Dokładność Precyzja Granica oznaczalności Czułość

Transkrypt

1 CHROMATOGRAFIA Dokładność Precyzja Granica oznaczalności Czułość Dokładność Precyzja Granica oznaczalności Czułość Dokładność Precyzja Granica oznaczalności Czułość 1

2 Dokładność Precyzja Granica oznaczalności Czułość Metoda precyzyjna i dokładna Metoda precyzyjna, ale niedokładna Metoda nieprecyzyjna, ale dokładna Metoda nieprecyzyjna, i niedokładna Metody analizy instrumentalnej Metody spektroskopowe Spektroskopia molekularna Spektromertia atomowa Spektrometria mas Spektroskopia rentgenowska Metody analizy instrumentalnej Metody elektroanalityczne Voltamperometria Polarografia Konduktometria Potencjometria (Amperometria) (Kulometria) (Elektrograwimetria)

3 Metody analizy instrumentalnej Metody chromatograficzne Chromatografia gazowa Chromatografia cieczowa Chromatografia fluidalna Chromatografia elektromigracyjna Chromatografia planarna Ultraszybka chromatografia gazowa Definicja chromatografii Chromatografia to technika rozdzielania, która opiera się na wielokrotnym, powtarzającym się podziale rozdzielanych składników pomiędzy dwie nie mieszające się fazy: Fazę stacjonarną i fazę ruchomą. Faza stacjonarna jest nieruchoma Faza ruchoma przepływa w jednym kierunku Warunkiem rozdzielenia substancji jest ich różnica w oddziaływaniu fizycznym z fazą stacjonarną Rodzaje chromatografii Cieczowa - LC Kolumnowa Planarna (cienkowarstwowa, bibułowa) Wysokosprawna cieczowa HPLC Jonowymienna Żelowa Gazowa GC Fluidalna - SFC Chromatografia nie jest tylko metodą analityczną, ale coraz częściej wykorzystywaną techniką do otrzymywania substancji czystych w skali laboratoryjnej i przemysłowej chromatografia preparatywna - Przemysł farmaceutyczny - Przemysł kosmetyczny - Przemysł spożywczy Elektromigracja EM 3

4 Chromatografia gazowa Rozdzielanie mieszaniny w układzie gaz ciecz - chromatografia podziałowa Schemat rozdzielania mieszaniny na kolumnie chromatograficznej Rozdzielanie mieszaniny w układzie gaz ciało stałe - chromatografia adsorpcyjna Teoria rozdzialania chromatograficznego Prędkość przemieszczania się związku chemicznego przez kolumnę zależy od jego powinowactwa do fazy stacjonarnej Powierzchnia pod krzywą jest de-facto masą związku zaadsorbowanego Teoria rozdzielania chromatograficznego c c S S k = = M V V M V K V k współczynnik retencji c s stężenie składnika w fazie stacjonarnej, c m - stężenie składnika w fazie ruchomej (mobile phase) V s, V m objętości fazy stacjonarnej i ruchomej S M Gaz nośny Stężenie w fazie gazowej K stała podziału dla układu faz w danej temperaturze K = c c S M 4

5 α = K K 1 = k k 1 = t t R R1 t t M M = t t ' R ' R1 α współczynnik rozdzielenia substancji o czasach retencji t R1 i t R gdzie t R > t R1,36 σ α musi być > 1 Rozkład gaussowski stężeń substancji na wyjściu z kolumny definicja piku chromatograficznego Sprawność rozdzielenia określana jest liczbą N półek teoretycznych kolumny σ = t R N σ odchylenie standardowe dla piku w jednostkach czasu idealnie gaussowski, symetryczny pik: symetryczny rozkład stężeń substancji w szerokość piku na określonej wysokości związana jest zależnością z wariancją σ Sprawność rozdzielenia wyrażoną liczbą półek teoretycznych N można więc wyrazić wzorem: w = a σ tr N = a w w podst = 4 σ a =16 w0,5 h =,36σ a = 5,54 16 t N = w R podst w w podst szerokość piku u podstawy w 0,5h szerokość piku w połowie wysokości 5,54 t = w = a σ Sprawność rozdzielenia może być obliczona praktycznie: R 0,5h 5

6 Dyfuzja I prawo Fick a Wrpt min mol dc Dyfuzja J = D m s dx Dyfuzyjne poszerzanie pasma chromatograficznego Dyfuzja Eddy ego w kolumnie wypełnionej (kolumna pakowana) 6

7 Rozdzielczość pików Types of Chromatography Adsorption chromatography a solid stationary phase and a liquid or gaseous mobile phase are used. Solute is adsorbed on the surface of the solid particles. The more strongly a solute is adsorbed, the slower it travels through the column. Partition chromatography A high boiling liquid stationary phase is bonded to a solid surface. Solute equilibrates between the stationary liquid and the mobile phase (a flowing gas). Types of Chromatography Ion-exchange chromatography Anions or cations are covalently attached to the stationary solid phase. Solute ions of the opposite charge are attracted to the stationary phase by electrostatic force. Size exclusion chromatography Separates molecules by size, with the larger solutes passing through most quickly. Smaller molecules get trapped inside tiny pours. Types of Chromatography Affinity chromatography Employs specific interactions between one kind of solute molecule and a second molecule that is covalently attached to the stationary phase. For example, the immobilized molecule might be an antibody to a particular protein. When thousands of proteins pass through the column, only the protein that reacts with the antibody binds to the column, all the other proteins pass through. The desired protein is dislodged when desired by changing the ph or ionic strength. 7

8 Wykres funkcji odpowiedzi detektora w czasie Kolumny kapilarne GC Budowa kolumny kapilarnej typu WCOT 8

9 WCOT Wall Coated Open Tubular PLOT Porous Layer Open Tubular SCOT Support Coated Open Tubular Wide Bore 0,75 mm 0,5 mm Capillary Column 0,5 0,5 mm Narrow Bore 0, 0,05 mm Ultra Fast 0,05 0,01 mm Porównanie zdolności rozdzielczej kolumn pakowana Kapilarne: megabore narrowbore Faza stacjonarna: cyjanopropylo-metylopolisiloksan silnie polarna Faza stacjonarna: dimetylopolisiloksan niepolarna 9

10 Rodzaj kolumn do chromatografii gazowej: Faza stacjonarna: metylo-fenylo polisiloksan umiarkowanie polarna 1. Kolumny preparatywne o średnicy powyżej 6 mm i długosci 1 5m. Pakowane analityczne o średnicy wewnętrznej 6 mm, długość 1 3m. 3. Kolumny mikropakowane o średnicy wewnętrznej mm i długości 10m. 4. Kolumny kapilarne o średnicy wewnętrznej mm i długości m. 5. Kolumny mikrokapilarne o średnicy wewnętrznej mm i długości m. 6. Kolumny monolityczne o średnicy 1 3mm i długosci 10 50cm Zalety kolumn kapilarnych w stosunku do kolumn pakowanych Kolumna kapilarna w termostacie GC 1. Zdecydowanie większa sprawność rozdzielania półek. Bardzo dobra powtarzalność czasów retencji oraz powierzchni pików 3. Mniej krytyczny dobór fazy stacjonarnej w odniesieniu do rozdzielanych składników mieszaniny 4. Minimalne zużycie gazu nośnego 5. Mozliwość sprzężenia ze spektrometrem mas i transformacją fourierowską 6. Duża łatwość w montażu i wymianie kolumn. 7. Wytrzymałośc termiczna do C. 8. Bardzo wysoka trwałość kolumn (przy warunku czystości gazu nośnego) 10

11 Kolumna stalowa do chromatografii gazowej typu pakowana Typowe kolumny HPLC Packed GC Column Kolumny preparatywne HPLC Kolumna 11

12 Chromatografia żelowa Konwencjonalne adsorbenty krzemionkowe i polimerowe w chromatografii adsorpcyjnej Chromatografia żelowa polega na mechanicznym rozdzielaniu cząsteczek mieszaniny różniących się średnicą. Małe cząsteczki wnikają głebiej w pory fazy stacjonarnej i dlatego dłużej pozostają zatrzymane. SiO Polimer XAD Pore Structure Comparison Flow Characteristics Advanced Polymer Systems Magnapore Macroporous polymer diffusion limited HIPE Polymer diffusion effects minimal 1

13 Solute Distribution Macroporous polymer Penetration of a few nanometers HIPE polymer Full interior communication Obraz chromatograficzny próbek alkoholi spożywczych dozowanych bez rozcieńczania techniką SSL Chromatogram pestycydów chloroorganicznych w śladowym stężeniu (wzglednie duża objętość rozpuszczalnika) Chromatogram GC aminokwasów 13

14 H R ES ET Chromatogram WWA Schemat chromatografu gazowego filtry System zbierania danych reduktory strzykawka dozownik powietrze wodór Gaz nośny kolumna detektor pneumatyka dozownik kolumna detektor Zbieranie danych Dozownik do kolumn kapilarnych z podziałem strumienia gazu nośnego SSL split/splitless Chromatogram pestycydów chloroorganicznych w śladowym stężeniu (wzglednie duża objętość rozpuszczalnika) 14

15 Dozownik pirolizacyjny Dozownik umożliwiający wprowadzenie całości próbki do wnętrza kolumny kapilarnej on-column Dozownik PTV z elektrycznym grzaniem Dozownik PTV z grzaniem powietrzem 15

16 Pompy do HPLC Schemat systemu izokratycznego HPLC Dozownik pętlicowy Schemat chromatografu gazowego Dozownik Kolumna kapilarna System przetwarzania danych Butla z gazem nośnym Termostat C Detektor 16

17 Chromatografia gazowa Detektor cieplno - przewodnościowy Rozdział na kolumnach kapilarnych Rozdział na kolumnach pakowanych Detektory: Płomieniowo jonizacyjny Wychwytu elektronów Płomieniowo fotometryczny Termojonowy (TID) Fotojonizacyjny Cieplno przewodnościowy Spektrometrii mas FID ECD FPD NPD PID TCD MS, MS/MS, HRMS Względne przewodnictwo cieplne Związek CCl4 Benzen Heksan Argon Metanol Azot Hel Wodór Względne przewodnictwo Detektor płomieniowo-jonizacyjny FID 17

18 Detektor wychwytu elektronów ECD Detektor płomieniowo-fotometryczny FPD Detektor UV-Vis z wydłużona drogą optyczną - znaczne obniżenie granicy wykrywalności Detektor emisji atomowej - AED 18

19 Źródło jonu typu EI (Electron Impact) Sektor kwadrupolowy detektora LRMS ~70 Volt Jon rezonansowy Kolektor elektronów Jon nie rezonansowy Pole elektryczne + Cząsteczki obojętne + Jony dodatnie Z kolumny _ do analizatora + + Detektor e - e - e - _ elektrony Źródło jonu Filament Soczewka zbierająca jony Zasilanie DC/AC 19

20 Sektor magnetyczny spektrometru HRMS Chromatografia cieczowa HPLC Źródło jonu Tor jonu rejestrowanego Tor jonu nie rejestrowanego (jon za lekki) S Detector N Tor jonu nie rejestrowanego elektomagnes (jon zbyt ciężki) Rozdział na kolumnach z fazą polarną układ faz normalnych Rozdział na kolumnach z fazą niepolarną układ faz odwróconych Detektory: Spektrofotometryczny UV-VIS, DAD Fluorescencyjny FLD Spektrometrii mas LC-MS Elektrochemiczne: Konduktometryczny Potencjometryczny Spektrometria mas Detektor UV-VIS (DAD): H 3 C N C O O C N H C C C H 3 N N C H Spektrometr mas 1 ng analitu Widmo masowe 194 Intensywność jonu Masa jonu (amu) 0

21 Mechanizmy fragmentacji (EI 70 ev) Pomiar wartości sygnałowej: Całkowity prąd jonowy TIC pomiar sygnału od wszystkich jonów docierających do dynody konwersyjnej. Stosowany jako uniwersalny sposób detekcji Sygnał od wybranych jonów pierwotnych SIM, SIS Pomiar sygnału od jednego, wybranego jonu charakterystycznego dla oznaczanego związku zwykle jonu molekularnego M +. Duża selektywność. Sygnał od jonu wtórnego przy warunku obecności jonu pierwotnego (SIM) CID, SRM Jednoczesny pomiar sygnału od jonu wtórnego, powstałego z rozpadu kolizyjnego z atomem He jonu pierwotnego Bardzo duża selektywność sygnałowa! Metody jonizacji: 1. Elektronami termicznymi Electron Ionisation EI. Chemiczna Chemical Ionisation CI 3. Chemiczna ujemna Negative Chemical Ionisation NCI 4. Jonizacja polem Field Ionisation FI 5. Desorpcja polem Field desorption FDI 6. Elektrohydrodynamiczna EHI 7. Termospray TSP 8. Elektrospray ESP 9. Jonosprej - ISP Porównanie widm m/z dla metylo-tolclofosu w jonizacji chemicznej dodatniej CI oraz EI 1

22 Jonizacja w metodach MS i HPLC MS desorpcja laserowa MALDI Często w układzie TOF MS Konstrukcja pułapki jonowej (Ion Trap) ITD

23 Schemat działania spektrometru mas z analizatorem czasu przelotu jonu TOF Time-Of-Flight Obraz (widmo) fragmentacyjny 4,4 DDT przy EI = 70eV Obraz (widmo) fragmentacyjny Etylobenzenu przy EI = 70eV Obraz fragmentacyjny heksachlorobenzenu przy EI = 70eV 3