Wpływ czasu przechowywania nasienia królika na parametry ruchu i zdolność zapładniającą plemników*

Transkrypt

1 Rocz. Nauk. Zoot., T. 39, z. 1 (2012) Wpływ czasu przechowywania nasienia królika na parametry ruchu i zdolność zapładniającą plemników* * P i o t r G o g o l Instytut Zootechniki Państwowy Instytut Badawczy, Dział Biotechnologii Rozrodu Zwierząt, Balice k. Krakowa W przeprowadzonych badaniach sprawdzano wpływ czasu przechowywania nasienia na parametry ruchu i zdolność zapładniającą plemników królika. Nasienie pobierano od 9 samców rasy nowozelandzkiej białej, rozrzedzano rozcieńczalnikiem Galap i przechowywano przez 48 godzin w temperaturze +15 C. Parametry ruchu oceniano po 4, 24 i 48 godzinach przy użyciu systemu komputerowej analizy ruchu plemników (CASA). Stwierdzono istotny wpływ czasu przechowywania na parametry ruchu plemników (z wyjątkiem szybkości ruchu prostoliniowego). Ruch całkowity i ruch postępowy były parametrami, których wartości zmieniały się najbardziej w trakcie przechowywania (spadek odpowiednio o 32,6 i 29,3%). Ocenę zdolności zapładniającej nasienia konserwowanego wykonano inseminując samice nasieniem przechowywanym przez okres 4 lub 48 godzin. Odsetek samic wykoconych po inseminacji nasieniem przechowywanym przez 4 godziny był wyższy w porównaniu do uzyskanego po inseminacji nasieniem przechowywanym przez 48 godzin (odpowiednio 83 i 74%). Ponadto dłuższy czas przechowywania nasienia spowodował spadek średniej liczby młodych w miocie o 2,11 (P<0,01) i średniej liczby żywych w miocie o 1,74 (P<0,01). Uzyskane wyniki wykazały, że parametry ruchu plemników oceniane przy użyciu systemu CASA są czułym wskaźnikiem jakości konserwowanego nasienia królika. Inseminacja jako ważny element biotechnologii rozrodu jest coraz częściej stosowaną metodą w hodowli królików. W praktyce inseminacyjnej stosuje się obecnie niemal wyłącznie nasienie świeże lub konserwowane w stanie płynnym przez stosunkowo krótki czas (Roca i in., 2000; Lopez-Gatius i in., 2005). Nasienie mrożone charakteryzuje się obniżoną wartością biologiczną, co sprawia, że po jego zastosowaniu uzyskuje się na ogół niższą płodność i plenność (Fargeas, 1995; Gogol, 1997; Mocé i in., 2010). Fakt ten, jak również konieczność znacznej selekcji samców i ejakulatów w kierunku przydatności nasienia do zamrażania jest głównym czynnikiem ograniczającym szerokie wykorzystanie nasienia od wybitnych samców. W związku z tym, głównym kierunkiem badań jest doskonalenie rozcieńczalników do przechowywania nasienia królika w temperaturach dodatnich. Dąży się do wydłużenia czasu przecho- Źródła finansowania: podzadanie nr

2 98 P. Gogol wywania nasienia bez obniżania wskaźników płodności (Alvarino, 2000; Roca i in., 2000). Możliwość przechowywania nasienia przez okres 2 3 dni, przy zachowaniu zdolności zapładniającej plemników, ułatwiłaby transport i dalsze rozpowszechnienie sztucznego unasieniania królików. Efektywny przebieg procesu zapłodnienia uzależniony jest głównie od aktywności metabolicznej komórek plemnikowych oraz od pełnej sprawności ich złożonego aparatu ruchu, gwarantującego prawidłowy transport przenoszonego przez plemnik materiału genetycznego. W związku z tym ocena jakości nasienia może być wykonywana na dwa sposoby: poprzez określanie aktywności ruchowej plemników oraz oznaczanie intensywności procesów biochemicznych charakteryzujących metabolizm komórki plemnikowej. Ocena ruchu plemników jest podstawowym, najczęściej wykonywanym testem. Powszechnie uważa się, że istnieje związek pomiędzy ruchliwością i płodnością, choć dane literaturowe na ten temat nie są jednoznaczne, a uzyskiwane w praktyce współczynniki korelacji niskie (Gadea, 2005). Prawdopodobnie wynika to z faktu niskiej powtarzalności i braku standaryzacji powszechnie stosowanej szacunkowej metody oceny ruchliwości plemników. Spowodowane to jest wieloma różnorodnymi czynnikami, z których należy wymienić doświadczenie przeprowadzającego ocenę, liczbę plemników poddanych ocenie, różnice w przygotowaniu preparatów, trudności z wizualną oceną charakterystyki ruchu plemników. Prowadzi to do różnic przy ocenie tego samego ejakulatu przez różne osoby lub laboratoria. Różnice pomiędzy wynikami subiektywnej oceny ruchu plemników jednego ejakulatu mogą sięgać nawet 30 60% (Verstegen i in., 2002). Wad tych jest pozbawiona wprowadzona w ostatnich latach ocena przy wykorzystaniu komputerowych systemów analizy nasienia (CASA). Główną zaletą automatycznych systemów analizy nasienia jest ich obiektywność, możliwość określania równocześnie wielu parametrów ruchu oraz standaryzacji warunków badania. Umożliwia to kontrolę jakości oraz zapewnia porównywalność wyników uzyskanych w różnych laboratoriach. Dotychczasowe badania (Farrell i in., 1998; Verstegen i in., 2002) wskazują na większą przydatność oceny ruchliwości przy zastosowaniu systemów CASA w porównaniu do wyników standardowego, subiektywnego badania. W przypadku nasienia królika przeprowadzono do tej pory jednak jedynie pojedyncze, wstępne badania, które wskazują na możliwość wykorzystania systemu CASA w przewidywaniu zdolności zapładniającej plemników (Lavara i in., 2005; Quintero-Moreno i in., 2007). Celem badań była ocena wpływu czasu przechowywania nasienia królika na parametry ruchu oceniane przy użyciu systemu CASA oraz zdolność zapładniającą plemników. Materiał i metody W badaniach wykorzystano nasienie 9 zdrowych, dojrzałych płciowo samców rasy nowozelandzkiej białej. Nasienie pobierano przy użyciu sztucznej pochwy w odstępach tygodniowych. Bezpośrednio po pobraniu oceniano objętość ejakulatu i koncentrację plemników. Do badań kwalifikowano ejakulaty o objętości minimum 0,6 ml i koncentracji powyżej plemników/ml. Zakwalifikowane ejakulaty rozrzedzano rozcieńczalnikiem Galap w stosunku 1:10 i przechowywano w tempe-

3 Czas przechowywania nasienia królika a właściwości plemników 99 raturze +15ºC przez 48 godzin. Po 4, 24 i 48 godzinach pobierano próbkę nasienia o objętości 0,5 ml, inkubowano przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 C, a następnie oceniano ruchliwość plemników. Ocena ruchu plemników Ocena ruchu wykonywana była przy użyciu komputerowego systemu analizy jakości nasienia (CASA) (Sperm Class Analyzer, S.C.A V5.1, Microptic, Barcelona, Spain). Bezpośrednio po dokładnym wymieszaniu nasienia próbka o objętości 3 µl była umieszczana na ogrzanym standardowym szkiełku Leja, posiadającym 4 komory pomiarowe (Leja Products B.V., The Netherlands). Ruch oceniano przy wykorzystaniu mikroskopu wyposażonego w urządzenie kontrastowo-fazowe i stolik podgrzewczy o temperaturze 37 C. Z każdej próbki nasienia analizowano minimum 500 plemników. Określano następujące parametry ruchu plemników: ruch całkowity (TMOT, %), ruch postępowy (PMOT, %), szybkość względem zarejestrowanego toru (VCL, µm/s), szybkość ruchu postępowego (VSL, µm/s), szybkość względem ścieżki przybliżonej (VAP, µm/s), liniowość (LIN, %; stosunek VSL/VCL 100), prostość (STR, %; stosunek VSL/VAP 100), amplitudę bocznych odchyleń główki (ALH, µm) i częstotliwość bocznych odchyleń główki (BCF, Hz). Ocena zdolności zapładniającej plemników Ocenę zdolności zapładniającej nasienia konserwowanego wykonano, inseminując samice nasieniem przechowywanym przez okres 4 lub 48 godzin. Przeprowadzono łącznie 150 zabiegów inseminacji nasieniem rozcieńczonym rozcieńczalnikiem Galap w stosunku 1:10. W celu synchronizacji rui stosowano domięśniową iniekcję 20 j.m. PMSG (Folligon, Intervet, The Netherlands) dwa dni przed inseminacją. 100 samicom podano nasienie przechowywane przez 4 godziny, natomiast 50 samicom nasienie przechowywane przez 48 godzin. W celu wywołania owulacji bezpośrednio po inseminacji samicom podawano domięśniowo 0,2 ml preparatu Receptal (Hoechst, Germany). Zdolność zapładniającą plemników oceniano na podstawie odsetka samic wykoconych oraz średniej liczby królików urodzonych w miocie. Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej przy użyciu pakietu Statistical Analysis System (SAS, version 8.2). Wyniki Stwierdzono istotny wpływ czasu przechowywania nasienia na parametry ruchu plemników (tab. 1). Efekt ten był szczególnie widoczny w odniesieniu do parametrów TMOT, PMOT, LIN, STR, ALH, BCF (P<0,01). Nie stwierdzono natomiast istotnego wpływu czasu przechowywania na wartości parametru VSL (P>0,05). W czasie przechowywania nasienia obserwowano stopniowy spadek wartości parametrów TMOT, PMOT, VCL i VAP oraz wzrost wartości parametru LIN. Wzrost wartości STR i BCF oraz spadek wartości ALH był szczególnie istotny po 24 godzinach przechowywania nasienia. Po 48 godzinach przechowywania wartości tych parametrów zmieniły się już tylko nieznacznie w stosunku do uzyskanych po 24 godzinach.

4 100 P. Gogol Tabela 1. Wpływ czasu przechowywania na parametry ruchu plemników królika (średnie, ±błąd standardowy; n = 20) Table 1. Effect of storage time on parameters of sperm motility (mean ± SE; n = 20) Parametr Parameter 4 godziny 4 hours 24 godziny 24 hours 48 godzin 48 hours TMOT 75,1±3,0 Aa 66,5±2,2 ABa 54,2±2,2 Bb PMOT 61,1±3,1 Aa 53,2±2,3 ABa 41,1±2,1 Bb VCL 103,0±5,1 a 94,8±4,0 ab 83,2±4,0 b VSL 42,2±2,9 a 49,1±3,6 a 45,1±3,6 a VAP 75,5±4,9 a 71,1±4,1 ab 61,7±4,2 b LIN 40,4±1,8 Aa 51,0±2,2 ABb 53,4±2,8 Bb STR 55,9±1,7 Aa 68,0±1,6 Bb 72,5±1,8 Bb ALH 3,4±0,1 Aa 2,9±0,1 Bb 2,7±0,1 Bb BCF 7,0±0,2 Aa 8,0±0,2 Bb 8,6±0,2 Bb Wartości w wierszach oznaczone różnymi literami różnią się istotnie: a, b (P<0,05); A, B (P<0,01). Values in rows with different letters differ significantly: a, b (P<0,05); A, B (P<0,01). Odsetek samic wykoconych po inseminacji nasieniem przechowywanym przez 4 godziny był wyższy w porównaniu do uzyskanego po inseminacji nasieniem przechowywanym przez 48 godzin, ale różnica ta była statystycznie nieistotna (tab. 2). Dłuższy czas przechowywania nasienia spowodował spadek średniej liczby młodych w miocie o 2,11 (P<0,01) i średniej liczby żywych w miocie o 1,74 (P<0,01). Tabela 2. Wpływ czasu przechowywania na zdolność zapładniającą plemników królika Table 2. Effect of storage time on fertilizing capacity of rabbit spermatozoa Wyszczególnienie Item Liczba samic inseminowanych No. of inseminated does Odsetek samic wykoconych No. of does kindled Liczba młodych w miocie (ogółem) No. of young rabbits per litter (total) Liczba młodych w miocie (żywe) No. of young rabbits per litter (live) 4 godziny 4 hours Wartości w wierszach oznaczone różnymi literami różnią się istotnie: A, B (P<0,01). Values in rows with different letters differ significantly: A, B (P<0.01). 48 godzin 48 hours 83,00 74,00 11,27 A 9,16 B 10,55 A 8,81 B Omówienie wyników Przeprowadzone badania wykazały istotny wpływ czasu przechowywania nasienia na parametry ruchu plemników (z wyjątkiem VSL) oceniane przy użyciu systemu CASA. Szczególnie istotne zmiany zaobserwowano w odniesieniu do ruchu całkowitego i postępowego plemników (spadek odpowiednio o 32,6 i 29,3%). Badania wska-

5 Czas przechowywania nasienia królika a właściwości plemników 101 zują, że ruch całkowity jest bardzo istotnym parametrem przy określaniu płodności nasienia królika i buhaja. Stwierdzono korelacje pomiędzy odsetkiem ruchliwych plemników w nasieniu królika i odsetkiem zapłodnionych oocytów po 42 godzinach od inseminacji (Hagen i in., 2003) oraz odsetkiem samic wykoconych (Lavara i in., 2005). W przypadku nasienia buhaja odsetek plemników ruchliwych po rozmrożeniu był parametrem najsilniej skorelowanym z płodnością mrożonego nasienia (Januskauskas i in., 2003). Chociaż niektóre parametry ruchu plemnika są ważne dla zdolności do zapłodnienia oocytu (Aitken i Clarkson, 1988), to wciąż nie jest wyjaśnione, które charakterystyki ruchu oceniane przy użyciu systemu CASA posiadają najwyższą wartość w przewidywaniu płodności i przez to są najbardziej przydatne w określaniu jakości nasienia in vitro. Hirano i in. (2001) wykazali ścisłe korelacje pomiędzy płodnością a parametrami VCL, VSL i ALH plemników człowieka. Również wartość ALH ruchliwych plemników człowieka selekcjonowanych metodą swim-up była skorelowana dodatnio ze wskaźnikami płodności (Liu i in., 1991). Dodatnie korelacje wykazano pomiędzy parametrami VCL, VSL oraz całkowitą liczbą mrożonych-rozmrożonych ruchliwych plemników zdeponowanych do narządu płciowego a wskaźnikami płodności (Verstegen i in., 2002). W badaniach wykonanych na nasieniu mężczyzn stwierdzono, że sam parametr VCL ma wysoką wartość w przewidywaniu płodności (Marshburn i in., 1992; Larsen i in., 2000). Spośród parametrów określających szybkość ruchu plemnika, ocenianych w przedstawianej pracy, to właśnie wartość VCL obniżyła się najbardziej w trakcie przechowywania nasienia. Świadczy to o wysokiej czułości i przydatności tego parametru w określaniu jakości konserwowanego nasienia królika. Jeśli w modelach statystycznych oceniających płodność nasienia buhajów uwzględniano kilka parametrów ruchu (ALH, BCF, LIN, VAP, VSL), to w dużym stopniu udawało się wyjaśnić różnice w płodności (Farrell i in., 1998). W przypadku świeżego nasienia królika dobre efekty uzyskano po uwzględnieniu takich parametrów, jak TMOT, PMOT, VCL, ALH, BCF, LIN, VAP i VSL (Farrell i in., 1993). W badaniach Lavara i in. (2005) wykonanych na nasieniu królika parametrami o największym znaczeniu były VAP, VCL oraz LIN. Dwa spośród nich, a mianowicie VCL i LIN, są ściśle związane z formą ruchu charakterystyczną dla hyperaktywacji plemników (Cancel i in., 2000; Schmidt i Kamp, 2004). Ponieważ hyperaktywacja jest właściwością ruchową obserwowaną u plemników podlegających kapacytacji, to przechowywane plemniki wykazujące takie cechy ruchowe mogą się charakteryzować krótszym czasem przeżycia i niższą zdolnością zapładniającą. Z tego względu identyfikacja plemników hyperaktywowanych ma duże znaczenie. Hyperaktywowane plemniki ssaków charakteryzuje utrata postępowego charakteru ruchu z towarzyszącymi gwałtownymi zmianami kierunku, dużą amplitudą bocznych odchyleń główki oraz porównywalną z biczem pracą witki. W przypadku plemników knura hyperaktywacja powoduje spadek wartości VSL i wzrost VCL prowadzący do spadku liniowości. Zmiany parametrów związanych z hyperaktywacją plemników, obserwowane w prezentowanym doświadczeniu, a mianowicie wzrost liniowości, spadek ALH i VCL oraz brak istotnych zmian VSL wskazują, że zjawisko to nie wystąpiło w trakcie przechowywania nasienia.

6 102 P. Gogol Wcześniejsze badania (Roca i in., 2000; Gogol i Bochenek, 2003; Gogol i Wierzchoś-Hilczer, 2009), jak również wyniki uzyskane w niniejszej pracy, świadczą o tym, że spadek ruchliwości i zmiany charakterystyk ruchu plemników królika obserwowane w trakcie przechowywania nasienia, przy nieznacznym tylko obniżeniu integralności błon komórkowych, są prawdopodobnie spowodowane uszkodzeniami elementów aksonemy. Tego typu uszkodzenia mogą powstawać na skutek działania wolnych rodników w warunkach stresu oksydacyjnego. Produkcja wolnych rodników może być znacznie podwyższona w wyniku zmian metabolicznych zachodzących w trakcie przechowywania nasienia in vitro (Hammerstedt, 1993). Castellini i in. (2000) wykazali, że peroksydacja jest jedną z głównych przyczyn uszkodzeń plemników królika w trakcie konserwacji. Atak wolnych rodników na bogate w nienasycone kwasy tłuszczowe lipidy błon komórkowych plemników prowadzi do nieodwracalnego obniżenia płynności błon i uszkodzenia związanych z błoną ATP-az. W efekcie zaburzona zostaje regulacja wewnątrzkomórkowego poziomu jonów, niezbędna do podtrzymania prawidłowej ruchliwości plemników (Rao i in., 1989). Przeprowadzone badania wskazują, że parametry ruchu plemników królika oceniane przy użyciu sytemu CASA są czułym wskaźnikiem jakości konserwowanego nasienia. Informacja uzyskana dzięki zastosowaniu komputerowo wspomaganej analizy jakości nasienia jest bogatsza i bardziej szczegółowa w porównaniu z konwencjonalną metodą mikroskopową. Dokładniejszy opis właściwości ruchowych plemników stwarza możliwość bardziej trafnego prognozowania zdolności zapładniającej nasienia. Konieczne są dalsze badania celem określenia przydatności poszczególnych parametrów ruchu do określania zdolności zapładniającej plemników. Piśmiennictwo A i t k e n R.J., C l a r k s o n J.S. (1988). Significance of reactive oxygen species and antioxidants in defining the efficacy of sperm preparation techniques. J. Androl., 9: A l v a r i n o J.M.R. (2000). Reproductive performance of male rabbits. World Rabbits Sci., 8 (Suppl. 1): C a n c e l A.M., L o b d e l l D., M e n d o l a P., P e r r e a u l t S.D. (2000). Objective evaluation of hyperactivated motility in rat spermatozoa using computer-assisted sperm analysis. Hum. Reprod., 15: C a s t e l l i n i C., L a t t a i o l i P., M o r o n i M., M i n e l l i A. (2000). Effect of seminal plasma on the characteristics and fertility of rabbit spermatozoa. Anim. Reprod. Sci., 63: F a r g e a s E. (1995). Quelques resultats obtenus en insemination artificielle avec la semence congelee. Cuniculture, 22: F a r r e l l P.B., F o o t e R.H., S i m k i n M.E., C l e g g E.D., W a l l R.J. (1993). Relationship of semen quality, number of sperm inseminated, and fertility in rabbits. J. Androl., 14: F a r r e l l P.B., P r e s i c c e G.A., B r o c k e t t C.C, F o o t e R.H. (1998). Quantification of bull sperm characteristics measured by computer-assisted sperm analysis (CASA) and the relationship to fertility. Theriogenology, 49: G a d e a J. (2005). Sperm factors related to in vitro and in vivo porcine fertility. Theriogenology, 63: G o g o l P. (1997). Zamrażalność nasienia królików pozbawionego osocza. Med. Weter., 53 (8): G o g o l P., B o c h e n e k M. (2003). Motility and plasma membrane integrity of rabbit spermatozoa during liquid storage. Ann. Anim. Sci., 3:

7 Czas przechowywania nasienia królika a właściwości plemników 103 G o g o l P., W i e r z c h o ś - H i l c z e r A. (2009). Membrane integrity, energy status and motility of rabbit spermatozoa stored for 2 days at 15 C. Ann. Anim. Sci., 9 (1): H a g e n D.R., G i l k e y A.L,. F o o t e R.H. (2003). Spermatozoal velocity and motility and its relationship to fertility in rabbit inseminated with low sperm numbers. World Rabbit Sci., 10: H a m m e r s t e d t R.H. (1993). Maintenance of bioenergetic balance in sperm and prevention of lipid peroxidation: a review of the effect on design of storage preservation systems. Reprod. Fertil. Dev., 5: H i r a n o Y., S h i b a h a r a H., O b a r a H., S u z u k i T., T a k a m i z a w a S., Y a m a g u c h i C., T s u - n o d a H., S a t o I. (2001). Relationships between sperm motility characteristics assessed by the computer-aided sperm analysis (CASA) and fertilization rates in vitro. J. Assist. Reprod. Genet., 18 (4): J a n u s k a u s k a s A., J o h a n n i s s o n A., R o d r i g u e z - M a r t i n e z H. (2003). Subtle membrane changes in cryopreserved bull semen in relation with sperm viability, chromatin structure, and field fertility. Theriogenology, 60: L a r s e n L., S c h e i k e T., J e n s e n T.K., B o n d e J.P., E r n s t E., H j o l l u n d N.H, Z h o u Y., N i e l s E., S k a k k e b æ k E., G i w e r c m a n A. (2000). Computer-assisted semen analysis parameters as predictors for fertility of men from the general population. Hum. Reprod., 15: L a v a r a R., M o c é E., L a v a r a F., V i u d e s d e C a s t r o M.P., V i c e n t e J.S. (2005). Do parameters of seminal quality correlate with the results of on-farm inseminations in rabbits? Theriogenology, 64: L i u D.Y., C l a r k e G.N., B a k e r H.W. (1991). Relationship between sperm motility assessed with Hamilton-Thorn motility analyzer and fertilization rates in vitro. J. Androl., 12: L ó p e z - G a t i u s F., S a n c e s G., S a n c h o M., Y á n i z J., S a n t o l a r i a P., G u t i é r r e z R., N ú ñ e z M., N ú ñ e z J., S o l e r C. (2005). Effect of solid storage at 15 C on the subsequent motility and fertility of rabbit semen. Theriogenology, 64: M a r s h b u r n P.B., M c I n t i r e D., C a r r B.R., B y r d W. (1992). Spermatozoal characteristics from fresh and frozen donor semen and their correlation with fertility outcome after intrauterine insemination. Fertil. Steril., 58: M o c é E., L a v a r a R., V i c e n t e J.S. (2010). Effect of cooling rate to 5 C, straw size and farm on fertilizing ability of cryopreserved rabbit sperm. Reprod. Domest. Anim., 45: 1 7. Q u i n t e r o - M o r e n o A., R i g a u T., R o d r í g u e z - G i l J.E. (2007). Multivariate cluster analysis regression procedures as tools to identify motile sperm subpopulations in rabbit semen and to predict semen fertility and litter size. Reprod. Domest. Anim., 42: R a o B., S o u f i r J.C., M a r t i n M., D a v i d G. (1989). Lipid peroxidation in human spermatozoa as related to midpiece abnormalities and motility. Gamete Res., 24: R o c a J., M a r t i n e z S., V a z q u e z J.M., L u c a s X., P a r r i l l a I., M a r t i n e z E.A. (2000). Viability and fertility of rabbit spermatozoa diluted in Tris-buffer extenders and stored at 15 C. Anim. Reprod. Sci., 64: SAS SAS user s guide statistics, version 8.2. SAS Institute Inc., Cary, NC, USA. S c h m i d t H., K a m p G. (2004). Induced hyperactivity in boar spermatozoa and its evaluation by computer-assisted sperm analysis. Reproduction, 128: V e r s t e g e n J., I g u e r - O u a d a M., O n c l i n K. (2002). Computer assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology, 57: Zatwierdzono do druku 11 I 2012 Piotr Gogol Effect of rabbit semen storage time on motility parameters and fertilizing capacity of spermatozoa Summary The effect of semen storage time on motility parameters and fertilizing capacity of spermatozoa was investigated. Semen was collected from 9 New Zealand White male rabbits, extended with Galap extend-

8 104 P. Gogol er, and stored for 48 h at +15 C. Motility parameters were evaluated after 4, 24 and 48 h using computerassisted sperm analysis (CASA). Storage time had a significant effect on parameters of sperm motility except linear motility. Total and progressive motility were the parameters whose values varied the most during storage (decreases by 32.6 and 29.3%, respectively). Fertilizing capacity of preserved semen was analysed by inseminating the does with the semen stored for 4 and 48 h. The percentage of does kindled following insemination with the semen stored for 4 h was higher compared to that obtained after insemination with the semen stored for 48 h (83 and 74%, respectively). In addition, the longer semen storage time reduced the mean number of young rabbits per litter by 2.11 (P<0.01) and the mean number of live rabbits per litter by 1.74 (P<0.01). The results obtained showed that sperm motility parameters evaluated using the CASA system are a sensitive indicator of the quality of preserved rabbit semen. Key words: rabbit, semen preservation, CASA, fertility, prolificacy