(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US99/19329 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US99/19329 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO00/11033 PCT Gazette nr 09/00 (51) Int.Cl. C07K 19/00 ( ) C07K 14/78 ( ) C07K 14/515 ( ) C12N 15/62 ( ) (54) Homodimeryczne białko fuzyjne będące inhibitorem angiogenezy, sposób jego otrzymywania oraz cząsteczka DNA i wektor ekspresyjny zawierający to DNA (30) Pierwszeństwo: ,US,60/097,883 (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 05/02 (73) Uprawniony z patentu: MERCK PATENT GMBH,Darmstadt,DE (72) Twórca(y) wynalazku: Kin-Ming Lo,Lexington,US Yue Li,Bedford,US Stephen D. Gillies,Carlisle,US (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 05/09 (74) Pełnomocnik: Kamiński Zbigniew, KANCELARIA PATENTOWA (57) Wynalazek dotyczy homodimerycznego białka fuzyjnego, będącego inhibitorem angiogenezy, zawierającym obszar Fc immunoglobuliny oraz białko docelowe. Przedmiotem wynalazku jest również cząsteczka DNA kodująca sekwencję sygnałową i białko fuzyjne według wynalazku; wektor ekspresyjny do transfekowania komórki ssaczej obejmujący DNA według wynalazku oraz sposób otrzymywania homodimerycznego białka fuzyjnego. Homodimeryczne białko fuzyjne może być zastosowane do wytwarzania leku do leczenia guzów litych, nowotworów przenoszonych przez krew i przerzutów nowotworowych. PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest homodimeryczne białko fuzyjne będące inhibitorem angiogenezy, zawierające obszar Fc immunoglobuliny oraz białko docelowe; DNA kodujący homodimeryczne białko fuzyjne według wynalazku, wektor ekspresyjny do transfekowania komórki ssaczej obejmujący DNA kodujące homodimeryczne białko fuzyjne oraz sposób otrzymywania homodimerycznego białka fuzyjnego. Dwa silne inhibitory angiogenezy: angiostatyna [O'Reilly i in., (1994) Cell 79: 315] oraz endostatyna [O'Reilly i in., (1997) Cell 88: 277] zostały odkryte i w wyniku badań stwierdzono, że powstają one naturalnie w czasie rozwoju guzów pierwotnych. Obydwa białka są specyficznymi inhibitorami namnażania komórek śródbłonkowych i hamują wzrost guza przez blokowanie angiogenezy, czyli powstawania nowych naczyń krwionośnych, co sprzyja odżywianiu guza. Badania wykazały, że takie inhibitory nie są toksyczne, nawet w bardzo wysokich dawkach. Mogą one powstrzymać rozwój przerzutów i spowodować regresję pierwotnego guza do postaci nieczynnej. Oba inhibitory zidentyfikowano jako proteolityczne fragmenty znacznie większych, nie poddanych obróbce cząsteczek. Angiostatynę zidentyfikowano jako proteolityczny fragment plazminogenu [O'Reilly i in., (1994) Cell 79: oraz patenty Stanów Zjednoczonych AP nr nr 5,733,876; 5,837,682 i 5,885,795]. Dokładniej mówiąc, angiostatyna jest wewnętrznym fragmentem plazminogenu o wielkości 38 kda, zawierającym przynajmniej trzy obszary kringle plazminogenu. Endostatynę zidentyfikowano jako proteolityczny fragment kolagenu XVIII [O'Reilly i in., (1997) Cell 88: ], a dokładniej fragment o wielkości 20 kda z końca C kolagenu XVIII. Wymienione białka wywołały duże zainteresowanie onkologów, ponieważ okazało się, że u myszy związki te powstrzymują rozwój wielu różnych rodzajów nowotworów, nie powodując efektów ubocznych i lekooporności. W tradycyjnej chemioterapii zwykle następuje nabyta lekooporność, spowodowana przede wszystkim przez genetyczną niestabilność komórek rakowych. Kuracje z wykorzystaniem inhibitorów angiogenezy nie są ukierunkowane na komórki rakowe, ale raczej na normalne komórki śródbłonkowe, wspierające rozwój guza. W związku z genetyczną stabilnością komórek śródbłonkowych, kuracja tego rodzaju może prowadzić do niższej lekooporności. U myszy poddanych przedłużonej kuracji z użyciem endostatyny, nie stwierdzano wystąpienia lekooporności. Ponadto, powtarzane cykle leczenia myszy endostatyną prowadziły do wydłużenia okresu nieczynności guza i braku nawrotów po przerwaniu kuracji [Boehm i in., (1997) Nature 390: 404]. Pomimo obiecujących wyników u myszy, nie udało się wyprodukować handlowych ilości klinicznie czystej, rozpuszczalnej, aktywnej angiostatyny lub endostatyny w układach ekspresyjnych obejmujących komórki E.coli, bakulowirusów, drożdży lub organizmów ssaków. Ekspresja w E.coli doprowadziła do wytworzenia nierozpuszczalnych agregatów białek o niezdefiniowanym składzie, których nie można było wstrzykiwać ludziom. W innych układach ekspresyjnych uzyskano bardzo niewielkie ilości rekombinowanych białek [O'Reilly i in. (1997) Cell 88:277]. Niskie wydajności ekspresji w tych układach można wytłumaczyć tym, że angiostatyna i endostatyna stanowią wewnętrzne fragmenty znacznie większych białek. Skrócone białka mogą nie fałdować się odpowiednio pod nieobecność reszt, które odcięto od cząsteczek prekursorowych. Na przykład, angiostatyna ma 26 reszt cysteinowych, które tworzą liczne wiązania disiarczkowe. Ekspresja angiostatyny może nie zapewniać optymalnego środowiska dla prawidłowego tworzenia wielu wiązań disiarczkowych na drodze wydzielniczej. Również białko rekombinowanej endostatyny, wytworzone w E.coli, wytrąca się w czasie dializy, prawdopodobnie z powodu hydrofobowości endostatyny [O'Reilly i in., (1997) Cell 88: 277]. Główną przeszkodę w zastosowaniu znanych dotychczas postaci angiostatyny i endostatyny stanowi konieczność iniekcji stosunkowo dużej ilości białka w ciągu tygodni lub miesięcy dla uzyskania pożądanego działania klinicznego. Przykładowo, optymalną skuteczność leczenia u myszy uzyskiwano, podając dawki 20 mg endostatyny/kg/dzień [Boehm i in., (1997) Nature 390:404]. Wobec pilnej potrzeby klinicznego sprawdzenia endostatyny i angiostatyny, bardzo ważne jest opracowanie sposobu wytwarzania dużych ilości materiałów o odpowiedniej czystości. Jednym z układów ekspresyjnych o dużej wydajności uzyskiwania białek fuzyjnych w komórkach ssaków jest konstrukt DNA kodujący sekwencję sygnałową obszar Fc immunoglobuliny i docelowe białko. Produkt konstruktu fuzyjnego określa się ogólnie jako białko fuzyjne z immunoglobuliną immunofuzynę. Kilka białek uzyskano w ten sposób, między innymi: IL2, CD26, Tat, Rev, OSF-2, βig-h3, Receptor IgE, PSMA i gp120. Konstrukty te przedstawiono w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych nr nr 5,541,087 i 5,726,044.

3 PL B1 3 Głównym celem uzyskania ekspresji rekombinowanych białek fuzyjnych w komórkach ssaków było nadanie nowych lub użytecznych właściwości cząsteczkom hybrydowym, na przykład, odpowiedniego fałdowania, zwiększonej rozpuszczalności, ukierunkowania cytokiny lub toksyny in vivo, wiązania receptora Fc, wiązania dopełniacza, wiązania białka A, wydłużenia półokresu trwania w układzie krążenia oraz zwiększonej zdolności do przekraczania bariery krew-mózg. Przykładami rekombinowanych białek fuzyjnych wytwarzanych w komórkach ssaków są immunogenne białka złożone cytokin [Gillies i in., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1428; Gillies i in., (1993) Bioconjugate Chemistry 4: 230], immunoadhezyny [Capon i in., (1989) Nature 337: 525], immunotoksyny [Chaudhary i in., (1989) Nature 339: 394] i białko złożone czynnika wzrostu nerwu [Friden i in., (1993) Science 259: 373]. Celem wynalazku było dostarczenie nowych cząsteczek DNA, które ułatwią wytwarzanie z dużą wydajnością i wydzielanie inhibitorów angiogenezy w różnych komórkach ssaków. Innym celem wynalazku było opracowanie sposobów leczenia ssaków nukleinowymi kwasami kodującymi białkowe inhibitory angiogenezy, bądź sekwencjami aminokwasowymi białkowych inhibitorów angiogenezy, w tym również białka nie występujące naturalnie, uzyskane w wyniku syntezy biologicznej lub w inny sposób sztuczne białka takie, jak wytworzone w wyniku projektowania. Przedmiotem wynalazku jest homodimeryczne białko fuzyjne będące inhibitorem angiogenezy, zawierające obszar Fc immunoglobuliny oraz białko docelowe, w którym region Fc obejmuje region zawiasowy, domenę 2 ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, CH 2, i domenę 3 ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, CH 3, a białko docelowe jest sprzężone z końcem C obszaru Fc i jest wybrane z grupy obejmującej: endostatynę, angiostatynę i endostatynę-polilinker-angiostatynę, gdzie angiostatyna jest angiostatyną o pełnej długości lub obszar kringle 1, 2 lub 3, lub stanowi ich kombinacje. Korzystnie białko docelowe jest endostatyną korzystniej białko docelowe zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako sekwencja nr 4. W innym korzystnym rozwiązaniu immunoglobuliną jest lgg1. Przedmiotem wynalazku jest również cząsteczka DNA kodująca sekwencję sygnałową i białko fuzjne według wynalazku. Innym przedmiotem wynalazku jest wektor ekspresyjny do transfekowania komórki ssaczej obejmujący DNA kodujący sekwencję sygnałową i białko fuzjne według wynalazku. Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób otrzymywania homodimerycznego białka fuzyjnego według wynalazku, obejmujący etapy, w których transfekuje się komórkę ssaczą wektorem niosącym gen kodujący białko fuzyjne według wynalazku, następnie prowadzi się hodowlę tak uzyskanych komórek ssaczych aby wytworzyć białko fuzyjne, po czym uzyskuje się z komórek białko fuzyjne. Białka fuzyjne według wynalazku zapewniają ekspresję biologiczną z dużą wydajnością czynnych białkowych inhibitorów angiogenezy. Inhibitory te mogą być następnie oddzielane i łączone z farmaceutycznie akceptowalnymi nośnikami, po czym podawane ssakom, na przykład ludziom. Alternatywnie, nukleinowe kwasy kodujące te białka fuzyjne, bądź sekwencje aminokwasowe zawierające białkowe inhibitory angiogenezy, można łączyć z farmaceutycznie akceptowalnymi nośnikami i podawać ssakom. Cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku koduje sekwencję sygnałową obszar Fc immunoglobuliny oraz przynajmniej jedno docelowe białko, określane tu również mianem białkowy inhibitor angiogenezy, wybrany z grupy obejmującej angiostatynę, endostatynę, fragment plazminogenu wykazujący aktywność angiostatyny, fragment kolagenu XVIII wykazujący aktywność endostatyny oraz ich kombinacje. W korzystnym rozwiązaniu wynalazku cząsteczka kwasu nukleinowego koduje kolejno w kierunku 5' do 3', sekwencję sygnałową obszar Fc immunoglobuliny oraz sekwencję docelowego białka. W innym korzystnym rozwiązaniu, cząsteczka kwasu nukleinowego koduje kolejno w kierunku 5' do 3', sekwencję sygnałową, sekwencję docelową oraz obszar Fc immunoglobuliny. W korzystnym rozwiązaniu obszar Fc immunoglobuliny zawiera obszar zawiasowy i przynajmniej jeden stały obszar ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, na przykład CH 2, CH 3 oraz, w zależności od typu immunoglobuliny użytej do wytworzenia obszaru Fc, opcjonalnie domenę 4 ciężkiego łańcucha immunoglobuliny (CH 4 ). W korzystniejszym rozwiązaniu obszar Fc immunoglobuliny zawiera obszar zawiasowy, domenę CH 2 i domenę CH 3. W pewnych okolicznościach, w obszarze tym korzystnie nie występuje przynajmniej domena CH 1. Obszary Fc immunoglobulin mogą pochodzić z każdej klasy immunoglobulin, na przykład IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, ale korzystnym źródłem jest IgG. W kolejnym rozwiązaniu kwas nukleinowy według wynalazku może zostać włączony w zdolny do replikacji wektor ekspresyjny, którym następnie transfekuje się komórki ssacze. Niniejszy wynalazek obejmuje także białko fuzyjne zawierające obszar Fc immunoglobuliny połączony, bezpośrednio wiązaniem polipeptydowym lub za pomocą linkera polipeptydowego, z docelo-

4 4 PL B1 wym białkiem wybranym z grupy obejmującej angiostatynę, endostatynę, fragment plazminogenu charakteryzujący się aktywnością angiostatyny, fragment kolagenu XVIII charakteryzujący się aktywnością endostatyny oraz ich kombinacje. Docelowe białko może być sprzęgane przez koniec C z końcem N obszaru Fc immunoglobuliny, ale bardziej korzystne jest połączenie końca N białka z końcem C obszaru Fc. W innej korzsytnej kompozycji białko fuzyjne może zawierać drugie białko docelowe wybrane z grupy obejmującej angiostatynę, endostatynę, fragment plazminogenu charakteryzujący się aktywnością angiostatyny oraz fragment kolagenu XVIII charakteryzujący się aktywnością endostatyny. W takim konstrukcje białka docelowe mogą być jednakowe bądź różne. Przykładowo, białko fuzyjne zawiera angiostatynę jako pierwsze białko docelowe, obszar Fc immunoglobuliny, oraz endostatynę jako drugie białko docelowe. Połączenie białek docelowych zachodzi bezpośrednio lub przez linker polipeptydowy. W taki sam sposób białka mogą być połączone z obszarem Fc immunoglobuliny. W takim przypadku, pierwsze białko jest dołączone z końcem N obszaru Fc immunoglobuliny, a drugie - z końcem C obszaru Fc. Inną możliwość stanowi asocjacja białek, wiązaniami kowalencyjnymi, na przykład wiązaniem disiarczkowym lub peptydowym, lub wiązaniami niekowalencyjnymi, prowadząca do powstania białka multimerycznego. W korzystnym rozwiązaniu, asocjacja zachodzi przez wiązania kowalencyjne za pomocą jednego lub więcej wiązań disiarczkowych między resztami cysteinowymi, korzystnie usytuowanymi w obszarach zawiasowych immunoglobuliny, rozmieszczonych w obszarach Fc obu łańcuchów. Docelowe białko zawiera fragment plazminogenu o masie cząsteczkowej około 40 kd, oraz opcjonalnie, sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID NO: 3, w innym rozwiązaniu - fragment kolagenu XVIII z sekwencją aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID NO: 1. Ponadto, docelowe białko może być angiostatyną bądź endostatyną o pełnej długości, albo ich bioaktywnymi fragmentami. Wybór źródła do uzyskania docelowego białka zależy od jego przeznaczenia. Na przykład, jeżeli docelowe białko ma być podawane ludziom, powinno ono być pochodzenia ludzkiego. Przedmiotem wynalazku są także sposoby wytwarzania białek fuzyjnych zawierających obszar Fc immunoglobuliny i białko docelowe wybrane z grupy obejmującej angiostatynę, endostatynę, fragment plazminogenu charakteryzujący się aktywnością angiostatyny, fragment kolagenu XVIII charakteryzujący się aktywnością endostatyny. Sposób obejmuje etapy, w których: a) przygotowuje się komórki ssacze, zawierające cząsteczkę DNA, kodującego odpowiednie białko, z sekwencją sygnałową lub bez i b) hoduje się komórkę w celu uzyskania pożądanego białka. Uzyskany produkt zbiera się, ponownie fałduje i oczyszcza znanymi sposobami. Zakładając, że białko zawiera miejsce cięcia proteolitycznego, rozdzielające obszar Fc immunoglobuliny i białko docelowe, białko docelowe można następnie oddzielić od białka fuzyjnego stosując znane enzymy proteolityczne, po czym jeżeli jest taka konieczność, oczyścić przed użyciem. W opisie przedstawiono również sposoby leczenia ssaków, na przykład ludzi, wymagające zastosowania inhibitorów angiogenezy. Dotyczy to leczenia nowotworów. Działanie inhibitorów angiogenezy prowadzi do spowolnienia lub zatrzymania wzrostu guza, a w niektórych okolicznościach, do jego regresji. Inhibitor podaje się w postaci białka fuzyjnego lub jako kwas nukleinowy, korzystnie włączony w wektor ekspresyjny, z farmaceutycznie akceptowalnym nośnikiem. Przedstawiona powyżej istota wynalazku, jego odmiany, właściwości i zalety staną się bardziej zrozumiałe po zapoznaniu się ze szczegółowym opisem i rysunkiem. Wynalazek został przykładowo przedstawiony na fig. 1A-1F, na której schematycznie przedstawiono przykładowe białkowe inhibitory angiogenezy, uzyskane według wynalazku (patrz przykłady 10-15). Na rysunku, fig. 1A przedstawia Fc-region Kringle'a angiostatyny; fig. 1B: Fc-wewnętrzny region Kringle'a angiostatyny; fig. 1C: Fc-endostatyna-linker GlySer-wewnętrzny region Kringle'a angiostatyny; fig. 1D: Fc-endostatyna-linker GlySer-region Kringle'a angiostatyny; fig. 1E: Fc-endostatyna-linker GlySer-angiostatyna; oraz fig. 1 F: angiostatyna-fc-endostatyna. Linie pionowe przedstawiają opcjonalne wiązania disiarczkowe, łączące reszty cysteinowe (C) w obszarze zawiasowym cząsteczki Fc. Szczegółowy opis wynalazku Wynalazek obejmuje białka fuzyjne, określane z jęz. ang. immunofuzynami, wykorzystywane do wytwarzania handlowych ilości klinicznie dopuszczalnych inhibitorów angiogenezy. Przed użyciem inhibitory te można wyodrębnić z konstruktów białkowych. Stosuje się także, jeżeli jest wskazane leczenie inhibitorami angiogenezy, bezpośrednie podawanie ssakom immunogennych białek fuzyjnych lub kodujących je kwasów nukleinowych.

5 PL B1 5 Białka według wynalazku zawierają obszar Fc immunoglobuliny i przynajmniej jedno docelowe białko, będące inhibitorem angiogenezy. Korzystnie inhibitor pochodzi z grupy obejmującej angiostatynę, endostatynę, fragment plazminogenu charakteryzujący się aktywnością angiostatyny fragment kolagenu XVIII charakteryzujący się aktywnością endostatyny. Przypuszcza się również, że inne polipeptydy wykazujące podobną aktywność, można poddać ekspresji w celu uzyskania białek fuzyjnych według wynalazku. Na fig. 1A-1F przedstawiono sześć przykładowych konstruktów białkowych, odpowiadających kompozycjom według wynalazku. Ponieważ najkorzystniejsze są produkty w postaci dimerów, wszystkie przedstawiono w tej postaci, połączone ze sobą parą wiązań disiarczkowych pomiędzy cysteinami sąsiednich jednostek. Na rysunku przedstawiono mostki disiarczkowe łączące ze sobą dwa obszary Fc immunoglobuliny przez ich obszar zawiasowy, podobnie jak to ma miejsce w przypadku naturalnych postaci tych cząsteczek. Mimo, że preferowane są konstrukty zawierające obszar zawiasowy Fc i wykazano, że rokują one doskonale jako leki, wynalazek obejmuje również sieciowanie w innych pozycjach. Ponadto w pewnych okolicznościach, użyteczne praktycznie dimery lub multimery można wytwarzać w drodze połączeń niekowalencyjnych, na przykład w wyniku oddziaływań hydrofobowych. Figura 1 pokazuje konstrukty homodimerowe, gdyż są one istotnymi rozwiązaniami wynalazku. Należy jednak przyznać, że użyteczne są również heterodimery, chociaż ich oczyszczanie często sprawia trudności. Ponadto możliwe jest zastosowanie do hamowania angiogenezy u ssaków, w tym u ludzi, aktywnych konstruktów stanowiących mieszaninę homodimerów i heterodimerów. Na przykład jeden łańcuch struktury heterodimerycznej zawiera angiostatynę, a drugi - endostatynę. Figura 1A przedstawia konstrukt dimerowy wytworzony zgodnie z procedurą podaną w przykładzie 10. W każdym monomerze znajduje się obszar Fc immunoglobuliny 1 z obszarem zawiasowym, domena CH 2 i domena CH 3. Pierwszy obszar kringle z angiostatyny 2, zarówno pierścień wewnętrzny jak i zewnętrzny, jest bezpośrednio połączony z końcem C obszaru Fc1. Na fig. 1B pokazano drugie rozwiązanie według wynalazku (patrz przykład 11), zawierające ten sam obszar Fc1, jak na fig. 1A, przy czym z końcem C obszaru Fc1 połączony jest tylko wewnętrzny pierścień pierwszej domeny kringle angiostatyny 3. Na fig. od 1C do 1F pokazano różne rozwiązania konstruktów według wynalazku, w których jako docelowe białko występuje wiele inhibitorów angiogenezy ustawionych kolejno i połączonych przez linker. Na fig. 1C docelowe białko zawiera pełnej długości endostatynę 4, linker polipeptydowy 5 i wewnętrzny pierścień pierwszej domeny kringle angiostatyny 3. Na fig. 1D przedstawiono białko zawierające obszar Fc taki sam, jak na fig. 1A, i docelowe białko zawierające pełnej długości endostatynę 4, linker polipeptydowy 5 i całkowity obszar (obydwa pierścienie zewnętrzny i wewnętrzny) kringle 1 angiostatyny 2. Konstrukt na fig. 1E różni się od fig. 1D tym, że najdalszym obszarem na końcu C domeny białkowej jest kopia pełnej długości angiostatyny 7. Na fig. 1A-1E pokazano konstrukty typu Fc-X, gdzie X oznacza docelowe białko, ale uważa się, że użyteczne są także konstrukty typu X-Fc, jak również X-Fc-X, gdzie X oznacza takie same lub różne białka. Na fig. 1F pokazano konstrukt, który zawiera w kierunku od końca N do C pełnej długości ludzką angiostatynę 7, ludzki obszar Fc immunoglobuliny 6 z obszarem zawiasowym, oraz domenę pełnej długości ludzkiej endostatyny 4. Określenie inhibitor angiogenezy oznacza tu dowolny łańcuch polipeptydowy, który ogranicza lub hamuje powstawanie nowych naczyń krwionośnych u ssaków. W zakresie terapii przeciwnowotworowej, inhibitor tego rodzaju powstrzymuje tworzenie się nowych naczyń krwionośnych w obrębie guza lub na jego powierzchni, zwłaszcza na guzie litym. Użyteczne inhibitory angiogenezy można identyfikować za pomocą wielu znanych testów. Należą do nich, na przykład, test namnażania bydlęcych komórek śródbłonkowych, test błony omoczniowej kurcząt (CAM) lub test mysiej rogówki. Preferowany jest test CAM [patrz przykładowo O'Reilly i in., (1994) Cell 79: i O'Reilly i in., (1997) Cell 88: ]. W skrócie, z zapłodnionych trzydniowych jajek pobierano embriony z nietkniętym żółtkiem i umieszczano je na szalkach Petri'ego. Po inkubacji w temperaturze 37 C i w atmosferze 3% CO 2 przez trzy dni, na błony omoczniowe poszczególnych embrionów nakładano krążek metylocelulozowy, zawierający przypuszczalny inhibitor angiogenezy. Po inkubacji przez 48 godzin, oglądano membrany pod mikroskopem celem stwierdzenia obecności obszarów o zahamowanym tworzeniu naczyń. Korzystnymi inhibitorami angiogenezy użytecznymi według wynalazku są: angiostatyna i endostatyna. Określenia angiostatyna i endostatyna dotyczą nie tylko białek pełnej długości, ale także ich odmian i fragmentów aktywnych biologicznie, jak również aktywnych biologicznie fragmentów plazminogenu i kolagenu XVIII. Określenie fragment aktywny biologicznie w przypadku angiostatyny odnosi się do każdego białkowego fragmentu plazminogenu lub angiostatyny, który wykazuje przynajmniej

6 6 PL B1 30%, korzystniej przynajmniej 70%, a zwłaszcza korzystnie przynajmniej 90% aktywności angiostatyny pełnej długości, oznaczonej testem CAM. W przypadku endostatyny określenie fragment aktywny biologicznie odnosi się do każdego białkowego fragmentu kolagenu XVIII lub endostatyny, który ma przynajmniej 30%, korzystniej przynajmniej 70%, a zwłaszcza korzystnie przynajmniej 90% aktywności endostatyny pełnej długości, oznaczonej testem CAM. Określenie odmiany oznacza odmiany specyficzne i alleliczne, a także inne odmiany występujące i nie występujące naturalnie, na przykład wytworzone konwencjonalnymi technikami genetycznymi, które są przynajmniej w 70% podobne lub w 60% identyczne, bardziej korzystnie przynajmniej w 75% podobne lub w 65% identyczne, a zwłaszcza korzystnie przynajmniej w 80% podobne lub w 70% identyczne z naturalnie występującymi sekwencjami endostatyny lub angiostatyny. W celu określenia, czy dany polipeptyd wykazuje podobną lub identyczną do polipeptydu odniesienia aktywność, dokonuje się najpierw porównania sekwencji, korzystając z dynamicznego programu algorytmu opisanego przez Smitha i Watermana (1981) J.Mol.Biol. 147: , stosując macierz podstawienia BLOSUM62, opisaną na fig. 2 w publikacji Henikoff i Henikoff (1992), Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: , jego sekwencji aminokwasowej albo kodującej jej sekwencji kwasu nukleinowego. Według wynalazku odpowiednia wartość wag za wystąpienie pierwszej przerwy w sekwencji wynosi -12, a wartość wag za wydłużenie przerwy wynosi -4. Programy komputerowe wykonujące porównanie sekwencji na podstawie algorytmu Smitha-Watermana i matrycy BLOSUM62, np. oprogramowanie GCG (Oxford Molecular Group, Oxford, Anglia), są dostępne na rynku i szeroko stosowane. Po dokonaniu przyrównania sekwencji można obliczyć w procentach stopień podobieństwa. Poszczególne reszty aminokwasowe z każdej sekwencji porównuje się kolejno ze sobą. Jeżeli w macierzy BLOSUM62 wartość dla dwóch porównywanych reszt aminokwasowych wynosi zero lub jest liczbą ujemną to stopień podobieństwa dla tej pary wynosi zero; w odwrotnym przypadku wynosi 1,0. Wynik podobieństwa jest sumą wyników dla porównanych reszt aminokwasowych. Wykonywana następnie normalizacja wyniku polega na podzieleniu go przez ilość aminokwasów w mniejszej z obu porównywanych sekwencji. Znormalizowany wynik określa procentowe podobieństwo dwóch polipeptydów. Alternatywnie, aby obliczyć w procentach stopień identyczności, porównywane reszty aminokwasowe z każdej sekwencji ponownie się porównuje. Jeżeli nie są one identyczne, wynik identyczności wynosi zero; w odwrotnym przypadku - wynosi 1.0. Wynik identyczności jest sumą wyników dla porównywanych aminokwasów. Wykonywana następnie normalizacja wyniku polega na podzieleniu go przez ilość aminokwasów w mniejszej z obu porównywanych sekwencji. Znormalizowany wynik określa w procentach identyczność dwóch polipeptydów. Przy obliczaniu procentowego podobieństwa i identyczności pomija się insercje i delecje. Nie uwzględnia się także wartości wag za przerwy w sekwencji, chociaż wykorzystuje się je w początkowym porównywaniu. Docelowe białka uzyskuje się w wyniku ekspresji jako białka fuzyjne z obszarem Fc immunoglobuliny. Jak wiadomo, każdy stały obszar ciężkiego łańcucha immunoglobuliny składa się z czterech lub pięciu domen. Domeny są kolejno nazwane następująco: CH 1 -zawias-ch 2 -CH 3 (-CH 4 ). W poszczególnych klasach immunoglobulin sekwencje DNA kodujące domeny ciężkiego łańcucha są wzajemnie homologiczne, na przykład, domena CH 2 z IgG jest homologiczna z domeną CH 2 z IgA i IgD, oraz domeną CH 3 z IgM i IgE. Określenie obszar Fc immunoglobuliny oznacza koniec karboksylowy stałego obszaru łańcucha immunoglobuliny, korzystnie stałego obszaru łańcucha ciężkiego, lub jego części. Na przykład, obszar Fc immunoglobuliny może zawierać 1) domenę CH 1, domenę CH 2 i domenę CH 3, 2) domenę CH 1 i domenę CH 2, 3) domenę CH 1 i domenę CH 3, 4) domenę CH 2 i domenę CH 3, lub 5) połączenie dwóch lub więcej domen z zawiasowym obszarem immunoglobuliny. W korzystnej kompozycji według wynalazku obszar Fc kodowany przez konstrukt DNA zawiera przynajmniej obszar zawiasowy immunoglobuliny, domenę CH 2 i domenę CH 3, i nie zawiera przynajmniej domeny CH 1. Preferowaną klasą immunoglobulin, z której pochodzi stały obszar łańcucha ciężkiego, jest IgG (Igy) (podklasy ү 1, 2, 3 lub 4). Mogą być także stosowane inne klasy immunoglobulin, IgA (Igα), IgD (Igδ), IgE (Igε) oraz IgM (Igμ). Wybór odpowiednich stałych obszarów łańcucha ciężkiego immunoglobuliny jest szczegółowo dyskutowany w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych AP nr nr 5,541,087 i 5,726,044. Dokonanie wyboru odpowiedniej klasy i podklasy tak, aby uzyskać określony rezultat wymaga wiedzy fachowej. Część konstruktu DNA kodującego obszar Fc immunoglobuliny korzystnie zawiera przynajmniej część domeny zawiasowej i przynajmniej część domeny CH 3 z Fcү bądź homologicznych domen z IgA, IgD, IgE lub IgM.

7 PL B1 7 Zależnie od zastosowania, mogą być stosowane geny kodujące stały obszar pochodzący od innych gatunków niż ludzie, np. od myszy lub szczurów. Obszar Fc używany jako składnik immunofuzyjnego konstruktu DNA może pochodzić z każdego gatunku ssaczego. Jeżeli niepożądane jest w komórce gospodarza lub u zwierzęcia wystąpienie odpowiedzi immunologicznej na działanie Fc, należy dobrać taki obszar z tego samego gatunku, co komórka gospodarza lub zwierzę. Na przykład, można użyć ludzkiego Fc, jeżeli białko ma być stosowane u ludzi; podobnie używa się mysiego Fc dla myszy. Ponadto użyteczne mogą być również substytucje lub delecje w domenach stałych obszarów w konstruktach, obejmujące jedną lub więcej reszt aminokwasowych. Jako przykład można podać substytucję reszt aminokwasowowych w górnym obszarze CH 2 celem uzyskania odmiany Fc o zmniejszonym powinowactwie wiązania z receptorami Fc [Cole i in., (1997) J. Immunol. 159: 3613]. Takie konstrukty można przygotować sposobami dobrze znanymi biologom molekularnym. Zastosowanie ludzkiego Fcү1 jako sekwencji z obszaru Fc ma szereg zalet. Jeżeli białko fuzyjne z inhibitorem angiogenezy ma być zastosowane jako lek, domena Fcү1 może nadać białku fuzyjnemu aktywność funkcjonowania jako efektor. Aktywność ta obejmuje aktywność biologiczną taką jak wiązanie dopełniacza, komórkową cytotoksyczność skierowaną przeciwko przeciwciałom, przenoszenie przez barierę łożyska i zwiększony półokres trwania w surowicy. Domena Fc umożliwia także wykrywalnie testem ELISA anty-fc i oczyszczanie przez związanie z białkiem A ze Staphylococcus aureus ( Białko A ). W niektórych zastosowaniach może być korzystne wyeliminowanie określonych rodzajów aktywności obszaru Fc, np. wiązania z receptorem Fc lub wiązania dopełniacza. W przypadku immunogennych białek fuzyjnych z inhibitorem angiogenezy, jedną z funkcji składnika fuzyjnego będącego obszarem Fc immunoglobuliny jest ułatwienie odpowiedniego sfałdowania białkowego inhibitora angiogenezy, zapewniającego uzyskanie aktywności i ograniczenia rozpuszczalności tylko do cząsteczek aktywnych, przynajmniej w przestrzeni międzykomórkowej. Ponieważ składnik białka fuzyjnego, Fc, jest hydrofilowy, uzyskane immunogenne białko fuzyjne z inhibitorem jest łatwo rozpuszczalne, w przeciwieństwie, na przykład, do rekombinowanej endostatyny, wytwarzanej w E.coli [O'Reilly (1997) Cell 88: 277]. We wszystkich podanych przykładach, uzyskano wysoką wydajność wytwarzania immunogennych białek fuzyjnych. Były one wydzielane do pożywek zwykle w stężeniach od około 30 do 100 μg/ml i oczyszczane z łatwością chromatograficznie z zastosowaniem białka A. Ponadto, możliwe jest oddzielanie tych białek i dalsze oczyszczanie znanymi metodami, np. z zastosowaniem sefarozy heparynowej, sefarozy lizynowej i chromatografią powinowactwa. Oprócz wysokiej wydajności ekspresji, białka fuzyjne według wynalazku charakteryzują się dłuższymi okresami półtrwania w surowicy, przypuszczalnie z powodu większych rozmiarów cząsteczek. Na przykład, ludzki Fc-ludzka angiostatyna ma półokres trwania w surowicy wynoszący 33 godziny u myszy, w porównaniu z 4 do 6 godzin dla ludzkiej angiostatyny [O'Reilly i in., (1996) Nature Medicine 2: 689]. Uważa się, że angiostatyna o masie cząsteczkowej 40 kd i endostatyna o masie 20 kd, są dostatecznie małe, aby ulegać efektywnemu usuwaniu przez nerki. Przeciwnie, Fc-angiostatyna i Fc-endostatyna w postaci dimeru mają masy cząsteczkowe, odpowiednio, 145 kd i 100 kd, ponieważ zawierają po dwa obszary Fc immunoglobuliny i po dwie cząsteczki angiostatyny lub endostatyny. Tego rodzaju dwuwartościowa struktura może wykazywać większe powinowactwo wiązania z receptorami angiostatyny lub endostatyny. Jeżeli aktywność inhibitora angiogenezy jest uzależniona od receptora, to białka fuzyjne zawierające Fc są potencjalnie bardziej skuteczne w ograniczaniu nowotworu niż sama jednowartościowa angiostatyna lub endostatyna. Ponadto, jeżeli angiostatyna i/lub endostatyna należą do klasy dimerowych ligandów białkowych, to fizyczne ograniczenie spowodowane przez Fc, powoduje, że dimeryzacja staje się procesem wewnątrzcząsteczkowym, jej równowaga przesuwa się w stronę dimeru, a wiązanie z receptorem ulega wzmocnieniu. Stosując standartowe techniki z użyciem rekombinowanego DNA można także w odpowiednie pozycje monomeru wprowadzać reszty cysteinowe w celu stabilizacji dimeru w wyniku tworzenia kowalencyjnego wiązania disiarczkowego. Określenie wielowartościowy oznacza tu cząsteczkę rekombinowaną zawierającą dwa lub więcej segmentów czynnych biologicznie. Fragmenty białkowe tworzące cząsteczkę wielowartościową mogą być połączone linkerem polipeptydowym, który łączy części składowe, nie powodując przesunięcia ramki i umożliwiając im niezależne działanie. Określenie dwuwartościowy oznacza wielowartościową cząsteczkę rekombinowaną zawierającą w fuzyjnym konstrukcje dwa białka docelowe według wynalazku, na przykład cząsteczka Fc-X, gdzie X wybrano niezależnie spośród angiostatyny, endostatyny lub ich odmian. Cząsteczkę określamy jako dwuwartościową (patrz np. fig. 1A), gdy zawiera dwie cząstki X dołączone do obszaru Fc immunoglobuliny (który zwykle sam jest dimerem złożonym z fragmentów ciężkiego łańcucha z przynajmniej

8 8 PL B1 częścią obszaru zawiasowego i domeną CH 3, oraz opcjonalnie domeną CH 2 ). Jeżeli konstrukt fuzyjny według wynalazku ma postać Fc-X-X, uzyskana dimerowa cząsteczka Fc jest czterowartościowa. Dwa białka tworzące cząsteczkę Fc-X-X mogą być połączone linkerem peptydowym. Dwuwartościowa cząsteczka może zwiększać pozorne powinowactwo wiązania pomiędzy cząsteczką a jej receptorem. Przykładowo, jeżeli jedna cząsteczka endostatyny w grupie Fc-endostatyna może wiązać się z receptorem komórki z określonym powinowactwem, to druga cząsteczka endostatyny z tej samej grupy może wiązać się ze znacznie większą intensywnością (powinowactwo pozorne) z drugim receptorem tej samej komórki. Wynika to z fizycznej bliskości drugiej cząsteczki endostatyny do receptora po związaniu się pierwszej cząsteczki. W przypadku wiązania się przeciwciała z antygenem, pozorne powinowactwo zwiększa się przynajmniej 10 4 razy. Określenia multimetr i multimerowy dotyczą stabilnego połączenia dwóch lub więcej łańcuchów polipeptydowych, kowalencyjnie, na przykład przez oddziaływanie kowalencyjne zwłaszcza wiązanie disiarczkowe, bądź niekowalencyjne, na przykład przez interakcję hydrofobową. Multimer oznacza zarówno homomultimer, w którym obydwa polipeptydy są jednakowe, jak również heteromultimer złożony z różnych polipeptydów. Określenie dimerowy dotyczy cząsteczki multimerowej, w której dwa łańcuchy polipeptydowe białka są stabilnie połączone w wyniku oddziaływań kowalencyjnych lub niekowalencyjnych. Należy rozumieć, że fragment obszaru Fc immunoglobulinowy jest zwykle dimerem złożonym fragmentów ciężkiego łańcucha zawierających przynajmniej część obszaru zawiasowego i domenę CH 3, oraz opcjonalnie domenę CH 2. Wiadomo, że wiele ligandów białkowych wiąże się z receptorami jako dimery. Jeżeli ligand białkowy X dimeryzuje naturalnie, to część X w cząsteczce Fc-X będzie ulegać dimeryzacji w znacznie większym stopniu, ponieważ proces dimeryzacji jest zależny od stężenia. Fizyczna bliskość dwóch cząsteczek X, połączonych poprzez wiążący obszar Fc immunoglobuliny, powoduje, że dimeryzacja staje się procesem wewnątrzcząsteczkowym, jej równowaga przesuwa się znacznie w stronę dimeru, a wiązanie białka z receptorem ulega wzmocnieniu. Należy rozumieć, że w przedstawionym wynalazku wykorzystuje się konwencjonalne techniki rekombinacji DNA w celu wytworzenia użytecznych białek fuzyjnych Fc. Konstrukty wytwarza się korzystnie na poziomie DNA, po czym uzyskany DNA wprowadza się wektorów ekspresyjnych i poddaje ekspresji prowadzącej do otrzymania immunogennych białek fuzyjnych. Określenie wektor oznacza kwas nukleinowy, zawierający sekwencję nukleotydową odpowiednią do umieszczenia w komórce gospodarza i rekombinacji lub wbudowania do genomu komórki gospodarza, bądź autonomicznej replikacji jako epizom. Wektory obejmują kwasy nukleinowe w postaci linowej, plazmidy, fagemidy, kosmidy, wektory RNA, wektory wirusowe itp. Wektorami wirusowymi mogą być retrowirusy, adenowirusy i parwowirusy związane z adenowirusem. Określenie ekspresja genowa lub ekspresja docelowego białka oznacza transkrypcję sekwencji DNA, translację transkryptu mrna i wydzielenie otrzymanego białka fuzyjnego Fc. Użytecznym wektorem ekspresyjnym jest pdcs [Lo i in., (1988) Protein Engineering 11: 495], w którym do transkrypcji genu Fc-X wykorzystuje się enhancer/promotor wirusa ludzkiej cytomegalii i sygnał poliadenylacji SV40. Sekwencja enchancera/promotora wirusa ludzkiej cytomegalii pochodzi z nukleotydów od -601 do +7 sekwencji opracowanej przez Bosharti'ego in., 1985, Cell 41: 521. Wektor zawiera także zmutowany gen kodujący reduktazę dihydrofolanową jako marker selekcyjny [Simonsen i Levinson, (1983) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80: 2495]. Odpowiednia komórka gospodarza może być transformowana lub transfektowana sekwencją DNA według wynalazku, po czym wykorzystana do ekspresji i wydzielania docelowego białka. Korzystnie stosuje się komórki hybrydomy, mielomy NS/O, komórki 293, komórki jajników chomika syryjskiego, komórki HeLa i komórki COS. Białka fuzyjne według wynalazku są korzystnie wytwarzane przy użyciu konwencjonalnych technik rekombinacji DNA. Korzystnie prowadzi się ekspresję w komórce gospodarza cząsteczki DNA kodującego sekwencję sygnałową obszaru Fc immunoglobuliny i docelowe białko (określane również jako inhibitor angiogenezy). Korzystne konstrukty mogą kodować w kierunku 5' do 3' sekwencję sygnałową obszar Fc immunoglobuliny i docelowe białko. Alternatywę stanowi kodowanie w kierunku 5' do 3' sekwencji sygnałowej, docelowego białka i obszaru Fc immunoglobuliny. Określenie sekwencja sygnałowa oznacza segment peptydowy, który w komórce gospodarza ukierunkowuje wydzielanie immunogennego białka fuzyjnego, będącego inhibitorem angiogenezy, a następnie jest odcinany po translacji. Sekwencja sygnałowa według wynalazku jest polinukleotydem, który koduje sekwencję aminokwasową inicjującą transport białka przez błonę retikulum endoplazmi-

9 PL B1 9 cznego. Do użytecznych sekwencji sygnałowych według wynalazku należą sygnałowe sekwencje przeciwciał z lekkim łańcuchem, np. przeciwciała (Gillies i in., 1989, Jour. of Immunol. Meth. 125: ), sekwencje sygnałowe ciężkiego łańcucha przeciwciał, np. przeciwciała MOPC141 (Sakano i in., 1980, Nature 286: 5774), a także inne znane sekwencje sygnałowe (patrz Watson, 1984, Nucleic Acids Research 12: 5145). Sekwencje sygnałowe są dobrze znane. Zwykle mają od 16 do 30 reszt aminokwasowych, a mogą także zawierać więcej lub mniej. Typowy peptyd sygnałowy zawiera trzy obszary: podstawowy obszar końca N, centralny obszar hydrofobowy oraz bardziej polarny obszar końca C. Centralny obszar hydrofobowy zawiera od 4 do 12 reszt hydrofobowych, które kotwiczą peptyd sygnałowy w dwuwarstwowej błonie lipidowej w czasie transportu powstającego polipeptydu. Po inicjacji, peptyd sygnałowy jest zazwyczaj odcinany w świetle retikulum endoplazmatycznego przez enzymy komórkowe, znane jako peptydazy sygnałowe. Potencjalne pozycje odcinania peptydu sygnałowego generalnie odpowiadają regule (-3, -1). Wynika stąd, że w pozycjach -1 i -3 typowy peptyd sygnałowy ma małe, obojętne reszty aminokwasowe, i nie ma w tym obszarze reszt proliny. Peptydaza sygnałowa tnie peptyd pomiędzy aminokwasami -1 i +1. W ten sposób, część DNA, kodująca sekwencję sygnałową może być odcinana od strony końca aminowej immunogennego białka fuzyjnego w czasie jego wydzielania. Wynikiem tego jest wydzielenie immunogennego białka fuzyjnego złożonego z obszaru Fc i białka docelowego. Szczegółowy opis sekwencji peptydu sygnałowego podał von Heijne (1986) Nucleic Acids Res., 14: Oczywiste jest, że wybór odpowiedniej sekwencji sygnałowej może wymagać przeprowadzenia kilku rutynowych doświadczeń. Należą do nich określenie zdolności sekwencji sygnałowej do ukierunkowania wydzielania immunogennego białka fuzyjnego, a także określenie optymalnej konfiguracji, genomowego lub cdna, sekwencji, której użycie zapewni skuteczne wydzielenie immunogennego białka fuzyjnego. Ponadto, przy odpowiedniej wprawie, można wytworzyć syntetyczny peptyd sygnałowy w oparciu o reguły podane przez von Heijne'a, a następnie sprawdzić jego wydajność. Sekwencję sygnałową określa się także mianem peptydu sygnałowego, sekwencji prowadzącej lub peptydu prowadzącego. Połączenie sekwencji sygnałowej i obszaru Fc immunoglobuliny określa się czasem jako kasetę wydzielniczą. Przykładową kasetę wydzielniczą według wynalazku stanowi polinukleotyd, kodujący w kierunku 5' do 3', sekwencję sygnałową genu kodującego lekki łańcuch immunoglobuliny i genu kodującego obszar Fcү1 ludzkiej immunoglobuliny ү1. Gen kodujący obszar Fcү1 immunoglobuliny Fcү1 korzystnie zawiera przynajmniej część domeny zawiasowej i przynajmniej część domeny CH 3, lub alternatywnie przynajmniej część domeny zawiasowej, domeny CH 2 i domeny CH 3. DNA kodujący kasetę wydzielniczą może mieć postać genomową lub cdna. W innym rozwiązaniu, sekwencja DNA zawiera miejsce cięcia proteolitycznego, wstawioną pomiędzy kasetę wydzielniczą a białkowy inhibitor angiogenezy. Miejsce cięcia umożliwia proteolityczne odcięcie kodowanego białka fuzyjnego, co pozwala oddzielić domenę Fc od białkowego inhibitora angiogenezy. Jako miejsce cięcia proteolitycznego określa się sekwencje aminokwasowe, które ulegają cięciu przez enzym proteolityczny lub inne proteolityczne czynniki rozszczepiające. Do użytecznych miejsc cięcia proteolitycznego należą sekwencje aminokwasowe, które są rozpoznawane przez enzymy proteolityczne, jak trypsyna, plazmina i enterokinaza K. Znane są liczne pary: miejsce cięcia/enzym tnący; patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr 5,726,044. Jeżeli sekwencja docelowego białka jest wyjściową cząsteczką dla angiostatyny, endostatyny lub ich aktywnej odmiany, pożądane białko można uzyskać przez odcięcie przy pomocy endogenicznego enzymu proteolitycznego, jak elastyna, plazmina lub urokinaza. Niniejszy wynalazek obejmuje także białka fuzyjne zawierające różne kombinacje rekombinowanej angiostatyny i endostatyny lub ich fragmentów, które można wytworzyć w dużych ilościach. Pomimo stwierdzonej efektywności w hamowaniu rozwoju nowotworów, mechanizm blokowania angiogenezy przez angiostatynę i endostatynę nie jest dokładnie znany. Angiostatyna ma kilka struktur Kringle, a endostatyna - inne motywy strukturalne, z których każdy może być samodzielnie odpowiedzialny lub brać udział w wiązaniu białek z komórkami śródbłonkowymi, co daje efekt zatrzymania angiogenezy. Zatem wynalazek dotyczy docelowych białek, które są bioaktywnymi fragmentami angiostatyny, jak kringle 1, kringle 2 i kringle 3, tudzież ich kombinacji, oraz endostatyny, które wykazują oddziaływanie podobne fizjologicznie do naturalnej angiostatyny i endostatyny o pełnej długości. W innym rozwiązaniu wynalazku przedstawiono dwufunkcyjne hybrydowe konstrukty inhibitorów angiogenezy. Jako dwufunkcyjną hybrydową cząsteczkę lub konstrukt określa się białko wytworzone

10 10 PL B1 przez połączenie dwóch podjednostek białkowych, pochodzących z różnych białek. Każda podjednostka białkowa ma swoją niezależną aktywność tak, że w cząsteczce hybrydowej działania te mogą być addytywne lub synergiczne. Dzięki białkom hybrydowym możliwe jest badanie synergicznego wpływu angiostatyny i endostatyny na zwierzęta. Korzystna dwufunkcyjna hybryda może zawierać przynajmniej dwa różne inhibitory angiogenezy połączone kolejno, bezpośrednio lub przez linker polipeptydowy. Przykładowo, w korzystnym rozwiązaniu sekwencja docelowa koduje przynajmniej część angiostatyny połączoną w ramce z przynajmniej częścią endostatyny, przy czym domeny angiostatyny i endostatyny wykazują czynność antyangiogenetyczną lub hamującą angiogenezę. Jednostki mogą być połączone przez linker polipeptydowy. Określenie linker polipeptydowy oznacza sekwencję peptydową która może łączyć dwa białka lub białko z obszarem Fc. Linker polipeptydowy korzystnie zawiera wiele reszt aminokwasów, takich jak glicyna i/lub seryna, szczególnie serie peptydów glicynowych i serynowych o długości reszt; patrz patent Stanów Zjednoczonych AP nr 5,258,698. Uważa się, że optymalną długość i kompozycję aminokwasową linkera należy dobrać doświadczalnie. Stwierdzono, że w ekspresji różnych części angiostatyny jako fuzyjnych cząsteczek z Fc uzyskuje się wysokie wydajności, przypuszczalnie dlatego, że część Fc działa jako nośnik, wspomagając poprawne fałdowanie polipeptydu na końcu C. Ponadto, obszar Fc może ulegać glikozylacji i uzyskiwać wysoki ładunek przy fizjologicznej wartości ph, co sprzyja rozpuszczaniu hydrofobowych białek. Niniejszy wynalazek ujawnia także sposoby wytwarzania, jako białek fuzyjnych Fc, angiostatyny i endostatyny z gatunków innych niż ludzie. Są one użyteczne w przedklinicznych badaniach inhibitorów angiogenezy, ponieważ ocena skuteczności i toksyczności leków białkowych musi być wykonana, przed podaniem ich ludziom, na organizmach zwierzęcych. Ludzkie białko może nie oddziaływać w oczekiwany sposób na myszy z powodu wywoływania reakcji immunologicznej i/lub wykazywać odmienną farmakokinetykę, co zniekształca wyniki testu. W związku z tym do badań na myszach używa się równoważnego białka mysiego. Do porównania rozpuszczalnych białek hufc-hu angiostatyna, hufc-hu endostatyna, mufc-mu angiostatyna, mufc-mu endostatyna, z nierozpuszczalnymi białkami wytwarzanymi w układzie ekspresyjnym z E. coli stosowano standardowy model raka płuc u myszy według Lewisa [O' Reilly i in., (1997) Cell 88: 277]. Rozpuszczalne białka fuzyjne Fc znacznie bardziej efektywnie tłumiły wzrost guza w modelu Lewisa niż odpowiadające im białka wytworzone w E.coli. Ponadto, myszy laboratoryjne były pochodzenia wsobnego, a ich nowotwory powstały w wyniku indukcji, a nie spontanicznie. A zatem, efektywność u myszy może nie korelować z prawdopodobną efektywnością leczenia nowotworów u ludzi. Przedkliniczne badania na psach dostarczą dokładniejszych informacji o skuteczności inhibitorów angiogenezy w przypadkach spontanicznych guzów, ponieważ u psów pojawia się naturalnie wiele nowotworów tego rodzaju. Opracowanie sposobów wytwarzania mysich białek fuzyjnych (mu) Fc-mu angiostatyna, mufc-mu endostatyna, oraz psich (ca) Fc-ca angiostatyna, cafc-ca endostatyna według wynalazku, umożliwi przedkliniczne badania inhibitorów angiogenezy w organizmach myszy i psów. Rozwiązania według wynalazku mogą być wykorzystywane w leczeniu stanów chorobowych wywołanych przez angiogenezę, dzięki podawaniu DNA, RNA lub białek według wynalazku. Do leczonych stanów chorobowych należą na przykład: guzy stałe; guzy krwiopochodne; przerzuty nowotworowe; nowotwory łagodne, w tym naczyniaki krwionośne, nerwiaki nerwu słuchowego, włókniakonerwiaki, jaglice i ziarniaki ropotwórcze; reumatoidalne zapalenie stawów; łuszczyca; choroby naczyń ocznych (retinopatia cukrzycowa, fibroplazja pozasoczewkowa, zwyrodnienie plamki, odrzucenie przeszczepu rogówki, jaskra naczyniowa); rubeoza, zespół Oslera-Webbera; angiogeneza mięśnia sercowego; unaczynienie płytkowe; telangiektazja; naczyniowłókniak hemofilowy; oraz ziaminowanie ran; a także nadmierna lub nieprawidłowa stymulacja komórek śródbłonkowych, zrosty jelitowe, zwężenie tętnic, blizny stwardnieniowe lub przerostowe skóry, tj. bliznowce. Przedstawione tutaj konstrukty DNA można stosować w terapii genowej, podając do komórki gen kodujący endostatynę lub angiostatynę różnymi sposobami, na przykład jako natywny DNA sprzężony z promotorem lub DNA wbudowany w wektor wirusowy. Po umieszczeniu w komórce, następuje ekspresja genów angiostatyny i/lub endostatyny bądź ich fragmentów i wytwarzanie in vivo białka przeznaczonego do uzyskania określonego skutku biologicznego. Konstrukt DNA według wynalazku zapewnia wysoką wydajność ekspresji białka fuzyjnego. Białka fuzyjne według wynalazku mogą być również przydatne w leczeniu stanów chorobowych związanych z angiogenezą a ich efektywność kliniczna jest większa od natywnych i rekombinowanych inhibitorów angiogenezy, ponieważ immunogenne białka fuzyjne zawierające inhibitory angiogenezy według wynalazku charakteryzują się dłuż-

11 PL B1 11 szym okresem półtrwania surowicy. Struktura dwuwartościowa i dimerowa białek według wynalazku sprawia, że wykazują one wyższe powinowactwo wiązania. Dwufunkcyjne hybrydowe cząsteczki według wynalazku mają wyższą efektywność kliniczną w wyniku synergicznych działań dwóch różnych inhibitorów angiogenezy połączonych przez sprzężony obszar Fc lub elastyczny linker polipeptydowy. Kompozycje według wynalazku dostarcza się zwierzętom różnymi odpowiednimi sposobami, bezpośrednio (np. miejscowo, przez iniekcję, wszczepienie lub miejscowe podanie do tkanki) lub ogólnoustrojowo (np. pozajelitowo lub doustnie). Przy dostarczaniu pozajelitowym, jak podawanie dożylne, podskórne, dooczne, dootrzewnowe, domięśniowe, policzkowe, doodbytnicze, dopochwowe, dooczodołowe, domózgowe, wewnątrzczaszkowe, wewnątrzrdzeniowe, dokomorowe, dooponowe, dozbiornikowe, wewnątrztorebkowe, donosowe, lub w postaci aerozolu, kompozycja zawiera korzystnie część wodnej lub ciekłej zawiesiny bądź roztworu odpowiednich fizjologicznie. Nośnik lub vehiculum jest fizjologicznie dopuszczalny, jeśli nie wpływa niekorzystnie na równowagę elektrolitową i/lub objętościową u pacjenta, wspomagając jedynie dostarczanie pożądanej kompozycji pacjentowi. Ośrodkiem ciekłym może być zwykła sól fizjologiczna (np. 9,85% roztwór wodny NaCI, 0,15 M, ph 7-7,4). Korzystne dawki immunogennych białek fuzyjnych wynoszą od 50 ng/m 2 do 1 g/m 2, korzystniej od 5 ng/m 2 do 200 mg/m 2, a najkorzystniej od 0,1 mg/m 2 do 50 mg/m 2. Korzystne dawki kwasów nukleinowych kodujących immunogenne białka fuzyjne wynoszą od 1 μg/m 2 do 100 mg/m 2, korzystniej od 20 μg/m 2 do 10 mg/m 2, a najkorzystniej 400 μg/m 2 do 4 mg/m 2. Uważa się, że optymalne sposoby podawania oraz dawki należy określać doświadczalnie. W dalszej części opisu przedstawione przykłady, które nie ograniczają zakresu wynalazku. Przykłady P r z y k ł a d 1 Ekspresja białka fuzyjnego hufc-hu endostatyna Ludzką endostatynę poddawano ekspresji jako białko fuzyjne o składzie: ludzki obszar Fc-ludzka endostatyna (hufc-huendo) według wskazówek Lo i in. (1998) Protein Engineering 11: 495. Fc oznacza fragment Fc ludzkiej immunoglobuliny gamma (sekwencja DNA przedstawiona jako SEQ ID NO: 1; sekwencja aminokwasowa przedstawiona jako SEQ ID NO: 2). Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) została wykorzystana do uzyskania cdna kodującego endostatynę (SEQ ID NO: 3; sekwencja aminokwasowa podana w SEQ ID NO: 4) tak, aby uzyskać ekspresję do fuzyjnego białka Fc-Endo. Wiodącym primerem był albo 5' - CC CCG GGT AAA CAC AGC CAC CGC GAC TTC C (SEQ ID NO: 5; kodowane aminokwasy pokazano jako SEQ ID NO: 6) albo 5' - C AAG CTT CAC AGC CAC CGC GAC TTC C (SEQ ID NO: 7; kodowane aminokwasy pokazane jako SEQ ID NO: 8), gdzie po miejscu restrykcyjnym Xmal lub Hindlll następowała sekwencja kodująca koniec N endostatyny. Primer z miejscem restrykcyjnym Xmal umożliwił wprowadzenie cdna kodującego endostatynę w miejsce Xmal na końcu domeny CH 3 obszaru Fc IgG. Primer z miejscem restrykcyjnym Hindlll dostosował cdna kodujący endostatynę do połączenia się z miejscem restrykcyjnym Hindlll wektora pdcs-fc(d 4 K), który zawiera miejsce rozpoznania enterokinazy Asp4-Lys [LaVallie i in., (1993) J. Biol. Chem. 268: ] na złączu białka fuzyjnego. Wstecznym primerem był 5' - C CTC GAG CTA CTT GGA GGC AGT CAT G (SEQ ID NO: 9), który zaprojektowano tak aby umieścić kodon stop translacji (antykodon, CTA) bezpośrednio po końcu C endostatyny, przy czym po kodonie stop występowało miejsce restrykcyjne Xhol. Produkty PCR klonowano i sekwencjonowano, a fragment Xmal-Xhol wprowadzano do uzyskanego wektora pdcs-fc ciętego przez Xmal i Xhol. Podobnie fragment Hindlll-Xhol kodujący endostatynę wprowadzano w odpowiednio cięty wektor pdcs-hufc(d 4 K). Stabilne klony prowadzące ekspresję Fc-Endo lub Fc(D 4 K)-endostatyna uzyskiwano w wyniku eloktroporacji komórek NS/0, a następnie selekcji w pożywce wzrostowej, zawierającej 100 nm metotreksanu. Poziom ekspresji białka oceniano testem ELISA pod kątem zawartości anty-ludzkiego Fc (przykład 3) i potwierdzano analizą SDS-PAGE, uzyskując białko o wielkości ok. 52 kd. Najlepsze klony wklonowywano przez ograniczone rozcieńczenie. P r z y k ł a d 2 Transfekcja i hodowla komórek W celu uzyskania czasowej transfekcji, plazmid wprowadzano do komórek 293 ludzkiej nerki przez współstrącenie plazmidu DNA fosforanem wapniowym [Sambrook i in., (1989) Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY] lub infekcję liposomami przy użyciu LipofectAMI- NE Plus (Life Technologies, Gaithersburg, MD) według protokołu producenta. W celu uzyskania stabilnie transferowanych klonów, plazmid DNA wprowadzano do komórek NS/0 mysiego szpiczaka przez elektroporację. Komórki NS/0 hodowano w pożywce Eagle zmodyfiko-