mgr Edyty Petters Konstrukcja i selekcja bibliotek fagowych opartych na wybranych modułach białkowych.

Transkrypt

1 PUBLICZNA OBRONA PRACY DOKTORSKIEJ Dnia 26 marca 2013 r. o godz na Wydziale Biotechnologii Uniwersytetu Wrocławskiego w sali im. J. Czekanowskiego, parter przy ul. Kuźniczej 35 (Katedra Antropologii) odbędzie się publiczna obrona rozprawy doktorskiej mgr Edyty Petters pt. Konstrukcja i selekcja bibliotek fagowych opartych na wybranych modułach białkowych. Promotor Prof. dr hab. Jacek Otlewski Recenzenci Prof. dr hab. Andrzej Gamian (Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej, PAN Wrocław) Prof. dr hab. Piotr Laidler (Uniwersytet Jagielloński, Wydział Lekarski) Praca do wglądu znajduje się w bibliotece Wydziału Biotechnologii przy ul.przybyszewskiego 63

2

3

4

5

6

7

8 INSTYTUT IMMUNOLOGII I TERAPII DOŚWIADCZALNEJ im. Ludwika Hirszfelda Polska Akademia Nauk ul. Rudolfa Weigla 12, Wrocław tel. (4871) , fax: (4871) gamian@iitd.pan.wroc.pl Zakład Immunologii Chorób Zakaźnych Wrocław, r. Laboratorium Mikrobiologii Lekarskiej Prof. dr hab. Andrzej Gamian Recenzja rozprawy doktorskiej Mgr Edyty Petters pt. Konstrukcja i selekcja bibliotek fagowych opartych na wybranych modułach białkowych wykonanej pod kierunkiem Prof. dr hab. Jacka Otlewskiego Przedstawiona do oceny praca dotyczy opracowania metodami inżynierii genetycznej i prezentacji fagowej nowych białek zdolnych do swoistego rozpoznawania wybranych antygenów białkowych. Poszukiwanie alternatywnych cząsteczek do przeciwciał jest ważnym zadaniem jakie stawiają sobie badacze. Takie cząsteczki mogły by charakteryzować się lepszymi cechami niż przeciwciała, bez wielofunkcyjnego fragmentu Fc, domen cukrowych, z możliwością dowolnego kształtowania swoistości oddziaływania i powinowactwa. Do otrzymania takich cząsteczek służą biblioteki fagowe, interesujące narzędzie bez konieczności użycia zwierząt. Białka w omawianej pracy, które miały być rozpoznawane przez konstruowane i syntezowane cząsteczki, stanowiły antygeny istotne dla terapii nowotworowej. Autorka wybrała antygeny powierzchniowe komórek nowotworowych Her2, S100A7 i Hsp90α, stąd rozprawa miała określony dalekosiężny cel aplikacyjny. W przypadku białka z rodziny S100, byłoby ono wraz z białkiem wiążącym również interesującym narzędziem badania niezbyt wyjaśnionych funkcji receptorowych dla produktów zaawansowanej glikacji. W pracy podjęto więc bardzo ważny problem otrzymania białkowych cząsteczek wiążących z zastosowaniem bibliotek fagowych. Strategia badania obejmowała poza użyciem biblioteki fragmentów przeciwciał, także skonstruowanie nowego zrębu białkowego, jego nadprodukcję w systemie bakteryjnym i użycie go do bibliotek fagowych. Podjęty przez Mgr Edytę Petters temat pracy doktorskiej jest ważny z punktu widzenia biochemicznego i biomedycznego i w pełni uzasadniony. Opracowanie nowych narzędzi badawczych otwiera szerokie perspektywy poznawania funkcji białek, procesów

9 biologicznych i możliwości wykorzystania tej wiedzy w medycynie. Niniejsza praca stanowi kontynuację dobrze znanych w świecie badań, prowadzonych w pracowni prof. Jacka Otlewskiego, nad strukturą białek, ich konstruowaniem, funkcją. Należy podkreślić unikalne podejście metodologiczne zastosowane w niniejszej pracy. Praca ma typowy układ dla rozprawy doktorskiej, zawiera 142 strony maszynopisu, 45 rysunków i 17 tabel, osobno podano wykazy skrótów, rysunków i tabel, podsumowanie i streszczenie. Autorka cytuje 255 pozycji piśmiennictwa, w większości z ostatniej dekady. We wstępie, bardzo dobrze napisanym, autorka wprowadza czytelnika w zasadę metody prezentacji fagowej (phage display, PD), jej optymalizacji i modyfikacji dla uzyskania pożądanych produktów. Dalej przedstawiła problemy związane z otrzymywaniem przeciwciał tą techniką oraz białek alternatywnych, np. adnektyny na bazie fibronektyny, afibody, peptydów pochodzących z białka A oraz peptydów powtórzeniowych typu darpinowych powtórzeń ankiryny i motywów TPR i konsensusowe CTPR, zbliżając się do zaprezentowania celu własnej pracy. Następnie omawia zagadnienia związane z terapią celowaną przeciw nowotworową i możliwościami użycia określonych białek, szczególnie z grupy S100, z grupy Her2 (autokinaza receptora EGF) oraz białka opiekuńczego Hsp90. Wyznaczone cele zostały sprecyzowane dla zastosowania bibliotek fagowych do otrzymania cząsteczek dtpr zrębu białkowego wiążących białka istotne w terapii nowotworowej, czyli Her2, S100A7 i Hsp90α oraz komercyjnych bibliotek Tomlinson I i J. Autorka do realizacji zadań zastosowała bogaty zestaw metod, dobrze i szczegółowo opisanych. Najpierw zaprojektowano zrąb białkowy modułu dtpr alternatywnego do przeciwciał w celu jego sklonowania, nadprodukcji i oczyszczenia. Na bazie genu białka S100A7 uzyskano jego nadprodukowaną formę w oczyszczonej postaci. Podobnie uzyskano oczyszczone fragmenty białkowe scfv. Następnie autorka przygotowała konstrukty bibliotek fagowych i scharakteryzowała je aby sprawdzić poprawność na poziomie DNA, po czym dokonała z nich selekcji odpowiednich fagów z antygenami i wreszcie przeprowadziła analizę wyników selekcji. Interesującym podejściem metodologicznym było zastosowanie dojrzewania powinowactwa, czyli jego wzbogacenie przez konstrukcję biblioteki drugiej generacji. Autorka z powodzeniem użyła tej metody do selekcji fragmentu przeciwciała swoistego dla białka Hsp90α. Procedura zawierała wiele szczegółów dopracowanych celem uniknięcia nieswoistych oddziaływań. Metodą mikroskopii fluorescencyjnej autorka sprawdziła funkcjonalność otrzymanych białek. Dokumentacja wyników nie budzi zastrzeżeń, jest bardzo starannie opracowana. W pracy zaproponowano jako alternatywa do przeciwciał, nowy zrąb białkowy dtpr, polipeptyd wiążący antygeny, którego konstrukcję

10 oparto o występujący w wielu cząsteczkach różnych organizmów motyw uczestniczący w oddziaływaniach białko-białko. Zaprojektowane białko nadprodukowano wydajnie w bakteriach, po czym wykazano jego wysoką stabilność termiczną i chemiczną. Białko to posłużyło następnie do konstrukcji kilku bibliotek fagowych i selekcji fagowej. Chociaż nie udało się uzyskać pozytywnych wyników selekcji wiążących docelowe antygeny, jednak opracowany zręb bez wątpienia może być przydatny w dalszych próbach. Następnie przeprowadzono selekcję fagową z gotowych bibliotek fagowych, co pozwoliło na uzyskanie białka z klonu scfv47 rozpoznającego swoiście białko Hsp90. Wstępne wyniki selekcji otrzymano także dla pozostałych antygenów Her2 i S100A7, ale najlepsze wyniki wraz z ustaleniem kinetyki wiązania ligandu udało się wyznaczyć dla scfv swoistego dla Hsp90. Tutaj wybrano cząsteczkę scfv47 o najwyższej sile wiązania do konstrukcji bibliotek fagowych drugiego rzędu w celu polepszenia siły oddziaływania przez przeprowadzenie selekcji dojrzewania powinowactwa. W ten sposób uzyskano wyselekcjonowaną cząsteczkę scfva4 o zwiększonej sile oddziaływania i dziesięć razy bardziej swoistą do Hsp90α niż do niepożądanej izoformy Hsp90β. Na liniach komórkowych potwierdzono metodami z uzyciem immunofluorescencji oddziaływania otrzymanych białek z cytoplazmatycznym Hsp90. Dyskusja została przeprowadzona przejrzyście, zagadnienia są podzielone na tematyczne podrozdziały. Autorka w dyskusji przeprowadziła bardzo dobrą analizę wyników, trudności metodycznych, trafnie omawia wyniki, również przyczyny rezultatów niezgodnych z oczekiwaniami, jest ostrożna w wyciaganiu wniosków, co świadczy o jej dogłębnej wiedzy. Autorka wysuwa wniosek, że fagowe biblioteki przeciwciałowe scfv są bardziej użyteczne do otrzymywania cząsteczek specyficznie rozpoznających ligandy białkowe niż randomizowane moduły białkowe dtpr. Nasuwa się tutaj pytanie jak można wykorzystać uzyskane białko dtpr o dużej stabilności do innych selekcji niż wybrany antygen psoriazyna. Drugie moje pytanie dotyczy selekcji scfv wobec białek Her2, Hsp90 i S100A7, czy możliwa jest różnica między wynikami testu ELISA a SPR, fałszywie negatywna dla tesu SPR z powodu innego typu immobilizacji liganda do płytki SPR i płytki w ELISA. Nie mam uwag krytycznych do pracy, błędy literowe są nieliczne, zostały zaznaczone na marginesach. Zauważyłem jedynie na str. 16 cytowaną pozycją miał być 29 zamiast 31, od str. 53 używany jest żargonowy termin anty-mysie przeciwciała gdy chodzi o przeciwciała wobec mysich immunoglobulin określonej klasy, zamiast bufor PBS, lepiej PBS, gdyż sam skrót zawiera bufor, rys. IV.2 zawiera nieczytelne fragmenty, na str. 64 przeciwciała zdjęte z membrany (stripowanie) lepiej zastąpić oddysocjowane, zamiast czipy CM5 można mówić płytki. Na str. 72 podano, że komórki blokowano w 100% FBS, czy chodziło o

11 nierozcieńczoną surowicę? Uwagi powyższe nie umniejszają dużej wartości pracy, ale mogą być pomocne przy redagowaniu manuskryptu do druku. W podsumowaniu chcę podkreślić, że praca jest bardzo wartościowa, została prawidłowo zaplanowana i zrealizowana, wnosi oryginalny i istotny wkład do wiedzy o tworzeniu bibliotek fagowych, konstruowaniu cząsteczek białkowych o zadanych właściwościach, rozpoznających pożądane antygeny. Opracowana metodologia, otrzymane wyniki, sa niezwykle ważne dla otrzymywania czystych białek niemodyfikowanych potranslacyjnie, także do badań samych modyfikacji potranslacyjnych, cząsteczek o znaczeniu biomedycznym. Poza technikami biologii molekularnej, mikrobiologicznymi, hodowli komórkowych, analizami biochemicznymi, immunochemicznymi, autorka stosowała nowoczesne techniki spektrometrii masowej, dichroizmu kołowego, powierzchniowego rezonansu plazmonowego, skaningowej kalorymetrii różnicowej. Dzięki zastosowaniu tych metod i dużego wkładu pracy autorka uzyskała wzorowe wyniki. Wykazała się znajomością właściwie wykorzystanego piśmiennictwa. Dowodzi to bardzo dobrego opanowania warsztatu badawczego. Praca jest utrzymana w najwyższym standardzie badań makrocząsteczek biologicznych. Uważam, że rozprawa doktorska Mgr Edyty Petters spełnia warunki określone w art. 13 Ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz stopniach i tytule naukowym w zakresie sztuki. Wnioskuję do Rady Wydziału Biotechnologii Uniwersytetu Wrocławskiego o przyjęcie tej pracy doktorskiej i dopuszczenie Mgr Edyty Petters do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Pozwalam sobie również złożyć Wysokiej Radzie wniosek o wyróżnienie tej pracy ze względu na dużą wartość merytoryczną i bardzo dobre wykonanie części doświadczalnej oraz napisanie całej rozprawy.

12 Konstrukcja i selekcja bibliotek fagowych opartych na wybranych modułach białkowych. Przeciwciała i ich fragmenty od lat z powodzeniem używane są do rozpoznawania różnorodnych celów molekularnych. Pomimo niewątpliwych zalet mają one jednak kilka zasadniczych wad, jak chociażby duże rozmiary, skomplikowaną strukturę molekularną, wysokie koszty wytwarzania czy niską stabilność, co znacznie utrudnia niekiedy możliwości ich wykorzystania. Takie ograniczenia wpływają na wzrost zainteresowania cząsteczkami wiążącymi odmiennymi od immunoglobulin. Alternatywne moduły białkowe projektowane i konstruowane są w sposób, zapewniający im stabilność, niewielkie rozmiary i niskie koszty uzyskiwania w bakteryjnych systemach ekspresyjnych. Identyfikację cząsteczek wiążących przeprowadza się w procesach selekcji z bibliotek fagowych, będących zbiorami zmutowanych wariantów wyjściowego modułu białkowego. Najbardziej popularną metodą wykorzystywaną w tym celu jest technika prezentacji puli białek na powierzchni faga włókienkowego M13, zwana z języka angielskiego phage display (PD). Jej najistotniejszą cechą jest połączenie w obrębie wirionu fenotypu (właściwości biofizycznych prezentowanej cząsteczki) z genotypem (cząsteczką DNA zamkniętą wewnątrz kapsydu fagowego). Celem prezentowanej pracy doktorskiej było zastosowanie bibliotek fagowych do uzyskania cząsteczek, wiążących wybrane białka, istotne dla terapii nowotworów. W ramach realizacji pierwszej części projektu zaproponowano nowy zrąb białkowy dtpr (ang. designed tetratricopeptide repeat), jako alternatywną do przeciwciał cząsteczkę wiążącą antygeny. Podstawą do jego zaprojektowania był moduł TPR, α -helikalny motyw strukturalny występujących powszechnie wśród organizmów żywych i uczestniczący w oddziaływaniach białko-białko ogromnej liczby funkcjonalnie różnych i niespokrewnionych ze sobą cząsteczek. Zaprojektowany polipeptyd dtpr był wydajnie nadprodukowany w bakteryjnym systemie ekspresyjnym i posiadał niezwykle wysoką stabilność termiczną i chemiczną. Na podstawie analizy struktur krystalicznych naturalnych domen TPR w kompleksach z ligandami, zaprojektowano dwie biblioteki fagowe, oparte na 1

13 sekwencji dtpr. Po przeprowadzeniu konstrukcji i charakterystyki tych zbiorów randomizowanych cząsteczek jedną z nich (6B20) odrzucono ze względu na zbyt duży odsetek niepoprawnych sekwencji DNA. Druga biblioteka (9B14) wykazywała satysfakcjonujący poziom poprawności konstrukcji poziomie DNA (58%) i równomierny rozkład poszczególnych aminokwasów, a także była wydajnie prezentowana w fuzji z fagowym białkiem piii na powierzchni wirionów M13. Dodatkowo zaprojektowano trzecią bibliotekę 6B14, która została skonstruowana na zlecenie wfirmie Sloning BioTechnology GmbH. W kolejnym etapie przeprowadzono selekcje fagowe wobec czterech ligandów (z których białko S100A7 przygotowano samodzielnie). Testowano szereg warunków selekcyjnych, ze szczególnym uwzględnieniem stężenia stosowanego antygenu, sposobu odmywania fagów niespecyficznych jak i czasu oraz warunków wiązania fagów do celu molekularnego. Pomimo podjętych wysiłków nie udało się jednak zidentyfikować wariantu dtpr specyficznego względem któregokolwiek z białek użytych do selekcji. Prawdopodobnie wprowadzenie mutacji w stabilną cząsteczkę dtpr zaburzało jej strukturyzowanie się i uniemożliwiało wiązanie antygenów. W drugiej części pracy zastosowano biblioteki fragmentów przeciwciał scfv Tomlinson I i J, aby wyizolować z nich cząsteczki specyficzne wobec trzech białek: Her2, S100A7 i Hsp90α, których wiązanie i blokowanie może mieć ważne znaczenie terapeutyczne. Her2 jest znanym celem molekularnym, wobec którego adresowane są niektóre ze sposobów leczenia raka piersi. Zwiększona ekspresja S100A7 również powiązana jest z nowotworem sutka i pozwala na miejscową identyfikację komórek rakowych, a także sygnalizuje niekorzystne rokowania dla pacjentek. Dodatkowo, najnowsze doniesienia wskazują, iż poprzez oddziaływanie z integryną ανβ6, S100A7 wzmaga inwazyjność nowotworów. Białko Hsp90 z kolei od dawna uznawane jest za jeden z ciekawszych celów ukierunkowanej terapii raka. Ponieważ prawidłowe zwijanie licznych polipeptydów onkogennych uzależnione jest od oddziaływań z tym białkiem opiekuńczym, blokowanie wiązań Hsp90 - białko podopieczne skutkuje wielokierunkowym hamowaniem rozwoju choroby. Dla wszystkich użytych antygenów uzyskano pozytywne, wstępne wyniki selekcji fagowych, jednak kinetykę wiązania ligandu udało się wyznaczyć jedynie dla scfv specyficznych wobec Hsp90. Cząsteczka scfv47, o wysokiej, nanomolowej sile wiązania antygenu, posłużyła również za matrycę do konstrukcji bibliotek fagowych 2

14 drugiej generacji. Przeprowadzone selekcje dojrzewania powinowactwa doprowadziły do dwukrotnego zwiększenia siły oddziaływania (w porównaniu do wyjściowego scfv47) wyselekcjonowanej cząsteczki scfva4 z Hsp90α czyniąc je jednocześnie bardziej specyficznym, ponieważ wiązanie innej izoformy białka, Hsp90β, zmalało ponad dziesięciokrotnie. Zdolność oddziaływania uzyskanych fragmentów przeciwciał z ligandem potwierdzono również in vivo - za pomocą immunofluorescencji. Przeprowadzone badania jednoznacznie wykazały wyższy potencjał fagowych bibliotek przeciwciałowych (scfv) do generacji cząsteczek, specyficznie rozpoznających ligandy białkowe. Randomizowane moduły dtpr nie umożliwiły uzyskania białek wiążących testowane antygeny. Uznano, niestety, iż nie stanowią użytecznej alternatywy dla przeciwciał. 3