BIAŁKA Elementarny skład, wyodrębnienie i masa białek

Transkrypt

1 Rozdział 2 BIAŁKA Dlaczego właśnie białka są najważniejszym substratem życia, odgrywającym podstawową rolę w budowie materii żywej? Dlatego, że posiadają szereg szczególnych właściwości, których nie mają żadne inne związki organiczne. 1. Olbrzymie cząsteczki białek wyróżniają się wielką różnorodnością struktury przy ścisłej jej specyfice w konkretnym białku. 2. Białka mają zdolność do wewnątrzcząsteczkowego oddziaływania, co zapewnia dynamikę struktury ich cząsteczek, zmienność ich kształtu, odwracalność przejść ze stanu globularnego do stanu fibrylarnego. 3. Posiadając liczne rodniki w postaci reszt bocznych aminokwasów w składzie łańcuchów polipeptydowych, cząsteczki białka i ich poszczególne części mają zdolność wzajemnego chemicznego i fizycznego oddziaływania na siebie oraz na kwasy nukleinowe, polisacharydy, lipidy itp., tworząc nadmolekularne kompleksy stanowiące podstawę struktur subkomórkowych. 4. Najważniejszą osobliwością mechanizmu powstawania wskazanych kompleksów jest bezbłędne wzajemne rozpoznawanie składników i przebieg samego procesu asocjacji wg zasady samoukładania. 5. Cząsteczki białek regularnie zmieniają swoją strukturę pod wpływem zewnętrznego oddziaływania, po czym odzyskują stan wyjściowy; zjawisko to może być związane z przekształceniem energii. 6. Wiele białek posiada właściwości katalizatorów przyspieszających reakcje chemiczne zachodzące w żywej materii. 7. Białka pełnią funkcje: regulatorów, modulatorów, obronne, toksyczne, transportowe, morfogenetyczne i zasobowe oraz zdolność do skurczu itp. Nawet ta niepełna lista właściwości białek, różniących je od innych biopolimerów naturalnych, jest dowodem na to jak ważniejszą rolę pełnią w funkcjonowaniu żywych organizmów. Tylko analiza budowy białek i ich właściwości pozwala zrozumieć ich funkcje Elementarny skład, wyodrębnienie i masa białek Białka, lub inaczej proteiny (z greckiego protos pierwszy, główny), to makromolekularne substancje organiczne, charakteryzujące się ściśle określonym składem elementarnym i ulegające rozpadowi na aminokwasy podczas hydrolizy. Procentowo zawierają: 50-55% węgla, 6,5-7,3% wodoru, 15-18% azotu, 21-24%

2 20 Podstawy biochemii tlenu, do 2,4% siarki i do 0.5% popiołu. Szczególnie charakterystycznym wskaźnikiem jest zawartość azotu. W większości przypadków wynosi ona 16%, dlatego na podstawie zawartości białkowego azotu często wylicza się zawartość białka w paszach i produktach żywnościowych. W tym celu wielkość wyrażającą procentową zawartość białkowego azotu w preparacie mnoży się przez współczynnik, który wynosi 6,25, a otrzymuje się go dzieląc 100:16 = 6,25. Do chwili obecnej udało się zsyntetyzować ok. 20 białek (insulina, rybonukleaza, cytochrom c, hormon somatotropina, β-lipotropina, kobrotoksyna, kardiotoksyna, α-bungarotoksyna, inhibitor gastryny, inhibitor trypsyny, białko przenoszące rodnik acylowy, feredotoksyna i in.) i w ten sposób zapoczątkować ich sztuczne uzyskiwanie, jednak synteza ta wymaga dużego wysiłku, czasu i kosztów. Dlatego nadal jedyną realną metodą otrzymywania białek jest wyodrębnienie ich ze źródeł naturalnych. Ale i to nie jest łatwe zadanie. Białka są wrażliwe na działanie większości odczynników chemicznych (kwasów, zasad, rozpuszczalników organicznych i in.) i ulegają zniszczeniu w trakcie przeprowadzenia zwykłych zabiegów stosowanych przy oczyszczaniu substancji (ogrzewanie, destylacja, sublimacja, ekstrakcja itp.). Możliwa jest też autoliza już wyodrębnionych. Białko bardzo łatwo traci swoje właściwości naturalne (rozpuszczalność, aktywność biologiczną itp.) i przechodzi w stan denaturacji. Żeby tego uniknąć w procesie jego wydzielania wszystkie czynności z nim związane przeprowadza się w łagodnych warunkach: w niskiej temperaturze (nie wyższej niż +50 o C), unikając działania aktywnych odczynników chemicznych. Większość białek wielkocząsteczkowych jest już dezaktywowana w temperaturze > 37 o C. Po raz pierwszy białko (gluten) zostało wydzielone przez J. Bekkari z mąki pszennej w 1728 r. Datę tę uważa się za początek chemii białka. W 1762 r. rozpoczęto prace nad badaniem białka mleka kazeiny (A. Haller), a następnie od 1789 r. białka krwi (A. Fourcroy). W ciągu dwóch i pół wieku ze źródeł naturalnych otrzymano setki różnych białek i zbadano ich właściwości. Białka wyodrębniano najczęściej za pomocą roztworów soli o stężeniu 8-10%, w których dobrze rozpuszcza się ich zdecydowana większość. Różne sole mają różną zdolność rozpuszczania białka. Niżej zamieszczono szereg kationów i anionów rozmieszczonych w kolejności ubywania ich właściwości rozpuszczających: Li + > K + > Na + P 2 O 4-7 > B 4 O 2-7 > PO 3-4 > CNS > HCO - 3 > I > CI - Największą zdolność rozpuszczania powinien posiadać pirofosforan litu, a najmniejszą chlorek sodu. Ponieważ na rozpuszczalność białek duży wpływ ma ph środowiska, większość soli stosuje się w postaci mieszanin buforowych (fosforanowych, octanowych, boranowych, cytrynianowych itp.). Szeroko wykorzystywane są mieszaniny buforowe z zastosowaniem związków organicznych tris-(hydoksymetylo)-aminometanu (HOCH 2 ) 3 CNH 2 i jego soli z HCl (tris-bufor); kwasu dietylobarbiturowego oraz jego soli sodowej (weronal-medinalowy bufor); N,N bis-(2-

3 Rozdział 2. Białka 21 hydroksyetylo)-glicyny (HOCH 2 CH 2 ) 2 NCH 2 COOH (bicynowy bufor); N-[tris- (hydroksymetylo)-metylo]-glicyny (HOCH 2 ) 3 CNHCH 2 COOH (tricynowy bufor) itp. Dobre wyniki daje ekstrakcja białek za pomocą mieszaniny alkoholi i soli. Tworzące się w tym procesie metaloproteiny posiadają różną rozpuszczalność w alkoholu, co pozwala na uzyskanie indywidualnych białek za pomocą roztworów o różnym stężeniu alkoholu. Bardzo szeroko stosuje się do ich ekstrakcji glicerynę, ponieważ chroni ona białka przed denaturacją. Wyodrębnieniu białek z materiału biologicznego sprzyja jego obróbka za pomocą detergentów: dodecylosiarczanu sodowego, dezoksycholiny sodowej, trytonu X-100, alkiloglukozydów oraz sulfonianów trójalkiloamonopropenowych: CH 3 (CH 2 ) 10 CH 2 OSO 3 Na CH 3 (CH 2 ) 11 N + - (CH 3 ) 2 (CH 2 ) 2 SO 3 Dodecylosiarczan sodu Dodecylo-dimetylo-amoniopropanosulfonian H 3 CC(CH 3 ) 2 CH 2 C(CH 3 ) 2 [p-c 6 H 4 ](OCH 2 CH 2 ) 9-10 OH Triton X-100 CH 2 OH H O O H OH H (CH 2 ) 7 CH 3 HO H H OH Oktylo-β, D-glukopiranozyda HO OH CH CH 3 3 CH 3 COONa Dezoksycholan sodu Wymienione detergenty osłabiają hydrofobowe oddziaływania białko-lipid i białko-białko, w wyniku czego zachodzi destrukcja membran biologicznych i uwolnienie z nich strukturalnych i funkcjonalnych komponentów białkowych. Powyższe rozważania odnoszą się przede wszystkim do tkanek zwierzęcych, gdyż wyodrębnianie białek z materiału roślinnego jest o wiele trudniejsze: tu trudniej jest zburzyć ścianki komórek, bardziej prawdopodobna jest denaturacja substancjami garbnikowymi itp. Dlatego podczas wydzielania białek z wegetatywnych organów roślin wykorzystuje się specyficzne sposoby: oddziaływanie na tkanki wodno-estrową mieszaniną, wyraźnie zwiększającą przenikalność błony komórki roślinnej oraz ekstrakcję białek mieszaniną fenolu, kwasu octowego i wody. Następnie przeprowadza się rozdzielanie otrzymanej mieszaniny na poszczególne białka, ponieważ w skład tkanek roślinnych, podobnie jak i zwierzęcych, wchodzi mnóstwo różnych białek, ekstrahujących się w różnych proporcjach w procesie wyodrębniania. Frakcjonowanie białek przeprowadza się różnymi sposobami: za pomocą soli, rozpuszczalników organicznych, sit molekularnych, metodami elektroforezy, chromatografii itp. Białka wydobyte omówionymi metodami zawsze zawierają pewną ilość niskocząsteczkowych domieszek, szczególnie jonów soli. W celu pełnego oczyszczenia 21

4 22 Podstawy biochemii poddawane są dializie, elektrodializie, ultrafiltracji i filtracji żelem, rekrystalizacji i innym procesom. Liczne badania udowodniły, że dowolne białko może istnieć w formie krystalicznej. U podstawy różnych sposobów krystalizacji białka leży zasada bardzo wolnego zbliżania do tego krytycznego punktu, w którym białko z roztworu przechodzi w osad. W tym przypadku cząsteczki białka zdążą połączyć się w supramolekularne agregaty i tworzą krystaliczne struktury. Praktycznie takie powolne osadzanie się białek osiąga się drogą wprowadzenia soli przez półprzepuszczalną membranę lub podczas powolnego odparowania wody z zawierającego sól roztworu białkowego aż do punktu wysalania. Ostatnio szeroko stosowana jest krystalizacja białek z wykorzystaniem związków organicznych: 2-metylo-2,4-pentadiolu i polietylenglikolu; za ich pomocą udało się wykrystalizować szereg białek, których nie udało się wykrystalizować tradycyjnymi metodami. Krystaliczne białka, szczególnie otrzymywane w rezultacie rekrystalizacji, wyróżniają się wysokim stopniem czystości. Dobre rezultaty daje oczyszczanie białek od niskocząsteczkowych domieszek za pomocą filtracji żelowej. Filtracja ta jest szeroko wykorzystywana do odsalania roztworów białkowych. Tabela 2.1. Masy cząsteczkowe, stopień asymetrii cząsteczki oraz punkt izoelektryczny niektórych białek Białko Mioglobina kaszalota Pepsyna Albumina jajka Hemoglobina konia γ-globulina człowieka Katalaza Fibrynogen człowieka Ureaza Tyreoglobulina świni Przeciwpneumokokowa globulina surowicy konia Hemocyjanina ślimaka Masa cząsteczkowa Stopień asymetrii cząsteczki 3,0 4,0 4,4 4,3 6,0 5,8 17,5 4,3 9,2 20,1 4,8 Punkt izoelektryczny Ciężar cząsteczkowy białka oznacza się różnymi metodami fizycznymi: grawimetryczną, wiskozymetryczną, osmometryczną, ultrafiltracyjną, żelfiltracyjną, metodą elektroforezy i metodą optyczną. Otrzymaną wielkość przyjęto nazywać fizyczną molekularną masą białka; jest ona określana z dokładnością do kilkuset, a czasem i tysięcy daltonów. Wiele białek ma obecnie ustaloną strukturę pierwotną, co daje możliwość obliczenia masy cząsteczkowej z dokładnością do setnych ułamka daltona, tzn. otrzymania wielkości chemicznej masy cząsteczkowej białka. 7,0 1,1 4,6 6,6 7,3 6,7 5,4 4,9 4,5 4,4 4,7

5 Rozdział 2. Białka 23 Zwykle operuje się terminami fizycznych mas cząsteczkowych białek, które zmieniają się w szerokim zakresie (tabela 2.1). Określenie masy cząsteczkowej białka metodą grawimetryczną prowadzi się w ultrawirówkach analitycznych Kształt oraz skład białka Kształt cząsteczek białka ocenia się na podstawie matematycznej obróbki danych, otrzymywanych podczas ultrawirowania roztworów białkowych. W tym celu szeroko wykorzystywana jest dwójłomność strumieniowa. Oparta jest ona na zmianie charakterystyk optycznych roztworu białka znajdującego się w ruchu w porównaniu z roztworem znajdującym się w stanie spoczynku. W pierwszym przypadku zachodzi orientacja rozciągniętych cząstek białkowych w kierunku ruchu roztworu i towarzyszy temu dwójłomność optyczna. Kształt cząsteczek białkowych jest także widoczny w bezpośredniej obserwacji w mikroskopie elektronowym. Wyczerpujące dane o formie cząsteczek białkowych i topografii ich powierzchni daje rentgenowska analiza strukturalna. Dzięki tym metodom wyjaśniono, że cząsteczki białka posiadają kształty niejednorodne od kulistych po nitkowate twory. W większości przypadków mają one rozciągniętą formę i zbudowane są asymetrycznie. Stopień asymetrii wyrażony jest stosunkiem długiej osi cząsteczki b do jej osi krótkiej a. Dane o stopniu asymetrii (b/a) cząsteczek niektórych białek pokazane są w tabeli 2.1. Białka, u których stopień asymetrii jest równy 1 (cząsteczki w postaci kulek) są rzadkością. Najczęściej ta wielkość mieści się w granicach od 3 do 6 (cząsteczki w kształcie elipsy lub pałeczek). W niektórych przypadkach stopień asymetrii osiąga 200 i więcej (nitkowate cząsteczki białek). Ogólnie długość cząsteczek białka o średniej masie cząsteczkowej wynosi w granicach kilku dziesiątek, a grubość kilku nanometrów. Późniejsze prace, w których opisano pełną strukturę niektórych białek, pokazały, że cząsteczki białka są asymetrycznie we wszystkich trzech wymiarach. Na przykład cząsteczka mioglobiny jedno z białek tkanki mięśniowej (M = ) ma rozmiary 2,5 3,5 4,5 nm. Wiele białek, szczególnie enzymy, zbudowane są z podjednostek o strukturze zawierającej szczeliny, wypukłości i zagłębienia (wklęsłości), na dnie których położone są funkcjonalnie aktywne centra. Jedną z najbardziej rozpowszechnionych metod badania składu chemicznego białek jest hydroliza. Białko ogrzewa się z roztworami kwasów lub zasad w temperaturze o C przez 24 godziny. Najczęściej wykorzystywany jest 20-procentowy roztwór HCl, zapewniający głęboką hydrolizę białka z minimalnym uszkodzeniem aminokwasów. Ostatnio w celu przyspieszenia reakcji hydrolizy białek wykorzystuje się imobilizowane (umocowane na nośnikach) proteolityczne enzymy i jonowymienne żywice, co zapewnia pełną zgodność zawartości aminokwasów w hydrolizacie z ich stosunkiem w białku. 23

6 24 Podstawy biochemii Aktualnie rozdzielenie aminokwasów otrzymanych w wyniku hydrolizy białek prowadzi się metodą chromatografii jonowymiennej zrealizowanej za pomocą automatycznego analizatora aminokwasów (rys. 2.1). Urządzenie to działa automatycznie według zadanego programu i określa zawartość aminokwasów w hydrolizacie (wykonując również niezbędne obliczenia) w ciągu kilku godzin prawie bez udziału eksperymentatora. Jeżeli analizator wyposażony jest w komputer, analiza nie trwa dłużej niż dwie godziny. Rys Schemat identyfikacji aminokwasów w hydrolizacie za pomocą automatycznego analizatora: 1, 2, 3 naczynia z roztworem ninhydryny, roztworem buforowym dla małej kolumny oraz roztworem buforowym dla wielkiej kolumny, odpowiednio; 4, 5, 6 pompy dla transportu odpowiednich roztworów; 7, 8 mała i wielka kolumny chromatograficzne; 9 mieszalnik; 10 łaźnia reakcyjna; 11 fotoelektrokolorymeter; 12 przyrząd rejestracyjny Zidentyfikowane aminokwasy dzieli się na dwie kategorie: stale i rzadko spotykane w białkach. Do pierwszej często występujących w białkach zalicza się 18 aminokwasów. Ich nazwy, wzory i skrótowe oznaczenia zawarte są w tabeli 2.2. Oprócz wymienionych 18 aminokwasów w skład białek stale wchodzą jeszcze dwa amidy: amid kwasu asparaginowego asparagina i amid kwasu glutaminowego glutamina (w skrócie asp i gln lub N i Q): H 2 NC(O)CH(NH 2 )COOH H 2 NC(O)CH 2 CH 2 CH(NH 2 )COOH Asparagina Glutamina

7 Tabela 2.2. Aminokwasy stale spotykane w składzie białek Rozdział 2. Białka 25 Aminokwasy Glicyna (kwas aminooctowy) Alanina (kwas α-aminopropionowy) Walina (kwas α-aminoizowalerianowy) Leucyna (kwas α-aminoizokpronowy) Izoleucyna (kwas α-aminoβ-metylo-walerianowy) Kwas asparaginowy (aminobursztynowy) Kwas glutaminowy (α-aminoglutarowy) Seryna (kwas α-amino-βhydoksy-propionowy) Treonina (kwas α-amino-βhydroksy-masłowy) Cysteina(kwas α-amino-βtiol-propionowy) Metionina (kwas α-amino-γmetylotio-masłowy) Arginina (kwas α-aminoδ-guanidynowalerianowy) Lizyna (kwas α,ε-diaminokapronowy) Histydyna (kwas α-amono-βimidazolilo-propionowy Prolina (kwas pirrolidyno-αkarboksylowy) Fenyloalanina (kwas α-amino-β-fenylopropionowy) Tyrozyna (kwas α-amino-βparahydroksypropionowy) Tryptofan (kwas α-amino-β-indolilopropionowy) H HO Wzór NH2CH2COOH CH3CH(NH2)COOH (CH3)2CHCH(NH2)COOH (CH3)2CHCH2CH(NH2)COOH CH3CH2CH(CH3)CH (NH2)COOH HOOCCH2CH(NH2)COOH HOOCCH2CH2CH(NH2)COOH HOCH2CH(NH2)COOH CH3CH(OH)CH(NH2)COOH HSCH2CH(NH2)COOH CH3SCH2CH2CH(NH2)COOH H2NC(NH)NH (CH2)2CH(NH2)COOH N H2N(CH2)4CH(NH2)COOH N N H NH 2 CH 2 CH COOH N H COOH CH 2 CH COOH NH 2 CH 2 CH COOH NH 2 CH 2 CH COOH NH 2 Nazwa skrótowa gly, G ala, A val, V leu, L ile, I asp, D glu, E ser, S thr, T cys, C met, M arg, R lyz, K his, H pro, P phen, F tyr, Y try, W Kiedy, przez kogo i w jakim białku odkryty 1820 r., A. Braconnot, w żelatynie 1888 r., T.Veil, w fibroinie jedwabiu 1879 r., P. Shutenberge w albuminie 1820 r., A. Braconnot, w białkach wełny i mięśni 1904 r., F. Erlich, w fibrynie krwi 1868 r., G. Ritthauzen, w białkach roślinnych 1866 r., G. Ritthauzen, w białkach roślinnych 1863 r., E. Cramer, w serycynie jedwabiu 1921 r., D. Zieliński, w keratynie gęsiego pióra 1901 r., G. Emblden, w jajku białka 1922 r., J. Muller, w kazeinie 1895 r., S. Hedin, w keratynie rogu 1889 r., E. Dreksel, w kazeinie 1896 r., A. Kossel i S. Hedin, w białku spermy jesiotra i kazeinie 1901 r., E. Fisher, w kazeinie 1881 r., E. Shultse i J. Barbiery, w białku roślinnym 1849 r., F. Bopp, w kazeinie 1901 r. F. Hopkins i D. Kol, w kazeinie 25

8 26 Podstawy biochemii Do grupy rzadziej spotykanych białkowych aminokwasów należą hydroksyprolina (kwas hydroksypirolidyno-α-karboksylowy); hydroksylizyna (kwas α,ε-diamino-δhydroksykapronowy), ornityna (kwas α,δ-diaminowalerianowy); 3,5-diiodotyrozyna; kwas α-aminoizomasłowy; N-metylo-, N,N-dimetylo i N,N,N-trimetylolizyna; N,N - dimetylo- oraz N-metylo-, N,N -dimetyloarginina; kwas γ-karboksyglutaminowy (gla); kwas β-karboksyasparaginowy (asa); 3-N-metylohistydyna; N,N-dimetyloprolina; estry metylowe asp i glu i niektóre inne aminokwasy. Ich wzory strukturalne łatwo wyprowadzić, wychodząc ze wzorów podanych w tabeli 2.1. Wzory ornityny, kwasów α-aminoizomasłowego i γ-karboksyglutaminowego są następujące: H 2 N(CH 2 ) 3 CH(NH 2 )COOH (CH 3 ) 2 C(NH 2 )COOH Ornityna Kwas α-aminoizomasłowy (HOOC) 2 CHCH 2 CH(NH 2 )COOH Kwas γ-karboksyglutaminowy Szczególnie ważną cechą aminokwasów jest ich aktywność optyczna. Za wyjątkiem glicyny, wszystkie zbudowane są asymetrycznie, a więc gdy są rozpuszczone w wodzie lub kwasie solnym, mają zdolność skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego. Wielkość kąta właściwego skręcenia w większości przypadków wynosi od 20 do 30 o (w lewo lub w prawo) i tylko czasem jest wyrażona większymi lub mniejszymi liczbami. Z siedemnastu optycznie aktywnych aminokwasów wchodzących w skład białka 7 charakteryzuje się skręceniem płaszczyzny polaryzacji światła w wodnych roztworach w prawo (+) i 10 w lewo ( ), ale wszystkie one należą do szeregu L. Tylko w składzie glikoprotein ścianek komórkowych bakterii i w antybiotykach wykryto D-α-aminokwasy: phen, glu, ala, leu, val, pro i in. Dokładna struktura cząsteczek aminokwasów zbadana została metodą rentgenowskiej analizy strukturalnej. Za pomocą tej metody udało się skonstruować przestrzenne modele aminokwasów; niektóre z nich przedstawione są na rys Strukturę przestrzenną glicyny przedstawia rys. 2.3, na którym podane zostały długości wiązań oraz kąty walencyjne otrzymane za pomocą metody rentgenowskiej analizy strukturalnej. Analogiczne dane otrzymano dla wszystkich aminokwasów stale spotykanych w składzie białek. W ten sposób uzyskuje się informacje o dokładnej budowie łańcucha polipeptydowego cząsteczek białka. Rentgenowska analiza strukturalna kryształów aminokwasów pokazała, że główną rolę w tworzeniu struktury kryształów aminokwasów odgrywa rozgałęziony system wiązań wodorowych, powstających między molekułami aminokwasu regularnie rozlokowanymi w strukturze kryształu. Właściwość tworzenia przez aminokwasy wiązań wodorowych zachowuje się nawet wtedy, gdy aminokwas jest częścią składową łańcucha polipeptydowego. W następstwie tego powstawanie α-spiralnej konformacji łańcucha polipeptydowego można rozpatrywać jako proces wewnętrznej krystalizacji polipeptydu.

9 Rozdział 2. Białka 27 O C H 2 C + NH 3 - O glicyna-gly kwas aminooctowy C H 2 O - C HC O CH H 3 C CH 3 + H 3 N leucyna-leu kwas L-2-aminoizokapronowy H 2 C H 2 C O C O - CH + NH 2 CH 2 prolinana-pro kwas pirolidyno- -5-karboksylowy O O - C HC H 2 C + H 3 N N H tryptofan-trp kwas L-2-amino- -3-indolilopropionowy O HC H 2 C C + H 3 N CH 2 O - O - H C 3 C CH O + H 3 N alanina-ala kwas L-2-aminopropionowy + H 3 N O C CH CH 2 H 2 C C NH 2 O O - glutamina-gln amid kwasu L-2- aminoglutarowego O O - H 2 C C CH + NH 3 SH cysteina-cys kwas L-2-amino- -3-tiolopropionowy O C HC CH 2 O - O - C H HC 3 C CH + NH 3 fenyloalanina-phe kwas L-2-amino- -3-fenylopropionowy CH 3 O + NH 3 walina-val kwas L-2-aminoizowalerianowy O O - C H 3 C HC CH CH 2 H 3 C + H 3 N izoleucyna-ile kwas L-2-amino- -3-metylowalerianowy + H 3 N O C H 2 C H 3 C CH CH 2 S O - metionina-met kwas L-2-amino- -4-metylotiolomaslowy O C H 2 C O - HC + H 3 N CH 2 NH C NH 2 HN arginina-arg kwas L-2-amino- -5-guanidynowalerianowy OH tyrozyna-tyr kwas L-2-amino- -3-hydroksyfenylopropionowy Rys Przestrzenne modele cząsteczek niektórych aminokwasów i ich wzory 27

10 28 Podstawy biochemii Rys Budowa cząsteczki glicyny w krysztale. Odległość pomiędzy atomami podana jest w nanometrach Przy ocenie 18 często występujących w składzie białek α-aminokwasów, biorąc pod uwagę kompleks ich właściwości chemicznych, zadziwia niezmiennie duża różnorodność wzajemnych oddziaływań możliwych między łańcuchami bocznymi ich cząsteczek. Łańcuchem bocznym aminokwasu przyjęto nazywać ugrupowanie atomów w jego cząsteczce, związane z α-atomem węgla i nie biorące udziału w tworzeniu łańcucha polipeptydowego. Chemiczny charakter tych łańcuchów (tab. 2.3) pozwala na udział w reakcjach tworzenia soli (z udziałem grup NH 2 i COOH), utleniania i redukcji (z udziałem grup HS i SS), alkilowania, acylowania i estryfikacji (z udziałem grup NH 2, OH, p-hoc 6 H 4, COOH), amidowania (z udziałem grup COOH), nitrowania oraz chlorowcowania (w pierścieniach aromatycznych), dezaminowania za pomocą kwasu azotawego (z udziałem grup NH 2 ), fosforylacji i sulfonowania (z udziałem grup OH), sprzęgania ze związkami dwuazowymi z udziałem pierścieni aromatycznych oraz heterocyklicznych itp. Wszystkie te procesy chemiczne są podstawą zmiany właściwości chemicznych preparatów białkowych podczas ich obróbki odpowiednimi odczynnikami. Niektóre ze wskazanych reakcji przebiegają w organizmach żywych (tworzenie soli, utlenianie, redukcja, acylowanie, estryfikacja, amidowanie, fosforylacja). Właściwości fizyczne łańcuchów bocznych aminokwasów także są bardzo różnorodne. Dotyczy to przede wszystkim długości rodników i ich objętości (tab. 2.3). Od długości, objętości i położenia względem siebie łańcuchów aminokwasów, zależy objętość, forma i kształt powierzchni cząsteczki białka, którą tworzą. Rodniki gly, ala, val, leu, ile, phen i trp są niepolarne, a pozostałych aminokwasów polarne. Od polarności cząsteczki zależy rozpuszczalność białek w różnych rozpuszczalnikach.

11 Rozdział 2. Białka 29 Tabela 2.3. Charakterystyka łańcuchów bocznych aminokwasów Aminokwas Długość, nm Objętość, nm 3 Aminokwas Długość, nm Objętość, nm 3 Glicyna Alanina Walina Leucyna Izoleucyna Kwas asparaginowy Kwas glutaminowy Seryna 0,15 0,28 0,40 0,53 0,53 0,50 0,63 0,38 0,0051 0,0322 0,0863 0,1134 0,1134 0,0584 0,0855 0,0360 Treonina Cysteina Metionina Arginina Lizyna Histydyna Tyrozyna Fenyloalanina Tryptofan 0,40 0,43 0,69 0,88 0,77 0,65 0,77 0,69 0,81 0,0631 0,0579 0,1121 0,1257 0,1210 0,0890 0,1388 0,1366 0,1755 Należy stwierdzić, że różnorodność rodników aminokwasów ze względu na charakter chemiczny i właściwości fizyczne jest ściśle związana z polifunkcjonalnością i specyficznymi właściwościami białek. To właśnie te właściwości wyróżniają białka z szeregu innych naturalnych biopolimerów i na równi z innymi szczególnymi ich cechami (aktywność biokatalityczna, zdolność do tworzenia kompleksów z innymi biopolimerami, zdolność do tworzenia nadmolekularnych struktur, denaturacja i renaturacja, dynamiczne przejścia między globularnym i fibrylarnym stanem, niewyczerpana różnorodność i przy tym wysoka specyfika budowy strukturalnej cząsteczek itp.) decydują o ich roli materialnej podstawy procesów życiowych. Jeżeli ze względu na skład jakościowy cała różnorodność elementów strukturalnych cząsteczki białka wynika z obecności 18 wyżej wymienionych α-aminokwasów, to ogólna ilość reszt aminokwasowych w cząsteczce białka zmienia się w szerokim zakresie. Przyjmując średnią masę cząsteczkową reszty aminokwasu równą 115, łatwo obliczyć współczynnik polikondensacji aminokwasów podczas tworzenia cząsteczki białka. Dla białka z M = będzie on równy (17000 : 115) w przybliżeniu 148, natomiast dla białka z M = w przybliżeniu 380 itp. W ten sposób 18 aminokwasów i dwa amidy (asparagina i glutamina) wielokrotnie powtarzają się w innych proporcjach i innym ułożeniu w cząsteczce białka (tab. 2.4). Obecnie trwają szczegółowe badania składu jakościowego i ilościowej zawartości aminokwasów w wielu tysiącach białek. Porównanie tych danych pozwoliło ustalić pewne prawidłowości. Stwierdzono, że takie aminokwasy jak leu, lyz, asp i glu są zawarte w białkach w znacznych ilościach (10-15%) i odwrotnie, zaś udział thr, cys i his rzadko przekracza 1,5-2%. Zawartość pozostałych aminokwasów waha się zwykle między przytoczonymi wyżej skrajnymi wielkościami ile w białkach prawie zawsze jest mniej niż leu; w takich samych stosunkach wzajemnych pozostaje w białkach his i arg, thr i ser, a także asp i glu. 29

12 30 Podstawy biochemii Tabela 2.4. Skład aminokwasowy niektórych białek (A zawartość aminokwasu, %; B liczba resztek aminokwasów w cząsteczce białka) Mioglobina Hemoglobina Pepsyna Albumina jajka Aminokwas człowieka człowieka A B A B A B A B Alanina Glicyna Walina Leucyna Izoleucyna Prolina Fenyloalanina Tyrozyna Tryptofan Seryna Treonina Cystyna Cysteina Metionina Arginina Histydyna Lizyna Kwas asparaginowy Kwas glutaminowy Asparagina Glutamina 5,7 6,3 5,3 12,2 5,0 4,0 6,2 2,4 3,6 4,6 2, ,5 2,7 8,2 16,1 9,2 17, ,5 8,1 7,1 10,4 10,0 4,9 6,7 9,4 3,5 13,2 9,5-1,5 2,1 1,0 0,5 0,4 16,6 11, ,7 3,1 7,1 9,2 7,0 3,6 7,7 3,7 1,2 8,2 4,0 0,5 1,4 5,2 5,7 2,4 6,3 9,3 16, ,0 4,2 10,3 14,0 0 4,8 7,3 2,9 1,9 4,4 5,2 0 1,0 1,2 3,3 8,8 9,6 9, Razem: 115, , , , Peptydy Dzięki równoczesnej obecności w cząsteczce grupy aminowej i karboksylowej jedną z ważnych właściwości chemicznych α-aminokwasów jest ich zdolność do tworzenia peptydów. Schemat tego procesu przebiegającego w reakcji polikondensacji, jest następujący: H 2 NCH(CH 3 )COOH + H 2 NCH(CH 2 SH)COOH Alanina Cysteina H 2 NCH(CH 3 )CONHCH(CH 2 SH)COOH + H 2 O Alanilocysteina (dipeptyd) W rzeczywistości w organizmie proces jest o wiele bardziej skomplikowany. Reakcja ta będzie opisana szczegółowo w dalszej części rozdziału. Reakcja tworzenia peptydów z aminokwasów ma duże znaczenie dla zrozumienia budowy chemicznej białek. W wyniku reakcji polikondensacji aminokwasów można otrzymać związki, składające się z wielu reszt aminokwasowych o bardzo wysokich masach cząsteczkowych. Takie związki noszą nazwę polipeptydów, grupy -CONH- w nich zawarte

13 Rozdział 2. Białka 31 zwane są grupami peptydowymi, a wiązanie CO-NH wiązaniem peptydowym. Peptydy mogą być otrzymane także podczas częściowej (niepełnej) hydrolizy białek. Ponieważ aminokwasy w składzie peptydów znajdują się w formie zacylowanej, to w nazwie peptydu dodaje się im charakterystyczną końcówkę ylo. Nazwę końcowego aminokwasu z wolną grupą karboksylową pozostawia się bez zmian. Nazwę peptydu zaczyna się od aminokwasu, który zachował wolną grupę α-aminową. Termin peptyd obecnie utracił swoje pierwotne znaczenie, ponieważ wcześniej przez pojęcie to rozumiano produkty końcowe trawienia białek, tzn. w istocie aminokwasy. Dlatego logicznie byłoby nazywać produkty trawienia, złożone z dwóch reszt aminokwasowych, dipeptydami, a z wielu polipeptydami. Znacznie dokładniejsze jest nazywanie peptydów heteropoli-aminokwasami, tzn. związkami utworzonymi z różnej liczby różnych aminokwasów. Jednak termin peptydy trwale wszedł do chemii białek. W warunkach laboratoryjnych peptydy mogą być otrzymywane różnorodnymi metodami, których wspólną cechą jest konieczna ochrona w jednym z reagujących aminokwasów grupy aminowej, a w drugim grupy karboksylowej, tak aby mogły one wziąć udział w reakcji kondensacji tylko z udziałem grupy karboksylowej (COOH) lub aminowej (NH 2 ), które pozostały bez ochrony. Najbardziej znana jest metoda syntezy peptydów w fazie stałej, zaproponowana przez R.B. Merrifielda (rys. 2.4). Grupa COOH wyjściowego aminokwasu jest tu chroniona przez przyłączenie jej do polimeru, a grupa NH 2 przyłączonego aminokwasu poprzez trzeciorzędowy rodnik izobutynylowy. Metodę tę zautomatyzowano. Obecnie dokonuje się jej w syntezatorze automatycznym, za pomocą którego syntezuje się nie tylko peptydy, ale i białka. Ze źródeł naturalnych wyodrębniono kilkaset indywidualnych peptydów i w wielu przypadkach szczegółowo zbadano ich budowę, właściwości i aktywność biologiczną. Oto kilka przykładów niskocząsteczkowych peptydów: Glutation (γ-glutamylocysteinyloglicyna, γ-glu-cys-gly) HOOCCH(NH 2 )CH 2 CH 2 CONHCH(CH 2 SH)CONHCH 2 COOH Reszta kwasu glutaminowego Reszta cysteiny Reszta glicyny jest jednym z najbardziej rozpowszechnionych peptydów wewnątrzkomórkowych, który bierze udział w procesach utleniająco-redukujących w komórkach i w przenoszeniu aminokwasów przez membrany biologiczne (rys. 2.4). Glutation został wykryty przez F. Hopkinsa w 1921 r. Jest to krystaliczny proszek o temperaturze topnienia o C. Po dodaniu Cu 2 O z roztworu w kwasie siarkowym o stężeniu 0,5 N wytrąca sę w postaci nierozpuszczalnego merkaptydu miedzi. 31

14 32 Podstawy biochemii Rys Schemat syntezy peptydów i białek w fazie stałej BOK tret-izobutyloksykarbonylowy rodnik Przytoczony wyżej wzór odpowiada tak zwanemu zredukowanemu glutationowi (HS-glutationowi). W komórce na równi ze zredukowaną formą glutationu zawsze jest obecna utleniona forma (SS-glutation przechodzący w zredukowany pod działaniem enzymu reduktazy glutationu): Kwas oftalmowy (γ-glutamylo-α-aminobutyryloglicyna) antagonista glutationu, jest tak samo szeroko rozpowszechniony w przyrodzie, jak i sam glutation: HOOCCH(NH 2 )CH 2 CH 2 CONHCH(CH 2 CH 3 )CONHCH 2 COOH Reszta kwasu glutaminowego Reszta kwasu α-amino- Reszta glicyny masłowego

15 Rozdział 2. Białka 33 Występując w komórkach w znikomych ilościach od 0,1 do 0,001 ułamka stężenia glutationu, kwas oftalmowy działa jak inhibitor w procesach zachodzących z udziałem glutationu. Karnozyna (β-alanylohistydyna; β-ala-his) peptyd zawarty w mięśniach zwierząt: Reszta β-alaniny Reszta histydyny Utrudnia on gromadzenie i usuwa produkty utleniania nadtlenowego lipidów, uczestniczy w podtrzymywaniu pojemności buforowej tkanki mięśniowej, przyspiesza proces rozpadu węglowodanów w mięśniach oraz w postaci fosforanu włącza się w proces wymiany energetycznej w mięśniu. Po raz pierwszy karnozynę z tkanki mięśniowej wyodrębnił i wyjaśnił jej budowę W.S. Gulewicz. Wzory peptydów i aminokwasów obrazuje rysunek 2.5. S H 2 C H 2 NCH 2 CH 2 CONHCHCH 2 S Oksytocyna ludzka COOH Cys Tyr Ile Gln Asn Cys Pro Leu Gly NH 2 C N CH NH CH Pro Val Orn Leu D-Phe Pro Val S S Cys Tyr Phe Gln Asn Cys Pro Arg Gly NH 2 D-Phe D-Phe Leu Orn Wazopresyna ludzka Gramicydyna S Trp Val Gly Ala D Leu Trp D Leu Trp D Leu Trp D Leu Leu Trp NH CH 2 CH 2 OH Gramicydyna G Rys Wzory strukturalne niektórych biologicznie aktywnych peptydów Znaczenie skrótów reszt aminokwasowych oznaczają ich położenie w cząsteczce, licząc od N-końca do C-końca peptydu. Oksytocyna ludzka peptydowy neurohormon wytwarzany w podwzgórzu, a magazynowany w tylnym płacie przysadki; zbudowany z 9 reszt aminokwasowych, powoduje skurcze mięśni gładkich przewodów gruczołu mlecznego (udział w wydzielaniu mleka); jest fizjologicznym bodźcem rozpoczęcia porodu; stosowany w położnictwie (także syntetyzowany); Wazopresyna ludzka peptydowy neurohormon wytwarzany w podwzgórzu, magazynowany w tylnym płacie przysadki; wzmagając wchłanianie zwrotne wody w kanalikach 33

16 34 Podstawy biochemii nerkowych powoduje zmniejszenie wydalania wody przez nerki; pobudza skurcz mięśni gładkich, głównie naczyń krwionośnych. Gramicydyna (cykliczna S i liniowa G) antybiotyk, działający na liczne bakterie gramdodatnie (dwoinki zapalenia płuc, paciorkowce, gronkowce i inne), zmienia przepuszczalność membran białkowych dla związków niskocząsteczkowych i powoduje zanik komórek. Rola peptydów w procesach czynności życiowych jest niezwykle różnorodna. Wiele z nich występuje w charakterze hormonów, niektóre są w składzie jadów żmij, żab, ślimaków, pająków, owadów, toksyn wyższych grzybów, bakterii, są silnymi antybiotykami, sprzyjają syntezie i uwolnieniu hormonów, są regulatorami podziału komórkowego, nosicielami cząsteczek i jonów przez membrany biologiczne, regulatorami działalności psychicznej. Znaczną ilość peptydów naturalnych otrzymano syntetycznie; w laboratoriach otrzymano także setki ich analogów, niektóre z nich posiadają silniejsze działanie biologiczne, niż ich naturalne prekursory. Naturalne oraz sztuczne peptydy znajdują szerokie zastosowanie praktyczne Struktura cząsteczki białka Pośród dużej liczby różnorodnych hipotez dotyczących struktury cząsteczki białka tylko jedna wytrzymała próbę czasu. Jest to polipeptydowa teoria budowy cząsteczki białka po raz pierwszy zaproponowana przez H.E. Fishera (1902). Zgodnie z tą teorią cząsteczki białka występują w postaci gigantycznych polipeptydów, zbudowanych z kilkudziesięciu, a niekiedy i kilkuset reszt zbędnych aminokwasów (zob. tab. 2.4). O tym, że cząsteczki białka zbudowane są właśnie w taki sposób, świadczą następujące fakty: 1. W białkach udaje się wykryć bardzo małą ilość wolnych grup NH 2 i COOH, ponieważ końcowe aminokwasy tworzą znikomą część ogromnego łańcucha polipeptydowego białka. 2. Podczas hydrolizy białek następuje stopniowe uwolnienie grup NH 2 i COOH w stosunku dokładnie 1:1, gdyż zachodzi rozpad wiązań CO NH. 3. Podczas wzajemnego oddziaływania biuretu H 2 N-CO-NH-CO-NH 2 z roztworami zasad i siarczanu miedziowego powstaje niebieskofioletowe zabarwienie (reakcja na obecność wiązań CO-NH); wszystkie białka dają biuretową reakcję, tzn. w ich cząsteczkach rzeczywiście jest duża ilość wiązań peptydowych. 4. Za pomocą syntezy chemicznej poznano polipeptydową naturę szeregu białek. 5. Podczas rentgenowskiej analizy strukturalnej budowy białek obserwuje się nieprzerwany łańcuch polipeptydowy z charakterystycznym dla badanego białka położeniem reszt aminokwasów. 6. Metody wykorzystywane w celu określenia kolejności reszt aminokwasów w białkach jednoznacznie świadczą o kolejnym (w szeregu przypadków fragmentarycznym, selektywnym) rozszczepianiu wiązań peptydowych właśnie w składzie łańcuchów polipeptydowych.

17 Rozdział 2. Białka 35 Charakterystyczną cechą budowy łańcucha polipeptydowego jest to, że atomy C i N w jego szkielecie utworzonym z systematycznie powtarzających się fragmentów CO CH NH, rozmieszczają się mniej więcej w jednej płaszczyźnie wtedy I gdy atomy i rodniki grup >CHR skierowane są do tej płaszczyzny pod kątem 109 o 28. Natomiast w sąsiednich resztach aminokwasów rozmieszczenie atomów H i rodników jest przeciwstawne. Wyjaśnia to np. rys. 2.6A obrazujący fragment łańcucha polipeptydowego cząsteczki insuliny. Rys Wielkości standardowe odległości pomiędzy atomami (nm) oraz kątów walencyjnych w łańcuchu polipeptydowym (A) oraz delokalizacja gęstości elektronowej wzdłuż ogniwa peptydowego (B), która doprowadza do stabilizacji jego struktury płaskiej (C i D) 35

18 36 Podstawy biochemii Inną charakterystyczną cechą budowy łańcucha polipeptydowego jest charakter wiązań CO-NH. Odległość między atomami C i N w wiązaniu peptydowym równa jest nm, tzn. jest ona mniejsza niż normalna odległość między α-atomem węgla i atomem N tego samego łańcucha (0,146 nm). Jednocześnie przewyższa ona odległość między atomami C i N, połączonymi podwójnym C = N wiązaniem (0,127 nm). W związku z tym wiązanie C-N w grupie CO-NH może być traktowane jako pośrednie między pojedynczym a podwójnym na skutek sprzężenia π-elektronów grupy karbonylowej z wolnymi elektronami atomu azotu. To w określony sposób uwidacznia się we właściwościach polipeptydów i białek: w miejscu wiązań peptydowych łatwo zachodzi tautomeria prowadząca do tworzenia enolu takiego wiązania peptydowego, które wyróżnia się podwyższoną zdolnością reakcyjną: H 2 N CH R' C O N H CH R'' COOH Trzecia szczególna cecha budowy wiązania peptydowego polega na tym, że wszystkie wchodzące w jej skład atomy rozmieszczone są w jednej płaszczyźnie (rys. 2.6C); taka konfiguracja nosi nazwę planarnej (płaskiej) i jest wynikiem delokalizacji gęstości elektronowej podwójnego wiązania grupy karbonylowej w kierunku wiązania między węglem i azotem (rys. 2.6B). Czwarta właściwość łańcucha polipeptydowego polega na tym, że jego fragmenty NH CH CO otoczone są różnorodnymi, ze względu na swoją budowę chemiczną łańcuchami bocznymi. I Łańcuchy boczne są bardzo różnorodne. Zawierają rodniki: alifatyczne (ala, val, leu, ile), aromatyczne (phen) oraz heterocykliczne (pro, trp, his). Większość z nich ma w swoim składzie grupy aminowe (lyz, arg), karboksylowe (asp, glu), hydroksylowe, fenolowe (ser, thr, tyr), tiolowe (cys), amidowe (asp, gln) i inne grupy funkcyjne. Współdziałając z otaczającymi molekułami rozpuszczalnika (wody), wolne grupy NH 2 i COOH, ulegające jonizacji, tworzą kationy i aniony. W zależności od ich ilości cząsteczka białka otrzymuje sumaryczny dodatni lub ujemny ładunek, a roztwór charakteryzuje się właściwą wielkością ph po osiągnięciu punktu izoelektrycznego białka. Liczba oraz stosunek kationowych, anionowych i innych grup w niektórych białkach podane są w tabeli 2.5. Budowa rodników ma duży wpływ na wiele innych właściwości białek, w szczególności na przestrzenną konfigurację łańcucha polipeptydowego: tworzące się mostki disulfidowe utrwalają względne położenie odcinków łańcucha polipeptydowego podczas formowania trzeciorzędowej struktury białka. Rodniki również zasadniczo określają zakres chemicznych reakcji, swoistych białkom, i mają wpływ wspólnie z innymi czynnikami na funkcjonalną aktywność białek. H 2 N CH R' C N OH CH R'' COOH

19 Rozdział 2. Białka 37 Tabela 2.5. Klasyfikacja grup funkcyjnych w białkach (liczba grup w jednej cząsteczce) Białko A B C D E F G H I Mioglobina konia, M = Pepsyna, M = Albumina jaja, M = Hemoglobina konia, M = A ogólna liczba resztek aminokwasów; B liczba rodników węglowodorowych; C liczba rodników heterocyklicznych; D liczba rodników fenolowych; E liczba grup hydroksylowych; F liczba grup aminowych; G liczba grup karboksylowych; H liczba grup tiolowych; I liczba innych rodników. Przez długi czas nasza wiedza o strukturze cząsteczki białka była ograniczona do pojęcia polipeptydowego łańcucha jako jego podstawy bez określania prawidłowości kolejności reszt aminokwasów lub konfiguracji łańcucha. Opracowanie metod określenia kolejności reszt aminokwasów w polipeptydowym łańcuchu i udoskonalenie rentgenowskiej analizy strukturalnej pozwoliły na postęp dotyczący zarówno struktury pierwszorzędowej (kolejności reszt aminokwasów), jak i drugorzędowej (konfiguracja łańcucha polipeptydowedo łańcucha) białka. Obecnie w dostatecznym stopniu rozwiązano problem struktury pierwszo-, drugo-, trzecio- i czwartorzędowej molekuł białka. Definicję czterech poziomów struktury molekuł białka po raz pierwszy zaproponował Lindenstrom-Lang, wychodząc z założeń metodycznych. Wszystkie wymienione poziomy struktury współistnieją w cząsteczce białka i ich unikalny układ w każdym konkretnym przypadku określa ogólną budowę cząsteczki białka. Pierwszorzędowa struktura białka. Pod nazwą pierwszorzędowa struktura białka rozumiemy kolejność reszt aminokwasów w jednym lub kilku polipeptydowych łańcuchach, z których zbudowana jest cząsteczka białka. Kolejność tę od końca aminowego do karboksylowego peptydu nazywamy sekwencją. Znając sekwencję aminokwasów białka można zapisać jego pełny wzór strukturalny. Zakładając, że w cząsteczce białka jest co najmniej kilkadziesiąt reszt aminokwasów, określenie położenia każdego z nich stanowi bardzo skomplikowane zadanie. Jego rozwiązanie może być osiągnięte w rezultacie realizacji szeregu czynności przedstawionych na schemacie

20 38 Podstawy biochemii Schemat 1. Kolejność czynności dokonywanych podczas ustalenia pierwszorzędowej struktury białka: Białko Rozerwanie mostków disulfidowych w drodze utleniającego działania kwasu Białko zdenaturowane Hydroliza selektywna za pomocą enzymów lub metod chemicznych Mieszanina peptydów Frakcjonowanie metodą wysokonapięciowej elektroforezy Zasadowe Neutralne Kwasowe peptydy peptydy peptydy Subfrakcjonowanie metodami elektroforezy i chromatografii Indywidualne peptydy Określenie kolejności reszt aminokwasów w każdym peptydzie Pierwszorzędowa struktura indywidualnych peptydów Odtwarzanie pierwszorzędowej struktury białka Pierwszorzędowa struktura białka Rozerwanie wiązań disulfidowych w cząsteczce białka (schemat 1) jest koniecznie z jednej strony dla zabezpieczenia kolejnego etapu fragmentacji polipeptydowego łańcucha białka, a z drugiej dla przekształcenia wszystkich reszt cys w białku w reszty kwasu, który nie rozkłada się w dalszej analizie: Łańcuch NH CH CH2 S HCOOH; H 2O 2 I (NH 4 ) 2 MoO 4 CO łańcuch 2 Łańcuch NH CH CH 2 SO3H 2 I CO łańcuch Hydroliza selektywna zdenaturowanego białka prowadzona jest przy pomocy enzymów proteolitycznych, szczególnie trypsyny (hydrolizuje wiązanie peptydowe utworzone przez arg oraz lyz) lub chymotrypsyny (hydrolizuje wiązanie peptydowe utworzone przez trp, phe oraz tyr):

21 Rozdział 2. Białka 39 H(NHCHCO)xNHCHCO(NHCHCO)yNHCHCO(NHCHCO)zOH R' (CH 2 ) 4 R'' (CH 2 ) 3 R''' NH 2 HN C NH 2 H 2 O Trypsyna NH C O OH C O OH H(NHCHCO)xNHCH + H(NHCHCO)yNHCH + H(NHCHCO)zOH (CH 2 ) 3 R' (CH 2 ) 4 R'' R''' NH 2 HN C NH 2 NH Białka można degradować również za pomocą substancji chemicznych, np. bromocyjanu, który przecina łańcuch polipeptydowy przy resztach met, 2,4-dinitrofluorobenzenu przy resztach cys, a N-bromosukcynimidu przy resztach tyr lub trp itp.: H(NHCHCO)xNHCHCO(NHCHCO)yOH R' (CH 2 ) 2 SCH 3 R'' BrCN+H 2 O (HBr +CH 3 SCN) 90% kwas mrówkowy, temperatura pokojowa O H(NHCHCO)x NH CH C + H(NHCHCO)yOH O R' CH 2 CH 2 R'' W rezultacie otrzymuje się dwa-trzy różne zestawy peptydów, pochodnych badanego białka, co w końcowym etapie pracy umożliwia zbudowanie jego pierwszorzędowej struktury. 39

22 40 Podstawy biochemii Frakcjonowanie peptydów jest wielostopniowym, długim, pracochłonnym, ale koniecznym etapem określenia pierwszorzędowej struktury białka. W tym celu wykorzystuje się głównie wysokonapięciową (do V) elektroforezę, szczególnie w końcowym etapie frakcjonowania oraz chromatografie różnych typów, w tym jonowymienną oraz podziałową. Określenie kolejności reszt aminokwasów w indywidualnych peptydach jest najbardziej istotną procedurą podczas ustalenia pierwszorzędowej struktury białka. Obecnie wykorzystuje się przeważnie metodę Edmana lub spektrometrię masową. Białkiem, którego pierwszorzędowa struktura została ustalona jako pierwsza była insulina byka. Dokonał tego F. Sanger, który za tę pracę w 1958 r. otrzymał nagrodę Nobla. W czasie rozwiązywania pierwszorzędowej struktury białka powstaje ważne pytanie: czy w białkach są realizowane wszystkie potencjalnie możliwe kombinacje reszt aminokwasów, czy istnieją kombinacje reszt aminokwasów, charakterystyczne dla wielu, a może dla wszystkich białek. Przecież białka i peptydy, dzięki przestawieniu reszt aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym, mogą dawać ogromną liczbę izomerów (tabela 2.6). Oczywiście, zwiększenie liczby reszt aminokwasów w cząsteczce białka do kilkuset powoduje, że liczba możliwych izomerów może osiągnąć astronomiczną wielkość. Jednak analiza kolejności aminokwasów w białkach doprowadziła do stwierdzenia szeregu prawidłowości, pozwalających na postawienie tezy, że w białkach nie są realizowane wszystkie możliwe pierwszorzędowe struktury. Tabela 2.6. Liczba izomerów w zależności od liczby reszt aminokwasów Liczba reszt aminokwasów w cząsteczce Możliwa liczba izomerów Liczba reszt aminokwasów w cząsteczce Możliwa liczba izomerów ~ Przede wszystkim w różnych białkach, a często także i w jednym spotkać można identyczne peptydy. W 52 białkach rybosomowych identyczne trójpeptydowe bloki powtarzają się 657 razy, tetrapeptydowe 86, pentapeptydowe 11, heksapeptydowe 3, natomiast heptapeptydowe ani razu. Co więcej w polipeptydowych łańcuchach są obecne analogiczne ugrupowania peptydowe, różniące się od siebie analogicznymi resztami aminokwasów, tzn. takimi resztami aminokwasów, które są bliskie strukturalnie lub biogenetycznie, np. gly-ser, gly-ala, leu-ile, leu-val, glu-asp itp. Wykazano, że w szeregu przypadków pierwszorzędowa struktura różnych białek zawiera 50% i więcej identycznych peptydowych fragmentów. Drugorzędowa struktura białek. Ściśle liniowy łańcuch polipeptydowy jest spotykany tylko w bardzo ograniczonej liczbie białek. Jednym z nich jest fibroina jedwabiu białko wydzielone przez gąsienicę jedwabnika. Rentgenowska analiza

23 Rozdział 2. Białka 41 strukturalna dała możliwość wyjaśnienia charakteru liniowej budowy polipeptydowych łańcuchów w fibroinie jedwabiu. Na jej podstawie w latach 30. XX w. uważano białko za całkowicie wyprostowany polipeptydowy łańcuch z okresem identyczności co 0,71 nm (podobnie do tego, który jest przedstawiony na rys. 2.7). Później wykazano, że nawet w białkach fibrylarnych bardzo rzadko występują w pełni rozciągnięte polipeptydowe łańcuchy. Zdjęcia rentgenowskie wskazywały na obecność w łańcuchach białka elementów strukturalnych ułożonych oraz skręconych w taki sposób, że ich okres identyczności, czyli odległość między sąsiadującymi atomami o identycznej konfiguracji wynosi 0,54 nm. Na podstawie analizy rentgenogramów rozciągniętych i normalnych włóknistych białek, takich jak keratyna włosa, W. Astbury i F. Bell (1941) po raz pierwszy zaproponowali model skręconego łańcucha polipeptydowego. W pełni wyjaśniał on obserwowany w doświadczeniach okres identyczności o 0,54 nm i jego zmianę w czasie rozciągania włókna białka. Model ten był zbudowany z uwzględnieniem tego, że kąty walencyjne oraz odległości międzyatomowe, charakterystyczne dla wiązania peptydowego i jego najbliższego otoczenia, nie powinny być zakłócone. Modelowanie jako sposób badania struktury cząsteczki białka został zaproponowany przez L. Paulinga i R. Cori ( ). Opracowali oni kryteria do zbudowania modelu, podobnego do możliwego stanu łańcucha polipeptydowego w cząsteczce białka. Na podstawie tych kryteriów L. Pauling i R. Cori zbudowali helisy α i δ typów, a B. Lou i R. Beibutt π typu. Ponieważ tylko charakterystyka konformacji α-helisy była zgodna z wielkościami otrzymanymi dzięki rentgenowskiej analizie strukturalnej kryształów białka, to właśnie ona została uznana przez L. Paulinga i R. Cori jako jeden z elementów strukturalnych istniejących w molekułach białka (rys. 2.7). Obecnie istnienie łańcucha polipeptydowego w postaci α-helisy jest już ogólnie przyjęte. Jak widać na rysunku 2.7, α-helisa charakteryzuje się maksymalnie gęstym upakowaniem skręconego łańcucha polipeptydowego. Na każdy zwój prawoskręconej α-helisy przypada 3,6 reszt aminokwasów, których podstawniki boczne skierowane są zawsze na zewnątrz i trochę do tyłu, tzn. odchylone w kierunku początku łańcucha peptydowego. Kierunek biegu spirali łatwo można ustalić, patrząc na spiralę od strony N-końcowego aminokwasu łańcucha polipeptydowego (początek molekuły). Na modelu wyraźnie widać, że skręcenie łańcucha polipeptydowego zachodzi zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Krok spirali (odległość między zwojami) równy jest 0,54 nm, a kąt uniesienia zwoju 26 o. Okres identyczności, tzn. długość odcinka spirali w pełni powtarzającego się, stanowi 2,7 nm (co odpowiada 18 resztom aminokwasów). Najważniejszą rolę w formowaniu i utrzymywaniu α-helisy łańcucha polipeptydowego odgrywają wiązania wodorowe typu O H-N, powstałe między grupami CO i NH głównego łańcucha polipeptydowego, a które są rozmieszczone na sąsiednich zwojach spirali (rys. 2.7). Chociaż energia tych wiązań jest niewielka, to 41

24 42 Podstawy biochemii duża ich ilość prowadzi do znaczącego energetycznego efektu, dzięki czemu konfiguracja α-helisy jest dostatecznie stabilna i sztywna. Rys Modele oraz schemat α-helisy W modelu α-helisy (A) linią przerywaną zaznaczone zostały wiązania wodorowe pomiędzy grupami CO oraz NH (typu N-H O=C) ułożone w sąsiednich odcinkach spirali. Schemat α-helisy (B) zawiera tylko układ łańcucha polipeptydowego, a nie zawiera rodników bocznych, (C) α-helisa z uwzględnieniem planarności wiązań wodorowych. Przypuszcza się, że π-elektrony grup CO i NH łańcucha polipeptydowego mogą oddziaływać ze sobą poprzez wiązania wodorowe, które odpowiadają za kształt sąsiednich zwojów α-helisy. W rezultacie na helisach białka powstają strefy sprzężenia elektronów. Mogą one służyć do przekazywania energii wzbudzenia elektronów, co ma ogromne znaczenie w transformacji jednego rodzaju energii w drugi. Dlatego pod pojęciem drugorzędnej struktury molekuły białka rozumiemy tę lub inną konfigurcję, charakterystyczną dla jednego lub kilku łańcuchów polipeptydowych, wchodzących w skład cząsteczki. Oczywiście, nie należy przez to rozumieć, że w dowolnym białku łańcuch polipeptydowy jest jedynie w formie helikalnej. Takie przypadki są bardzo rzadkie. Widocznie dla każdego białka charakterystyczny jest stopień spiralizacji łańcucha polipeptydowego (tab. 2.7). W molekułach białka spiralne w części łańcucha polipeptydowego regularnie przeplatają się z liniowymi.

25 Rozdział 2. Białka 43 W naturalnych białkach istnieją tylko α-helikalne zakręcone w prawo konformacje łańcuchów polipeptydowych, co związane jest z istnieniem w białkach reszt aminokwasów wyłącznie o konformacji L-typu (za wyjątkiem szczególnych przypadków). Tabela 2.7. Stopień spiralizacji łańcucha polipeptydowego w różnych białkach Białko Paramiozyna Mioglobina Hemoglobina Albumina surowicy świni Albumina jaja kury Lizocyma jaja kury Wirus tytoniowej mozaiki (subjednostka) Pepsina Rybonukleaza Chemotrypsynogen Udział konfiguracji helikalnej spirali w łańcuchu polipeptydowym, % Równocześnie z α-helikalną strukturą w molekułach białek obserwuje się również β-struktury. Są to warstwowe struktury, tworzone z połączeń części łańcucha polipeptydowego znajdujących się w postaci zbudowanych liniowo peptydowych fragmentów. Liniowa konformacja tych fragmentów utrzymuje się dzięki powstaniu wiązań wodorowych pomiędzy równolegle ułożonymi i odległymi od siebie o 0,272 nm (odpowiednio długości wiązania wodorowego między grupami CO i NH) częściami łańcucha polipeptydowego (rys. 2.8). Podobne struktury przeważają w białkach włóknistych, np. fibroinie jedwabiu. Jednak także w globularnych białkach β-struktury często występują i niekiedy dominują nad α-strukturami. Powstanie α- i β-struktur w molekule białka jest następstwem tego, że aminokwasy i w składzie łańcuchów polipeptydowych zachowują właściwą dla nich zdolność do tworzenia wiązań wodorowych. W związku z tym bardzo ważna właściwość aminokwasów łączenie się ze sobą za pomocą wiązań wodorowych w procesie tworzenia układów krystalicznych realizuje się w postaci konformacji α-helikalnej lub β-struktury. To znaczy, że powstanie wskazanych struktur można rozpatrywać jako proces krystalizacji części łańcucha polipeptydowego w granicach jednej cząsteczki białka. Zdolność do tworzenia wiązań wodorowych, będących napędową siłą w czasie tworzenia α- i β-struktur w molekule białka, jest właściwa w różnym stopniu dla różnych aminokwasów. Wśród nich wydzielić można grupę aminokwasów przyjmujących strukturę helisy, do której należą: ala, glu, gln, leu, lyz, met oraz his. Jeżeli reszty wymienionych wyżej aminokwasów dominują w jakiejś części łańcucha polipeptydowego lub w całym jego składzie, to tworzenie struktury α-helikalnej zachodzi się bardzo łatwo. Takie aminokwasy, jak: val, ile, trp, tyr 43