OCENA PRZYDATNOŚCI TECHNIK MOLEKULARNYCH W DIAGNOSTYCE ZIELONYCH PLEŚNI W UPRAWACH PIECZARKI (AGARICUS BISPORUS)

Transkrypt

1 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 50 (3) 2010 OCENA PRZYDATNOŚCI TECHNIK MOLEKULARNYCH W DIAGNOSTYCE ZIELONYCH PLEŚNI W UPRAWACH PIECZARKI (AGARICUS BISPORUS) KRZYSZTOF PUDEŁKO, SZYMON PYŻALSKI Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu Katedra Biochemii i Biotechnologii Wołyńska 35, Poznań bioline@home.pl I. WSTĘP Na przestrzeni ostatnich 20 lat obserwuje się w Polsce znaczącą intensyfikację produkcji pieczarek. W 2006 roku Polska stała się drugim pod względem wielkości producentem ( t rocznie) nieznacznie tylko ustępując Holandii ( t). W tym okresie w Polsce wielkość produkcji podwoiła się, przy jednoczesnym spadku produkcji w Wielkiej Brytanii i Francji (50%), a także w Holandii (20%) (Grogan 2008). Wraz ze zmianą struktury produkcji można również zaobserwować istotne zmiany w jej organizacji. Dochodzi do konsolidacji w większe, wydajniejsze i centralnie zarządzane gospodarstwa. W tej sytuacji szczególnego znaczenia nabiera szybka i efektywna identyfikacja zagrożeń wynikających z występowania chorób w uprawach pieczarek (Maszkiewicz 2004). Obecnie jednym z najpoważniejszych w skali świata zagrożeń dla rozwoju produkcji pieczarki jest występowanie w uprawach zielonych pleśni (ang. green mold) wywoływanych przez grzyby z rodzaju Trichoderma. Te powszechnie występujące w przyrodzie saprotroficzne organizmy glebowe dotychczas znane były w ochronie roślin jako czynniki ochrony biologicznej przed wieloma organizmami chorobotwórczymi. Stosuje się je bowiem do produkcji biopreparatów przeciwko grzybom chorobotwórczym występującym na roślinach uprawnych (Weber i wsp. 2001). W uprawie grzybów jadalnych, Trichoderma spp. atakuje zarówno podłoże z rozwijającą się grzybnią pieczarek, boczniaka i shiitake, jak i ich owocniki (Samuels i wsp. 2002). Identyfikacja szczepów wywołujących zielone pleśnie możliwa jest przy wykorzystaniu klasycznych metod fenotypowych i mikroskopowych, jednak wobec dużego zróżnicowania patogenności fenotypowo podobnych szczepów, zastosowanie metod analizy DNA wydaje się szczególnie przydatne. Początkowo opisano cztery odrębne biotypy związane z występowaniem zielonej pleśni, które zostały zaklasyfikowane w obrębie gatunku T. harzianum (Morris i wsp. 1995; Seaby 1996). Jednakże tylko dwa z tych biotypów można powiązać z istotnymi stratami w uprawach pieczarek (Th2 w Europie i Th4 w Ameryce Północnej). Dalsze badania molekularne pozwoliły na wydzielenie

2 1134 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 50 (3) 2010 odrębnego gatunku, opisywanego jako Trichoderma aggressivum (Samuels i wsp. 2002). W pracy podjęto próbę oceny przydatności metod molekularnych w identyfikacji in situ grzybów gatunku T. aggressivum i wywołujących zielone pleśnie w uprawach pieczarek w Polsce. II. MATERIAŁ I METODY Izolacja szczepów T. aggressivum: Szczepy izolowano inokulując stałą pożywkę PDA (agar ziemniaczano-glukozowy) z dodatkiem tetracykliny (17,5 mg/l) fragmentami porażonej okrywy. Wybrane zostały obszary okrywy wyraźnie pokryte zielonymi zarodnikami. Grzybnię o morfologii odpowiadającej T. aggressivum pasażowano do uzyskania czystej linii. Wzrost grzybni prowadzono w 28 C z ograniczonym dostępem światła. Izolacja DNA: Zieloną pleśń przenoszono następnie do 50 ml płynnej pożywki PD i hodowlę prowadzono na wytrząsarce z prędkością 90 obr./min w temperaturze 28 C. Dwa ml płynnej hodowli wirowano i po zlaniu supernatantu zalewano 1 ml buforu do izolacji (20 mm Tris-HCl ph 7,8; 100 mm chlorek litu; 10 mm EDTA; 0,5% siarczan dodecylu sodu), homogenizowano przy pomocy mikrotłuczka przez 1 minutę i przenoszono na 5 minut do lodówki. Do lizatu dodano równą objętość PCI (fenol//alkohol izoamylowy w proporcji 30 : 29 : 1) i wytrząsano do połączenia faz poczym wirowano przez 15 minut przy 14 g. Czynność ekstrakcji powtarzano do uzyskania przejrzystej fazy wodnej. DNA wytrącano równą ilością izopropanolu, wirowano 15 min przy 14 g, suszono i rozpuszczono przez noc w 50 μl wody destylowanej. Reakcja PCR: Reakcję prowadzono w 20 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 1 bufor PCR (20 mm Tris-HCl ph 8,4; 50 mm KCl), 2 mm MgCl 2, 0,1 mm każdego z deoksynukleotydów, 0,2 μm każdego ze starterów, 1 U polimerazy Taq DNA (Novazym AllegroTaq), 20 ng DNA. Parametry reakcji: 94 C przez 1 min, następnie 35 cykli amplifikacji denaturacja 94 C przez 1 min; 1 min przyłączanie starterów; synteza przez 1 min w 72 C; po 35 cyklach prowadzono końcową syntezę w 72 C przez 5 min. Sekwencję stosowanych starterów i temperatury przyłączania przedstawiono w tabeli 1. Tabela 1. Sekwencja i temperatura przyłączania starterów wykorzystane w reakcjach PCR Table 1. Primers and annealing temperature used in PCR Reakcja Reaction PCR dla for T. aggressivum RAPD dla for T. aggressivum Starter Primer Sekwencja 5-3 Sequence 5-3 Temp. przyłączania starterów Annealing temperature ThF CGGTGACATCTGAAAAGTCGTG 60 C ThR TGTCACCCGTTCGGATCATCCG 60 C OPA13 CAGCACCCAC 35 C Literatura Reference Chen i wsp Chen i wsp Chen i wsp. 1999

3 Ocena przydatności technik molekularnych 1135 Elektroforeza produktów: Rozdział elektroforetyczny prowadzono w aparacie SUBDNA w 1% żelu agarozowym (Promega Agarose LE Analytical Grade) z dodatkiem bromku etydyny w stężeniu 1 ng/μl, przy napięciu 90 V przez 1 godzinę. Zawiesina zarodników do reakcji PCR: Porównano dwie metody. W pierwszej zawiesina była zamrożona w 20 C, a następnie inkubowana w 95 C przez 10 minut. W drugiej występowała jedynie inkubacja w 95 C. Do PCR użyto 1 μl zawiesiny na reakcję. Przygotowanie substratu do PCR: Porównano kilka wersji różnych etapów procedury składającej się z: degradacji, ekstrakcji i precypitacji DNA. W przypadku degradacji stosowano zawieszanie zarodników w buforze ekstrakcyjnym oraz wodzie i następujące traktowanie: mrożenie w 20 C i inkubację w łaźni wrzącej, wyłącznie inkubację w łaźni wrzącej oraz homogenizację mechaniczną przy użyciu mikrotłuczka. Ekstrakcję przeprowadzano przy użyciu równej objętości u lub równej objętości PCI. W obu przypadkach wytrząsano mieszaninę przez 2 min i wirowano przy 14 g przez 15 minut. Wytrącano przy użyciu równej objętości etanolu przez 1 godzinę w 20 C. Wirowano przez 15 min przy 14 g, przemywano 70% etanolem, suszono i rozpuszczano w wodzie. Przygotowanie kompostu i okrywy do PCR: 10 g kompostu lub okrywy umieszczono w autoklawowanym moździerzu i zalano ciekłym azotem. Po odparowaniu całej cieczy masa była rozcierana do postaci drobnego proszku. Roztartą masę zawieszano w buforze TE+T (20 mm Tris-HCl ph 7,8; 10 mm EDTA; 1% Triton) i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 4 C z okresowym wytrząsaniem. III. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE W prezentowanej pracy podjęto próbę wykorzystania technik molekularnych opartych na analizie produktów PCR do identyfikacji T. agressivum. Równolegle analizowano przydatność metod opartych na amplifikacji DNA metodą PCR do analizy in situ ognisk chorobowych. W celu weryfikacji przydatności metody opisanej przez Chen i wsp. (1999) oczyszczono szczepy z chorobowych ognisk zielonej pleśni z dwóch pieczarkarni z rejonu Wielkopolski. W przypadku prowadzenia amplifikacji metodą PCR z wykorzystaniem wyizolowanego i oczyszczonego DNA tych szczepów uzyskano zadawalające i powtarzalne rezultaty, obserwując na elektroforogramie pojedyncze prążki odpowiadające cząsteczkom DNA wielkości około 450 pz. Te charakterystyczne produkty reakcji pozwalają odróżnić szczepy T. agressivum od grzybów należących do innych gatunków rodzaju Trichoderma (T. harzianum), w przypadku których nie uzyskano produktów PCR przy amplifikacji DNA z zastosowaniem identycznych starterów (ThRi ThF) w takich samych warunkach reakcji (rys. 1A). Analiza RAPD pozwala na stwierdzenie, że badana grupa izolatów nie jest jednorodna i składa się zarówno ze szczepów klasyfikowanych w obrębie T. aggressivum f. europeanum (rys. 1B, linia 2 i 4), jak i innych, prawdopodobnie należących do T. aggressivum f. aggressivum (rys. 1B, linia 3).

4 1136 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 50 (3) 2010 Rys. 1. A Elektroforogram produktów PCR w żelu agarozowym, M wzorzec 1kb, 18 badane izolaty, 9 T. harzianum, 10 kontrola negatywna, B Elektroforogram produktów RAPD w żelu agarozowym, M wzorzec 1kb, 1 kontrola negatywna, 24 badane izolaty Fig. 1. A Electrophoresis of PCR products in agarose, M 1kb marker, 18 analyzed isolates, 9 T. harzianum, 10 negative control, B Electrophoresis of RAPD products in agarose, M 1kb marker, 1 negative control, 24 analyzed isolates Po potwierdzeniu przydatności podstawowych założeń metody do identyfikacji szczepów izolowanych z polskich pieczarkarni oceniano jej przydatność do analizy in situ zakażeń T. aggressivum w warunkach produkcyjnych. W tym celu przeprowadzono szereg analiz PCR z wykorzystaniem różnych sposobów uzyskania matrycy DNA do amplifikacji. Porównywano wydajność amplifikacji oczyszczonego DNA, preparatów uzyskanych z materiału biologicznego hodowanego w warunkach laboratoryjnych (z pominięciem czasochłonnego etapu oczyszczania DNA), preparatów pobranych w warunkach produkcyjnych (z pominięciem etapu namnażania) bezpośrednio z porażonej powierzchni okrywy, z okrywy w przekroju i z podłoża. Szczegółowe zestawienie źródeł materiału do amplifikacji, zastosowanych metod przygotowania preparatów i wydajności amplifikacji zestawiono w tabeli 2. Uzyskane wyniki wskazują na to, że metoda analizy patogenów wywołujących zieloną pleśń w uprawach pieczarek może być z powodzeniem zastosowana w tych przypadkach, gdy jest dostępny materiał nie zanieczyszczony kompostem lub nadmierną ilością okrywy, zwłaszcza do kontroli efektywności dezynfekcji pomieszczeń i czystości powietrza w czasie zagrzybiania kompostu i w momencie jego dostawy do odbiorców końcowych. W procesie produkcji podłoża kompostownie standardowo korzystają z posiewów z powietrza i posiewów z kompostu w celu weryfikacji jakości. We wszystkich tych przypadkach molekularna identyfikacja patogenów należących do T. aggressivum może być z powodzeniem zastosowana. Natomiast metoda ta napotyka na istotne ograniczenia jako bezpośredni sposób (z pominięciem etapu posiewu na pożywki) identyfikacji patogenów obecnych w kompoście i okrywie. Podczas, gdy możliwa jest amplifikacja

5 Ocena przydatności technik molekularnych 1137 Tabela 2. Matryce do PCR i efektywność amplifikacji Table 2. PCR matrix and amplification efficiency Źródło DNA do PCR DNA Source for PCR DNA oczyszczony Isolated DNA Zarodniki z grzybnią z hodowli na pożywce stałej Spores and mycelium from solid medium Zarodniki i grzybnia z powierzchni okrywy Spores and mycelium from casing surface Zakażona okrywa Infected casing Zakażony kompost Infected compost Metoda przygotowania Preparation method izolacja DNA DNA isolation zawiesina wodna water suspension Dodatkowe oczyszczanie Additional treatment PCI; wytrącanie PCI; precipitation Wydajność amplifikacji Amplification efficiency PCI + ++ PCI PCI bardzo dobra wydajność very good efficiency, ++ dobra wydajność good efficiency, + słaba wydajność poor efficiency, brak produktów PCR lack of PCR products

6 1138 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 50 (3) 2010 DNA z kolonii pobranych bezpośrednio z powierzchni okrywy, to prawdopodobna obecność w kompoście dużej ilości rozpuszczalnych w wodzie inhibitorów polimerazy DNA uniemożliwia przeprowadzenie efektywnej amplifikacji w preparatach pobranych bezpośrednio z podłoża do produkcji. IV. PODSUMOWANIE 1. Prezentowane wyniki wydają się potwierdzać przydatność technik molekularnych do analizy występujących w polskich pieczarkarniach przypadków zielonej pleśni. Opracowane przez Chen i wsp. (1999) zestawy starterów do PCR pozwalają zarówno na klasyfikację gatunkową, jak i różnicowanie szczepów T. agressivum wywołujących tę chorobę. 2. Metoda ta ma jednak swoje ograniczenia. Pozwala na analizę i klasyfikację szczepów hodowanych na pożywkach stałych oraz w ograniczonych przypadkach także pobranych wprost ze stanowisk produkcyjnych. Bezpośrednie próby analizy czystości mikrobiologicznej podłoża i okrywy, podjęte przez autorów nie zakończyły się powodzeniem. Wydaje się, że wobec prawdopodobnej obecności w podłożu do produkcji pieczarek dużej ilości substancji wykazujących aktywność inhibitorów polimerazy DNA stosowanej w reakcji PCR konieczne jest opracowanie skutecznej metody oczyszczania prób kompostu z takich substancji. 3. Prezentowane wyniki wydają się również wskazywać na obecność w polskich pieczarkarniach szczepów klasyfikowanych zarówno w obrębie T. aggressivum f. europeanum, jak i T. aggressivum f. aggressivum. V. LITERATURA Chen X., Romaine C.P., Tan Q., Schlagnhaufer B., Ospina-Giraldo M.D., Royse D.J., Huff D.R A PCR-based genotyping of epidemic and preepidemic Trichoderma isolates associated with green mold of Agaricus bisporus. Appl. Environ. Microbiol. 65: Grogan H.M Changes and challenges for the Irish mushroom Industry. Mushroom Business 28: Maszkiewicz J Rola monitoringu w zwalczaniu zielonej pleśni Trichoderma. Biuletyn Producenta Pieczarek. Pieczarki 2: Morris E., Doyle O., Clancy K.J A profile of Trichoderma species I mushroom compost production. p In: Science and Cultivation of Edible Fungi (T.J. Elliot, ed.). Balkema, Rotterdam. Samuels G.J., Dodd S.L., Gams W., Castlebury L.A., Petrini O Trichoderma species associated with the green mold epidemic of commercially grown Agaricus bisporus. Mycologia 94: Seaby D.A Differentiation of Trichoderma taxa associated with mushroom production. Plant Pathol. 45: Weber Z., Orlikowski L., Grajek W., Werner M., Frużyńska-Jóźwiak D Trichoderma biopreparates in the control of Fusarium oxysporum Schlecht. Bull. Pol. Acad. Sci., Biol. Sci. 49 (3):

7 Ocena przydatności technik molekularnych 1139 KRZYSZTOF PUDEŁKO, SZYMON PYŻALSKI EVALUATION OF MOLECULAR METHODS USE FOR THE GREEN MOLD DIAGNOSIS IN MUSHROOM (AGARICUS BISPORUS) CROPS SUMMARY The aim of the presented studies was to evaluate the usefulness of previously described method for the diagnosis of green mold in Polish mushroom-growing cellars. The PCR analysis showed the possibility of its use for distinguish Trichoderma aggressivum strains, occurring in mushroom crops. Molecular differences among green mold isolates were stated. They showed DNA band pattern characteristic for T. aggressivum f. europeanum as well as different pattern, suggesting the presence of strains belonging to T. aggressivum f. aggressivum. We successfully amplified purified DNA as well as DNA from purified cells suspension and cells collected on the casing surface while were not able to obtain PCR product from compost and casing suspensions. Key words: green mold, Trichoderma aggressivum, Agaricus bisporus, mushrooms, PCR