięcia pewnych celów, takich jak, ale nieograniczone do, przetwarzania cech, jałowości, stabilności, wykonalności poprzez podanie kompozycji na drodze wewnątrzjelitowej lub pozajelitowej taką jak podanie doustne, donosowe, dożylne, domięśniowe, podskórne, śródskórne lub inną odpowiednią drogą, tolerancji po podaniu, właściwości kontrolowanego uwalniania. Jednym nieograniczającym przykładem takiej kompozycji farmaceutycznej, podanej wyłącznie do

11 celów demonstracyjnych, może być przygotowana w następujący sposób: supernatant kultury komórkowej skażonej hodowli komórkowej jest mieszany ze stabilizatorem (np. spermidyną i/lub BSA (albumina surowicy bydlęcej)) i mieszanina, następnie liofilizowana lub odwodadniana innymi sposobami. Przed szczepieniem, wspomniana mieszanina jest następnie z powrotem uwadniana w roztworze wodnym (np. soli fizjologicznej, PBS (buforowana sól fizjologiczna)) lub w roztworze niewodnym (np. emulsji olejowej, adiuwancie opartym na glinie). Ujawnienie wynalazku Rozwiązanie powyższego problemu technicznego osiągnięte jest w opisie i wariantach scharakteryzowanych w zastrzeżeniach. Nieoczekiwanie stwierdzono, że pestiwirusy, w szczególności BVDV można skuteczniej atenuować poprzez wprowadzenie, co najmniej jednej mutacji do sekwencji kodującej glikoproteinę E ms i przynajmniej jednej kolejnej mutacji w sekwencji kodującej N pro, która korzystnie prowadzi do połączonej inaktywacji aktywności RNazy znajdującej się w glikoproteinie E ms w dodatku do inaktywacji aktywności immunomodulującej znajdującej się w N pro. Efekt immunomodulujący jest w jednym aspekcie jest wskazany, ale nieograniczony do wskazanych funkcji dla jednego pestiwirusa w sposób wzorowany na Ruggli i inni (2003). Pestiwirus, w szczególności BVDV atenuowany według bieżącego wynalazku może być użytecznie stosowany w szczepionkach. Wspomniany atenuowany pestiwirus, w szczególności wspomniany atenuowany BVDV dostarcza teraz żywą szczepionkę o wysokiej immunogeniczności. Ponadto nieoczekiwanie, pestiwirus, w szczególności BVDV według wynalazku jest bezpieczny w stosowaniu dla zwierząt w ciąży, ponieważ nie przenika przez łożysko. Jest to zilustrowane w nieograniczający sposób dla BVDV w przykładzie 3. Ponadto, żywe szczepionki z określonymi mutacjami, jako podstawa do atenuacji, pozwolą uniknąć niedogodności obecnego pokolenia szczepionek, np. ryzyka rewersji do bardziej patogennego szczepu. Kolejna zaleta wspomnianych atenujących mutacji polega na ich niepowtarzalności molekularnej, która pozwala na zastosowanie ich jako charakterystyczne określenia dla atenuowanego pestiwirusa, w szczególności BVDV i odróżnić je od pestiwirusa, w szczególności od BVDV z dziedziny. Dlatego w jednym z aspektów bieżący wynalazek dostarcza atenuowany pestiwirus, w szczególności atenuowany BVDV posiadający, co najmniej jedną mutację w sekwencji kodującej glikoproteinę E ms i co najmniej kolejną mutację w sekwencji kodującej N pro. Korzystnie w takim atenuowanym pestiwirusie, korzystnie w takim atenuowanym BVDV wspomniana

12 mutacja w sekwencji kodującej glikoproteinę E ms prowadzi do inaktywacji aktywności RNazy związanej z E ms i/lub wspomnianej mutacji w sekwencji kodującej N pro prowadzi do inaktywacji wspomnianego N pro. Wspomniana inaktywacja może odbywać się poprzez wszelkie mutacje znane osobie biegłej w dziedzinie w sekwencji kodującej E ms i N pro, w których mutacje są dowolnymi mutacjami, jak określono w sekcji definicji, takie jak mutacje polegająca delecji, insercji i/lub substytucji. Korzystniej, mutacja(-e) są delecjami, ponieważ prawdopodobieństwo rewertacji do typu dzikiego jest najniższe dla delecji. Wykazano, że glikoproteina E ms tworzy homodimer połączony wiązaniem disiarczkowym o około 97 kd, gdzie każdy monomer składa się z 227 aminokwasów odpowiadających aminokwasom 268 do 494 poliproteiny CSFV opisanych przez Rümenapf i inni (1993). Sekwencja genomu szczepu Alfort/Tübingen CSFV dostępna jest w bibliotece danych GenBank/EMBL pod numerem akcesji J04358; alternatywnie sekwencja aminokwasów dla szczepu BVDV CP7 może być uzyskana w bibliotece danych GenBank/EMBL (numer akcesji U63479); w poliproteinie BVDV CP7, białko E ms odpowiada resztom 271 do 497. Dwa regiony aminokwasów są bardzo konserwatywne w glikoproteinie E ms, jak również w białkach RNazo-aktywnych niektórych roślin i grzybów (Schneider i inni, 1993). Te dwa regiony mają szczególne znaczenie dla aktywności enzymatycznej RNazy. Pierwszy regionu składa się z regionu aminokwasów w pozycjach 295 do 307 (298 do 310 dla szczepu BVDV cp7) i drugiego regionu składającego się z aminokwasów w pozycjach 338 do 357 (341 do 360 dla szczepu BVDV cp7) wspomnianej poliproteiny wirusowej jak zilustrowano dla CSFV szczepu Alfort w Meyers i inni, 1999 (numeracja według opublikowanych wyprowadzonych sekwencji aminokwasów CSFV szczepu Alfort/Tübingen (Meyers i inni, 1989)). Aminokwasy o szczególnym znaczeniu dla aktywności RNazy, jak wspomniano powyżej, nie są ograniczone do dokładnego położenia jak określono dla CSFV szczepu Alfort/Tübingen, ale są po prostu zastosowane w przykładowy sposób w celu wskazania preferowanych aminokwasów znajdujących się w tej pozycji lub odpowiednich do tej pozycji w innych szczepach, jak znaleziono w BVDV, BDV i ogólnie w pestiwirusach, ponieważ są one bardzo konserwatywne. Dla pestiwirusów innym niż CSFV szczepu Alfort/Tübingen numeracja pozycji korzystnych aminokwasów mogą być różne, ale ekspert w dziedzinie biologii molekularnej pestiwirusów łatwo zidentyfikuje te korzystne aminokwasy poprzez wysoki stopień konserwatyzmu tej sekwencji aminokwasów i pozycji tych motywów w kontekście sekwencji. W jednym szczególnym nieograniczającym przykładzie pozycja CSFV Alfort/Tübingen 346 jest identyczna z pozycją 349 w BVDV szczepu cp7.

13 W rezultacie, przedmiotowy wynalazek korzystnie dotyczy BVDV według wynalazku, w którym wspomniana(e) mutacja(e) w sekwencji kodującej glikoproteinę E ms znajdują się w sekwencji nukleotydowej kodującej właściwymch aminokwasów w pozycji 298 do 310 i/lub w pozycji 341 do 360. Korzystnie, takimi mutacjami są (aminokwasy są przedstawione za pomocą jednoliterowych symboli; aminokwas przed numerem pozycji wskazuje aminokwas, który ma być poddany substytucji, aminokwas po numerze pozycji jest aminokwasem poddanym substytucji, (del oznacza delecję), na przykład: H300L oznacza, że histydyna 300 została zastąpiona przez leucynę: Odpowiednimi modyfikacjami w glikoproteinie E ms są na przykład pojedyncze substytucje/delecje: S298G, H300K, H300L, H300R, H300del, W303G, P304del, E305A, C308G, R343G, E345del, W346G, K348A, H349K, H349L, H349del, H349Q, H349SV (mutacja H349S i insercja V), K348R, W351P, W351G, W351L, W351K, W351H; podwójna substytucja/delecja: H300L/H349L, K348del/H349del, H349del/G350del, E345del/H349del, W303G/E305A, H300K/H349K, H300K/H349L i potrójna delecja: L299del/H300del/G300del, K348del/H349del/G350del. Numeracja jest zgodna z publikowaną sekwencją aminokwasów BVDV CP7 dla wszystkich mutantów wymienionych powyżej (podane liczby minus 3 miałby odpowiadać odpowiednim resztom sekwencji aminokwasów CSFV Alfort/Tübingen). Wszystkie wyżej wymienione mutanty były przynajmniej testowane jako odpowiednie mutanty CSFV lub BVDV bez mutacji w regionie N pro. Odpowiednie mutanty pestiwirusowej glikoproteiny E ms są dostarczone, na przykład przez WO 99/64604, który jest włączony tutaj w całości. Należy jednak zauważyć, że według bieżącego wynalazku, obecna musi być co najmniej jedna dodatkowa mutacja w regionie N pro, jak ujawniono w szczegółowo poniżej. W szczególności okazało się, że delecja lub substytucja reszty histydynowej w pozycji 346 (CSFV) lub 349 (BVDV) prowadzi do skutecznej inaktywacji E ms i dlatego prowadzi do szczególnie przydatnej pestiwirusowej żywej szczepionki. Bieżący wynalazek dowodzi, że pestiwirusy są żywe i kodują białka E ms bez aktywności RNazy, gdy reszta histydynowa w pozycji 346 wirusowej poliproteiny jest usunięta (numeracja zgodnie z opublikowaną sekwencją CSFV Alfort/Tübingen (Meyers i inni, 1989)), lub w pozycji 349 (numeracja zgodnie z opublikowaną sekwencją BVDV CP7 (Meyers i inni, 1996b)), jeżeli wspomnianym pestiwiusem jest BVDV, co stanowi jeden z konserwatywnych domniemanych pozostałości miejsc aktywnych E ms RNazy. Tak więc, korzystnie, wynalazek również dotyczy BVDV według wynalazku, w którym wspomniana mutacja w sekwencji kodującej glikoproteinę E ms jest poddaną delecji lub poddaną substytucji resztą histydynową w pozycji 349. Bardziej specjalnie, domniemane miejsce aktywne RNazy jest

14 reprezentowane przez konserwatywne sekwencje E ms SLHGIWPEKICTG i/lub LQRHEWNKHGWCNWFHIEPW (sekwencja białka BVDV-2 New York'93 podana tutaj jako wzorzec, niewielkie zmiany mogą znajdować się w innych sekwencjach pestiwirusowych, ale tożsamość motywu zawsze będzie oczywista dla eksperta z dziedziny. Jako przykład, odpowiednią sekwencją aminokwasową BVDV-1 CP7 będzie SLHGIWPEKICTG i/lub LQRHEWNKHGWCNWYNTEPW i ta z CSFV Alfort/Tübingen SLHGIWPEKICKG i/lub LQRHEWNKHGWCNW). Tak więc, korzystnie, wynalazek dalej dotyczy BVDV według wynalazku, w którym wspomniana mutacja(e) w sekwencji kodującej glikoproteinę E ms znajduje się w nukleotydowej sekwencji kodującej konserwatywną sekwencję E ms SLHGIWPEKICTG i/lub LQRHEWNKHGWCNWFHIEPW. Sekwencje te reprezentują domniemane miejsce aktywne RNazy. Sekwencje SLHGIWPEKIC i RHEWNKHGWCNW domniemanego miejsca aktywnego E ms są nawet bardziej konserwatywne spośród pestiwirusów. Tak więc, korzystnie, wynalazek również dotyczy pestiwirusa, w szczególności BVDV posiadającego co najmniej jedną mutację w sekwencji kodującej białko N pro i glikoproteinę E ms, w której wspomniana mutacja(e) w sekwencji kodującej glikoproteinę E ms znajdują się w nukleotydowej sekwencji kodującej dla konserwatywnej sekwencji E ms SLHGIWPEKIC i/lub RHEWNKHGWCNW. Korzystnie mutacja ma miejsce tylko w jednej ze wspomnianych sekwencji. Tak więc, wynalazek również dotyczy pestiwirusa, w szczególności BVDV posiadającego co najmniej jedną mutację w sekwencji kodującej białko N pro i glikoproteinę E ms, w której wspomniana mutacja(e) w sekwencji kodującej glikoproteinę E ms znajdują się w nukleotydowej sekwencji kodującej dla konserwatywnej sekwencji E ms SLHGIWPEKIC lub RHEWNKHGWCNW. Korzystnie takie mutacje dotyczą dwóch aminokwasów, tj. są podwójnymi mutacjami. Tak więc, wspomniane mutacje mogą być 1 do 3 nukleotydowymi mutacjami w dwóch różnych trypletach kodujących dwa aminokwasy. Tak więc, wynalazek również dotyczy pestiwirusa, w szczególności BVDV posiadającego co najmniej jedną mutację w sekwencji kodującej białko N pro i glikoproteinę E ms, w której wspomniana mutacja(e) w sekwencji kodującej glikoproteinę E ms są dwoma mutacjami znajdującymi się w nukleotydowej sekwencji kodującej dla konserwatywnej sekwencji E ms SLHGIWPEKIC i/lub RHEWNKHGWCNW. Korzystnie, takie mutacje dotyczą pojedynczego aminokwasu. Tak więc, wspomniana mutacja może być 1 do 3 nukleotydowymi mutacjami w jednym tryplecie kodującym jeden aminokwas. Tak więc, wynalazek również dotyczy pestiwirusa, w szczególności BVDV posiadającego co najmniej jedną mutację w sekwencji kodującej

15 białko N pro i glikoproteinę E ms, w której pojedyncza mutacja znajduje się w konserwatywnej sekwencji E ms SLHGIWPEKIC lub RHEWNKHGWCNW. Jak wspomniano powyżej, atenuowane pestiwirusy dostarczane zgodnie z przedmitowym wynalazkiem, posiadające co najmniej jedną mutację w sekwencji kodującej glikoproteinę E ms i w sekwencji kodującej białko N pro, w których wspomniane mutacje korzystnie powodują inaktywację aktywności RNazy znajdującej się w glikoproteinie E RNS i aktywności immunomodulującej znajdującej się w N pro. Inaktywacja N pro jest osiągana w pestiwirusach, w szczególności w BVDV o określonej formule opisanej szczegółowo poniżej, w której obecne są aminokwasy pomiędzy 0 i wszystkie aminokwasy N pro ; ubikwityna lub LC3 lub inna sekwencja służąca jako sygnał procesowy (np. SUMO-1, NEDD8, GATE-16, GABA(A)RAP, lub proteazy takie jak inteina, 3C pikornawirusa, 2A caridovirusa lub pl5 wirusowej krwotocznej choroby królików) są obecne lub nie. W przypadku obecności sygnału procesowego, sekwencja kodująca sygnału procesowego wstawiona jest w lub w pobliże C-końcowego końca (pozostałej części) białka N pro. Jedynie w przypadku, gdy sygnał procesowy jest obecny, może być obecna każda liczba aminokwasów kodujących dla N pro (= aminokwasy N pro ). W przypadku nie wstawienia sekwencji sygnału procesowego, może być obecne maksymalnie 12 aminokwasów, korzystnie aminokwasów amino-końcowych N pro, pozostałe aminokwasy muszą być usunięte. Ponadto, inne niż mutacje E ms, jak ujawniono powyżej (co najmniej jedna z nich powinna być obecna w pestiwirusie, w szczególności w BVDV według wynalazku), pozostałe sekwencje pestiwirusa, w szczególności BVDV mogą pozostać niezmienione, tj. niezmutowane lub mogą również posiadać mutacje blisko N- końcowego końca C-białka. Zilustrowane jest to wieloma bardziej specyficznymi wariantami jak ujawniono poniżej. Tak więc, wynalazek dotyczy pestiwirusa, w szczególności BVDV według wynalazku, w którym wspomniana mutacja(e) w sekwencji kodującej N pro prowadzą do zakodowanej poliproteiny scharakteryzowanej następującym wzorem: [N pro ] x -[PS] y -[C-końc] w którym [N pro ] dotyczy części N pro wspomnianej poliproteiny, w której x reprezentuje liczbę aminokwasów N pro obecnych w poliproteinie; [PS] dotyczy sygnału procesowego wybranego z: ubikwityna, LC3, SUMO-1 NEDD8, GATE-16 i GABA(A)RAP lub proteazy np. inteina, 3C pikornawirusa, 2A caridovirusa i pl5 wirusowej krwotocznej choroby królików lub jakiegokolwiek sygnału procesowego znanego osobie biegłej w dziedzinie, który zapewnia generację czynnościowego N-

16 końcowego C-białka. Y może być równe 0, co oznacza, że nie ma sygnału procesowego (= PS nieobecne), lub Y może być równe 1, co oznacza, że sygnał procesowy jest obecny (= PS obecne). [C-końc] dotyczy kompletnego pestiwirusa, w szczególności kompletnej poliproteiny BVDV za wyjątkiem N pro, ale obejmującego (C)-białkowy kapsyd i każdo inne białko obecne w poliproteinie pestiwirusa, w szczególności w poliproteinie BVDV obejmującej karboksykońcowe NS5B. Korzystnie, glikoproteina E ms we wspomnianym [C-końc] jest zmutowana w taki sposób, że aktywność RNazy znajdująca się glikoproteinie E ms jest inaktywowana. Termin każdo inne białko obecne w poliproteinie pestiwirusa/poliproteinie BVDV dotyczy E ms, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B i NS5A, w którym glikoproteina E ms jest zmutowana, korzystnie jak ujawniono tutaj (patrz powyżej), w taki sposób, że aktywność RNazy znajdująca się glikoproteinie E ms jest inaktywowana. Korzystnie, pestiwirus, w szczególności BVDV według wynalazku posiada C-białko, które nie jest zmutowane, za wyjątkiem aminokwasu w pozycji 2, które jest zmienione z D na N. Z tego powodu, [C-końc*] jest taki sam jak [C-końc], ale z mutacją w pozycji 2 C-białka (N zamiast D); jeżeli y jest równe 0 (oznacza nieobecność [PS]) wówczas x jest równe od 0 do 12 (oznacza brak specyficznego aminokwasu N pro lub 1 do 12 aminokwasów N pro, korzystnie obecne są N-końcowe N pro ); jeżeli y jest równe 1 (oznacza obecność [PS]) wówczas x jest równe od 0 do 168; (oznacza brak specyficznego aminokwasu N pro lub 1 do wszystkich 168 aminokwasów N pro, korzystnie obecne są N-końcowe N pro ). Również korzystniej, wynalazek dotyczy pestiwirusa, w szczególności BVDV według wynalazku, w którym wspomniana mutacja(e) w sekwencji kodującej N pro prowadzą do zakodowanej poliproteiny scharakteryzowanej następującym wzorem: [N pro ] 1 -[PS] 0 -[C-końc] i w którym definicje są takie, jak określono powyżej. Jego specyficzny przykład ujawniono poniżej, w którym po N-końcowej metioninie następuje C-białko i każde inne białko obecne w poliproteinie obejmującej karboksykońcowe NS5B. Dlatego, najkorzystniej, wynalazek dotyczy pestiwirusa, w szczególności BVDV według wynalazku, w którym wspomniana mutacja(e) w sekwencji kodującej N pro prowadzą do zakodowanej poliproteiny scharakteryzowanej następującym wzorem: M[C-końc] i w którym definicje są takie, jak określono powyżej.

17 Również korzystniej wynalazek dotyczy pestiwirusa, w szczególności BVDV według wynalazku, w którym wspomniana mutacja(e) w sekwencji kodującej N pro prowadzą do zakodowanej poliproteiny scharakteryzowanej następującym wzorem: [N pro ] 3 -[PS] 0 -[C-końc] i w którym definicje są takie, jak określono powyżej. Specyficzny przykład BVDV ujawniono poniżej, w którym po N-końcowej metioninie następuje sekwencja EL N pro i C-białko i każde inne białko obecne w poliproteinie obejmującej karboksykońcowe NS5B. Dlatego, najkorzystniej, wynalazek dotyczy BVDV według wynalazku, w którym wspomniana mutacja(e) w sekwencji kodującej N pro prowadzą do zakodowanej poliproteiny scharakteryzowanej następującym wzorem: MEL-[C-końc] i w którym definicje są takie, jak określono powyżej. Również korzystniej wynalazek dotyczy pestiwirusa, w szczególności BVDV według wynalazku, w którym wspomniana mutacja(e) w sekwencji kodującej N pro prowadzą do zakodowanej poliproteiny scharakteryzowanej następującym wzorem: [N pro ] 4 -[PS] 0 -[C-końc] i w którym definicje są takie, jak określono powyżej. Specyficzny przykład BVDV ujawniono poniżej, w którym po N-końcowej metioninie następuje sekwencja ELF N pro i C-białko i każde inne białko obecne w poliproteinie obejmującej karboksykońcowe NS5B. Dlatego, najkorzystniej, wynalazek dotyczy BVDV według wynalazku, w którym wspomniana mutacja(e) w sekwencji kodującej N pro prowadzą do zakodowanej poliproteiny scharakteryzowanej następującym wzorem: MELF-[C-końc] i w którym definicje są takie, jak określono powyżej. Również korzystniej wynalazek dotyczy pestiwirusa, w szczególności BVDV według wynalazku, w którym wspomniana mutacja(e) w sekwencji kodującej N pro prowadzą do zakodowanej poliproteiny scharakteryzowanej następującym wzorem: [N pro ] 6 -[PS] 0 -[C-końc] i w którym definicje są takie, jak określono powyżej. Specyficzny przykład BVDV ujawniono poniżej, w którym po N-końcowej metioninie następuje sekwencja ELFSN N pro i C-białko i każde inne białko obecne w poliproteinie obejmującej karboksyterminalne NS5B. Dlatego, najkorzystniej, wynalazek dotyczy BVDV według wynalazku, w którym wspomniana mutacja(e) w sekwencji kodującej N pro prowadzą do zakodowanej poliproteiny scharakteryzowanej następującym wzorem: MELFSN-[C-końc]

18 i w którym definicje są takie, jak określono powyżej. Również korzystniej wynalazek dotyczy pestiwirusa, w szczególności BVDV według wynalazku, w którym wspomniana mutacja(e) w sekwencji kodującej N pro prowadzą do zakodowanej poliproteiny scharakteryzowanej następującym wzorem: [N pro ] 4 -[PS] 0 -[C-końc*] i w którym definicje są takie, jak określono powyżej za wyjątkiem faktu, że zmieniona jest aminotermalna część C-białka. Specyficzny przykład BVDV ujawniono poniżej, w którym po N-końcowej metioninie następuje sekwencja ELF N pro i w sekwencji C-białka zmieniono aminokwas w pozycji 2 z D na N. Dlatego aminokońcową sekwencją C-białka jest SNEGSK... zamiast SDEGSK. Dlatego/w ten sposób, najkorzystniej, wynalazek dotyczy BVDV według wynalazku, w którym wspomniana mutacja(e) w sekwencji kodującej N pro prowadzą do zakodowanej poliproteiny scharakteryzowanej następującym wzorem: MELF-[C-term*] i w którym w C-białku zmieniono aminokwas w pozycji 2 z D na N i w którym definicje są takie, jak określono powyżej. Również korzystniej wynalazek dotyczy pestiwirusa, w szczególności BVDV według wynalazku, w którym wspomniana mutacja(e) w sekwencji kodującej N pro prowadzą do zakodowanej poliproteiny scharakteryzowanej następującym wzorem: [N pro ] x -[PS] 1 -[C-końc] i w którym definicje są takie, jak określono powyżej i w którym ujawnione powyżej PS korzystnie jest wybrane z grupy ubikwityna lub LC3. Specyficzny przykład BVDV ujawniono poniżej, w którym po N-końcowej metioninie następuje każdy z 21 lub 28 aminokwasów N pro, ubikwityna lub LC3 i C-białko. Dlatego/w ten sposób, najkorzystniej, wynalazek dotyczy BVDV według wynalazku, w którym wspomniana mutacja(e) w sekwencji kodującej N pro prowadzą do zakodowanej poliproteiny scharakteryzowanej następującym wzorem: [N pro ] 22 -[PS] 1 -[C-końc], w którym korzystnie PS jest ubikwityną lub LC3 lub [N pro ] 29 -[PS] 1 -[C-końc], w którym korzystnie PS jest ubikwityną lub LC3. Ubikwityna jest dobre znanym wysoce konserwatywnym białkiem komórkowym o 76 aminokwasach. Spośród innych funkcji, ubikwityna odgrywa kluczową rolę w katabolizmie, połączenie białka z ubikwityną naznacza je w procesie degradacji przez proteosom. Sprzężenie lub połączenie z ubikwityną z innymi białkami poprzez grupę karboksylową C-końcowej reszty glicyny może zostać rozerwane przez komórkowe specyficzne względem ubikwityny proteazy. Tak więc, połączenie białka do

19 karboksykońca ubikwityny zwykle powoduje określony rozpad przyłączonego białka na jego składniki, gdy ulega ekspresji wewnątrz komórki. LC3 (lekki łańcuch 3 białka towarzyszącego mikrotubulom) reprezentuje białko komórkowe złożone z 125 aminokwasów, które wykonuje wiele czynności (długość podana dla bydlęcej LC3). Ostatnio określono fundamentalną rolę tego białka w samożerności. Podczas tego procesu LC3 jest aktywowane rozerwaniem wiązania karboksylowej grupy końcowej. Skutkiem tego tworzona jest nowa karboksylowa grupa końcowa składająca się z glicyny. LC3 jest wówczas połączone poprzez karboksylową grupę końcową glicyny do fosfatydyloetanoloaminy obecnej w błonach samożernych pęcherzyków. Ze względu na ten proces, białko połączone do karboksylowego końca LC3 będzie rozszczepiane przez proteazy komórkowe w określonej pozycji. Również korzystniej wynalazek dotyczy pestiwirusa, w szczególności BVDV według wynalazku, w którym wspomniana mutacja(e) w sekwencji kodującej N pro prowadzą do zakodowanej poliproteiny scharakteryzowanej następującym wzorem wybranym z grupy: [N pro ] 2 -[PS] y -[C-końc] i korzystnie ME-[PS] y -[C-końc] [N pro ] 5 -[PS] y -[C-końc] i korzystnie MELFS-[PS] y -[C-końc] [N pro ] 7 -[PS] y -[C-końc] i korzystnie MELFSNE-[PS] y -[C-końc] [N pro ] 8 -[PS] y -[C-końc] i korzystnie MELFSNEL-[PS] y -[C-końc] [N pro ] 9 -[PS] y -[C-końc] i korzystnie MELFSNELL-[PS] y -[C-końc] [N pro ] 10 -[PS] y -[C-końc] i korzystnie MELFSNELLY-[PS] y -[C-końc] [N pro ] 11 -[PS] y -[C-końc] i korzystnie MELFSNELLYK-[PS] y -[C-końc] i [N pro ] 12 -[PS] y -[C-końc] i korzystnie MELFSNELLYKT-[PS] y -[C-końc] i w których definicje są takie, jak określono powyżej. Korzystnie ujawnione warianty dotyczą BVDV. Najkorzystniej, y jest równe 0 (PS nieobecne) Również korzystniej, wspomniane BVDV według wynalazku jak opisane supra jest typem 1 BVDV. Najkorzystniej, wspomniane BVDV według wynalazku jak opisano supra jest typem 2 BVDV. BVDV-1 i BVDV-2 różnią się od siebie genomowymi sekwencjami (Heinz i inni, 2000 i zawarte tam odnośniki). BVDV-1 jak ujawniono tutaj można zastosować do wytwarzania kompozycji do zastosowania w zapobieganiu i/lub leczeniu zakażeń BVDV typu 1 w stadach hodowlanych bydła, u ciężarnych krów i w wywoływaniu ochrony płodu przeciwko zakażeniom BVDV typu 1 u ciężarnych krów. Nieoczekiwanie, BVDV-2 jak ujawniono tutaj można zastosować do wytwarzania kompozycji do zastosowania w zapobieganiu i/lub leczeniu zakażeń BVDV typu 1 w stadach hodowlanych bydła. W szczególności, wynalazek dotyczy zastosowania BVDV

20 typu 2 według wynalazku do wytwarzania kompozycji do zastosowania w zapobieganiu i/lub leczeniu zakażeń BVDV typu 1 u ciężarnych krów. Korzystnie, BVDV typu 2 według wynalazku można zastosować do wytwarzania kompozycji do zastosowania w wywoływaniu ochrony płodu przeciwko zakażeniom BVDV typu 1 u ciężarnych krów. Również nieoczekiwanie, BVDV-1 jak ujawniono tutaj można zastosować do wytwarzania kompozycji do zastosowania w zapobieganiu i/lub leczeniu zakażeń BVDV typu 2 w stadach hodowlanych bydła. W szczególności wynalazek dotyczy zastosowania BVDV typu 1 według wynalazku do wytwarzania kompozycji do zastosowania w zapobieganiu i/lub leczeniu zakażeń BVDV typu 2 u ciężarnych krów. Korzystnie, BVDV typu 1 według wynalazku można zastosować do wytwarzania kompozycji do zastosowania w wywoływaniu ochrony płodu przed zakażeniami BVDV typu 2 u ciężarnych krów. Najkorzystniejsze jest zastosowanie BVDV typu 1 i typu 2 w połączeniu do wytwarzania kompozycji do zastosowania w zapobieganiu i/lub leczeniu zakażeń BVDV typu 1 lub typu 2 w stadach hodowlanych bydła, u ciężarnych krów i w wywoływaniu ochrony płodu przeciwko zakażeniom BVDV typu 1/ lub typu 2 u ciężarnych krów. Najkorzystniej, dziki typ BVDV według wynalazku, który musi zostać zmutowany jak ujawniono tutaj, odpowiada sekwencji aminokwasowej nr 5 (określoną XIKE A) lub jest jego odmianą czynnościową. Również najkorzystniej, BVDV według wynalazku posiada mutację N pro według wynalazku i odpowiada sekwencji aminokwasowej nr 6 (określoną XIKE-A-NdN) lub jest jego odmianą czynnościową. Korzystnie taka odmiana czynnościowa jest, co najmniej w 65% homologiczna do ujawnionej tutaj sekwencji aminokwasowej. Na poziomie aminokwasowym, homologi są bardzo przybliżone: BVDV- 1/BVDV-1: 93%, BVDV-1/BVDV-2: 84%, BVDV-2/BVDV-2: 98%. Dlatego korzystniej taka odmiana czynnościowa jest, co najmniej w 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% lub 90% homologiczna do ujawnionej tutaj sekwencji aminokwasowej. Również korzystniej taka odmiana czynnościowa jest, co najmniej w 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% lub 98% homologiczna do ujawnionej tutaj sekwencji aminokwasowej. Najkorzystniej taka odmiana czynnościowa jest, co najmniej w 99% lub 99,9% homologiczna do ujawnionej tutaj sekwencji aminokwasowej. Również najkorzystniej BVDV według wynalazku posiada mutację E ms według wynalazku, która jest delecją kodonu kodującego histydynę 349 i odpowiada sekwencji aminokwasowej nr 7 (określoną XIKE-B) lub jest jego odmianą czynnościową. Również najkorzystniej BVDV według wynalazku posiada mutację E ms i

21 mutację N pro według wynalazku, w których usunięty jest kodon kodujący histydynę 349 z E ms i również usunięty jest kompletny region kodujący N pro, za wyjątkiem kodonów od 1 do 4, w ten sposób pozostają aminokwasy MELF N pro. Wspomniany mutant odpowiada sekwencji aminokwasowej nr 8 (określoną XIKE-B-NdN) lub jest jego odmianą czynnościową. Korzystnie, taka odmiana czynnościowa jest, co najmniej w 65% homologiczna do ujawnionej tutaj sekwencji aminokwasowej. Korzystniej, taka odmiana czynnościowa jest, co najmniej w 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% lub 90% homologiczna do ujawnionej tutaj sekwencji aminokwasowej. Również korzystniej taka odmiana czynnościowa jest, co najmniej w 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% lub 98% homologiczna do ujawnionej tutaj sekwencji aminokwasowej. Najkorzystniej taka odmiana czynnościowa jest, co najmniej w 99% lub 99,9% homologiczna do ujawnionej tutaj sekwencji aminokwasowej. Również najkorzystniej BVDV według wynalazku posiada mutację E ms według wynalazku, która jest substytucją kodonu kodującego histydynę 300 przez kodon kodujący leucynę i odpowiada sekwencji aminokwasowej nr 9 (określoną XIKE-C) lub jest jego odmianą czynnościową. Również najkorzystniej BVDV według wynalazku posiada obie mutacje, mutację E ms i mutację N pro według wynalazku, w których kodon kodujący histydynę 300 z E ms jest zastąpiony przez kodon kodujący leucynę i również usunięty jest kompletny region kodujący N pro, za wyjątkiem kodonów od 1 do 4, w ten sposób pozostają aminokwasy MELF N pro. Wspomniany mutant odpowiada sekwencji aminokwasowej nr 10 (określoną XIKE-C-NdN) lub jest jego odmianą czynnościową. Korzystnie, taka odmiana czynnościowa jest, co najmniej w 65% homologiczna do ujawnionej tutaj sekwencji aminokwasowej. Korzystniej, taka odmiana czynnościowa jest, co najmniej w 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% lub 90% homologiczna do ujawnionej tutaj sekwencji aminokwasowej. Również korzystniej taka odmiana czynnościowa jest, co najmniej w 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% lub 98% homologiczna do ujawnionej tutaj sekwencji aminokwasowej. Najkorzystniej taka odmiana czynnościowa jest, co najmniej w 99% lub 99,9% homologiczna do ujawnionej tutaj sekwencji aminokwasowej. Kolejnym ważnym wariantem ujawnionego tutaj wynalazku jest kompozycja zawierająca pestiwirus, w szczególności BVDV według wynalazku i roztwór. Dla osoby biegłej w dziedzinie znane są dodatkowe składniki, które wspomniana kompozycja może zawierać (patrz również Remington s Pharmaceutical Sciences. (1990). 18-sta edycja,

22 Mack Publ., Easton). Ekspert może zastosować znany, przeznaczony do wstrzykiwania, akceptowalny fizjologicznie sterylny roztwór. Do przygotowania roztworu gotowego do podania do pozajelitowego nastrzykiwania lub infuzji, łatwo dostępne są wodne izotoniczne roztwory takie jak sól fizjologiczna lub odpowiednie roztwory białek surowicy. Kompozycje farmaceutyczne mogą być obecne jako liofilizaty lub suche preparaty, które można odtworzyć znanym roztworem do wstrzykiwań bezpośrednio przed zastosowaniem w sterylnych warunkach, np. jako zestaw. Końcowe przygotowanie kompozycji bieżącego wynalazku polega na, np. nastrzyknięciu poprzez mieszanie wspomnianego pestiwirusa, korzystnie BVDV według wynalazku ze sterylnym, akceptowalnym fizjologicznie roztworem, który może być uzupełniony znanymi substancjami nośnikowymi i/lub konserwantami (np. albuminą surowycy, dekstrozą, wodorosiarczanem sodu, EDTA). Wspomniany roztwór może być oparty na akceptowalnym fizjologicznie roztworze, np. roztworze wodnym o ph pomiędzy 7 i 8. ph może być stabilizowane przez fizjologicznie akceptowalny bufor. Roztwór może zawierać również dalsze czynniki stabilizujące jak substancja powierzchniowo czynna jak Tween 20, albumina surowicy jak BSA (albumina surowicy bydlęcej), kwas askorbinowy i/lub spermidyna. Kompozycja może również zawierać adjuwanty, np. wodorotlenek glinowy, oleje mineralne lub inne lub cząsteczki pomocnicze dodawane do szczepionki lub wytwarzane przez ciało po odpowiedniej indukcji przez takie składniki dodatkowe jak, ale nieograniczające się do interferonów, interleukin i czynników wzrostu. Na przykład, kompozycja według wynalazku, pestiwirus, w szczególności BVDV mogą być rozpuszczane w: Pestiwirus (korzystnie BVDV) TCID 50 SGS* 25% v/v Pożywka do hodowli komórkowej do 1 dawki *SGS Sacharoza Żelatyna Wodorotlenek potasu Kwas L-glutaminowy Diwodorofosforan potasu Wodorofosforan potasu Woda do injekcji Skład w 2 ml 75 mg 20mg 0,274 mg 0,72 mg 0,516 mg 1,254 mg do 2 ml

23 Jeżeli kompozycja jest najpierw liofilizowana lub odwadniana innymi sposobami, to następnie przed zaszczepieniem wspomniana kompozycja jest z powrotem uwadniana w roztworze wodnym (np. soli fizjologicznej, PBS (buforowana sól fizjologiczna)) lub w roztworze niewodnym (np. emulsji olejowej (oleju mineralnym lub opartym na oleju roślinnym/metabolizowanym /opartym na pojedynczej lub podwójnej emulsji), opartym na glinie, adiuwancie opartym na karbomerze). Korzystnie, kompozycja według wynalazku wywołuje odpowiedź immunologiczną u zwierząt. Korzystniej, kompozycja według wynalazku jest szczepionką. Rozumiana tutaj szczepionka zawiera pestiwirus, w szczególności BVDV według wynalazku i jest określona powyżej (sekcja definicje ). Najkorzystniej, kompozycja według wynalazku zawiera dalej farmaceutycznie akceptowalny nośnik lub substancję pomocniczą. Kilka nośników lub substancji pomocniczych ujawniono powyżej. Jeżeli przeznaczona jest do nastrzykiwań lub infuzji, kompozycja może zawierać substancje do przygotowywania roztworów izotonicznych, konserwanty takie jak p-hydroksybenzoesany, stabilizatory, takie jak sole alkaliczne kwasu etylenodiaminotetraoctowego, możliwie również zawierające czynniki emulgujące i/lub środki rozpraszające. Kompozycja według wynalazku może być aplikowana śródskórnie, dotchawicznie lub dopochwowo. Kompozycja korzystnie może być aplikowana domięśniowo lub donosowo. W ciele zwierzęcia może okazać się korzystne aplikowanie kompozycji farmaceutycnych jak opisano powyżej poprzez podanie dożylne lub bezpośrednie nastrzyki do tkanek docelowych. Do podania systemowego korzystne są drogi podania dożylnego, donaczyniowego, domięśniowego, donosowego, dotętnicowego, dootrzewnowego, doustnego lub podoponowego. Bardziej miejscowe podanie może być wykonane podskórnie, śródskórnie, dosercowo, wewnątrzpłatowo, śródrdzeniowo, śródpłucnie lub bezpośrednio do lub w pobliże leczonej tkanki (tkanka łączna, kostna, mięśniowa, nerwowa, nabłonkowa). W zależności od pożądanego czasu trwania i skuteczności leczenia, kompozycje według wynalazku mogą być podawane jednokrotnie lub kilka razy, również okresowo, na przykład każdego dnia przez kilka dni, tygodni lub miesięcy i w różnych dawkach. Wynalazek również dotyczy zastosowania pestiwirusa, w szczególności BVDV według wynalazku do wytwarzania szczepionki w celu profilaktyki i leczenia zakażeń pestiwirusowych, w szczególności zakażeń BVDV. Kolejną ważną częścią wynalazku jest cząsteczka polinukleotydowa zawierająca kwas nukleinowy kodujący pestiwirusa, w szczególności BVDV według wynalazku, lub

24 fragment, odmianę czynnościową, odmianę opartą na degeneracyjnym kodzie kwasów nukleinowych, połączoną cząsteczkę lub jej chemiczną pochodną. Korzystnie, wspomnianą cząsteczką polinukleotydową jest DNA. Również korzystnie wspomnianą cząsteczką polinukleotydową jest RNA. W korzystniejszym wariancie wspomniana cząsteczka polinukleotydowa również zawiera sekwencję nukleotydową czynnościowego 5 i/lub 3 nieulegającego translacji obszaru pestiwirusa, w szczególności BVDV. Istnieje kilka sekwencji nukleotydowych znanych w dziedzinie, które reprezentują podstawę wytwarzania cząsteczki polinukleotydowej kodującej pestiwirusa atenuowanego według bieżącego wynalazku, posiadającego, co najmniej jedną mutację w sekwencji kodującej N pro i co najmniej jedną w sekwencji kodującej glikoproteinę E ms, w której wspomniane mutacje prowadzą do połączonej inaktywacji aktywności RNazy znajdującej się w glikoproteinie E ms i do inaktywacji aktywności immunomodulującej znajdującej się w N pro. Przykłady sekwencji kwasu nukleinowego dzikiego typu sekwencji kilku elementów pestiwirusów zamieszczono poniżej: Wirus choroby granicznej Szczep BD31 NCBI GenBank, nr dostępu [U70263] Szczep X818 NCBI GenBank, nr dostępu [AF037405] Wirus wirusowej biegunki bydła 1 Szczep NADL NCBI GenBank, nr dostępu [M31182] Szczep Osloss NCBI GenBank, nr dostępu [M96687] Szczep SD-1 NCBI GenBank, nr dostępu [M96751] Szczep CP7 NCBI GenBank, nr dostępu [U63479] Wirus wirusowej biegunki bydła 2 Szczep 890 NCBI GenBank, nr dostępu [U18059] Szczep C413 NCBI GenBank, nr dostępu [AF002227] Wirus klasycznego pomoru świń Szczep Alfort/187 NCBI GenBank, nr dostępu [X87939] Szczep Alfort/Tübingen NCBI GenBank, nr dostępu [J04358] Szczep Brescia NCBI GenBank, nr dostępu [M31768] Szczep szczep C NCBI GenBank, nr dostępu [Z46258] Mutacje/Modyfikacje według wynalazku dotyczące sekwencji kodującej N pro i E ms szczegółowo opisano powyżej. Posiadając te informacje osoba biegła w dziedzinie jest w stanie zrealizować wytwarzanie jakiegokolwiek polinukleotydu / kwasu polinukleinowego kodującego pestiwirusa według przedmiotowego wynalazku. Co więcej, osoba ta jest

25 w stanie wytworzyć atenuowany pestiwirus według wynalazku. Cząsteczkowy sposób wprowadzania mutacji do sekwencji polinukleotydowej, klonowanie i amplifikacja wspomnianego zmutowanego polinukleotydu są na przykład dostarczone przez Sambrook i inni 1989 lub Ausubel i inni Najkorzystniej, typ dziki BVDV według wynalazku, który jest mutowany jak ujawniono tutaj, jest kodowany przez sekwencję kwasu nukleinowego nr 1 (określoną XIKE A) lub jej odmianą czynnościową. Również najkorzystniej, BVDV według wynalazku posiada mutację w Npro według wynalazku i jest kodowany przez sekwencję kwasu nukleinowego nr 2 (określoną XIKE-A-NdN) lub jej odmianą czynnościową. Korzystnie, taka odmiana czynnościowa jest, co najmniej w 65% homologiczna do ujawnionej tutaj sekwencji kwasu nukleinowego. Na poziomie kwasu nukleinowego homologi są bardzo przybliżone: BVDV-1/BVDV-1: 80%, BVDV-1/BVDV-2: 70%, BVDV-2/BVDV-2: 96%. Dlatego korzystniej, taka odmiana czynnościowa jest, co najmniej w 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% lub 90% homologiczna do ujawnionej tutaj sekwencji kwasu nukleinowego. Również korzystniej taka odmiana czynnościowa jest, co najmniej w 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% lub 98% homologiczna do ujawnionej tutaj sekwencji kwasu nukleinowego. Najkorzystniej taka odmiana czynnościowa jest, co najmniej w 99% lub 99,9% homologiczna do ujawnionej tutaj sekwencji kwasu nukleinowego. Również najkorzystniej BVDV według wynalazku posiada mutację w E ms według wynalazku, która jest delecją kodonu H349 i jest kodowana przez sekwencję kwasu nukleinowego nr 7 (określoną XIKE-B) lub jest jej odmianę czynnościową. Również najkorzystniej BVDV według wynalazku posiada mutację w E ms i mutację w N pro według wynalazku, w których usunięty jest kodon kodujący histydynę 349 z E ms i również usunięty jest kompletny region kodujący N pro, za wyjątkiem kodonów 1 do 4, w ten sposób pozostają aminokwasy MELF N pro. Wspomniany mutant jest kodowany przez sekwencję kwasu nukleinowego nr 8 (określoną XIKE-B-NdN) lub jego odmianę czynnościową. Korzystnie, taka odmiana czynnościowa jest, co najmniej w 65% homologiczna do ujawnionej tutaj sekwencji kwasu nukleinowego. Korzystniej, taka odmiana czynnościowa jest, co najmniej w 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% lub 90% homologiczna do ujawnionej tutaj sekwencji kwasu nukleinowego. Również korzystniej taka odmiana czynnościowa jest, co najmniej w 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% lub 98% homologiczna do ujawnionej tutaj sekwencji kwasu nukleinowego. Najkorzystniej taka odmiana czynnościowa jest, co

26 najmniej w 99% lub 99,9% homologiczna do ujawnionej tutaj sekwencji kwasu nukleinowego. Również najkorzystniej BVDV według wynalazku posiada mutację w E ms według wynalazku, która jest substytucją kodonu H300 przez kodon kodujący leucynę i jest kodowany przez sekwencję kwasu nukleinowego nr 11 (określoną XIKE-C) lub jej odmianę czynnościową. Również najkorzystniej BVDV według wynalazku posiada obie mutacje, mutację w E ms i mutację w N pro według wynalazku, w których kodon kodujący histydynę 300 jest zastąpiony przez kodon kodujący leucynę i również usunięty jest kompletny region kodujący N pro, za wyjątkiem kodonów 1 do 4, w ten sposób pozostają aminokwasy MELF N pro. Wspomniany mutant kodowany jest przez sekwencję kwasu nukleinowego nr 12 (określoną XIKE-C-NdN) lub jej odmianę czynnościową. Korzystnie, taka odmiana czynnościowa jest, co najmniej w 65% homologiczna do ujawnionej tutaj sekwencji kwasu nukleinowego. Korzystniej, taka odmiana czynnościowa jest, co najmniej w 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% lub 90% homologiczna do ujawnionej tutaj sekwencji kwasu nukleinowego. Również korzystniej taka odmiana czynnościowa jest, co najmniej w 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% lub 98% homologiczna do ujawnionej tutaj sekwencji kwasu nukleinowego. Najkorzystniej taka odmiana czynnościowa jest, co najmniej w 99% lub 99,9% homologiczna do ujawnionej tutaj sekwencji kwasu nukleinowego. Kolejnym ważnym aspektem wynalazku jest sposób atenuacji pestiwirusa, znamienny tym, że co najmniej jedna mutacja w sekwencji kodującej glikoproteinę E ms i co najmniej kolejna mutacja w sekwencji kodującej N pro wytwarzana jest w genomie pestiwirusowym. Według korzystnego wariantu wspomnianym pestiwirusem jest BVDV. Według korzystniejszego wariantu, wspomniany sposób zawiera etapy: a) odwrotną tranckrypcję sekwencji nukleotydowej pestiwirusa typu dzikiego na cdna b) klonowanie wspomnianego cdna c) wprowadzenie mutacji wybranych z grupy delecji, insercji i/lub substytucji do wspomnianego cdna, w którym wspomniane mutacje znajdują się kodującej sekwencji kodującej glikoproteinę E ms i proteazę N pro, d) włączanie cdna do plazmidu lub do DNA wirusa zdolnego do bezpośredniej transkrypcji pestiwirusowego cdna na RNA in vitro lub po zainfekowaniu odpowiednich komórek. Odnośnie sposobu atenuowania BVDV według wynalazku, wspomniany korzystny sposób zawiera etapy: a) odwrotną tranckrypcję sekwencji nukleotydowej pestiwirusa typu dzikiego na cdna

27 b) klonowanie wspomnianego cdna c) wprowadzenie mutacji wybranych z grupy delecji, insercji i/lub substytucji do wspomnianego cdna, w którym wspomniane mutacje znajdują się kodującej sekwencji kodującej glikoproteinę E ms i proteazę N pro, d) włączanie cdna do plazmidu lub do DNA wirusa zdolnego do bezpośredniej transkrypcji pestiwirusowego cdna na RNA in vitro lub po zainfekowaniu odpowiednich komórek. Jeszcze kolejnym ważnym wariantem wynalazku jest sposób wytwarzania leku do leczenia chorób spowodowanych pestiwirusem, w którym pestiwirus według wynalazku lub kompozycja według wynalazku, w którym wspomniany pestiwirus lub wspomniana kompozycja jest podawana zwierzętom wymagającym takiego podania w odpowiednich dawkach znanych osobie biegłej w dziedzinie i zmniejszaniu objawów wspomnianemu pestiwirusowemu zakażeniu. Jeszcze kolejnym ważnym wariantem wynalazku jest sposób wytwarzania leku do leczenia chorób spowodowanych pestiwirusem, w którym pestiwirus według wynalazku lub kompozycja według wynalazku, w którym wspomniany pestiwirus lub wspomniana kompozycja jest podawana zwierzętom wymagającym takiego podania w odpowiednich dawkach znanych osobie biegłej w dziedzinie i kontrolowane jest zmniejszanie objawów zakażenia pestiwirusowego takich jak wiremia i leukocytopenia i/lub gorączka i/lub biegunka. Przykłady Następujące przykłady służą za dalszą ilustrację bieżącego wynalazku, ale one same nie powinny być uważane za jedyne możliwości zakresu ujawnionego tutaj wynalazku. Przykład 1 BVDV XIKE-B: Oszacowanie patogeniczności płodu u ciężarnych jałówek BVDV XIKE-B, mutany RNazo-ujemne o wysoce patogennym BVDV typu 2 izolowane z New York 93/C odzyskano z zakaźnego klonu cdna pkane40b i wykazano charakterystykę wzrostu podobną do dzikiego typu w hodowli tkanek. W eksperymantach ze zwierzętami zmutowany wirus okazał się znacząco atenowany, tak, że reprezentuje on obiecującego kandydata do rozwoju żywej atenuowanej szczepionki wirusowej (Meyer i inni, 2002). W celu zbadania, czy ten atenuowany wirus jest nadal w stanie przejść przez łożysko i zakazić płód, ciężarne jałówki zakażono XIKE-B. Jako kontrolę zastosowano dziki typ BVDV odzyskany z klonu cdna pkane40b. Odpowiedni wirus nazwany XIKE-A daje ekspresję aktywnej RNazy E ms w zakażonej komórce.

28 5 27 Celem badania było oszacowanie bezpieczeństwa XIKE-A i XIKE-B u ciężarnych zwierząt. Projekt eksperymentu Ciężarne jałówki wybrano ze BVDV-ujemnego stada. Badanie kliniczne objęło następujące grupy 5 jałówek: Nr Inokulacja Wirus Grupa 1 5 Jednorazowe donosowe podanie, 3 ml do każdego z nozdrzy XIKE-A Grupa 2 5 Jednorazowe donosowe podanie, 3 ml do każdego z nozdrzy XIKE-B Jałówki przeniesiono do pomieszczeń badawczych na 8 dni przed inokulacją. Obecność ciąży potwierdzono po przetransportowaniu do pomieszczenia badawczego. W dniu inokulacji wiek ciąży jałówek wynosił pomiędzy 60 i 90 dniem. Inokulacja miała miejsce w tym samym czasie dla wszystkich zwierząt. Jałówki obserwowano pod względem obecności oznak klinicznych zakażenia BVDV obejmujących poronienia podczas okresu obserwacyjnego. Od zwierząt pobrano próbki krwi do badań serologicznych, detekcji antygenów i pomiaru ilości białych krwinek. Eksperyment zakończono 9 tygodni po zakażeniu. Krowy, które nie poroniły ubito, zebrano i zbadano macice. Próbki narządów płodowych zebrano podczas procedury sekcji zwłok i zbadano pod kątem zakażenia BVDV. Obecność zakażenia płodowego była głównym parametrem badania, składająca się z liczby śmiertelności krów związaną z BVDV, liczby poronień związanych z BVDV i liczby BVDV-dodatnich płodów w chwili zakończenia eksperymentu. W dodatku do głównego parametru, sprawdzano oznaki kliniczne charakterystyczne dla zakażenia BVDV, obecność wirusa we krwi i liczbę białych krwinek u krów i temperaturę ciała mierzoną w odbycie po ekspozycji. Zwierzęta Jałówki uzyskano z farm wolnych od BVDV. Do eksperymentu użyto tylko te zwierzęta, które spełniały następujące kryteria włączenia: Kryteria włączenia - Niemające przeciwciał BVD; każdą jednostkę badano w teście przeciwciał w surowicy przed przetransportowaniem i na początku badania (w pomieszczeniu badawczym zwierząt). - Niechorujące na BVDV; badano osocze i/lub preparat buffy-coat od każdej jednostki za pomocą odpowiednich testów.

29 Klinicznie zdrowe na początku badania ocenione na podstawie badania przedmiotowego. Badanie stanu zdrowia zwierząt dokonano zgodnie z bieżącą, ogólnie przyjętą praktyką weterynaryjną. - Ciążę potwierdzono na podstawie badania przedmiotowego przez inokulacją. Wiek ciąży wynosił pomiędzy 60 a 90 dniem w chwili inokulacji, czego dowodem jest dokumentacja inseminacji. Szczep badany A Opis: XIKE A, żywy szczep wirusowy BVDV Skład: Materiał badawczy zawierający supernatant hodowli komórkowej nisko pasażowanego XIKE-A Składniki BVD: Szczep BVDV typu 2: XIKE-A Dostarczone Dr Gregor Meyers, Bundesforschungsanstalt für Viruskrankheiten der przez: Tiere (BFAV), Paul-Ehrlich-Straße 28, Tybinga, Niemcy Podana dawka Typ 1 szczepu:10 5 TCID 50 /6 ml (TCID = ang. Tissue Culture Infective wirusa BVD: Dose dawka zakażająca hodowlę tkankową) Podana objętość 3 ml do każdego nozdrza szczepionki: Droga podania: donosowo Preparowanie Szczepionkę wysłano w postaci zamrożonej wstępnie rozcieńczonej w postaci 50 ml fiolce w suchym lodzie i przechowywano w -70ºC przed dawkowania: zaszczepieniem. Bezpośrednio przed zaszczepieniem Grupy 1 jałówek, materiał rozmrożono unikając miejscowych temperatur powyżej 37ºC. Gdy w płynie nie było widać lodu, materiał delikatnie mieszano i natychmiast użyto do zaszczepienia zwierząt. Niezużyta Zmierzono objętość nie zużytego materiału i podzielono na dwie porcje szczepionka: przed bezpośrednim zamrożeniem w suchym lodzie lub ciekłym azocie i przechowywano do celów ponownego miareczkowania. Wirus i zanieczyszczony plastik lub szkło inkubowano w celu inaktywacji wirusa w odpowiedniej objętości 8-10% roztworu formaldehydu przez co najmniej 24 godziny w temperaturze pokojowej przed wyrzuceniem. 10 Szczep badany B

30 Opis: Skład: Składniki BVD: Dostarczone przez: Podana dawka wirusa BVD: Podana objętość szczepionki: Droga podania: Preparowanie postaci dawkowania: Niezużyta szczepionka: 29 XIKE B, żywy szczep wirusowy BVDV Materiał badawczy zawierający supernatant hodowli komórkowej nisko pasażowanego XIKE-B Szczep BVDV typu 2: XIKE-B Dr Gregor Meyers, Bundesforschungsanstalt für Viruskrankheiten der Tiere (BFAV), Paul-Ehrlich-Straße 28, Tybinga, Niemcy Typ 1 szczepu:10 5 TCID 50 /6 ml (TCID = ang. Tissue Culture Infective Dose dawka zakażająca hodowlę tkankową) 3 ml do każdego nozdrza donosowo Szczepionkę wysłano w postaci zamrożonej wstępnie rozcieńczonej w 50 ml fiolce w suchym lodzie i przechowywano w -70ºC przed zaszczepieniem. Bezpośrednio przed zaszczepieniem Grupy 2 jałówek, materiał rozmrożono unikając miejscowych temperatur powyżej 37ºC. Gdy w płynie nie było widać lodu, materiał delikatnie mieszano i natychmiast użyto do zaszczepienia zwierząt. Zmierzono objętość nie zużytego materiału i podzielono na dwie porcje przed bezpośrednim zamrożeniem w suchym lodzie lub ciekłym azocie i przechowywano do celów ponownego miareczkowania. Wirus i zanieczyszczony plastik lub szkło inkubowano w celu inaktywacji wirusa w odpowiedniej objętości 8-10% roztworu formaldehydu przez co najmniej 24 godziny w temperaturze pokojowej przed wyrzuceniem Kontrola ciąży Obecność ciąży potwierdzono bezpośrednio przed inokulacją. Szczepienie jałówek Inokulacja jest dniem 0 eksperymentu. Do każdego z nozdrzy podano donosowo 3 ml badanego materiału strzykawką bez igły. Za każdym razem użyto nowej sterylnej strzykawki. Podawanie prowadzono podczas fazy wdechu, aby zminimalizować straty płynu podczas wydechu. Obserwacje po inokulacji Pobieranie i badanie próbek krwi Krew zbierano przestrzegając standardowych, aseptycznych procedur (dezynfekując miejsce krwawienia). Dla każdego zwierzęcia używano nowej sterylnej strzykawki i igły.

31 Pobieranie krwi w celu przygotowania surowicy Co najmniej 10 ml krwi pobierano od jałówek bezpośrednio przed inokulacją, następnie tydzień po zakażeniu i na zakończenie badania. Surowicę przechowywano w -20ºC do chwili jej wykorzystania. Pobieranie krwi w celu zliczenia leukocytów i do preparatów buffy coat Do znaczenia ilości leukocytów, bezpośrednio po pobraniu przeniesiono 3 ml krwi do odpowiednich sterylnych naczyń (Venoject, Terumo Europe N.V., Leuven, Belgia), wypełnionych wstępnie 0,06 ml EDTA (0,235 mol/l). Do preparatów buffy coat, bezpośrednio po pobraniu przeniesiono, co najmniej 15 ml krwi do odpowiednich sterylnych naczyń, wypełnionych wstępnie 0,1 ml roztworu heparyny (Na-heparin do injekcji, IU/ml, seria A7B163A, data ważności 11/2000: Gedeon Richter RT, Budapeszt, Węgry) osiągając, co najmniej 20 IU heparyny na mililitr krwi w próbce krwi. Następnie zawartość ostrożnie mieszano. Do preparatów buffy coat i do oznaczenia ilości leukocytów krew pobierano od jałówek: Każdego dnia, pomiędzy dniem 0 i dniem 14 po zakażeniu Co drugi dzień, pomiędzy dniem 15 i dniem 40, lub aż do uzyskania u wszystkich zwierząt negatywnych wyników izolacji wirusa w trzech kolejnych określonych momentach pobierania próbek. Przygotowanie surowicy Krew pozostawiono do skrzepnięcia w temperaturze pokojowej i rozdzielono poprzez odwirowanie. Każdą próbkę surowicy podzielono na dwie alikwoty co najmniej po 2 ml każda. Jeden zestaw alikwot analizowano pod kątem specyficznych przeciwciał BVDV przy pomocy ELISA. Pozostałe surowice zamrożono i przechowywano w -20ºC do chwili jej wykorzystania. Zliczanie leukocytów Ilość leukocytów oznaczono półautomatycznym elektrycznym licznikiem komórek coulter-counter (Diatron Minicell-16, Messtechnik GmbH, Wiedeń, Austria) o dokładności 0,1 x 10 9 /1, 100/μl. Instrument używano według zaleceń producenta (kalibracja i zliczanie leukocytów). Przygotowanie buffy coats (koncentratów bogatopłytkowych) Heparynowane próbki krwi przeniesiono do laboratorium tak szybko, jak było to możliwe. Procedurę przygotowywania buffy coats (koncentratów bogatopłytkowych), prowadzoną godnie ze standardową procedurą laboratoryjną, wykonywano w warunkach aseptycznych (sterylne pipety, przenoszenie, stół badawczy itd.).

32 Otrzymane buffy coats (koncentraty bogatopłytkowe) zawieszano ponownie w małej objętości (2 ml) RPMI 1640 i zamrażano w -70ºC w dwóch alikowtach po 0,5 ml. Pozostałe 1 ml buffy coats bezpośrednio użyto do wyznaczenia BVDV skojarzonego z komórkami krwi przy pomocy współuprawy w dopuszczającej hodowli komórkowej. Wykrywanie przeciwciał BVD w surowicy testem ELISA Każdą próbkę surowicy badano pod kątem obecności przeciwciał BVDV stosując odpowiedni i zwalidowany test ELISA (Svanovir TM test na przeciwciała BVDV nr kat ). Test walidowano i wykonano według zaleceń producenta. Próbki o dodatnim wyniku rozcieńczono według skali log 2 w celu wyznaczenia stężenia przeciwciał BVDV. Analiza(y) antygenu BVD Każdą próbkę buffy coats analizowano pod kątem obecności BVDV poprzez współuprawę świeżo przygotowanych buffy coats z wrażliwymi komórkami lub liną komórkową. Zabronione jest zamrażanie przed współuprawą. Zebrano osocze i z każdej próbki dostarczono do Man-Gene. Obserwacje kliniczne Obserwacje jałówek Zwierzęta badane były codziennie od dnia 0 do 42 po inokulacji pod kątem obecności objawów klinicznych przez dostatecznie wyszkolonego lekarza weterynarii. Odnotowywano wszystkie objawy kliniczne i opisywano ich naturę, konsystencję/dotyk, stopień zaawansowania (lekki, średni lub ciężki), umiejscowienie, rozmiar dotkniętego obszaru, które zbierano według uznanych i standardowych definicji. Szczególną uwagę poświęcono objawom oddechowym (oddychaniu, jego częstości, wydzieliny nosowej lub ocznej, zapalenia spojówek, kichanie, kaszlenie itd.) i biegunka. Temperatura odbytnicza Temperaturę w odbycie mierzono codziennie u każdej jałówki o tej samej porze (korzystnie rano) od 5 dnia przed inokulacją do 21 dnia po zakażeniu. Codzienne pomiary temperatury w odbycie kontynuowano do czasu, aż temperatura w odbycie u każdego zwierzęcia była niższa lub równa 39ºC przez 3 kolejne dni. Wykrycie przerwanej ciąży Obecność ciąży potwierdzono i podejrzenie poronienia lub resorpcji płodu ustalano na podstawie badania przez odbytnicę. Wyszkolony lekarz weterynarii badał wszystkie zwierzęta podczas inokulacji, 1 i 2 miesiące po inokulacji. Badanie przeprowadzone było według ogólnie przyjętej praktyki weterynaryjnej. Jałówki badano codziennie pod kątem oznak poronienia aż do chwili zakończenia badania (8-12 tygodni po ekspozycji).

33 Zakończenie badania Badanie zakończono poprzez ubicie jałówek i wydobycie płodów. Płody i materiał płodowy przeniesiono do zamkniętych przenośnych pojemników oznaczonych numerem krowy i datą/czasem. Pojemniki przeniesiono do wybranego pomieszczenia autopsyjnego. Autopsja jałówek nie była wymagana. Autopsja była przeprowadzana na płodach, wyniki zapisywane i zebrany został panel próbek jak opisano poniżej. Badanie pośmiertne Szczegółowa autopsja zwierząt eksperymentalnych wykonywana była w każdym przypadku śmierci. Badanie pośmiertne prowadzone było przez doświadczonego chirurga weterynaryjnego i dane zapisywano w odpowiedniej karcie danych. Dalsze testy laboratoryjne przeprowadzano według oznak klinicznych i obserwowanych zmian chorobowych. Jeżeli diagnoza autopsji odnosiła się do choroby spowodowanej czynnikiem bakteryjnym, diagnozę weryfikowano odpowiednimi testami, specyficznymi dla każdego czynnika. Każdą próbkę tkanki zbierano do co najmniej 2 oddzielnych oznaczonych pojemników i natychmiastowo zamrażano w ciekłym azocie. Próbki przechowywano w -70º do chwili użycia. Usunięte płody i zakończenie badania Z płodów pobrano przynajmniej następujące próbki tkanek: Wysięk z jamy otrzewnej lub piersiowej, jeżeli obecny, Krezkowe węzły chłonne Śledziona Grasica Móżdżek Nerki Szpik kostny z mostka Próbki z łożyska, jeżeli dostępne. Martwe lub ubite jałówki Pobrano przynajmniej następujące próbki tkanek: Krew do buffy coat, jeżeli dostępna Krew na surowicę, jeżeli dostępna Kępki Peyera Krezkowe węzły chłonne Śledziona

34 33 Nerki Macica, obejmujące, jeżeli dostępne, próbki z łożyska. Przechowywanie i transport próbek Próbki Przechowywanie Surowica -20ºC Buffy coat (koncentrat -70ºC bogatopłytkowy) Wirus -70ºC Tkanki z jałówek -70ºC Tkanki z płodów -70ºC 5 10 Próbki, zgodnie z wymaganiami sponsora, zostały wysłane do analizy laboratoryjnej. Wybór próbek i koordynacja transportu uzgodnione zostały z nadzorującym badanie lub zarządzającym projektem. W ogólnej zasadzie próbki przychodzące z poronionego materiału lub z nowo narodzonych cieląt badano tak szybko, jak było to możliwe. WYNIKI Śmiertelność Jałówka nr 626 (Grupa 1) zdechła w 13 DPI (Dniu Po Inokulacji). Następująca tabela podsumowuje obserwowane objawy kliniczne i zmiany patologiczne ujawnione w trakcie autopsji: Jałówka Obserwacje za życia Wyniki po śmierci Nr 626 objawy choroby od 7 DPI odwodnienie łzawienie, wydzielina nosowa w 7-12 DPI krwotoki z błon utrata apetytu od 8-12 DPI surowiczych biegunka w DPI przekrwienie kępek podwyższona częstość oddechów w 9-10 Peyera i w 12 DPI obrzęk płuc kaszlenie w 9 DPI nieprawidłowe oddychanie w 12 DPI 15 Wyniki kliniczne i patologia w obrazie makroskopowym są zgodne z zmianami patologicznymi wywołanymi BVDV, dlatego też można wywnioskować, że przyczyną śmierci było zakażenie BVDV.

35 Poronienia po zakażeniu W każdej grupie kliniczne poronienie miała jedna jałówka. Jałówka nr 615 (Grupa 1) poroniła w 38 DPI, jałówka nr 469 (Grupa 2) poroniła w 39 DPI. Oba płody wykazały objawy autolizy i oszacowano, że obumarły co najmniej 3-7 dni przed poronieniem (około DPI). W Grupie 1, nie znaleziono płodu u jałówki nr 526 podczas badania po uboju na zakończenie eksperymentu. Patologia w obrazie makroskopowym macicy ujawniła co następuje: prawy róg macicy był delikatnie powiększony pozostałości łożyska z postępującą autolizą zatrzymane było w świetle. Wyniki z macicy jałówki nr 526 są zgodne z cichym poronieniem, najprawdopodobniej z powodu zakażenia BVD. Kliniczne obserwacje jałówek Podsumowanie danych obserwacji klinicznych i czasu trwania objawów klinicznych w grupach jest przedstawione poniżej. Objawy kliniczne i dni po inokulacji (DPI), w których były one obserwowane Grupa 1 (XIKE-A) Objawy kliniczne Numer identyfikacyjny zwierzęcia * DPI Utrata apetytu Łzawienie , Zapalenie spojówek Wydzielina z nosa , Nadżerki jamy ustnej Krwotok z jamy ustnej Biegunka Kaszlenie 9 10, , 13 9 Nieprawidłowe oddychanie Podwyższona częstość oddechów , 12 Nadżerki kopyt *Jałówka nr 626 zdechła w 13 dniu po zaszczepieniu 20

36 35 Grupa 2 (XIKE-B) Objawy kliniczne Numer identyfikacyjny zwierzęcia * DPI Utrata apetytu Łzawienie Zapalenie spojówek Wydzielina z nosa Nadżerki jamy ustnej Krwotok z jamy ustnej Biegunka Kaszlenie Nieprawidłowe oddychanie Podwyższona częstość oddechów Nadżerki kopyt Wszystkie grupy zwierząt zakażonych XIKE-A wykazały szerokie spektrum objawów klinicznych. Jako pierwsze pojawiły się objawy ze strony układu oddechowego, którym towarzyszyła utrata apetytu i kilka dni później u jałówek rozwinęła się biegunka za wyjątkiem jałówki nr 526. Jedna jałówka zdechła i kolejna poroniła po zakażeniu (patrz poniżej). Wszystkie te objawy są spójne z oczekiwanymi symptomami występującymi po zakażeniu zjadliwym szczepem BVDV. Wszystkie grupy zwierząt zakażonych XIKE-B nie wykazały objawów klinicznych. W tym samym czasie jedna jałówka poroniła w czasie trwania obserwacji. Pomiar temperatury odbytniczej Nie wykryto żadnych nieprawidłowych zmian temperatury przed zakażeniem zwierząt. W grupie 2 wszystkie wartości temperatury pozostawały w zakresie fizjologicznym od dnia 0 do dnia 21 po zakażeniu. Wszystkie zwierzęta w grupie 1 wykazały podwyższoną temperaturę odbytniczą po zakażeniu, co wykryto pomiędzy dniami 7-11 PI. Wyniki na zakończenie badania Na zakończenie badania płody badano po ubiciu. Nie wydobyto płodu z jałówki nr 526 (patrz sekcja 10.2 Poronienia po zakażeniu ). Podczas autopsji płodów zaobserwowano następujące wyniki:

37 36 Nr Wyniki Rezultat zwierzęcia Grupa Wodobrzusze, ogólny obrzęk, autoliza Obumarcie co najmniej 2 tygodnie wcześniej 618 Wodobrzusze, ogólny obrzęk, autoliza Obumarcie co najmniej 3 tygodnie wcześniej Grupa Wodobrzusze, ogólny obrzęk, Płód uważany za nieżywy zwyrodnienie wątroby 588 Normalny Normalny, obrzęk okołonerkowy Ogólna autoliza Obumarcie 3-6 tygodni wcześniej 5 10 Wyniki sugerują, że 2 zwierzęta grupy 1(Jałówki nr 598 i nr 618) i jedno zwierzę grupy 2 (Jałówka nr 619) obumarły klika tygodni przed wyciągnięciem i dlatego też mogą być uważane jako poronienia. Aborcje zmodyfikowane wynikami pośmiertnymi Po pośmiertnych badaniach nie było jasne, dlaczego u niektórych jałówek nie wystąpiło poronienie. Martwe płody powinny być rozważane jako poronienia, dlatego też zmodyfikowano obraz kliniczny po zakończeniu badania następująco: Grupa 1 Nr zwierzęcia Rezultat 526 Poronienie BVD (macica z łożyskiem pośmiertnie) 598 Poronienie BVD (płód pośmiertnie) 615 Poronienie kliniczne BVD 618 Poronienie BVD (płód pośmiertnie) 626 Obumarcie z powodu BVD 15

38 37 Grupa 2 Nr zwierzęcia Rezultat 469 Poronienie kliniczne BVD 565 Oczekiwane poronienie BVD; nieżywy płód 588 Normalne 608 Normalne 619 Poronienie BVD (płód pośmiertnie) Badanie próbek krwi Zliczanie leukocytów Zliczanie WBC przerwano w dniu 26 PI, gdy w tym momencie u wszystkich zwierząt obserwowano ujemny wynik izolacji wirusa. Wartości 0 DPI uważano za indywidualne linie bazowe w celu porównania. W grupie 2, zliczania leukocytów nigdy nie przekroczyły 40% lub więcej poniżej wartości linii bazowej aż do zakończenia okresu obserwacyjnego (26 DPZ). W grupie 1, jedno zwierzę (jałówka nr 598) posiadała jednego dnia liczbę WBC poniżej 40% linii bazowej. Serologia Żadno z wybranych zwierząt nie miało specyficznych przeciwciał BVDV w surowicy przed zakażeniem. Po zakażeniu, u wszystkich jałówek, które przeżyły, rozwinęły się specyficzne przeciwciała BVDV, wykrywane od 3 tygodnia PI i trwające aż do końca okresu obserwacji u wszystkich badanych zwierząt. W grupie 2, 4 spośród 5 jałówek posiadały specyficzne przeciwciała wykrywane od 4 tygodnia PI. Mierzalna odpowiedź przeciwciała występowała jedynie u 3 zwierząt aż do zakończenia okresu obserwacyjnego. Stężenia były niższe w grupie 2 niż w grupie 1. Wykrywanie wirusa poprzez współuprawę Buffy coats (koncentraty bogatopłytkowe) BVDV wykryto w obu grupach. Czas trwania wykrywalności wirusa podsumowano poniżej. Wszystkie próbki poddano współuprawie bezpośrednio po pobraniu, tj. bez zamrażania.

39 38 Nr zwierzęcia DPI, w którym wykryto BVDV Grupa , , 13 Grupa Próbki tkanek Obecność wirusa BVD u martwych jałówki i płodów podsumowano poniżej: Jałówka Nr zwierzęcia BVDV w próbkach tkanek Grupa Obecny # Płody Nr zwierzęcia BVDV w próbkach tkanek Grupa Nieobecny # 526 NB 626 Obecny # 618 Nieobecny 598 Obecny Grupa Obecny 588 Nieobecny 608 Obecny 469 Nieobecny # 619 Nieobecny NB nie badano

40 5 39 Próbki współuprawiano bezpośrednio po pobraniu (tj. bez zamrażania) za wyjątkiem # oznaczające te, z których dostępne były jedynie zamrożone próbki. Podsumowanie danych klinicznych i laboratoryjnych związanych z BVD Grupa 1 Nr Rezultat BVD zwierzęcia 615 Poronienie BVD (macica z łożyskiem NB (nie znaleziono pośmiertnie) próbki) 526 Poronienie BVD (płód pośmiertnie) + (płód)* 626 Poronienie kliniczne BVD - (płód)* 618 Poronienie BVD (płód pośmiertnie) - (płód)* 598 Obumarcie z powodu BVD + (płód)/ +(jałówka) NB nie badano Grupa 2 Nr zwierzęcia Rezultat BVD 565 Poronienie kliniczne BVD - (płód)* 588 Oczekiwane poronienie BVD; nieżywy płód + (płód) 608 Normalne - (płód) 469 Normalne + (płód) 619 Poronienie BVD (płód pośmiertnie) - (płód)* *w czasie pobierania próbki płód był zautolizowany Wniosek: Celem badania była ocena bezpieczeństwa XIKE-A i XIKE-B u ciężarnych zwierząt. 10 ciężarnych jałówek wybrano ze stada o ujemnym wyniku BVDV. Badanie kliniczne objęto dwie grupy 5 jałówek: pierwsza została inokulowana szczepem wirusa XIKE-A, druga szczepem wirusa XIKE-B. W dniu inokulacji wiek ciąży jałówek wynosił pomiędzy 60 i 90 dniem. Jałówki obserwowano pod względem obecności oznak klinicznych zakażenia BVDV obejmujących poronienia podczas okresu obserwacyjnego. Od zwierząt pobrano próbki krwi do badań serologicznych, detekcji antygenów i ilości białych krwinek. Eksperyment zakończono 9 tygodni po zakażeniu. Krowy, które nie poroniły ubito, zebrano i zbadano macice. Próbki narządów płodowych zebrano podczas procedury sekcji zwłok i zbadano pod kątem zakażenia BVDV.

41 Obecność zakażenia płodowego była głównym parametrem badania, składająca się z liczby śmiertelności krów związaną z BVDV, liczby poronień związanych z BVDV i liczby płodów z dodatnim wynikiem BVDV w chwili zakończenia eksperymentu. W dodatku do głównego parametru, sprawdzano oznaki kliniczne charakterystyczne dla zakażenia BVDV, obecność wirusa we krwi i ilość białych krwinek u krów i temperaturę ciała mierzoną w odbycie po ekspozycji. Udowodniono, że wirus XIKE-B jest mniej patogenny od XIKE-A, pomimo to, w grupie XIKE-B również obserwowano poronienia związane z BVD i zakażenia płodu. Dlatego można podsumować, że inaktywacja RNazy E ms nie zapobiega zakażeniom płodu. Przykład 2 BVDV XIKE-A-NdN: Oszacowanie patogeniczności płodu u ciężarnych jałówek Wykazano, że gen N pro nie jest nieodzowny do wzrostu CSFV w hodowli tkankowej (Tratschin i inni, 1998). Pomimo tego, że nadal nie ma dowodu na atenuację BVDV w konsekwencji delecji N pro, rola tego białka w oddziaływaniu pomiędzy wirusem i żywicielem wydaje się być możliwa i w zasadzie wykazano to w ostatnich eksperymentach dla CSFV (Mayer i inni, 2004, Rüggli i inni, 2003). Dlatego też chcieliśmy prześledzić, czy delecja sekwencji kodującej głównej części N pro prowadzi do wirusa, który już nie zakaża płodów u ciężarnych jałówek. Gen N pro, za wyjątkiem czterech 5 -końcowych kodonów usunięto z pełnej długości cdna klonu pkane40a według ogólnie przyjętych procedur. Powstały pełnej długości zmutowany klon użyto jako templatu do transkrypcji in vitro i powstałym crna transfekowano komórki MDBK jak opisano (Mayer i inni, 2002). Odzyskany wirus amplifikowano do hodowli komórkowej i następnie zastosowano w opisanym poniżej eksperymencie na zwierzętach. BVDV XIKE-B spełniał rolę kontrolną po tym, jak wykazano wcześniej, że jest zdolny do przejścia przez łożysko (Przykład 1). Zamierzenie(a)/cel badania Celem badania była ocena bezpieczeństwa żywego atenuowanego BVDV z genomową delecją większości kodującego obszaru N pro u ciężarnych zwierząt. Zastosowane tutaj Materiały i Metody opisano w Przykładzie 1. Projekt badania Osiem ciężarnych jałówek przypisano losowo do dwóch grup. Poddawano je terapii i obserwowano według następującego planu: 35

42 41 Grupa 1 Grupa 2 Liczba 5 3 Terapia XIKE-A-NdN XIKE-B/kontrolna Droga podania Domięśniowo Czas zaszczepienia Pomiędzy 60 i 90 dniem ciąży (dzień 0 badania) Obserwacje po Objawy kliniczne zaszczepieniu Surowica w dniu 0, 14, 28, 42 i na zakończenie (za życia) badania WBC w dniu 0 i następnie codziennie przez 14 dni Buffy coat w dniu 0 i następnie codziennie przez 14 dni Obserwacje pośmiertne Patologia w obrazie makroskopowym (dzień 60) Panel organów do izolacji wirusa Rodzaj badania: Jednostka eksperymentalna: Metoda zaślepienia: Otwarte kontrolowane badanie kliniczne Poszczególne zwierzę Częściowe zaślepienie. Nie zastosowano szczegółowych procedur zaślepienia i dostępu do planu terapii. Obserwujący weterynarz w miejscu prowadzenia badania i patolog nie znali leczenia, otrzymali jedynie fragment protokołu odpowiedniego do ich zadań. Szczepienie wykonane było przez badacza lub jego pełnomocnika. Próbki do izolacji wirusa zostały zakodowane przez badacza do czasu, gdy dostępne były wszystkie wyniki Wyniki Na początku badania wszystkie jałówki były zdrowe i ciężarne. Na początku badania udowodniono, że wszystkie zwierzęta nie posiadały BVDV i przeciwciał BVDV. Preparowanie i kontrola wirusa zastosowanego do zakażenia Próbki pobierano ze wszystkich etapów rozcieńczenia i analizowano w dniu preparowania, tj. bez zamrażania przez wspłówzrastanie na odpowiedniej hodowli komórkowej. Wyniki miareczkowania wirusa przedstawiono w następującej tabeli:

43 42 Nr ident. próbki Szczep wirusa Rozcieńczenie/opis Log 10 stężenie/ml VT1a 1:2 (w 4ºC) 4,4 XIKE-A/NdN VT1b #2a na lodzie bez otwierania 4,0 (S) VT1c Powrót #2b 2,8 VT2a 1:2,2 (w 4ºC) 2,3 VT2b XIKE-B #3a na lodzie bez otwierania 2,8 VT2c Powrót #3b Ujemne 5 Kliniczne symptomy zakażenia BVDV W poniższej tabeli podsumowano zwierzęta, u których występowały objawy kliniczne w trakcie okresu obserwacyjnego Objawy kliniczne i dni po inokulacji (DPI), w których je obserwowano Grupa 1 (XIKE-A NdN) Grupa 2 (XIKE-B) Objawy kliniczne Nr identyfikacyjny zwierzęcia Utrata apetytu 8-10 Łzawienie Zapalenie spojówek Wydzielina z nosa Nadżerki jamy ustnej Krwotok z jamy ustnej Biegunka Kaszlenie Nieprawidłowe oddychanie Podwyższona częstość oddechów Nadżerki kopyt Obserwowano jedynie lekkie i krótkotrwałe objawy kliniczne u niektórych zwierząt w każdej grupie. W grupie 1, jedna z pięciu jałówek straciła apetyt w dniu 8 PI. W grupie 2, dwoje z trojga zwierząt miało objawy kliniczne. Obydwie jałówki doświadczyły kaszlu około dnia 21 PI, któremu towarzyszyła utrata apetytu u jednej z nich.

44 Pomiar temperatury odbytniczo Nie wykryto żadnych nieprawidłowych zmian temperatury przed inokulacją zwierząt. W kilku przypadkach podwyższonej temperatury mierzonej po inokulacji podsumowano w poniższej tabeli. Grupa Nr ident. zwierzęcia Temperatura (ºC) Dzień PI , , , ,8 9 W każdej grupie jedno zwierzę miało nieznacznie podwyższoną temperaturę i również w każdej grupie jedno zwierzę miało gorączkę. Gorączkę wykryto w dzień 8 lub 9 PZ. Wartości temperatury zawsze powracały do wartości normalnych w następnym dniu. Zliczanie leukocytów We wszystkich grupach obserwowano leukocytopenie pomiędzy dniem 3-8 PI. Liczba zwierząt z co najmniej 40% redukcją liczby białych krwinek była następująca: Grupa Liczba zwierząt posiadających leukocytopenię/całkowita liczba zwierząt 1 3/5 (60%) 2 1/3 (33%) Serologia (przeciwciała BVDV) W zgodności z protokołem badania, wszystkie jałówki nie miały przeciwciał BVDV przed zaszczepieniem. W grupie 1 (inokulowanej XIKE-A NdN) i grupie 2 (inokulowanej XIKE- B) całkowita serokonwersja była wykrywana jedynie na koniec badania (2 miesiące po inokulacji). Izolowanie wirusa BVD z buffy coats (koncentratów bogatopłytkowych) Nie wykryto wiremii. 25

45 44 Izolowanie wirusa BVD z płodowych próbek tkankowych Grupa 1 Grupa 2 Liczba 5 3 Leczenie XIKE-A-NdN XIKE-B/kontrolne Droga podania Domięśniowo Domięśniowo Liczba płodów, u których wykryto przekazanie wirusa do płodu Zakażone 4 z 5 płodów Zakażone 2 z 3 płodów Wniosek, czy wirus zastosowany Obserwowane przenikanie Obserwowane w leczeniu posiada możliwość do płodu przez XIKE-A- przenikanie do płodu przenikania przez łożysko NdN przez XIKE-B Wniosek Macierzysty wirus XIKE-A wykazuje wysoką patogeniczność w porównaniu do delecji N pro wynikającej z istotnej atenuacji BVDV (Meyer i inni, 2002). Jednakże sama delecja Npro nie zapobiega przenikaniu rekombinatu wirusowego opartego na NY93 do płodu po inokulacji ciężarnych krów. Przykład 3 BVDV XIKE-B-NdN: Oszacowanie patogeniczności płodu u ciężarnych jałówek W celu zbadania możliwości kombinacji inaktywacji RNazy i delecji N pro w związku z atenuacją BVDV i transmisji zakażenia do płodu, ustalono różne mutanty BVDV-2 z delecją w kodującym obszarze N pro w oparciu o cdna zakaźnego klonu pkane40b, RNazo-ujemny mutant pkane40a z delecją kodonu 349. Odzyskane wirusy analizowano w związku z obecnością pożądanych mutacji, nieobecności mutacji drugiego miejsca w obszarach oskrzydlających wprowadzone zmiany i ich charakterystykę wzrostu w hodowli tkankowej. XIKE-B-NdN (V-pK88C), odmiana zawierająca delecję kompletnego regionu kodującego N pro, za wyjątkiem kodonów od 1 do 4 w dodatku do inaktywującej RNazę delecji kodonu 349 wybrano do eksperymentu ze zwierzętami, ponieważ łączy to w sobie pożądane mutacje o akceptowalnych charakterystykach wzrostowych. Celem badania było oszacowanie bezpieczeństwa żywego atenowanego izolatu BVDV u ciężarnych zwierząt. Pięć ujemnych pod względem BVDV, ciężarnych jałówek inokulowano donosowo infekcyjną dawką 10 5 TCID 50 /zwierzę XIKE-B-NdN (dane odwrotnego miareckowania przedstawiono w Tabeli 3.1) Dane kliniczne notowano codziennie. Próbki krwi pobierano do zliczania białych krwinek, preparowania buffy coat i seroligii. Po zakończeniu badania zebrano tkanki płodowe do izolacji wirusa.

46 Materiały i metody Jak wyszczególniono w przykładzie 1. Wyniki Nie obserwowano danych klinicznych (dane nieujawnione). Liczba leukocytów pozostawała właściwie niezmieniona, za wyjątkiem jednorazowego znacznego zmniejszenia w około 40% poniżej wartości bazowej (dzień 0) u jałówki nr 1015 w dniu 6 PI (dane nieujawnione). a) Analiza preparatów buffy coat (koncentratów bogatopłytkowych): Około 10 6 leukocytów hodowano w dwóch egzemplarzach z komórkami MDBK w 24- dołkowych płytkach do hodowli komórkowej przez 5 dni. Próbki dwukrotnie zamrażano i rozmrażano. 100 mikrolitrowe alikwoty rozmrożonych próbek inokulowano do świeżo posianych 24-dołkowych płytek hodowli komórkowych i badano pod kątem wirusa pośrednim wybarwieniem immunofluorescencyjnym (mab kod 4, bezpośrednio przeciwko konserwatywnemu epitopowi w białku niestrukturalnym NS3). Nie wyizolowano BVDV z preparatów buffy coat zwierząt o numerach 921, 1013, 1015, 1055 i 1075 (Tabela 3.2) podczas, gdy dodatnie kontrole jasno wykazały poprawne warunki testu. b) Pośmiertne badanie tkanek płodowych Po zakończeniu badania w celu izolacji wirusa, zebrano następujące tkanki płodowe: śledziona, nerki, grasica, mostek, móżdżek, łożysko, jelita i płyny brzuszne. W skrócie, zawiesiny tkankowe przygotowano w moździeżu stosując jałowy piasek morski i lodowaty PBS bez Ca 2+ i Mg 2+. Moździeże przepłukano 1 ml lodowatym PBS bez Ca 2+ i Mg 2+ i zawiesiny odwirowywano przez 10 minut przy 2000 x g (4ºC). Najpierw supernatant przepuszczono przez jednorazowy uchwyt filtracyjny (0,45 μm), po którym następowało drugie przejście filtrowe (wielkość porów 0,2 μm). Iolację wirusa prowadzono w dwóch egzemplarzach (400 μl zawiesiny tkankowej płodu lub 100 μl płodowych płynów brzusznych) na monowarstwie komórek MDBK w 24-dołkowej płytce do hodowli komórkowej (37ºC, 7% CO 2 ). Próbki tkankowe sprawdzano codziennie pod kątem efektów cytopatologicznych lub zanieczyszczenia bakteryjnego i po czasie inkubacji trwającym 5 dni płytki zamrożono i rozmrożono dwukrotnie. 100 μl próbek pasażowano do świeżo posianych komórek MDBK. Wirus wykrywano pośrednim wybarwieniem immunofluorescencyjnym (mab kod 4). W próbkach tkankowych lub płodowych płynach brzusznych nie wykryto BVDV (Tabela 3.3). c) Wyniki badań serologicznych Stężenia zobojętniania surowicy wyznaczono przed inokulacją, jeden miesiąc po inokulacji i na zakończenie badania. Surowice od wszystkich zwierząt badano w trzech

47 egzemplarzach w celu zobojętnienia przeciwciał przeciwko NY93/C i punkt końcowy rozcieńczenia odczytano poprzez pośrednie wybarwienie immunofluoroscencyjne. Wyniki wyrażono jako punkt końcowy rozcieńczenia, który zobojętniał około 100 TCID 50 i obliczono je metodą Kaerbera. Dla dnia 0 i 1 i 2 tygodnie po zakażeniu nie można było otrzymać żadnych pewnych danych, ponieważ surowice były toksyczne dla komórek MBDK w rozcieńczeniach aż do 1:16 i nie można było wykryć zobojętnienia w wyższych rozcieńczeniach. Począwszy od trzeciego tygodnia po zaszczepieniu u wszystkich zwierząt rozwinęły się przeciwciała zobojętniające przeciwko homologu wirusa BVDV-2 - NY 93/C trwające aż do końca badania (Tabela 3.4 i Fig. 1). d) Wnioski Dane otrzymane w trakcie badania na zwierzętach jasno pokazują, że BVDV XIKE-B- NdN reprezentuje silnie atenuowany wirus. W przeciwieństwie do dzikiego typu wirusa lub pojedynczych mutantów XIKE-B lub XIKE-A-NdN, które wykazują w wysokim stopniu transmisję zakażenia do płodu u ciężarnych jałówek, podwójny mutant nie przekracza łożyska. BVDV XIKE-B-NdN jak również podobne podwójne mutanty są wyjątkowo odpowiednie do zastosowania w żywej atenuowanej szczepionce. 20 Badanie nr: B01 BIVI020 i B01 BIVI022 Tabela 3.1: Miareczkowanie odwrotne wirusa Identyfikacja próbki Szczep wirusa Rozcieńczenie Stężenie 1a stężony wirus 10 5,44 TCID 50 /ml 1 XIKE-B-NdN 1:4 10 4,86 TCID 50 /ml 6 pozostałości zakażenia (#1) 10 4,27 TCID 50 /ml

48 47 Nr identyfikacyjny zwierzęcia Data _- ujemna próba Tabela 3.2 Wykrywanie wiremii Dni po zaszczepieniu izolacja 2. izolacja 1. izolacja 2. izolacja 1. izolacja 2. izolacja 1. izolacja 2. izolacja 1. izolacja 2. izolacja

49 48 Nr ident. zwierzęcia NP nie pobrane - ujemna próba Płyny brzuszne Płyny piersiowe NP NP NP NP NP Tabela 3.3 Analiza próbek tkankowych płodów na obecność BVDV Krezkowe węzły chłonne Śledziona Nerki Grasica Szpik kostny (mostek) Móżdżek - - NP NP NP NP NP Łożysko Jelita Data pobrania tkanki Izolacja izolacja izolacja 2. izolacja izolacja 2. i l j izolacja 2. izolacja izolacja 2.

50 49 Tabela 3.4: B01 BIVI022/BVDV XIKE-B-NdN; Badanie ochronne płodu Test Zobojętniania Surowicy Nr ident. zwierzęcia przy wyborze Podczas inok. 1 tydz. PZ 2 tydz. PZ 3 tydz. PZ Od jałówek 4 tydz. PZ 5 tydz. PZ 6 tydz. PZ 0921 * * * 1:40 (2) 1:161 (1) 1:256 (1) 1:323 (1) 1013 * * * 1:3 (2) DN 1:161 (1) 1:323 (1) 1015 * * * 1:64 (2) 1:161 (1) 1:256 (1) 1:323 (1) 1055 * * * 1:32 (2) 1:40 (2) 1:256 (1) 1:323 (1) 1075 * * * DN 1:128 (2) 1:102 (1) 1:203 (1) Data (1) Zobojętnianie serum przeciwko RNaie 1456 (= NY93/C) 10 2,03 TCID50/50 μl *Surowica toksyczna dla komórek MBDK w stężeniu aż do 1:16 - dane niedostępne (2) Zobojętnianie serum przeciwko RNazie 1456 (= NY93/C) 10 1,57 TCID50/50 μl DN dane niedostępne Test Zobojętniania Surowicy przeciwko NY93/C zilustrowano na Fig.1. 7 tydz. PZ 1:128 (1) 1:406 (1) 1:406 (1) 1:406 (1) 1:161 (1) tydz. PZ 1:256 (1) 1:256 (1) 1:323 (1) 1:406 (1) 1:406 (1)

51 Badanie skuteczności i ochrony krzyżowej W odniesieniu do szczepienia atenuowanymi mutantami wirusowymi BVDV XIKE-B lub BVDV XIKE-B-NdN można napotkać dwa możliwe problemy. Pierwszy z nich dotyczy ogólnego problemu dotyczącego ochrony krzyżowej pomiędzy BVDV-1 i BVDV-2. Szczepienie inaktywowanymi szczepionkami BVDV-1 nie zapobiega transmisji zakażenia BVDV-2 do płodu u ciężarnych zwierząt. Ponieważ ochrona przeciwko zakażeniu płodu reprezentuje główny cel przeciwko szczepieniu BVDV, takich szczepionek nie można uważać za wywołujące ochronę immunologiczną w szerokim zakresie. Pozostawało pytanie, czy szczepienie żywym atenuoawnym BVDV-2 może zapobiegać transmisji wirusowego zakażenia do płodu. Drugi problem, zmniejszenie szybkości wzrostu BVDV XIKE-B-NdN może powodować jedynie niski poziom ochrony niezdolnej do zapobiegania zakażeniu przez łożysko płodu u ciężarnych jałówek. W celu rozwiązania tych problemów rozpoczęto badanie na zwierzętach. Zwierzęta (2 grupy po 10 zwierząt w każdej) zaszczepiono albo BVDV XIKE-B albo XIKE-B-NdN (zamierzone dawkowanie: 1 ml supernatantu z 10 5 TCID 50 wirusa; miareczkowanie odwrotne pokazane jest w Tabeli 3.5). Żadno ze zwierząt nie wykazało znaczących objawów klinicznych po zaszczepieniu, za wyjątkiem jednego zwierzęcia z nieszczepionej grupy kontrolnej, u którego przez jeden dzień obserwowano lekkie kaszlenie. Wartości temperatury w odbycie były poniżej 39ºC, za wyjątkiem jednego zwierzęcia z nieszczepionej grupy kontrolnej, u którego przez jeden dzień obserwowano temperaturę 39,1ºC. Próbki buffy coat przygotowane po zaszczepieniu były analizowane pod kątem obecności wirusa jak opisano powyżej. Eksperymenty wykazały, że jedynie 5 spośród 20 zwierząt miało wirusa we krwi przez 1 lub 2 dni w 4 do 8 dniu po zakażeniu (Tabela 3.6). Tabela 3.5: Miareczkowanie odwrotne wirusów zastosowanych do szczepienia Identyfikacja próbki Szczep wirusa Rozcieńczenie Stężenie 1a stężony wirus 10 5,44 TCID 50 /ml 1 XIKE-B-NdN 1:4 10 4,86 TCID 50 /ml 6 pozostałości zakażenia (#1) 10 4,27 TCID 50 /ml 3 1: ,76 TCID 50 /ml 4 XIKE-B 1: ,92 TCID 50 /ml 5 pozostałości zakażenia (#4) 10 4,27 TCID 50 /ml

52 Nr ident. zwierzęcia Data 51 Badanie Nr /Id.: B01BIVI020/BVDV Tü XIKE-B/XIKE-B-NdN; badanie ochrony płodu Tabela 3.6: Inokulacja preparatami białymi krwinkami (buffy coat) pobranymi po zaszczepieniu Dni po zaszczepieniu 1. izolacja 2. izolacja 1. izolacja 2. izolacja 1. izolacja 2. izolacja 1. izolacja 2. izolacja 1. izolacja 2. izolacja 1. izolacja 2. izolacja 1. izolacja 2. izolacja 1. izolacja 2. izolacja 1. izolacja 2. izolacja 1. izolacja 2. izolacja 1. izolacja 2. izolacja 1. izolacja 2. izolacja

53 52 (kontynuacja) Nr ident. zwierzęcia Dni po zaszczepieniu 1. izolacja 2. izolacja 1. izolacja 2. izolacja 1. izolacja 2. izolacja 1. izolacja 2. izolacja 1. izolacja 2. izolacja 1. izolacja 2. izolacja 1. izolacja 2. izolacja Data 1. izolacja 2. izolacja 1. izolacja 2. izolacja 5 Barwienie immunofluorescencyjne: Kod 4: Kod numerów zwierząt: próba ujemna; (1) szczepienie BVDV XIKE-B (mutant RNazy); + - próba dodatnia; (2) szczepienie BVDV XIKE-B-NdN (podwójny mutant RNazy i N pro ) B zanieczyszczenie bakteryjne w dołku

54 Cztery tygodnie po zaszczepieniu przeprowadzono inseminację zwierząt. Zakażenia ekspozycyjne wykonano 60 do 90 dni później stosując zarówno szczepi BVDV-1 (BVDV KE-9, ekspozycja heterologiczna, zwierzęta zaszczepione XIKE-B) lub heterogenicznym szczepem BVDV-2 (BVDV KE-13, ekspozycja homologiczna, zwierzęta zaszczepione XIKE-B-NdN) (dawka zamierzona:10 5 TCID 50 w 6 ml; miareczkowanie odwrotne przedstawiono w Tabeli 3.7). Z każdej grupy zaszczepionych zwierząt losowo wybrano 5 ciężarnych jałówek w celu zakażenia ekspozycyjnego. Zwierzęta zaszczepione BVDV XIKE-B eksponowano na szczep KE-9 BVDV, podczas, gdy jałówki zaszczepione BVDV XIKE-B/NdN eksponowano na BVDV-2 KE-13. Dodatkowo zakażono 2 niezaszczepione zwierzęta kontrolne każdym z wirusów ekspozycyjnych. Badanie Nr/Id.: B01 BIVI020/BVDV Tü XIKE-B-NdN; Badanie ochrony płodu Tabela 3.7: Miareczkowanie odwrotne ekspozycyjnych wirusów Szczep wirusa Ident. próbki Miano (TCID 50 /ml) Średnie miano (TCID 50 /ml) 10 4, , ,10 KE ,69 * 10 4,44 3 ** 10 4, ,76 KE , , , ,69 3*** 10 3,5 10 3, Próbka 1: stado szczepione Próbka 2: stado szczepione, które wróciło ze stajni Próbka 3: nadmiar szczepionki *Druga inokulacja KE9, próbkę 2 nie interpretowano z powodu obumarcia komórek. **KE9, próbkę 3 nie interpretowano z powodu obumarcia komórek lub zanieczyszczenia bakteryjnego. ***Pierwsza inokulacja KE13, próbkę 3 nie interpretowano z powodu zanieczyszczenia bakteryjnego. Zaszczepione zwierzęta nie wykazywały wiremii lub klinicznych symptomów na zakażenie ekspozycyjne. Ekspozycję uznawano za udaną, gdy u wsztstkich nieszczepionych zwierząt wykryto dodatnie BVDV (Tabela 3.8). Jedynie łagodne oznaki choroby obserwowano w grupach kontrolnych. Liczba białych krwinek pozostawała prawie w normie (niepokazano).

55 Nr ident. zwierzęcia 54 Badanie Nr /Id.: B01BIVI020/BVDV Tü XIKE-B/XIKE-B-NdN; badanie ochrony płodu Tabela 3.8: Inokulacja preparatami białymi krwinkami (buffy coat) pobranymi po zaszczepieniu Dni po ekspozycji Izolacja 1. izolacja 2. izolacja 1. izolacja 2. izolacja 1. izolacja 2. izolacja 1. izolacja 2. izolacja 1. izolacja 2. izolacja 3. izolacja 1. izolacja 2. izolacja 3. izolacja

56 Nr ident. zwierzęcia 55 (kontynuacja) Dni po ekspozycji izolacja 1. izolacja 2. izolacja 3. izolacja 1. izolacja 2. izolacja 3. izolacja 1. izolacja 2. izolacja 1. izolacja 2. izolacja 3. izolacja 1. izolacja 2. izolacja 3. izolacja

57 Nr ident. zwierzęcia 56 (kontynuacja) Dni po ekspozycji izolacja 1. izolacja 2. izolacja 3. izolacja 1. izolacja 2. izolacja 1. izolacja 2. izolacja Data 5 Barwienie immunofluorescencyjne: Kod 4: Kod numerów zwierząt: próba ujemna; (1) szczepienie BVDV XIKE-B (mutant RNazy); + - próba dodatnia; (2) szczepienie BVDV XIKE-B-NdN (podwójny mutant RNazy i N pro ); B zanieczyszczenie bakteryjne w dołku (3) niezaszczepione grupy kontrolne

58 Stężenia zobojętniania surowicy oznaczono przed inokulacją, 1 miesiąc po inokulacji, przed ekspozycją, 1 miesiąc po ekspozycji i na zakończenie badania. Surowice od wszystkich zwierząt badano w trzech egzemplarzach na zobojętnienie przeciwciał przeciwko KE9 i NY93/C (RNaza 1456) i punkt końcowy rozcieńczenia odczytano pośrednim wybarwieniem immunofluorescencyjnym. Wyniki wyrażono jako punkt końcowy rozcieńczenia, który zobojętniał około 100 TCID 50 i obliczono je metodą Kaebera. Przy niektórych wyższych stężenia przeciwciała zastosowany punkt końcowy rozcieńczenia nie był wystarczająco wysoki. Przeciwko KE9, jedynie zwierzęta zaszczepione XIKE-B rozwinęły niskie stężenia przeciwciał począwszy od około 4 tygodnia. Przy ekspozycji wszystkie zwierzęta posiadały stężenia preciwciał, które wzrastały znacząco począwszy od około 4 tygodnia po ekspozycji. Zwierzęta zaszczepione XIKE-B posiadały wyższe stężenia preciwciał niż te zaszczepione XIKE-B-NdN. Wszystkie zwierzęta rozwinęły w miarę podobne stężenia zobojętnienia przeciwko NY93/C cztery tygodnie po zaszczepieniu, z marginalnie niższymi stężeniami u zwierząt zaszczepionych XIKE-B-NdN. Po ekspozycji wszystkie zwierzęta posiadały wysokie stężenia przeciwciał. Fig. 2 pokazuje test zobojętnienia w surowicy przeciwko KE9 (BVDV-1) i Fig.3 pokazuje test zobojętnienia w surowicy przeciwko NY93/C (BVDV-2). Analizy próbek tkankowych otrzymanych po zakończeniu badania z płodów ujawniły, że materiał otrzymany od zaszczepionych zwierząt dał ujemne wyniki, podczas gdy transmisja zakażenia pojawiła się u wszystkich 4 zwierząt kontrolnych (Tabela 3.9). Z tego względu ocywiste jest, że określone mutanty BVDV-2 lepiej służą jako skuteczna ochrona przed przenikaniem przez łożysko wirusów szczepionki.

59 58 Badanie Nr /Id.: B01BIVI020/BVDV Tü XIKE-B/XIKE-B-NdN; badanie ochrony płodu Tabela 3.9: Analiza próbek tkankowych płodu na obecność BVDV Nr zwierzęcia Płyn brzuszny Płyn piersiowy Krezkowe węzły chłonne Jelito cienkie Śledziona Grasica Nerki Szpik kostny (mostek) Móżdżek Placenta Data 5 ND = niedostępne Kod liczb zwierząt *nie znaleziono płodu w macicy jałówki #1218 (1) szczepienie BVDV XIKE-B (mutant RNazy) **Endometrium (również pobrane do badań histologicznych) (2) szczepienie BVDV XIKE-B-NdN (podwójny mutant RNazy i N pro ) ***Próbki nie wysłanodo BFA Tubinga (3) nieszczepiona grupa kontrolna

60 Wnioski Ekspozycja powiodła się, ponieważ u wszystkich niezaszczepionych zwierząt kontrolnych wykryto wiremię BVDV i u wszystkich płodów z niezaszczepionych grup kontrolnych wykryto dodatnie BVDV. Oba izolaty dawały pełną ochronę w bierzącym teście i warunkach analizy. Izolat XIKE-B z pojedynczym genetycznym markerem wykazywał ochronę krzyżową przeciwko ekspozycji BVDV typu 1 w określeniach wiremii BVD i transmisji zakażenia do płodu po ekspozycji. Izolat XIKE-B-NdN z podwójnym genetycznym markerem dawał pełną ochronę przeciwko ekspozycji heterologicznym szczepem BVDV typu 2 w określeniach wiremii BVD i transmisji zakażenia do płodu po ekspozycji. 1. Izolat XIKE-B (izolat typu 2) wykazywał ochronę krzyżową przeciwko ekspozycji BVDV typu 1 w określeniach wiremii BVD i transmisji zakażenia do płodu po ekspozycji w bierzącym teście i warunkach analizy (n = 4). 2. Izolat XIKE-B-NdN (izolat typu 2) wykazywał pełną ochronę przeciwko ekspozycji heterologicznym szczepem BVDV typu 2 w określeniach wiremii BVD i transmisji zakażenia do płodu po ekspozycji w bierzącym teście i warunkach analizy (n = 5). Przykład 4 Ustalenie mutantów N pro Dalsze analizy mutantów BVDV-2 z delecjami w N pro. Ustalono różne mutanty z delecjami w obszarze kodującym N pro genomu. Początkowo wprowadzono jedynie wierne delecje lub delecje, którym towarzyszy mutacja punktowa. A: [N pro ] 1 -[C-końc]; B: [N pro ] 3 -[C-końc]; C: [N pro ] 4 -[C-końc]; D: [N pro ] 6 -[C-końc]; E: [N pro ] 4 -[C-końc*]; We wzorach [N pro ] x reprezentuje liczbę aminokońcowych reszt N pro, które pozostawiono w zmutowanej aminokwasowej poliproteinie, [C-końc] jest kompletną poliproteiną za wyjątkiem N pro (rozpoczynając od białka C i kończąc na NS5B), i [Ckońc*] jest takie same jak [C-końc], ale posiada mutację w pozycji 2 C białka (N zamiast D). Szybkości wzrostu odzyskanych wirusów były znacznie niższe niż te z dzikiego typu XIKR-A lub RNazo-ujemnych mutantów XIKE-B. Istnieją dwa możliwe wytłumaczenia tych wyników: (i) w zależności od szczepu wirusa, sekwencje zmiennej długości obszaru kodującego N pro są konieczne do skutecznej inicjacji translacji (Myers i inni, 2001; Tautz i

61 inni, 1999) i (ii) fuzja dodatkowych sekwencji do aminokońca białka kapsydu koliduje z funkcjonowaniem białkowego kapsydu. W celu uzyskania lepszego wzrostu mutantów z delecją N pro, utworzono drugi zestaw mutantów z albo bydlęcym genem ubikwityny lub z fragmentem bydlęcej sekwencji kodującej LC3 zastępującą główną część genu N pro. Konstrukcje te pozwalają na skuteczną translację i generację białka kapsydowego o prawidłowym aminokońcu. [N pro ] 22 -[PS]-[C-końc] gdzie PS jest ubikwityną lub LC3, C-końc jest kompletną poliproteiną za wyjątkiem N pro (rozpoczynając od białka C i kończąc na NS5B). Szybkości wzrostu tych mutantów są bardziej zbliżone do tych wyznaczonych dla XIKE-A. Wydaje się nawet, że dwa RNazo-dodatnie wirusy według wzoru [N pro ] 22 -[PS]- [C-końc] nazwane V-pK87F i V-pK87G wcale nie wykazują znacznego opóźnienia wzrostu, podczas gdy RNazo-ujemny odpowiednik V-pK88G raz jeszcze był w pewnym stopniu powstrzymywany w propagacji, ale w mniejszym zakresie nież poprzednio opisane mutanty. Dalszymi przykładami mutantów z delecją w N pro mogą być: MESDEGSK... MELFSSDEGSK... MELFSNESDEGSK... MELFSNELSDEGSK... MELFSNELLSDEGSK... MELFSNELLYSDEGSK... MELFSNELLYKSDEGSK... MELFSNELLYKTSDEGSK... MELFSNELLYKT reprezentuje aminokońcową sekwencję N pro izolatu BVDV NewYork93/C. Moliwe jest również zastosowanie odmian tej sekwencji z jedną lub kilkoma mutacjami. Można oczekiwać, że w szczególności naturalnie występujące odmiany, jakie znaleziono w innych pestiwirusach mogą być funkcjonalne. Dlatego całkowitą listę zbadanych lub proponowanych odmian w różnych częściach aminokońcowego końca N pro można rozszerzyć odpowiednim zestawem wymian aminokwasowych. Poniej dla kilku pestiwirusów podano typowe przykłady reprezentatywnych sekwencji, ale możliwe odmiany nie ograniczają się do tych przykładów. BVDV NewYork93/C: MELFSNELLYKT BVDV CP13: MELISNELLYKT

62 BVDV SD1: MELITNELLYKT Brescia CSFV: MELNHFELLYKT BVD X818: MELNKFELLYKT Zatem, odmiany te na przykład mogą obejmować: MELI-[PS] 0 -[C-końc]; MELIS-[PS] 0 -[C-końc]; MELISN-[PS] 0 -[C-końc]; MELISNE-[PS] 0 -[C-końc]; MELISNEL-[PS] 0 -[C-końc]; MELISNELL-[PS] 0 -[C-końc]; MELISNELLY-[PS] 0 -[C-końc]; MELISNELLYK-[PS] 0 -[C-końc]; MELISNELLYKT-[PS] 0 -[C-końc]; MELIT-[PS] 0 -[C-końc]; MELITN-[PS] 0 -[C-końc]; MELITNE-[PS] 0 -[C-końc]; MELITNEL-[PS] 0 -[C-końc]; MELITNELL-[PS] 0 -[C-końc]; MELITNELLY-[PS] 0 -[C-końc]; MELITNELLYK-[PS] 0 -[C-końc]; MELITNELLYKT-[PS] 0 -[C-końc]; Wzory te mogą również posiadać [PS] 1, tj. PS może być również jednym z PS jak opisano tutaj. Sekwencje należące do białka N pro oznaczone są kursywą. Wymiany aminokwasowe odnoszace się do sekwencji BVDV NewYork93/C są pogrubione. Dalsze przykłady można znaleść np. stosując numery akcesji GenBank podane w Becher i inni, 2003, Virology 311, , lub przeszukując dane standardowych sekwencji. Dalszą możliwością może być zastosowanie sygnału procesowego (PS) insertowanego pomiędzy (pozostałą) sekwencję N pro i aminokoniec białka kapsydu. PS prowadzi do rozerwania wiązania, co generuje funkcjonalne białko kapsydu. Konfiguracja takiej konstrukcji może być następująca: [N pro ] 22 -PS[C-końc] PS: Sygnał procesowy może być albo celem dla proteazy (tj. ubikwityny, LC3 jak określono tutaj lub proteazy lub niestabilnego peptydu prowadzącego do przetwarzania na swoim własnym karboksykońcu jak np. inteina (Chong i inni, 1998 i w tym referencje) lub

63 C pikornawirusa, 2A caridovirusa lub aphtovirusy, pl5 wirusowej krwotocznej choroby królików lub odpowiednie proteay innych kalciwirusów (Proter 1993 i w tym referencje; Meyers i inni 2000, w tym referencje). Gdy stosuje się PS, możliwych jest wiele rónych odmian, ponieważ PS zapewnia generację prawidłowych amino końców białka C kapsydu. Dlatego też, gdy stosuje się konstrukcję z PS oczekiwane są wszystkie rodzaje delecji lub mutacji w sekwencji N pro prowadzace do żywych mutantów tak długo, jak ramka odczytu nie uległa przesunięciu lub translacja nie została zatrzymana przez kodon stop ramki. Jako przykład ustalono żywy mutant CSFV z delecją w N pro według wzoru: [N pro ] 29 -PS[C-końc] Szczególnie interesujące mogą być mutacje w N pro blokujące aktywność proteolityczną białek. Rümenapf i inni (1998) opublikowali identyfikację reszt miejsca aktywnego proteazy dla CSFV Alfort Tübingen. Odpowiednie aminokwasy (kwas glutaminowy w poycji 22, histydyna w pozycji 49 i cysteina w pozycji 69) są konserwatywne dla innych pestiwirusów. Dlatego też wymiany cysteiny z pozycji 69 na jakikolwiek aminokwas za wyjatkiem seryny lub treoniny może prowadzić do zniszczenia aktywności proteazowej. Podobnie wymiana kwasu glutaminowego w pozycji 22 najprawdopodobnie spowoduje inaktywację proteay, chyba, że nowym aminokwasem będzie kwas asparginowy. Podobnie większość, jeżeli nie wszystkie wymiany w pozycji 49 będą prowadzić do nieaktywnej proteazy. Odnośniki literaturowe Ausubel, FM i inni., Current Protocols in molecular biology. Nowy Jork : Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (aktualizowany) Baker, JC Bovine viral diarrhea virus: a review. J. Am. Vet. Med.Assoc. 190: Becher, P., König, M., Paton, DJ, Thiel, HJ., 1995, Further characterization of border disease virus isolates: evidence for the presence of more than three species within the genus pesivirus. Virology 209 (1), Chong, S., Williams, KS, Wotkowicz, C, i Xu, MQ, Modulation of Protein Splicing of the Saccharomyces cerevisiae Vacuolar Membrane ATPase Intein. J. Biol. Chem. 273: Donis, RO, Corapi, W., i Dubovi, EJ Neutralizing monoclonal antibodies to bovine viral diarrhea virus bind to the 56K to 58K glycoprotein. J. Gen. Virol. 69: Fuerst T.R. i inni Eukaryotic transient expression system based on recombinant vaccinia virus that synthesizes bacteriophage T7 RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. 83:

64 Heinz, FX, Collett, MS, Purcell., RH, Cold, EA, Howard, CR, Houghton, M., Moormann, RJM, Rice, CM., i Thiel, H.-J Familiy Flaviviridae. Str w: Virus Taxonomy (pod redakcją van Regenmortel., HHV, Fauquet, CM., i Bishop, DHL). Academic Press, San Diego. Hulst, MM, Himes, G., Newbigin, E., Moormann, RJ.M Glycoprotein E2 of classical swine fever virus: expression in insect cells and identification as a ribonuclease. Virology 200: Hulst, MM, FE Panoto, A. Hooekmann, HGP van Gennip., i Moormann, RJ.M Inactivation of the RNase activity of glycoprotein Ems of classical swine fever virus results in a cytopathogenic virus. J. Virol. 72: Kit, M. i S. Kit Sensitive glycoprotein giii blocking ELISA to distinguish between pseudorabies (Aujeszky's disease) -infected and vaccinated pigs. Veterinary Microbiology 28: Kunkel, TA, JD Roberts, i RA Zakour Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Methods Enzymol. 154: König, Matthias, 1994, Virus der klassischen Schweinepest: Untersuchungen zur Pathogenese und zur Induktion einer protektiven Immunantwort. Dissertation, Tierarztliche Hochschule Hannover, Germany. Lindenbach, BD, i Rice, CM The pestiviruses. In Fields Virology, pod redakcją Knipe, DM, & Howley, PM (Lippincott-Raven, Philadelphia), str Mayer, D., Hofmann, MA, i Tratschin, JD Attenuation of classical swine fever virus by deletion of the viral N(ρro) gene. Vaccine. 22: Meyers, G., Riimenapf, T. i Thiel, H.-J Molecular cloning and nucleotide sequence of the genome of hog cholera virus.virology 171: Meyers, G., Saalmuller, A., i Büttner, M. (1999). Mutations abrogating the RNase activity in glycoprotein e(rns) of the pestivirus classical swine fever virus lead to virus attenuation. J Virol 73: Meyers, G., Tautz, N., Becher, P., Thiel, H.-J., & Kϋmmerer, BM 1996b. Recovery of cytopathogenic and noncytopathogenic bovine viral diarrhea viruses from cdna constructs. J. Virol., 70: Meyers, G., Thiel, H.-J., i Riimenapf, T. 1996a. Classical swine fever virus: Recovery of infectious viruses from cdna constructs and generation of recombinant cytopathogenic swine fever virus. J. Virol. 67:

65 Meyers, G., Wirblich, C, Thiel. H. -J. and Thumfart, JO Rabbit hemorrhagic disease Virus: genome organization and polyprotein processing of a calicivirus studied after transient expression of cdna constructs. Virology 276: Moennig, V. i Plagemann, J The pestiviruses. Adv. Virus Res. 41: Paton, DJ, Lowings, JP, Barrett, AD Epitope mapping of the gp53 envelope protein of bovine viral diarrhea virus. Virology 190: Pellerin, C. et. al. Identification of a new group of bovine viral diarrhea virus strains associated with severe outbreaks and high mortalities, Virology 203, 1994: Porter, AG (1993). Picornavirus nonstructural proteins: emerging roles in virus replication and inhibition of host cell functions. J. Virol. 67, Rüggli, N., Tratschin, JD, Schweizer, M., McCullough, KC, Hofmann, MA, Summerfield, A Classical swine fever virus interferes with cellular antiviral defense: evidence for a novel function of N(ρro). J. Virol. 77: Rümenapf, T., Stark, R., Heimann, M., i Thiel, H.-J N-terminal protease of pestiviruses: identification of putative catalytic residues by site directed mutagenesis. J. Virol. 72: Rümenapf, T., Unger, G., Strauss, JH, i Thiel, H.-J Processing of the evelope glycoproteins of pestiviruses. J. Virol. 67: Schneider, R., G. Unger, R. Stark, E. Schneider-Scherzer, i H.-J. Thiel Identification of a structural glycoprotein of an RNA virus as a ribonuclease. Science 261: Sambrook, J., Fritsch, EF & Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nowy Jork, 1989 Stark, R., Meyers, G., Rümenapf, T., i Thiel, H. -J. (1993): Processing of pestivirus polyprotein: Cleavage site between autoprotease and nucleocapsid protein of classical swine fever virus. J. Virol., 67, Thiel, HJ., Plagemann, GW, & Moennig, V The pestiviruses. In Fields Virology, pod redakcją Fields, BN, Knipe, DM, & Howley, PM (Lippincott-Raven, Philadelphia), str Thiel, H.-J., Stark, R., Weiland, E., Rümenapf, T. & Meyers, G Hog cholera virus: molecular composition of virions from a pestivirus. J. Virol. 65: Tratschin, J.-D., Moser, C, Ruggli, N., i Hofmann, MA Classical swine fever virus leader proteinase Npro is not required for viral replication in cell culture. J. Virol. 72,

66 van Rijn, PA, van Gennip, HG, de Meijer, EJ., Moormann, RJ Epitope mapping of envelope glycoprotein El of hog cholera virus strain Brescia. J. Gen. Virol. 74: Weiland, E., Thiel, H.-J., Hess, G., i Weiland, F. (1989). Development of monoclonal neutralizing antibodies agaist bovine viral diarrhea virus after pretreatment of mice with normal bovine cells and cyclophosphamide. J. Virol. Methods 24: Weiland, E., Stark, R., Haas, B., Rümenapf, T., Meyers, G. i Thiel, H. -J. (1990). Pestivirus glycoprotein which induces neutralizing antibodies forms part of a disulfidelinked heterodimer. J. Virology 64, Weiland, E., AhI, R., Stark, R., Weiland, F. i Thiel, H. -J. (1992). A second envelope glycoprotein mediates neutralization of a pestivirus, hog cholera virus. J. Virology 66, Windisch, JM, Schneider, R., Stark, R., Weiland, E., Meyers, G., i Thiel, H. -J RNase of classical swine fever virus: biochemical characterization and inhibition by virusneutralizing monoclonal antibodies. J. Virol. 70: Wiskerchen, M., Belzer, SK, i Collett, MS Pestivirus gene expression: the first protein product of the bovine viral diarrhea virus large open reading frame, p20, possesses proteolytic activity J. Virol. 65:

67 66 PROTOKÓŁ SEKWENCJI Lista sekwencji <110> Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH <120> Atenuowany wirus wirusowej biegunki bydlęcej (BVDV) <130> sprawa 1/1716 <160> 12 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> <212> DNA <213> BVDV typu dzikiego: XIKE-A

68 67

69 68

70 5 69

71 70 <Sekwencja sztuczna: zmutowany BVDV: XIKE- A-NdN <400> 2

72 71

73 72

74 73 <210> 3 <211> <212> DNA 5 <213> Sekwencja sztuczna: zmutowany BVDV: XIKE-B <400> 3

75 74

76 75

77 76

78 77 <210> 4 <211> <212> DNA 5 <213> Sekwencja sztuczna: zmutowany BVDV: XIKE-B-NdN <400> 4

79 78

80 79

81 80 <210> 5 <211> 3913 <212> PRT 5 <213> BVDV typu dzikiego: XIKE-A <400> 5

82 81

83 82

84 83

85 84

86 85

87 86

88 87

89 88

90 89

91 90

92 91

93 92

94 93

95 94 Sekwencja sztuczna: zmutowany BVDV: XIKE-A-NdN

96 95

97 96

98 97

99 98

100 99

101 100

102 101

103 102

104 103

105 104

106 105

107 106

108 107 <210> 7 <211> 3912 <212> PRT 5 <213> Sekwencja sztuczna: zmutowany BVDV: XIKE-B <400> 7

109 108

110 109

111 110

112 111

113 112

114 113

115 114

116 115

117 116

118 117

119 118

120 119

121 120

122 121 Sekwencja sztuczna: zmutowany BVDV: XIKE-B-NdN

123 122

124 123

125 124

126 125

127 126

128 127

129 128

130 129

131 130

132 131

133 132

134 133

135 134 Sekwencja sztuczna: XIKE-C sekwencja BVDV

136 135

137 136

138 137

139 138

140 139

141 140

142 141

143 142

144 143

145 144

146 145

147 146

148 147

149 148 Sekwencja sztuczna: XIKE-C sekwencja BVDV

150 149

151 150

152 151 Sekwencja sztuczna: XIKE-C-NdN sekwencja BVDV

153 152

154 153

155 154

156 Sekwencja sztuczna: XIKE-C-NdN 155

157 156

158 157

159 158

160 159

161 160

162 161

163 162

164 163

165 164

166 165

167 166

168 167

169 168 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH; Niemcy Pełnomocnik:

170 169 EP B1 Z-5621 Zastrzeżenia patentowe 1. Atenuowany pestiwirus, posiadający co najmniej jedną mutację w sekwencji kodującej glikoproteinę E ms i przynajmniej jedną kolejną mutację w sekwencji kodującej N pro, w którym wspomniana mutacja w sekwencji kodującej glikoproteinę E ms prowadzi do inaktywacji aktywności RNazy znajdującej się w E ms, zaś wspomniana mutacja w sekwencji kodującej N pro prowadzi do inaktywacji wspomnianego N pro. 2. Wirus według zastrzeżenia 1, w którym wspomniane mutacje wybrane są z grupy mutacji polegających na delecji, insercji lub substytucji. 3. Wirus według jednego z zastrzeżeń 1 do 2, w którym wspomniana(e) mutacja(e) są delecjami. 4. Wirus według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 3, w którym wspomniany pestiwirus jest wirusem biegunki wirusowej bydła (BVDV). 5. Wirus według zastrzeżenia 4, w którym wspomniana(e) mutacja(e) w sekwencji kodującej glikoproteinę E ms znajdują się w nukleotydowej sekwencji kodującej odpowiadającej aminokwasom w pozycji 298 do 310 i/lub pozycji 341 do Wirus według zastrzeżenia 4 albo 5, znamienny tym, że wspomniana(e) mutacja w sekwencji kodującej glikoproteinę E ms jest delecją lub substytucją histydyny w pozycji Wirus według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 6, w którym wspomniana(e) mutacja(e) w sekwencji kodującej glikoproteinę E ms znajdują się w sekwencji nukleotydowej kodującej konserwatywną sekwencję E ms SLHGIWPEKICTG i/lub LQRHEWNKHGWCNWFHIEPW. 8. Wirus według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 7, w którym wspomniana(e) mutacja(e) w sekwencji kodującej glikoproteinę E ms znajdują się w sekwencji nukleotydowej kodującej konserwatywną sekwencję E ms SLHGIWPEKIC i/lub RHEWNKHGWCNW. 9. Wirus według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 8, w którym wspomniana(e) mutacja(e) w sekwencji kodującej glikoproteinę E ms są dwiema mutacjami znajdującymi się w sekwencji nukleotydowej kodującej konserwatywną sekwencję E ms SLHGIWPEKIC i/lub RHEWNKHGWCNW.

171 Wirus według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 9, w którym wspomniana mutacja w sekwencji kodującej glikoproteinę E ms jest pojedynczą mutacją znajdującą się w konserwatywnej sekwencji E ms SLHGIWPEKIC lub RHEWNKHGWCNW. 11. Wirus według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 10, w którym wspomniana(e) mutacja(e) w sekwencji kodującej N pro prowadzą do zakodowanej poliproteiny scharakteryzowanej następującym wzorem: [N pro ] x -[PS] y -[C-końc] w którym [N pro ] dotyczy części N pro wspomnianej poliproteiny, w której x reprezentuje liczbę aminokwasów N pro obecnych w poliproteinie; i w którym [PS] dotyczy sygnału procesowego wybranego z gupy składającej się z: ubikwityny, LC3, SUMO-1 NEDD8, GATE-16 lub GABA(A)RAP, inteiny, 3C pikornawirusa, 2A caridovirusa lub pl5 wirusa krwotocznej choroby królików; i w którym Y może być równe 0, co oznacza, że nie ma sygnału procesowego lub Y może być równe 1, co oznacza, że sygnał procesowy jest obecny; i w którym [C-końc] dotyczy kompletnej poliproteiny wirusa, za wyjątkiem N pro, ale obejmującej (C)- białkowy kapsyd i każdo inne białko obecne w poliproteinie pestiwirusa obejmującej karboksykońcowe NS5B; i w którym jeżeli y jest równe 0, wówczas x jest równe od 0 do 12 (oznacza brak specyficznego aminokwasu N pro lub obecność od 1 do 12 aminokwasów N pro ; i w którym jeżeli y jest równe 1, wówczas x jest równe od 0 do 168; (oznacza brak specyficznego aminokwasu N pro lub obecność od 1 do wszystkich 168 aminokwasów N pro ). 12. Wirus według zastrzeżenia 11, w którym wspomniana(e) mutacja(e) w sekwencji kodującej N pro prowadzą do zakodowanej poliproteiny scharakteryzowanej następującym wzorem: [N pro ] 1 -[PS] 0 -[C-końc] 13. Wirus według zastrzeżenia 11, w którym wspomniana(e) mutacja(e) w sekwencji kodującej N pro prowadzą do zakodowanej poliproteiny scharakteryzowanej następującym wzorem: [N pro ] 3 -[PS] 0 -[C-końc] i w którym definicje są takie, jak określono w zastrzeżeniu Wirus według zastrzeżenia 11, w którym wspomniana(e) mutacja(e) w sekwencji kodującej N pro prowadzą do zakodowanej poliproteiny scharakteryzowanej wzorem: [N pro ] 4 -[PS] 0 -[C-końc]

172 Wirus według zastrzeżenia 11, w którym wspomniana(e) mutacja(e) w sekwencji kodującej N pro prowadzą do zakodowanej poliproteiny scharakteryzowanej wzorem: [N pro ] 6 -[PS] 0 -[C-końc] 16. Wirus według zastrzeżenia 11, w którym wspomniana(e) mutacja(e) w sekwencji kodującej N pro prowadzą do zakodowanej poliproteiny scharakteryzowanej wzorem: [N pro ] 4 -[PS] 0 -[C-końc*] w którym [C-końc*] jest równe [C-końc], przy czym w białku-c aminokwas w pozycji 2 zmieniono z D na N. 17. Wirus według zastrzeżenia 11, w którym wspomniana(e) mutacja(e) w sekwencji kodującej N pro prowadzą do zakodowanej poliproteiny scharakteryzowanej wzorem: [N pro ] x -[PS] 1 -[C-końc] i w którym PS jest wybrane z grupy obejmującej ubikwitynę lub LC Wirus według zastrzeżenia 11, przy czym wirus jest BVDV, zaś mutacja(e) w sekwencji kodującej N pro prowadzą do zakodowanej poliproteiny scharakteryzowanej następującym wzorem wybranym z grupy złożonej z: M-[PS] 0 -[C-końc]; MEL-[PS] 0 -[C-końc]; MELF-[PS] 0 -[C-końc]; MELFS-[PS] 0 -[C-końc]; MELFSN-[PS] 0 -[C-końc]; MELFSNE-[PS] 0 -[C-końc]; MELFSNEL-[PS] 0 -[C-końc]; MELFSNELL-[PS] 0 -[C-końc]; MELFSNELLY-[PS] 0 -[C-końc]; MELFSNELLYK-[PS] 0 -[C-końc]; MELFSNELLYKT-[PS] 0 -[C-końc]; 19. Wirus według zastrzeżenia 11, przy czym wspomniany wirus jest BVDV, zaś mutacja(e) w sekwencji kodującej N pro prowadzą do zakodowanej poliproteiny scharakteryzowanej następującym wzorem wybranym z grupy złożonej z: MELI-[PS] 0 -[C-końc]; MELIS-[PS] 0 -[C-końc]; MELISN-[PS] 0 -[C-końc]; MELISNE-[PS] 0 -[C-końc]; MELISNEL-[PS] 0 -[C-końc]; MELISNELL-[PS] 0 -[C-końc];

173 172 MELISNELLY-[PS] 0 -[C-końc]; MELISNELLYK-[PS] 0 -[C-końc]; MELISNELLYKT-[PS] 0 -[C-końc]; 20. Wirus według zastrzeżenia 11, przy czym wspomniany wirus jest BVDV, zaś mutacja(e) w sekwencji kodującej N pro prowadzą do zakodowanej poliproteiny scharakteryzowanej następującym wzorem wybranym z grupy złożonej z: MELIT-[PS] 0 -[C-końc]; MELITN-[PS] 0 -[C-końc]; MELITNE-[PS] 0 -[C-końc]; MELITNEL-[PS] 0 -[C-końc]; MELITNELL-[PS] 0 -[C-końc]; MELITNELLY-[PS] 0 -[C-końc]; MELITNELLYK-[PS] 0 -[C-końc]; MELITNELLYKT-[PS] 0 -[C-końc]; 21. Wirus według zastrzeżenia 11, przy czym wspomniany wirus jest BVDV, zaś mutacja(e) w sekwencji kodującej N pro prowadzą do zakodowanej poliproteiny scharakteryzowanej wzorem: [N pro ] x -[PS] 0 -MELF-[PS] 0 -[C-końc*] w którym [C-końc*] jest równe [C-końc], przy czym w białku-c aminokwas w pozycji 2 zmieniono z D na N. 22. Wirus według zastrzeżenia 11, w którym wspomniana(e) mutacja(e) w sekwencji kodującej N pro prowadzą do zakodowanej poliproteiny scharakteryzowanej wzorem: [N pro ] 22 -[PS] 1 -[C-końc] w którym PS jest ubikwityną lub LC Wirus według któregokolwiek z zastrzeżeń 18 do 21, w którym [PS] 0 jest zastąpione przez [PS] 1, zaś wspomniane PS jest wybrane z gupy składającej się z: ubikwityny, LC3, SUMO-1, NEDD8, GATE-16, GABA(A)RAP, inteiny, 3C pikornawirusa, 2A caridovirusa lub pl5 wirusa krwotocznej choroby królików. 24. BVDV według któregokolwiek z zastrzeżeń 4 do 23, wybrany z grupy BVDV typu 1 lub BVDV typu BVDV według któregokolwiek z zastrzeżeń 4 do 24, posiadająca sekwencję nr Kompozycja zawierająca wirus według któregokolwiek z zastrzeżeń od 1 do 25 oraz roztwór. 27. Kompozycja według zastrzeżenia 26, która wywołuje reakcji immunologicznej u zwierzęcia.

174 Kompozycja według zastrzeżenia 26 albo 27, w postaci szczepionki. 29. Kompozycja według któregokolwiek z zastrzeżeń od 26 do 28, zawierająca ponadto farmaceutycznie akceptowalny nośnik lub substancję pomocniczą. 30. Zastosowanie wirusa według któregokolwiek z zastrzeżeń od 1 do 25 do wytwarzania szczepionki do zapobiegania i leczenia zakażeń pestiwirusowych. 31. Zastosowanie BVDV według któregokolwiek z zastrzeżeń od 4 do 25 do wytwarzania szczepionki do zapobiegania i leczenia zakażeń BVDV. 32. Cząsteczka kwasu nukleinowego zawierająca kwas nukleinowy kodujący żywy atenuowany BVDV według któregokolwiek z zastrzeżeń od 4 do Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrzeżenia 32, mająca postać cząsteczki DNA. 34. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrzeżenia 33, mająca postać cząsteczki RNA. 35. Sposób atenuowania pestiwirusa, znamienny tym, że w pestiwirusie tworzy się co najmniej jedną mutację w sekwencji kodującej glikoproteinę E ms i co najmniej jedną kolejną mutację w sekwencji kodującej N pro. 36. Sposób według zastrzeżenia 35, zawierający następujące etapy: a) odwrotną transkrypcję sekwencji nukleotydowej pestiwirusa typu dzikiego na cdna; b) klonowanie wspomnianego cdna; c) wprowadzenie do wspomnianego cdna mutacji wybranych spośród delecji, insercji i/lub substytucji, przy czym wspomniane mutacje znajdują się w sekwencji kodującej kodującej glikoproteinę E ms i proteazę N pro ; d) włączanie cdna do plazmidu lub do DNA wirusa zdolnego do kierowania transkrypcji pestiwirusowego cdna na RNA in vitro lub po zainfekowaniu odpowiednich komórek. 37. Sposób według zastrzeżenia 35 albo 36, w którym wspomnianym pestiwirusem jest BVDV. 38. Zastosowanie BVDV według któregokolwiek z zastrzeżeń od 3 do 25 lub kompozycji według zastrzeżeń od 26 do 29 do wytwarzania szczepionki do zmniejszenia objawów infekcji BVDV takich, jak wiremia i leukocytopenia i/lub gorączka i/lub biegunka. Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH; Niemcy Pełnomocnik:

175 174 EP B1 Z-5621 Fig. 1 Zobojętnianie surowicy przeciwko NY93/C Tygodnie po zakażeniu Stężenie (log 10)

176 175 EP B1 Z-5621 Fig. 2 Test zobojętnianiania surowicy przeciwko KE (BVDV-1) Dzień próby Stężenie (log 2)

177 176 EP B1 Z-5621 Fig. 3 Test zobojętnianiania surowicy przeciwko NY93/C (BVDV-2) Dzień próby Stężenie (log 2)