Inżynieria białek I Wykład 3 (2014/2015) Magdalena Tworzydło Zakład Biochemii Fizycznej, WBBiB UJ

Transkrypt

1 Inżynieria białek I Wykład 3 (2014/2015) Magdalena Tworzydło Zakład Biochemii Fizycznej, WBBiB UJ

2 Hodowle bakteryjne produkcja białka wektor gospodarz warunki hodowli Trzy elementy składowe: gospodarz, wektor i warunki hodowli. Zmiana każdego z nich może zasadniczo zmienić wydajność syntezy i własności powstającego białka.

3 Wprowadzanie obcego DNA do komórek Transformacja pobranie ze środowiska obcego, nagiego DNA Transdukcja wprowadzenie materiału genetycznego do komórki przez faga Koniugacja transfer kwasu nukleinowego pomiędzy dwoma komórkami pozostającymi w bezpośrednim kontakcie Transfekcja wprowadzenie obcego materiału genetycznego do komórki (w przypadku komórek zwierzęcych nie stosuje się terminu transformacja, gdyż jest on zarezerwowany dla procesu spontanicznej mutagenezy i transformacji nowotworowej)

4 Kompetencja u bakterii Kompetencja stan, w którym bakterie są zdolne do pobierania obcego DNA ze środowiska naturalna uwarunkowana obecnością odpowiednich genów, kodujących białka odpowiedzialne za wiązanie, obróbkę i transport materiału genetycznego przez błonę komórkową. sztuczna wywołana w warunkach laboratoryjnych, wiąże się ze zmianą przepuszczalności błony komórkowej na skutek czynników chemicznych lub fizycznych.

5 Transformacja E. coli Szczepy E. coli nie wykazują naturalnej kompetencji, dlatego konieczne jest wprowadzenie ich w stan sztucznej kompetencji metodami chemicznymi lub/i fizycznymi ELEKTROPORACJA CaCl 2 i SZOK CIEPLNY

6 Na co możemy mieć wpływ? ekspresja genu - wydajność transkrypcji - moment startu transkrypcji - stabilność mrna wydajność translacji rozpuszczalność białka stabilność białka prawidłowe fałdowanie białka toksyczność białka wydajność oczyszczania białka

7 Powstawanie ciał inkluzyjnych Jednym z głównych problemów przy produkcji białek heterologicznych, których geny znajdują się pod kontrolą silnych promotorów jest nieprawidłowe fałdowanie tych białek i ich wytrącanie w postaci nierozpuszczalnych agregatów, tak zwanych CIAŁ INKLUZYJNYCH (inclusion bodies). Ciałka inkluzyjne (śr. 0,5 1,3 µm) mogą się formować zarówno w cytoplazmie, jak i w przestrzeni peryplazmatycznej.

8 Powstawanie ciał inkluzyjnych ZALETY ochrona białka przed działaniem komórkowych proteaz ochrona komórki przed toksycznym białkiem wygodny sposób wstępnego oczyszczania WADY czasochłonny, kosztowny i nie zawsze skuteczny proces renaturacji białka ZAPOBIEGANIE hodowla w niskiej temperaturze słabszy promotor, mniej kopii plazmidu mniejsze stężenie induktora dodatkowe białka opiekuńcze dołączanie białek fuzyjnych, które się prawidłowo fałdują i są rozpuszczalne eksport do peryplazmy

9 Usuwanie N-końcowej metioniny W ramach obróbki potranslacyjnej w komórkach E. coli dochodzi do usunięcia sygnału startu translacji. Wydajność tego procesu zależy od rodzaju aminokwasu występującego bezpośrednio po N-formylometioninie (fmet). Usuwanie N-końcowej metioniny jest częstym problemem w trakcie nadekspresji białek heterologicznych. W org. eukariotycznych fmet nie występuje w białkach cytozolowych, dlatego jej obecność jest sygnałem do aktywacji systemu immunologicznego. Sposobem na uzyskanie homogennego białka może być równoczesna ekspresja genu map kodującego aminopeptydazę metioninową. fmet jest usuwana fmet może być usunięta fmet nie jest usuwana Ala Cys Lys Gly His Arg Pro Ser Thr Met Trp Tyr Asp Glu Gln Val Leu Ile Asn Phe Na podstawie Production of recombinant proteins, edited by Gerd Gellisen 2005 Wiley-Vch Verlag GmbH & Co. Weinheim

10 Zasada N-końca (N-end rule) sygnał degradacji (degron) Występowanie na N-końcu białka aminokwasów takich jak Arg, Lys, Leu, Phe, Tyr i Trp znacząca skraca okres półtrwania białka w komórce bakteryjnej. (Arg i Lys są drugorzędowymi czynnikami obniżającymi stabilność białka u E. coli.) W proces degradacji takich białek zaangażowane są: zależna od ATP proteaza ClpAP kompleks ClpA (6 podj.) z ClpP (14 podj.) białko ClpS (monomer) rozpoznaje pierwszorzędowe destabilizujące aminokwasy (LFTW), transportuje białka do kompleksu ClpAP, wpływa na tempo degradacji białka przez kompleks ClpAP transferaza leucyny/fenyloalaniny rozpoznaje czynniki II-rzędowe i dołącza do nich leucynę lub fenyloalaninę.

11 Znakowanie uszkodzonych transkryptów transkrypt bez kodonu STOP alanina SsrA RNA Rekombinowane białko nie powinno posiadać na końcu karboksylowym sekwencji podobnej do sekwencji ANDENYALAA. przyłączenie alaniny elongacja translokacja, zmiana mrna wyznakowany polipeptyd degradacja Sekwencja ta jest w komórkach E. coli dodawana przez SsrA (small subunit ribosomal RNA, 10Sa RNA) RNA na końcach przedwcześnie zakończonych łańcuchów polipeptydowych, powstałych w wyniku translacji uszkodzonych mrna, które nie posiadają kodonów STOP i służy jako sygnał degradacji przez specyficzne proteazy ClpAP i ClpXP.

12 Tworzenie wiązań disiarczkowych Wiązania disiarczkowe zwykle nie występują w białkach cytoplazmatycznych, za to ich tworzenie jest często niezbędnym krokiem w procesie fałdowania białek wydzielanych na zewnątrz komórki (ponad 300 peryplazmatycznych E. coli zawiera wiązania disiarczkowe). U E. coli środowisko komórki ma charakter redukujący dzięki obecności tioredoksyn (Trx) oraz glutaredoksyn (Grx). Enzymy te utrzymywane są w formie zredukowanej przez reduktazę tioredoksyny (TrxB) oraz glutation, który z kolei ulega redukcji za pośrednictwem oksydoreduktazy glutationu (Gor). Do rodziny białek Dsb odpowiedzialnych za tworzenie wiązań disiarczkowych w peryplazmie należą: DsbA, DsbB oraz izomerazy DsbC, DsbD i DsbG.

13 W peryplazmie E. coli SH SH S S Forma zredukowana białka DsbA Forma utleniona DsbA Forma utleniona białka S S SH SH DsbA Forma zredukowana DsbA Na podstawie Protein Folding Handbook, Part II. Edited by J. Buchner and T. Kiefhaber, 2005 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

14 W peryplazmie E. coli DsbA DsbA S S HS HS 2eˉ S S 2eˉ SH SH 2eˉ S S SH SH S S S S Chinon (Q) Recykling DsbA DsbB

15 W peryplazmie E. coli SH SH SH HS SH HS DsbC HS S S SH SH S S S SH S S SH DsbC DsbC SH SH HS SH S S Izomeryzacja wiązań disiarczkowych DsbC

16 What a difference a strain makes What a diff rence a day makes słowa piosenki o tym tytule zostały opublikowane przez Stanleya Adamsa w roku Piosenka zdobyła największą popularność w latach 50-tych, w wykonaniu Dinah Washington ( Nazwa szczepu Modyfikacje Korzyści BL21 BL21 (DE3) Origami Rosetta BL21(DE3)LysS/E Arctic Express brak genów ompt i lon dla proteaz gen dla polimerazy T7 mutacje w obrębie genów trxb i gor plazmid (prare) z genami kodującymi trna dla rzadkich kodonów E. coli wektor LysS lub LysE z genem kodującym lizozym wektor z białkami opiekuńczymi Cpn10 i Cpn60 z psychrofilowej bakterii Oleispira antarctica zwiększenie stabilności syntetyzowanych białek synteza białek pod kontrolą promotora T7 tworzenie mostków disiarczkowych w cytoplazmie wydajniejsza ekspresja białek eukariotycznych zawierających kodony AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA kontrola aktywności polimerazy faga T7, ochrona przed przeciekaniem promotora lac produkcja białek w niższej temperaturze ogranicza tworzenie ciał inkluzyjnych

17 What a difference a strain makes

18 What a difference a strain makes C41(DE3),C43(DE3), tzw.szczepy Walkera (nie)zidentyfikowana/e mutacje synteza toksycznych i błonowych białek rekombinowanych S. Wagner at al., 2008 Tuning Escherichia coli for membrane protein overexpression. PNAS, (105)

19 Produkcja białek Transformacja wprowadzenie wektora ekspresyjnego (np. z serii pet) do wybranego szczepu ekspresyjnego E. coli Założenie płynnej hodowli matki z pojedynczej kolonii bakteryjnej w niewielkiej objętości pożywki ( ml) Zaszczepienie hodowlą matką dużej objętości pożywki (1 2 l) Prowadzenie hodowli do momentu uzyskania odpowiedniej gęstości optycznej (pomiar OD 600 ) Indukcja (w zależności od rodzaju promotora): dodanie induktora, np. IPTG (represor lac), podwyższenie temperatury hodowli (represor I z faga λ) zmiana pożywki (represor Trp) Monitorowanie wzrostu hodowli (pomiar OD 600 ) Pobieranie próbek do późniejszego oznaczenia profilu ekspresji (SDS-PAGE) Zakończenie hodowli zwirowanie bakterii (zamrożenie osadu) temperatura antybiotyki wymiana pożywki stężenie induktora mieszanie napowietrzenie

20 Produkcja białka Szczep E. coli Origami B(DE3) Wektor petduet-1/dsbc/blgb Rozprawa doktorska. Joanna Loch Badania strukturalne oddziaływań β-laktoglobuliny ze związkami o działaniu biologicznym, Kraków 2011

21 Inżynieria białek I Wykład 4 (2014/2015) Magdalena Tworzydło Zakład Biochemii Fizycznej, WBBiB UJ

22 Wydzielanie białek do peryplazmy

23 Wydzielanie białek do periplazmy ZALETY możliwość tworzenia wiązań disiarczkowych ochrona białka przed działaniem cytoplazmatycznych proteaz usunięcie N-końcowej metioniny przy okazji usuwania sekwencji sygnałowej ochrona komórki przed toksycznym działaniem syntetyzowanego białka PROBLEMY transport przez błonę stanowi wąskie gardło przy produkcji białka spod silnych promotorów możliwość utknięcia transportowanych białek w błonie śmierć komórki ograniczona wielkość transportowanych białek powstanie niewłaściwych wiązań disiarczkowych nieprawidłowe fałdowanie powstawanie ciałek inkluzyjnych

24 Wydzielanie białek do peryplazmy Około 25 30% białek bakteryjnych występuje w błonie komórkowej lub jest wydzielana do peryplazmy. Są one transportowane przez jeden z dwóch systemów sekrecji. Pierwsza ścieżka to związany z błoną system Sec, na który składają się białka SecY, SecE, SecG oraz SecA. cytoplazma SRP/FtsY peryplazma SecYE SecYEG SecA/SecB Do przejścia przez błonę konieczna jest: - sekwencja sygnałowa (18-30 aa): dodatnio naładowany N-koniec, hydrofobowa część środkowa i miejsce cięcia dla proteaz - luźna konformacja białka (ochrona przez białko SecB i inne białka opiekuńcze). Przy przechodzeniu przez błonę sekwencja sygnałowa zostaje odcięta. W peryplazmie znajduje się osobny zestaw białek opiekuńczych ułatwiających poprawne fałdowanie oraz białka odpowiedzialne za powstawanie wiązań disiarczkowych.

25 Wbudowywanie białek w błonę Integralne białka błonowe do wbudowania w dwuwarstwę lipidową potrzebują: - nieodtrawialnej sekwencji zakotwiczającej, - kompleksu SRP (signal recognition particle), - białka FtsY. cytoplazma Do rozpoznania sekwencji sygnałowej przez SRP dochodzi w trakcie syntezy białka na rybosomie. Syntetyzowany łańcuch transportowany jest do kanału YE przez białko FtsY. SRP/FtsY SecYE peryplazma SecYEG SecA/SecB

26 Wydzielanie białek do peryplazmy Druga ścieżka: system sekrecji TAT (Tween Arginine Translocation) kodowany przez geny tatabce. Transport białek sfałdowanych w cytoplazmie charakterystyczna sekwencja sygnałowa: Ser/Thr Arg Arg X F Leu Lys Translocation of Jellyfish Green Fluorescent Protein via the Tat System of Escherichia coli and Change of Its Periplasmic Localization in Response to Osmotic Up-shock JBC November 30, 2000 C. Santini, A. Bernadac, M. Zhang, A. Chanal, B. Ize, C. Blanco, L. FeiWu A GFP z sygnałem translokacji. Ekspresja w niezmutowanych komórkach B GFP z sygnałem translokacji. Ekspresja w komórkach z delecją genu tatc. (Białka TatBC odpowiadają za rozpoznanie sekwencji sygnałowej natomiast białko TatA tworzy kanał transportujący).

27 Zmiany w ogólnym profilu ekspresji genów pod wpływem produkcji białka rekombinowanego Bardzo wysoki poziom ekspresji jednego genu może prowadzić do wyraźnych zmian w ogólnym profilu ekspresji genów w komórce. Średnio 6% genów ulega w takiej sytuacji ponad trzykrotnie wyższej ekspresji. Nieprawidłowe fałdowanie nowopowstającego białka wywołuje w komórce reakcję podobną do reakcji na szok cieplny. Silnej indukcji podlegają geny dla białek opiekuńczych (m.in. DnaK, DnaJ, GrpE, GroEL, GroES), które umożliwiają ponowne fałdowanie białek, zapobiegają agregacji źle sfałdowanych białek, rozpuszczają agregaty białkowe, oraz wykazują aktywność proteolityczną.

28 Fałdowanie białek u E. coli Białka opiekuńcze, czaperony wysoce konserwowane cząsteczki o zbliżonej strukturze i funkcji występujące w obrębie wszystkich królestw. Ochraniają hydrofobowe części nowopowstających białek, zapobiegając ich agregacji i wytrąceniu. Foldazy enzymy odpowiedzialne za katalizowanie reakcji, niezbędnych do tego, by nowopowstające białka osiągnęły właściwą konformację. Do reakcji takich zalicza się tworzenie i izomeryzację wiązań disiarczkowych (białka PDI) oraz izomeryzację wiązań peptydylo-prolilowych (białka PPI).

29 Izomeryzacja wiązań peptydylo-prolilowych Konformacja trans jest korzystniejsza energetycznie i występuje w ponad 99% wszystkich wiązań peptydowych. Jednak w przypadku proliny stabilność konformacji trans i cis jest porównywalna w związku z tym obie konformacje są spotykane w białkach natywnych. cis trans Ze względu na wysoką energię aktywacji izomeryzacja cis-trans wiązań peptydylowych przy N-końcu proliny jest jednym z etapów najbardziej ograniczających szybkość reakcji fałdowania białek. Około 10% wiązań prolilowych w białkach przyjmuje konformację cis. Rodzaj konformacji w jakiej występuje określona reszta proliny jest charakterystyczna dla danego białka.

30 Czynnik inicjujący TF (Trigger Factor) Oprócz białek opiekuńczych obecnych w cytoplazmie zidentyfikowano również białko opiekuńcze związane z rybosomem. Łączy się ono z nowosyntetyzowanym peptydem natychmiast po tym, jak wyłania się on z tunelu w rybosomie. W komórkach z delecją genu tig, hodowanych w temperaturze C nie stwierdzono ani obniżonego tempa wzrostu ani też zaburzeń w fałdowaniu nowopowstających białek. Podobnie było w przypadku bakterii z delecją genu dnak, które rosły w przedziale temperatur od 15 do 37 C. Jednak równoczesna delecja w/w genów powodowała śmierć komórek. Wniosek: DnaK i TF współdziałają ze sobą w procesie fałdowania nowopowstałych białek.

31 Czynnik inicjujący TF (Trigger Factor) Czynnik TF posiada aktywność cis/trans peptydylo-prolilo izomerazy (PPI). W rozpoznawanych przez TF sekwencjach nie musi jednak występować prolina. DnaK oraz czynnik TF rozpoznają podobne motywy w białkach których fałdowanie nadzorują: są to fragmenty o charakterze hydrofobowym, obdarzone ładunkiem dodatnim. TF wiąże się przede wszystkim z białkami o masie powyżej 60 kda, białka takie stanowią do 20% proteomu E. coli.

32 Czynnik inicjujący TF (Trigger Factor) TF ma masę 48 kda i składa się z 432 aa. Wyróżnia się w nim trzy domeny: 1-sza, N-końcowa (1 110 aa) 2-ga, domena o aktywności PP-izomerazy ( aa) 3-cia, domena łącząca ( aa i aa) W obrębie domeny N-końcowej występuje sekwencja GFRXGXXP odpowiedzialna za wiązanie białka do podjednostki 50S rybosomu (a dokładniej do rybosomowego białka L23, występującego przy wyjściu tunelu translacyjnego). TF wiąże się z rybosomem jako monomer. Dimer TF The crystal structure of ribosomal chaperone trigger factor from Vibrio cholerae PNAS, September 14, 2004 Anthony V. Ludlam, Brian A. Moore, and Zhaohui Xu

33 Czynnik inicjujący TF (Trigger Factor) model działania TF tworzy osłoniętą, bezpieczną kieszeń dla łańcucha polipeptydowego wyłaniającego się z tunelu rybosomu. Powinowactwo TF do kompleksu rybosom-łańcuch potomny białka (ribosome-nascent chain complex, RNC) wzrasta w momencie pojawienia się w obrębie łańcucha polipetydowego hydrofobowych reszt aminokwasowych 1. Gdy tylko dostępna jest wystarczająca informacja o sekwencji pierwsza domena powstającego białka przybiera konformację natywną. 2. W procesie fałdowania, hydrofobowe reszty aminokwasowe zostają schowane wewnątrz białka w konsekwencji TF traci powinowactwo do kompleksu RNC i oddysocjowuje od rybosomu. 3. W przypadku białek wielodomenowych TF może się ponownie połączyć z kompleksem RNC i asystować przy fałdowaniu kolejnej domeny w białku

34 Białko opiekuńcze DnaK DnaK z E. coli należy do rodziny białek Hsp70. W optymalnych dla wzrostu bakterii warunkach DnaK stanowi około 1% białek cytoplazmatycznych. Pod wpływem stresu jego poziom wzrasta do 3%. W bakteriach z delecją genu dnak wzrost temperatury skutkuje agregacją i wytrąceniem 15 25% białek wewnątrzkomórkowych. Oprócz zapobieganiu agregacji i rozpuszczaniu powstałych agregatów białkowych DnaK jest także zaangażowane w proces fałdowania nowosyntetyzowanych białek. Ta jego funkcja może być częściowo zastąpiona przez inne białka opiekuńcze występujące w cytoplazmie (m. in. TF). Konformacja DnaK i związany ze zmianą konformacji mechanizm działania białka zależy, podobnie jak w przypadku wielu innych czaperonów, od obecności ATP.

35 Białko opiekuńcze DnaK W skład białka DnaK wchodzą dwie domeny: Domena N-końcowa DnaK Na podstawie Protein Data Bank, 1DKG Domena C-końcowa DnaK Na podstawie Protein Data Bank, 1DKX Domena C-końcowa (25 kda) posiada hydrofobową szczelinę i jest odpowiedzialna za wiązanie substratów (niesfałdowanych polipeptydów). Białko DnaK w kompleksie z GrpE

36 Białko opiekuńcze DnaK (Hsp 70) Przyłączanie i odłączanie polipeptydów jest kontrolowane przez zmiany strukturalne, do jakich dochodzi pod wpływem wiązania i hydrolizy ATP. DnaK działa we współpracy z dwoma dodatkowymi czynnikami: białkiem DnaJ i czynnikiem wymiany nukleotydu GrpE. W DnaJ (40 kda) wyróżnia się 4 domeny: pierwsza domena J jest wysoce konserwowana ewolucyjnie, odpowiada za stymulację aktywności ATP-azowej DnaK, druga jest bogata w reszty glicyny i fenyloalaniny (G/F), trzecia zawiera reszty cysteinowe wiążąca jony cynku, czwarta domena karboksylowa działająca jak białko opiekuńcze, gdyż rozpoznaje hydrofobowe fragmenty polipeptydów.

37 Białko opiekuńcze DnaK (Hsp 70) DnaJ, za pośrednictwem C-końca, wiąże substrat (S) i transportuje go do DnaK. DnaJ-S stymuluje hydrolizę ATP związanego z DnaK. H 2 0 DnaJ DnaK związane z ADP łączy się mocno z polipeptydem (S) ATP-DnaK + S (ATP-DnaK)-S DnaK związane z ATP charakteryzuje się szybkim wiązaniem i uwalnianiem polipeptydu (S) ATP GrpE ADP + P i (ADP-P i -DnaK)-S Odłączenie prawidłowo sfałdowanego białka wymaga uwolnienia ADP, dysocjacja ADP od DnaK jest wspomagana przez GrpE Najczęściej proces fałdowania nie kończy się na jednym cyklu i białka, aby osiągnąć prawidłową konformację przestrzenną, muszą być poddane kilku cyklom zwijania z udziałem DnaK i białek współdziałających lub przekazane do innego systemu białek opiekuńczych celem ukończenia procesu fałdowania.

38 Chaperoniny I GroEL/(Hsp60) Widok z góry Widok z boku Duże (800 kda) oligomeryczne białko w kształcie cylindra, złożone z dwóch pierścieni, na które składa się 14 identycznych podjednostek o masie 57 kda. System GroEL/GroES uczestniczy w fałdowaniu de novo około 10% bakteryjnych białek

39 Chaperoniny I GroEL

40 Chaperoniny I GroES, heptamer złożony z podjednostek o masie 10 kda, w kształcie kopuły.

41 Chaperoniny I Po związaniu ATP i GroES, hydrofobowe reszty chowają się w ścianie pierścienia, objętość wewnętrznej przestrzeni wzrasta z do Ä 3. Umożliwia to spułapkowanie białka o masie do ~60 kda.

42 Chaperoniny I Cykl reakcji, którym podlega GroEL można podzielić na trzy stadia: a) wiązanie polipeptydu, b) spułapkowanie polipeptydu, c) uwolnienie polipeptydu. 1) Wiązanie polipeptydu (dolny pierścień pozbawiony nukleotydu ma wysokie powinowactwo do substratu) 2) Związanie ATP 3) oraz związanie GroES inicjuje zmiany konformacyjne w pierścieniu GroEL. Spada powinowactwo do hydrofobowego substratu, zostaje on przesunięty do hydrofilowej komory 4) Po związaniu ATP i GroES przez dolny pierścień, w pierścieniu górnym dochodzi o uwolnienia sfałdowanego białka, ADP i GroES 5) Hydroliza ATP powoduje przyjęcie konformacji umożliwiającej związanie kolejnego niesfałdowanego łańcucha polipeptydowego. Prawidłowe sfałdowanie białka wymaga prawdopodobnie kilku interakcji z GroEL 5 flip-flop

43 Fałdowanie białek u E. coli Ze względu na sposób działania można wyróżnić 3 grupy białek opiekuńczych: folding chaperons holding chaperons disaggregating chaperons pośredniczą w fałdowaniu/re-fałdowaniu białek w oczekiwaniu na dostępność czaperonów fałdujących wiążą się z częściowo sfałdowanymi białkami, chroniąc je w ten sposób przed wytrąceniem lub degradacją biorą udział w rozbijaniu zagregowanych białek

44 Fałdowanie białek w cytoplazmie E. coli Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli. Nat Biotechnol Nov;22(11): Baneyx F, Mujacic M.

45 Fałdowanie białek w cytoplazmie E. coli

46 Fałdowanie białek w peryplazmie E. coli Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli. Nat Biotechnol Nov;22(11): Baneyx F, Mujacic M.

47 Fałdowanie białek w peryplazmie E. coli