Szczep drożdżowy przeznaczony do biologicznej walidacji inhibitorów szlaku kwasu mewalonowego, sposób jego wytwarzania oraz jego zastosowanie

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. C12N 1/16 ( ) C12N 1/15 ( ) C12R 1/865 ( ) C12N 15/53 ( ) C12N 1/04 ( ) C12P 1/02 ( ) C12P 7/42 ( ) (54) Szczep drożdżowy przeznaczony do biologicznej walidacji inhibitorów szlaku kwasu mewalonowego, sposób jego wytwarzania oraz jego zastosowanie (73) Uprawniony z patentu: INSTYTUT BIOCHEMII I BIOFIZYKI POLSKA AKADEMIA NAUK, Warszawa, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 14/10 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 01/12 (72) Twórca(y) wynalazku: BEATA BURZYŃSKA, Warszawa, PL ANNA SZKOPIŃSKA, Warszawa, PL AGATA LESZCZYŃSKA, Warszawa, PL BARBARA KŁUDKIEWICZ, Warszawa, PL JANINA LUTYK-NADOLSKA, Józefów, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Iwona Brodowska PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest szczep drożdżowy z wprowadzonymi ludzkimi genami kodującymi dzikie lub zmutowane formy HMGR, przeznaczony do biologicznej walidacji inhibitorów szlaku kwasu mewalonowego, którego końcowym produktem jest cholesterol, sposób jego wytwarzania oraz jego zastosowanie. Wstęp Przyczyną wielu chorób cywilizacyjnych są zaburzenia w gospodarce lipidowej. Należą do nich choroby sercowo-naczyniowe, cukrzyca typu II związana z otyłością, zawały serca oraz udary. Inną grupą chorób jest rak, choroba Alzheimera, Parkinsona, czy choroby związane z defektami w poziomie syntezy cholesterolu i magazynowaniem lipidów. W społeczeństwach europejskich choroby naczyniowe są jednymi z głównych powodów niepełnosprawności i śmierci. Statyny uznawane są za wysoce skuteczną grupę leków w pierwotnej i wtórnej prewencji chorób układu sercowo-naczyniowego. Hamując kompetycyjnie reduktazę 3-hydroksy-3-metylo-glutarylokoenzymu A (HMGR), główny enzym szlaku biosyntezy cholesterolu, statyny obniżają biosyntezę cholesterolu i zmniejszają jego pulę w komórkach. Prowadzi to do zwiększenia ekspresji receptorów LDL, większego wychwytu LDL cholesterolu z krążenia, a w konsekwencji do mniejszego ich stężenia w osoczu. Następuje przy tym zwiększenie stężenia frakcji HDL. Leki te wykazują również szereg innych, plejotropowych efektów działania. Poprawiają funkcję śródbłonka naczyniowego, hamują funkcję makrofagów, hamują rozrost i migrację komórek mięśni gładkich, działają przeciwzapalnie, a także wpływają korzystnie na krzepnięcie krwi, fibrynolizę oraz aktywność płytek krwi. Większość z tych efektów przyczynia się do redukcji ryzyka powikłań sercowo-naczyniowych. Potwierdzają to badania kliniczne, w których stwierdzono liczne korzyści stosowania statyn - zmniejszenie: ryzyka nowych zdarzeń wieńcowych, umieralności z przyczyn sercowo-naczyniowych, umieralności całkowitej, konieczności wykonywania rewaskularyzacji serca oraz częstości hospitalizacji. Statyny stosuje się zatem w hipercholesterolemii rodzinnej heterozygotycznej oraz mieszanej hiperlipidemii z przeważającym zwiększeniem stężenia cholesterolu i nieznacznym zwiększeniem stężenia triglicerydów. Szczególnie wskazane są u chorych po zawale serca i po zabiegach na naczyniach wieńcowych. Na podstawie licznych badań wiadomo, że pacjenci w różny sposób odpowiadają na podawane statyny. Leki te różnią się siłą działania zmniejszającego stężenie LDL cholesterolu i to przynajmniej dwukrotnie. Na przykład, niedawne badania porównujące siłę działania statyn pokazują zmniejszenie stężenia LDL cholesterolu o 20-30% w przypadku prawastatyny (10-40 mg/d), o 28-46% w przypadku simwastatyny (10-80 mg/d), o 37-51% w przypadku atorwastatyny (10-80%) i 46-55% w przypadku rosuwastatyny (10-40 mg/d). Choć statyny są na ogół dobrze tolerowane, u części pacjentów mogą wywoływać działania niepożądane. Pojawić się mogą przejściowe zaburzenia ze strony układu pokarmowego, duże dawki mogą uszkadzać komórki wątroby i mięśnie szkieletowe. Statyny zwiększają aktywność fosfokinazy kreatynowej w mięśniach (u ok. 1% leczonych) i mogą w różnym stopniu uszkadzać mięśnie szkieletowe - od łagodnej miopatii do zapalenia mięśni, rzadziej rabdomiolizy, a nawet śmierci. Ponadto czasopisma medyczne podają coraz więcej doniesień o niewyjaśnionych zaburzeniach neurologicznych towarzyszących terapiom statynowym. Badania przedkliniczne leków Obecnie w celu poszukiwania nowych leków przeprowadza się skrining potencjalnych substancji leczniczych. W celu określenia zarówno profilu działania, jak i efektów toksycznych nowych leków niezbędne są badania na zwierzętach, które powinny być wykonywane równocześnie z innymi badaniami uzupełniającymi. Badania uzupełniające to doświadczenia na systemach enzymatycznych, na izolowanych komórkach lub hodowlach komórek oraz na narządach izolowanych. Przykładem mogą być badania na zalęgłych jajach kurzych lub badania na rogówce oka królika. Badanie wchłaniania przez skórę miejscowo działających środków dermatologicznych prowadzi się na modelach skóry ludzkiej (np. rekonstruowany naskórek). Dotychczas stosowane metody wstępnej walidacji nowych statyn naturalnych, jak i syntetycznych charakteryzują się trudnościami w standaryzacji, wysokimi kosztami wykonywanych oznaczeń,

3 PL B1 3 brakiem możliwości uwzględnienia różnic genetycznych występujących w ludzkiej HMGR, jak również koniecznością przeprowadzenia kilku analiz wykazujących zmiany w poziomie syntetyzowanych lipidów po zastosowaniu testowanej statyny. Nieoczekiwanie okazało się, że możliwe jest wytworzenie zmodyfikowanego szczepu drożdżowego według wynalazku, pozwalającego na stworzenie efektywnego i prostego systemu, umożliwiającego testowanie statyn, bądź innych inhibitorów ludzkiej HMGR w systemie drożdżowym. Istota wynalazku Szczep drożdżowy przeznaczony do biologicznej walidacji inhibitorów szlaku kwasu mewalonowego, według wynalazku, charakteryzuje się tym, że stanowi go szczep drożdżowy Saccharomyces cerevisiae typu BY, z wprowadzonym ludzkim genem kodującym dziką lub występujące u pacjentów z objawami chorobowymi zmutowane formy HMGR o długości 4471 nukleotydów. Szczep drożdżowy, według wynalazku, korzystnie zawiera gen HMGR z wprowadzoną zidentyfikowaną zmianą w pozycji 766, CAG CAT, czyli zamieniony kwas glutaminowy na tristydynę i/lub w pozycji 393 ze zmienioną CGA CAG, czyli argininę na glutaminę. Sposób wytwarzania szczepu drożdżowego według wynalazku, charakteryzuje się tym, że sekwencjonuje się reduktazę ludzką, zwłaszcza od pacjentów z objawami chorobowymi, następnie wprowadza się do genu HMGR, korzystnie metodą PCR, zidentyfikowaną zmianę w pozycji 766, CAG CAT, czyli zamienia kwas glutaminowy na histydynę i/lub w pozycji 393 zmienia CGA CAG, czyli argininę na glutaminę, po czym DNA zawierające wprowadzoną mutację liguje się do wektora. W sposobie według wynalazku, korzystnie, do ligacji stosuje się wektory plazmidowe zawierające promotor MET25, GFP i otrzymane zmutowane wersje genu HMGR. Uzyskane plazmidy przedstawiono w tabeli 2. Zastosowanie szczepu drożdżowego według wynalazku do biologicznej walidacji inhibitorów szlaku kwasu mewalonowego, którego końcowym produktem jest cholesterol. Poniżej przedstawiono przykłady wykonania wynalazku. P r z y k ł a d I. Klonowanie ludzkiego genu HMGR Gen ludzki namnożono metodą PCR (Polimerase Chain Reaction) na matrycy cdna, przy użyciu primerów: HMG-F: 5'-TCTGGAGGATCCAAGGATrCTG-3' i HMG-R: 5'-ACCAAGTGGCTGTCTCA- GTGAT-3' (polimeraza TaKara). Uzyskany produkt PCR zawierał część kodującą z otoczeniem +30 pz przed ATG i pz za STOP i został wklonowany do pgem-t Easy-pMB7/8. Konstrukt pmb7/8 został zsekwencjonowany i posłużył do dalszych konstrukcji. pmb7/8 trawiono BamHI (przed ATG) i EcoRI (z pgeil-t Easy). Fragment około 2831 pz wklonowano do pyes2 w miejsca BamHI/EcoRI-pMB8/2 i pug36-pmb9/10 (konstrukt zawiera promotor IET25 i GFP na N-końcowej części HMGh z zachowaniem ramki odczytu). pmb9/10 wytrawiono Sacl/Sall i fragment zawierający promotor MET25 i GFP na N-końcowej części HMGh z zachowaniem ramki odczytu i wligowano do pyep351 w miejsca Sacl/Sall-pMB11 i do prs315-pmb12. Sprawdzenie ekspresji ludzkiej reduktazy w delecji drożdżowej Użyto szczepów BY z wprowadzoną kasetą oporności na G418 (geneticin)-kanmx4. Wykorzystane oraz otrzymane szczepy i ich charakterystykę przedstawiono w tabeli 1. Dla rozróżnienia reduktaz do szczepu z Δhmg1 wintegrowano w miejsce KanMX4 gen HIS3 używając konstruktu trawionego Notl M4754 (Voth et al. 2003). W ten sposób uzyskano szczep MB01. Po skrzyżowaniu szczepów MB01 z Y16054 otrzymano szczep diploidalny MB02. Szczep MB02 został stransformowany plazmidem pmb8/2 (pgal1-hmgh, URA3 + ). Po rozłożeniu tetrad uzyskano szczep MB03-1D, niosący Δhmg1Δhmg2, który był żywotny dzięki ludzkiej reduktazie na plazmidzie. P r z y k ł a d II. Klonowanie mutacji 393 i 766 W wyniku sekwencjonowania reduktazy ludzkiej od pacjentów z objawami chorobowymi zidentyfikowano dwie mutacje: 393 i 766. Używając primerów: 766R 5'-CAATGTAGATGGCGGTGACAATGTTTGC-3' i 766F 5'-CCTGT- GGACATGATGCAGCACAGAATG-3' wprowadzono do genu HMGR mutację 766, która ma mocniejszy fenotyp, zmieniając CAG CAT, zamieniając kwas glutaminowy na histydynę.

4 4 PL B1 Natomiast primery 393-Fl 5'-GGATAAACCAGGAAAGAAAAGTTGAGG-3" i 393R 5'-CTGTCTC- TTCCTCTACTGAATCAC-3' umożliwiły wprowadzenie mutacji 393, co doprowadziło do zamiany CGACAG, zamieniając argininę na glutaminę. Mutacje zostały wprowadzone metodą PCR na matrycy pmb7/8. Następnie, DNA zawierające wprowadzoną mutację trawiono BamHI/EcoRI i ligowano do pyes2, pug34. Uzyskane plazmidy przedstawiono w tabeli 2. Konstrukty pmb23 i pmb24 zawierające promotor MET25, GFP i zmutowane wersje HMGR zostały wytrawione Sacl/Sall i wligowane do pyep351 w miejsca Sacl/Sall. P r z y k ł a d III. Testy szalkowe dla zmutowanych wersji HMGR Do szczepu MB03-1D, niosącego delecje obu drożdżowych reduktaz i dziką HMGh (pmb8/2) regulowaną galaktozą dotransformowano pmb25 (HMGh-766) i pmb26 (HMGh-393). Transformanty hodowane były na pożywce minimalnej z galaktozą. Uzyskane transformanty testowano na następujących podłożach: - pożywka minimalna z glukozą; - pożywka minimalna z galaktozą +FoA; - pożywka minimalna z galaktozą leu. P r z y k ł a d IV. Analiza profili lipidowych komórek Komórki drożdżowe z wprowadzonymi ludzkimi genami kodującymi dziką lub zmutowane formy HMGR traktowane są różnymi rodzajami statyn. Z komórek tych ekstrahowane są lipidy. Otrzymany ekstrakt lipidowy analizowany jest przy pomocy chromatografii cienkowarstwowej na silicażelu w solwentach polarnych i obojętnych. Otrzymane w ten sposób lipidogramy pozwalają na stwierdzenie: 1. wpływu każdego rodzaju statyny na syntezę: a. lipidów komórkowych powstających w szlaku kwasu mewalonowego, którego końcowym produktem jest cholesterol - u ludzi, bądź ergosterol - u drożdży; b. prekursorów sterolowych, również tych mogących przejmować funkcje cholesterolu (ergosterolu); 2. zmian w syntezie klas lipidów nie powstających w szlaku kwasu mewalonowego, takich jak: a. triglicerydy; b. fosfolipidy; c. sfingomieliny. 3. powstawania pochodnych statyn w komórce w procesie ich metabolizowania. 4. indywidualnej, wynikającej z mutacji w genie kodującym HMGR reakcji pacjenta na podawane statyny. Końcowe wnioski 1. Zaproponowany model umożliwia testowanie inhibitorów HMGR prowadzących do obniżenia poziomu cholesterolu. 2. Model pozwala na szybki i tani skrining inhibitorów HMGR eliminujący substancje mniej skuteczne lub powodujące zbyt wiele niekorzystnych działań ubocznych. 3. Model daje możliwość indywidualnego doboru rodzaju i dawki statyny do pacjenta. 4. Zastosowanie modelu w bardzo istotnym stopniu ograniczy koszty wprowadzenia na rynek leków obniżających poziom cholesterolu przez hamowanie HMGR. T a b e l a 1 Szczep Genotyp Referencje Y06733 Mat a his3δ1 Ieu2Δ0 met15δ0 ura3δ0 YML075c::kanMX4 Euroscarf Y16054 Mat a his3δ1 leu2δ0 lys2δ0 ura3δ0 YLR450w::kanMX4 Euroscarf MB01 MB03-1D Mat a; his3δ1; leu2δ0; met15δ0; ura3δ0; YML075c::kanMX4::HIS::kanMX4 Mat a; his3δ1; leu2δ0; lys2δ0; ura3δ0; YML075C::kanMX4: :HIS::kanMX4; YLR450w::kanMX4 + pgal4-hmgh/pyes2 (URA + ) S. cerevlsiae szczep powstał po wprowadzeniu kasety HIS w KAN- MX4 do Y06733

5 PL B1 5 T a b e l a 2 Plazmid pmb7/8 pmb8/2 PMB9/10 pmb11 pmb25 pmb26 pmb21 pmb22 pmb23 pmb24 Genotyp HMGh/pGm -T Easy, 2µ, P GAL1 -HMGh, URA3 CEN, P MET25 -GFP-HMGh, URA3 2µ, P MET25 -GFP-HMGh, LEU2 2µ, P MET25 -GFP-HMGh-766, LEU2 2µ, P MET25 -GFP-HMGh-393, LEU2 2µ, P GAL1 -HMGh-393, URA3 2µ, P GAL1 -HMGh-766, URA3 CEN, P MET25 -GFP-HMGh-393, HIS3 CEN, P MET25 -GFP-HMGh-766, HIS3 Zastrzeżenia patentowe 1. Szczep drożdżowy przeznaczony do biologicznej walidacji inhibitorów szlaku kwasu mewalonowego, stanowiący szczep drożdżowy Saccharomyces cerevisiae typu BY, z wprowadzonym ludzkim genem kodującym dziką lub zidentyfikowane u pacjentów zmutowane formy HMGR o długości 4471 nukleotydów. 2. Szczep według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera gen HMGR y wprowadzoną zidentyfikowaną zmianą w pozycji 766, CAG CAT, czyli zamieniony kwas glutaminowy na histydynę i/lub w pozycji 393 ze zmienioną CGA CAG, czyli argininę na glutaminę. 3. Sposób wytwarzania szczepu drożdżowego przeznaczonego do biologicznej walidacji inhibitorów szlaku kwasu mewalonowego, znamienny tym, że sekwencjonuje się reduktazę ludzką, zwłaszcza od pacjentów z objawami chorobowymi, następnie wprowadza się do genu HMGR mutacje, korzystnie metodą PGR, zmieniając przykładowo w pozycji 766, CAG CAT, czyli kwas glutaminowy na histydynę i/lub w pozycji 393, zmieniając CGA CAG, czyli argininę na glutaminę, po czym DNA zawierające wprowadzoną mutację liguje się do wektora. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że do ligacji stosuje się wektory plazmidowe zawierające promotor MET25, GFP i otrzymane zmutowane wersje genu HMGR. 5. Zastosowanie szczepu jak określono w zastrz. 1, do biologicznej walidacji inhibitorów szlaku kwasu mewalonowego, którego końcowym produktem jest cholesterol (ergosterol).

6 6 PL B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)