Kraków, dnia r.

Transkrypt

1 Prof. dr hab. Jadwiga Szostak-Kot, prof. zw. UEK Katedra Mikrobiologii Wydział Towaroznawstwa Uniwersytet Ekonomiczny w Krakowie Kraków, dnia r. RECENZJA rozprawy doktorskiej mgr inż. Katarzyny Marchwińskiej pt. "Projektowanie dodatków paszowych z wykorzystaniem bakterii fermentacji mlekowej" napisanej pod kierunkiem dr hab. inż. Danieli Gwiazdowskiej Podstawą opracowania niniejszej recenzji jest pismo Dziekana Wydziału Towaroznawstwa Uniwersytetu Ekonomicznego w Poznaniu prof. dr hab. inż. Ryszarda Zielińskiego, prof. zw. UEP z dnia 29 listopada 2016 roku. Problematyka, która jest przedmiotem rozprawy doktorskiej mgr inż. Katarzyny Marchwińskiej, jest aktualna i wpisuje się w szeroki nurt badań nad probiotykami i ich zastosowaniami. Dotyczy wykorzystania bakterii mlekowych w dodatkach paszowych przeznaczonych dla trzody chlewnej i drobiu. Bakterie te mają olbrzymi potencjał metaboliczny i zainteresowanie nimi od jakiegoś czasu znacząco wzrosło. Znane od dawna, powodują fermentację mlekową i są składnikiem wielu produktów żywnościowych. Występują także w mikrobiomie ludzi i zwierząt, gdzie odgrywają pozytywną rolę. Przypisuje się im wiele korzystnych oddziaływań na organizm, zwłaszcza bakteriom probiotycznym, z których większość należy do bakterii mlekowych. Wiadomo, że likwidują przykre skutki uboczne wywołane przez antybiotyki i w przypadku zwierząt zaobserwowano zwiększenie przyrostu masy ciała. Bakterie probiotyczne to szczepy izolowane z przewodu pokarmowego, które muszą spełniać cały szereg wymagań związanych z bezpieczeństwem, funkcjonalnością i przydatnością technologiczną. Niewątpliwie najpopularniejszymi probiotykami są bakterie należące do rodzaju Lactobacillus, gdyż oprócz posiadania odpowiednich dla probiotyków cech można je stosunkowo łatwo hodować w warunkach tlenowych w przeciwieństwie do większości beztlenowych bakterii mikrobiomu jelitowego. Rozprawa doktorska obejmuje 180 stron w tym 24 tabele, 20 wykresów, 37 fotografii, 7 rysunków i 318 pozycji bibliograficznych krajowych i zagranicznych, (zawartych na 31 1

2 stronach). Składa się ze wstępu, części literaturowej (6 rozdziałów, 42 strony) i części doświadczalnej (4 rozdziałów, 107 stron), jak widać najobszerniejszej. Do tego dochodzi załącznik elektroniczny, zawierający szczegółowe dane doświadczalne. Część literaturowa napisana jest logicznie, jasno i ładnym językiem. Wprowadza w sposób syntetyczny do tematyki będącej przedmiotem dalszych rozważań. Znalazły się w niej zagadnienia dotyczące bezpieczeństwa zdrowotnego żywności i pasz, ponadto charakterystyka probiotyków i ich zastosowanie w żywieniu zwierząt, a także regulacje prawne, związane z dodatkami paszowymi zawierającymi probiotyki oraz przedstawiony został rynek produktów probiotycznych. Znajdują się tutaj wszystkie niezbędne informacje konieczne do zrozumienia problemu. Na koniec zaprezentowano założenia badawcze. Celem pracy było opracowanie i kompozycja nowych preparatów, zawierających w swoim składzie odpowiednio wyselekcjonowane szczepy bakterii fermentacji mlekowej, o wielokierunkowym działaniu ze szczególnym uwzględnieniem antagonizmu wobec bakterii chorobotwórczych. Preparaty będą przeznaczone dla zwierząt monogastrycznych, głównie dla trzody chlewnej i drobiu. Cele szczegółowe 1. Izolacja bakterii fermentacji mlekowej z mikrobioty jelitowej zwierząt monogastrycznych. 2. Selekcja bakterii na podstawie wytycznych FAO/WHO i wybranych wyróżników determinujących funkcjonalność szczepów. 3. Identyfikacja genetyczna wyselekcjonowanych bakterii. 4. Kompozycja biopreparatów w oparciu o bakterie dedykowane wybranym grupom zwierząt monogastrycznych i ocena wybranych właściwości technologicznych. Hipotezy badawcze 1. Właściwości funkcjonalne bakterii fermentacji mlekowej pochodzących z mikrobioty jelitowej zwierząt monogastrycznych są szczepozależne. 2. Odpowiednio wyselekcjonowane bakterie fermentacji mlekowej dają możliwość skomponowania nowych, wieloszczepowych preparatów przeznaczonych do określonych grup zwierząt monogastrycznych. 3. Zaproponowane, nowe preparaty mogą stanowić bezpieczną alternatywę dla antybiotyków stosowanych w hodowli zwierząt monogastrycznych. 2

3 Uwaga: wydaje się, że hipoteza 1 to teza, ewentualnie wymagająca potwierdzenia, a nie udowodnienia. Wiadomo, że cechy probiotyczne są szczepozależne o czym informuje również Autorka w pracy na str. 20. Zakres badań obejmował cztery etapy: - izolację bakterii fermentacji mlekowej z mikrobiomu jelitowego prosiąt (ssących i odsadzonych) oraz brojlerów; - selekcję izolatów bakterii fermentacji mlekowej na podstawie wybranych wyróżników (aktywności antybakteryjnej, wrażliwości na antybiotyki, zdolności wytwarzania kwasów organicznych, hydrofobowości komórek); - identyfikację genetyczną wyselekcjonowanych izolatów LAB (izolacja genomowego DNA, amplifikacja genu 16SRNA i jego sekwencjonowanie, oraz identyfikacja gatunkowa); - kompozycję biopreparatów bakteryjnych w formie dodatków paszowych (dobór nośników, ocena przeżywalności bakterii po procesie liofilizacji, ocena stabilności przechowalniczej liofilizowanych biopreparatów w różnych warunkach temperaturowych i przeżywalność LAB w symulowanym przewodzie pokarmowym prosiąt (jama gębowa, żołądek, jelito cienkie) i drobiu (wole, żołądek, jelito cienkie), która była badana in vitro. Chciałabym zwrócić uwagę na końcowe rezultaty uzyskane w czterech etapach eksperymentu. W etapie pierwszym pobrany został kał od 20 prosiąt oraz 10 próbek przewodów pokarmowych kurcząt rzeźnych, w celu wyodrębnienia mikroorganizmów. W efekcie wyizolowano 700 czystych kultur bakterii, z czego 565 zakwalifikowano do bakterii mlekowych. Porównanie liczebności w różnych odcinkach przewodu pokarmowego u ptaków pokazało, że najwięcej bakterii znajduje się w jelicie ślepym. Uwaga: sądzę, że gdyby w ten sam sposób analizowano liczebność u świń byłoby podobnie. Wiadomo bowiem, że u ssaków właśnie w jelicie ślepym liczebność mikroorganizmów i różnorodność gatunków znacznie wzrasta. Szacuje się, że w mikrobiomie ludzkim liczba gatunków dochodzi tu nawet do 4000, a liczebność wrasta do 10mln/ml. Układ pokarmowy człowieka nie różni się bardzo od świńskiego. Człowiek i świnia są stworzeniami wszystkożernymi, mają proste żołądki i duże okrężnice wypełnione mikroorganizmami, które wykorzystują resztki pozostałe po trawieniu w jelicie cienkim. Dlatego sądzę, że takie domniemanie jest uprawnione. W etapie drugim przeprowadzono selekcję uzyskanych izolatów na podstawie wytycznych FAO/WHO oraz wybranych wyróżników determinujących funkcjonalność szczepów. Oceniono aktywność antybakteryjną, wrażliwość na antybiotyki, zawartość kwasów organicznych, określano wybrane właściwości enzymatyczne oraz przeżywalność w 3

4 warunkach panujących w przewodzie pokarmowym, a także hydrofobowość komórek izolatów bakterii fermentacji mlekowej. Badania te powtórzono po 18 miesiącach przechowywania. W efekcie wytypowano 30 izolatów. Uwagi: - str. 80, 14 w. od dołu jest (tab. 3 w pkt. 9.3.) ma być (tab. 3 w pkt. 7.3.), - przy serowarach Salmonella wystarczy pisać Salmonella Typhimurium, czy S. Enteritidis, a nie S. enterica ser. Typhimurium. Wiadomo, że są to serowary, a nie gatunki, gdyż drugi człon pisany jest z dużej litery. W etapie trzecim identyfikowano wytypowane izolaty metodami genetycznymi. Ostatecznie uzyskano 10 szczepów - 5 dla trzody chlewnej i 5 dla drobiu. Uwagi: - brak producenta polimerazy, przy innych odczynnikach jest on podawany, - stosuje się określenie PCR (Polymerase Chain Reaction), a nie reakcja PCR, gdyż "reakcja" jest w nazwie, - w tabeli 22 powinno być zaznaczone Accession number z bazy NCBI, - gen 16S RNA (nie 16s RNA) stanowi rodzaj kodu paskowego bakterii, po którym szybko można ją rozpoznać. Im bardziej podobne są kody genów 16S RNA tym gatunki są bliżej spokrewnione. W przypadku bakterii mlekowych, wykazujących duże podobieństwo, identyfikacja oparta na 16S RNA może być niewystarczająca. Sugerowane jest potwierdzenie identyfikacji innymi metodami. Etap czwarty poświęcony był uzyskaniu kompozycji biopreparatów dla trzody chlewnej i drobiu. W związku z tym, że przeżywalność probiotyków w przewodzie pokarmowym zależy od postaci w jakiej zostaną zaaplikowane wybrano, na podstawie prób, nośnik i dodatki. Do przygotowania preparatów bakteryjnych wykorzystano liofilizację. Następnie potwierdzono stabilność liofilizowanych bakterii podczas 30 dniowego przechowywania w zróżnicowanych temperaturach. Końcową fazą była ocena przeżywalności bakterii w przygotowanych prototypach dodatków paszowych w symulowanym układzie pokarmowym dla trzody chlewnej i dla drobiu. Efektem było przygotowanie dwu preparatów, jednego dla trzody chlewnej, drugiego dla bakterii. Uwagi: - symulowany układ przewodu pokarmowego, w obu przypadkach, obejmował odcinek od jamy gębowej do jelita cienkiego. Na str. 105 Doktorantka pisze, że "tylko odpowiednia ilość komórek docierająca do jelita grubego może wywierać korzystny wpływ na zdrowie gospodarza". I rzeczywiście, rola bakterii probiotycznych zaczyna się właściwie w jelicie 4

5 grubym. W jelicie cienkim odbywa się trawienie pokarmu przez własne enzymy i wchłanianie do krwioobiegu. Są tam oczywiście drobnoustroje, ale w znacznie mniejszej ilości niż w jelicie grubym, w którym następuje rozkład niestrawionych w jelicie cienkim resztek. Dlatego myślę, że dalszy etap badań powinien skoncentrować się na tym odcinku przewodu pokarmowego. Rozumiem, że przyjęto wynik- ile bakterii przeżyje w jelicie cienkim, tyle dostanie się do jelita grubego, tylko czy one je zasiedlą? Dlatego, jak zostało wspomniane na str. 147, dalszym etapem są badania in vitro. Należy dodać, że bardzo ważna jest nie tylko ilość mikroorganizmów, ale również stosunek poszczególnych grup do siebie. W badaniach mikrobiomu ludzkiego okazało się, że inny jest zestaw mikroorganizmów zarówno ilościowy jak i jakościowy u osób otyłych i szczupłych, a także u osób z dietą wegetariańską w porównaniu do osób mięsożernych. Wiadomym jest, że aby preparaty wprowadzić do obrotu, muszą one przejść skomplikowane procedury, o czym jest mowa w części literaturowej (str. 32). W pracy zbadano cechy probiotyków wymienione na str. 21, dotyczące bezpieczeństwa oraz częściowo cechy technologiczne i funkcjonalne, natomiast reszta pozostała do zbadania. Dalsze uwagi: - We Wstępie (str. 12) jest informacja, że w handlu znajdują się preparaty probiotyczne przeznaczone dla zwierząt hodowlanych, pochodzące z kolekcji ogólnoświatowych. Tymczasem badania naukowe podkreślają fakt, że duże znaczenie ma środowisko izolacji, gdyż mikrobiom jelit cechuje unikalny skład w zależności od organizmu. To prawda, dlatego szczepy wyizolowane w pracy też mają wobec tego zastosowanie ograniczające się tylko do wąskiego środowiska hodowlanego, nawet jeśli rozszerzyć zakres do całej Wielkopolski. Trudno wyobrazić sobie dobór probiotyków do poszczególnych województw, nie mówiąc o poszczególnych hodowlach. Jeśli korzystamy z kolekcji probiotyków to mamy dokładny opis pochodzenia szczepu, zatem wiemy czy pochodzi od zwierząt monogastrycznych czy nie i wówczas dobieramy szczepy właściwe. Ponadto, jak pisze Pani na str. 22 i 34, większość stosowanych w Polsce produktów probiotycznych jest wieloszczepowa. Stąd wynika pytanie: na czym polega konkurencyjność wyizolowanych przez Panią probiotyków w stosunku do suplementów oferowanych aktualnie na polskim rynku dodatków paszowych, o czym wspomniano na str Na str. 29 pisze Pani, że większość mechanizmów działania probiotyków na organizmy zwierząt nie została jeszcze w pełni poznana. Ja powiedziałabym, że jesteśmy dopiero na 5

6 początku poznania. Są to mechanizmy tak skomplikowane i trudne w badaniach, że do tej pory niewiele na ten temat wiemy. Oczywiście wieloletnie obserwacje potwierdzają ich dobroczynny wpływ, ale szczegółowa wiedza na ten temat jest niewielka. - Str. 31 i inne - gatunki bakteryjne podano bez nazwy rodzajowej - B. licheniformis, B. toyonesis, L. sobrius, L. paracasei. W ten sposób podaje się, gdy w pierwszym wymienionym drobnoustroju była nazwa rodzajowa - jak na str. 17 (w przypadku Salmonella). - Sama jestem bardziej przywiązana do określenia mikrobiom a nie mikrobiota, ale są to synonimy i posługiwanie się oboma terminami jest poprawne. - Uważam, że rozdział 7 jest niepotrzebnie tak rozbudowany. Czy konieczny był opis wykonania pewnych odczynników, np. roztworu soli fizjologicznej, nadtlenku wodoru, kwasu solnego itd. (str. 54 i dalsze). - Str jest proteolitycznych, ma być lipolitycznych. - Hodowle mikroorganizmów względnie beztlenowych powinny być prowadzone w anaerostatach, a nie eksykatorach. - Tab. 3 jest w rozdz a nie 9.3. jak podano na str Str. 84 w tekście jest - fot , a powinno być Str. 94, 13w. od dołu, wankomycyna została określona jako chemioterapeutyk co nie jest prawidłowe, bo chemioterapeutyki to sulfonamidy. Błędy w nazewnictwie wynikają z tłumaczeń anglojęzycznych, gdzie antibiotic to antybiotyk a antimicrobial to lek oznaczający chemioterapeutyki (często tłumaczony jako antybiotyki). Wankomycyna jest antybiotykiem i tak została wcześniej określona w tekście pracy. - Str. 103, na fot. 25 i 26 niewidoczne strefy przejaśnień - zatem zamieszczenie takich fotografii jest niecelowe. Zgłoszone przeze mnie uwagi miały na celu doprecyzowanie pewnych zagadnień, pojęć, czy sformułowań. Natomiast pytania zadane Doktorantce mają rozwiać moje wątpliwości. Nie wpływają one na pozytywną ocenę merytorycznej i formalnej strony pracy. Na zakończenie chciałabym podkreślić trafność wyboru tematu i jego aktualność. Jakość paszy dla zwierząt wpływa na jakość mięsa, które konsumujemy, a tym samym na nasze zdrowie, co ma również znaczenie ekonomiczne, związane m.in. z kosztami hodowli i ochrony zdrowia zwierząt i ludzi. Zatem treści zawarte w pracy mieszczą się w dyscyplinie towaroznawstwo. Doktorantka postawiła sobie bardzo ambitny cel, który wymagał różnorodnych badań. Metodyka badawcza została dobrana i wykorzystana prawidłowo. 6

7 Uzyskane wyniki potwierdzają duży wkład pracy, na który składa się zapoznanie z obszerną bibliografią jak i rozbudowany eksperyment. Szczegółowe i wieloetapowe badania doprowadziły do uzyskania szczepów bakterii mlekowych, które selekcjonowano zgodnie z aktualnymi wytycznymi FAO/WHO. W końcowym etapie pracy wykorzystano ostatecznie 10 szczepów - pięć dla trzody chlewnej i pięć dla drobiu. Dla trzody chlewnej wytypowano Lactobacillus paracasei KK 008, L. casei KK 033, L. paracasei KK160, L. buchneri DG 068 i Pediococcus pentosaceus DG 059. Dla drobiu wytypowano Lactobacillus rhamnosus KK 270, L. paracasei KK 281, L. buchneri DG 177, L. buchneri DG 190 i L. casei DG 213. Szczepy te znalazły się w prototypach dodatków paszowych i wykazały się wysoką przeżywalnością w symulowanych przewodach pokarmowych zarówno trzody chlewnej jak i drobiu. Zwracam uwagę, że te 10 szczepów wytypowano z początkowych 700 czystych kultur mikroorganizmów. Stąd widać ile pracy włożono, aby uzyskać szczepy, mogące służyć postawionemu celowi, który został osiągnięty. Należy zwrócić uwagę na dojrzałość w prowadzeniu dyskusji naukowej. Doktorantka prowadziła ją po każdym etapie badań, co świadczy o dobrej znajomości zagadnienia i umiejętności interpretacji wyników oraz ich konfrontacji z wynikami innych autorów. Stwierdzam, że przedłożona mi do recenzji rozprawa mgr inż. Katarzyny Marchwińskiej spełnia, pod względem merytorycznym i formalnym, wymagania ustawowe stawiane pracom doktorskim. Wnoszę do Wysokiej Rady Wydziału Towaroznawstwa Uniwersytetu Ekonomicznego w Poznaniu o jej przyjęcie i dopuszczenie Doktorantki do dalszych etapów przewodu doktorskiego. 7