Wydzielanie cytokin prozapalnych przez jednojądrzaste komórki krwi obwodowej w hodowli z komórkami raka płaskonabłonkowego krtani*

Transkrypt

1 PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS 35 Wydzielanie cytokin prozapalnych przez jednojądrzaste komórki krwi obwodowej w hodowli z komórkami raka płaskonabłonkowego krtani* Production of proinflammatory cytokines by peripheral blood mononuclear cells in cocultures with squamous cell carcinoma of the larynx* Katarzyna Starska 1, Marek Łukomski 1, Henryk Tchórzewski 2, Ewa Głowacka 2 SUMMARY Purpose: Antitumor mechanisms of cellular immune response are connected with the cytokines activity secreted by peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The aim of this study was estimation of proinflammatory cytokine (IL-6 and TNF- ) concentration in patients with laryngeal squamous cell carcinoma and analysis of directed influence of neoplasm cells to the function of PBMC and modification of cytokine profile. Materials and methods: For analysis of cytokine secretion, the cultures of isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with marginal neoplasm cells and noncancerous adjacent mucosa cells from 55 patients with laryngeal squamous cell carcinoma were established. Production of cytokines in 21h and 72h culture supernatants was detected by Elisa. Results: Authors reported the increase of IL-6 and decrease of TNF- concentration in cultures of isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with marginal neoplasm cells and non-cancerous adjacent mucosa cells. Conclusion: The presence of laryngeal squamous carcinoma cells in PBMC culture can modify immunocompetent cells activity and production of proinflammatory cytokines. Hasła indeksowe: rak krtani, cytokiny prozapalne, jednojądrzaste komórki krwi Key words: carcinoma larynx, proinflammatory cytokines, peripheral blood mononuclear cells by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów Chirurgów Głowy i Szyi Otrzymano/Received: Zaakceptowano do druku/accepted: Katedra Otolaryngologii, Klinika Laryngologii Onkologicznej UM w Łodzi Kierownik Kliniki: Prof. dr hab. med. M. Łukomski 2 Zakład Immunologii Klinicznej ICZMP w Łodzi Kierownik Zakładu: Prof. dr hab. med. H. Tchórzewski Wkład pracy autorów/authors contribution: Według kolejności Konflikt interesu/conflicts of interest: Autorzy pracy nie zgłaszają konfliktu interesów. Adres do korespondencji/ Address for correspondence: imię i nazwisko: Katarzyna Starska adres pocztowy: Klinika Otolaryngologii UM ul. Kopcińskiego łódź tel fax katarzyna.starska@op.pl Otolaryngol Pol 2009; 63 (7 ): Wstęp Rola komórek immunokompetentnych w chorobie nowotworowej nie jest do końca wyjaśniona. Liczne badania doświadczalne wskazują na aktywność mechanizmów komórkowej odpowiedzi immunologicznej w walce z komórkami nowotworowymi różnego pochodzenia. Wyjaśnienie interakcji międzykomórkowych w układzie autologicznym (komórki nowotworowe < > komórki immunokompetentne gospodarza) może w przyszłości warunkować postęp w rozwoju immunoterapii nowotworów, stworzeniu szczepionek przeciwnowotworowych oraz stanowić wykładnik przebiegu choroby nowotworowej i być jednym z czynników prognostycznych branych pod uwagę przy wyborze optymalnej metody leczenia. Odpowiedź immunologiczna skierowana przeciw rozwijającemu się nowotworowi obejmuje różne mechanizmy komórkowe i humoralne. Mechanizmy efektorowe komórkowej odpowiedzi przeciwnowotworowej związane są m.in. z aktywnością cytokin wydzielanych przez limfocyty T, zarówno przez T CD4+ (pomocnicze Th), jak i T CD8+ (cytotoksyczne Tc). Rola limfocytów T cytotoksycznych polega na odróżnianiu i zabijaniu komórek potencjalnie nowotworowych. Aktywacja limfocytów T CD8+ odbywa się z udziałem uprzednio pobudzonych limfocytów T CD4+ [1]. Pobudzone limfocyty CD4+ mają zdolność do produkowania szeregu cytokin pozapalnych, regulatorowych oraz biorących udział w procesie angiogenezy czy apoptozy. Największe znaczenie w obronie przeciwnowotworowej i regulacji oddziaływań między limfocytami i komórkami guza pełnią cytokiny IL-2, Il-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-18, IFN-γ, TNF-α. Wywierają one działanie sprzyjające rozwojowi odpowiedzi typu komórkowego, w którym elementami efektorowymi są limfocyty CD8+ [1 24]. Również limfocyty CD8+ wykazują zróżnicowanie pod względem rodzaju produkowanych cytokin. Interleukiny uwalniane przez limfocyty cytotoksyczne m.in. IL-2, IFN-γ, TNF-α biorą udział w nasilaniu reakcji komórkowych skierowanych przeciw komórkom nowotworowym (indukcja apoptozy m.in. w mechanizmie * Praca finansowana z funduszy Komitetu Badań Naukowych Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego (Projekt KBN nr N /2326).

2 36 PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS FAS-FAS-L, przy udziale perforyn, granzym i kaspaz) [1 24]. Istnieją jednak liczne dowody na znaczne upośledzenie mechanizmów obrony immunologicznej u chorych z nowotworami, w tym głównie z nowotworami regionu głowy i szyi [24]. Działanie immunosupresyjne nowotworu może polegać m.in. na blokowaniu reakcji cytotoksycznych poprzez wydzielanie TGF-β (transforming growth factor), IL-10, PGE2 przez komórki guza. Cytokiny te wykazują działanie supresyjne poprzez blokadę funkcji limfocytów cytotoksycznych i komórek NK lub aktywację limfocytów supresorowych [1]. Cytokiny spełniają istotną rolę w tworzeniu/wspomaganiu odporności przeciwnowotworowej. Znaczenie tych czynników w onkologii klinicznej opiera się na próbach modyfikowania odpowiedzi immunologicznej. Celem przeprowadzonych badań była: 1) ocena wydzielania cytokin prozpalnych (IL-6 i TNF-α) przez jednojądrzaste komórki krwi obwodowej pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym krtani, 2) próba określenia bezpośredniego oddziaływania komórek nowotworowych raka krtani na funkcję komórek immunokompetentnych i modyfikację profilu cytokinowego, prowadzonych w układzie autologicznym (komórki nowotworowe < > limfocyty T). Proponowane badania stają się obecnie wiodącymi w immunopatologii klinicznej chorób nowotworowych. Materiał i metody Badania dotyczyły 55 chorych na raka płaskonabłonkowego krtani, którzy zostali poddani leczeniu chirurgicznemu (laryngektomii całkowitej i operacji usunięcia węzłów chłonnych szyi) lub leczeniu skojarzonemu tj. chirurgicznemu i radioterapii. Chorzy byli operowani w Klinice Laryngologii Onkologicznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi, a leczenie uzupełniające zostało przeprowadzone w Zakładzie Radioterapii Szpitala Zespolonego im. M. Kopernika w Łodzi. Rozległość zmian nowotworowych określono wg kryteriów klasyfikacji TNM (International Union Against Cancer (UICC- TNM 2002). Charakterystykę kliniczno-morfologiczną badanej grupy chorych przedstawia tabela I. Grupę kontrolną stanowiło 14 zdrowych ochotników. Celem przeprowadznia badań siedem mililitrów świeżej krwi, pobranej z żyły łokciowej do probówki zawierającej heparynę litową (stężenie końcowe 10IU/mL), rozcieńczano płynem hodowlanym o składzie: RPMI (Biomed, Lublin, Poland) z dodatkiem 2Mm L-glutaminy oraz wzbogaconym 10% v/v płodowej surowicy cielęcej FCS (Biochrom AG Seromed, Berlin, Germany), 100 U/mL penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny (Sigma, USA), tak by uzyskać gęstość 1x10 6 komórek/ml. Zgodę na wykonanie badań wyraziła Komisja Bioetyczna Uniwersytetu Medycznego w Łodzi w dniu 14 stycznia 2002 roku (Nr RNN/15/03/KN). Komórki obrzeża guza (TMC tumor marginal cells) oraz komórki niezmienionego nowotworowo nabłonka krtani (NCC non-cancerous cells) były izolowane z materiału pooperacyjnego pobranego aseptycznie, z co najmniej czterech różnych miejsc guza i z dwóch różnych miejsc niezmienionego nabłonka krtani, do jałowego płynu hodowlanego o składzie: RPMI-1640 (Biomed, Lublin, Poland) z dodatkiem 1% v/v antybiotyków penicyliny, streptomycyny, gentamycyny i przeciwgrzybiczego ketokonazolu (Sigma, Aldrich, Germany), natychmiast po wykonaniu laryngektomii. Po mechanicznym rozdrobnieniu, fragmenty tkanki płukano trzykrotnie płynem Hanksa (Biomed Lublin, Poland) a następnie poddawano trawieniu enzymatycznemu z użyciem 0,16 mg/ml hialuronidazy (Sigma, Aldrich, Germany), 0,55 mg/ml kolagenazy (Sigma, Aldrich, Germany) z dodatkiem 1% v/v antybiotyków penicyliny, streptomycyny, gentamycyny i przeciwgrzybiczego ketokonazolu (Sigma, Aldrich, Germany) i inkubowano 18 h w temp. 37 C w atmosferze 5% CO 2 (Cellstar Incubator). Po inkubacji fragmenty tkanki przecierano przez sitko o 50 (Sigma-Aldrich), płukano trzykrotnie w PBS bez jonów Ca++ i Mg++ (1800 obrotów/min, przez 20 minut, w temp. 8 C) a następnie zalewano roztworem dyspaszy w stężeniu 2,4 U/mL, inkubowano w 30 minut w temp. 37 C i zawieszano w 1ml PBS. Gęstość komórek liczono przy użyciu komory Bürkera. Komórki martwe usuwano za pomocą zestawu Dead Cell Removal. Czystość hodowli komórek nowotworowych w zawiesinie komórkowej oceniana była z zastosowaniem obiektywnych metod immunomorfologicznych (oznaczanie ekspresji filamentów cytokeratynowych metodą immunohistochemiczną z użyciem polikonalnych przeciwciał przeciw pośrednim filamantom cytokeratynowym NCL-C11, Multi-Cytokeratin 4/5/6/8/10/13/18, RTU-D Novostatin Universal Detection Kit, NCL-L-DAB Liquid DAB Substrate Kit; Novocastra, UK) badania zostały wykonane w Zakładzie Patomorfologii Klinicznej ICZMP w Łodzi). Dla określenia wpływu komórek raka płaskonabłonkowego krtani na funkcję jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) przeprowadzono następujące interakcje: krew pełna (WB whole blood), krew pełna stymulowana PHA, autologiczne komórki guza (TMC), autologiczne komórki niezmienionego nowotworowo nabłonka (NCC) oraz hodowle mieszane w następujących układach (w proporcjach 10:1): autologiczne PBMC + autologiczne komórki nowotworowe części obwodowej guza (WBTMC), autologiczne PBMC + autologiczne komórki niezmienionego nowotworowo nabłonka (WBNCC), autologiczne PBMC + autologiczne komórki nowotworowe części obwodowej guza w obecności PHA (WBTMCPHA), autologiczne PBMC + autologiczne komórki niezmienionego nowotworowo nabłonka w obecności PHA (WBNCCPHA). W badaniach był oceniany efekt interakcji między tymi komórkami stosując inkubacje 21 i 72 h godzinne w temp. 37 C, w atmosferze 5% CO 2. W nadsączach hodowlanych

3 PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS 37 podanych układów komórek (1 x 10 6 komórek PBMC i 1 x 105 komórek nowotworowych) oceniono produkcję wybranych cytokin: TNF-α i IL-6. Stężenie wytwarzanych cytokin określone zostało metodą Elisa (Enzyme Linked Immuno Absorbent Assay) stosując zestawy opt EIA firmy Pharmingen, postępując zgodnie z procedurą podaną przez producenta. Absorbancję próbek odczytywano przy użyciu czytnika Elx808, Bio-Tek Instruments, USA). Badania immunologiczne wykonano w Zakładzie Immunologii Klinicznej Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi. W analizie statystycznej uzyskanych wyników zastosowano test dwuczynnikowej wariancji ANOVA, przy poziomie istotności p 0,05. Wyniki W przeprowadzonych doświadczeniach oceniono stężenie IL-6 i TNFα w nadsączach krwi pełnej w 21h inkubacji, w układach badawczych bez stymulacji mitogenem oraz po stymulacji fitohemaglutyniną (PHA). Porównano średnie wartości stężeń wydzielanych cytokin prozapalnych w grupie badanej i kontrolnej. Nie zanotowano różnic istotnych statystycznie między wartościami średnich stężeń wydzielanych IL-6 i TNFα w analizowanych grupach badawczych, zarówno w układach doświadczalnych bez stymulacji, jak i po stymulacji PHA. Analiza wyników w badanych układach doświadczalnych, pomimo niewystępowania znamiennych statystycznie różnic dla średnich wartości stężeń IL-6 i TNFα wykazała występowanie zauważalnych tendencji: średnie wartości stężeń IL-6, IL-8, TNFα w nadsączach krwi pełnej, zarówno w układach bez stymulacji, jak po stymulacji fitohemaglutyniną Tabela I. Kliniczno-morfologiczna charakterystyka badanej grupy chorych z rakiem płaskonabłonkowym krtani Cecha Liczebność grupy N (%) Płeć Mężczyźni Kobiety Leczenie chirurgiczne Częściowe usunięcie krtani Całkowite usunięcie krtani Operacja usunięcia węzłów chłonnych szyi Selektywna operacja węzłowa (SND) Radykalna operacja węzłowa (RND) pt pn Zróżnicowanie histopatologiczne G pt2 pt3 pt4 pn0 pn1-3 pn1 pn2 pn3 G1 G2 G3 PHA, były wyższe w grupie badanej, w porównaniu z poziomem cytokin, oznaczonych w grupie kontrolnej. Wyjątek stanowiły układy badawcze, w których średnie wartości stężeń IL-6 w 21h inkubacji, w doświadczeniu bez stymulacji PHA, były niższe w grupie kontrolnej w porównaniu z wynikami grupy badanej, 53 (96,4) 2 (3,6) 22 (40,0) 33 (60,0) 22 (40,0) 20 (36,4) 2 (3,6) 14 (25,4) 21 (38,2) 20 (36,4) 39 (70,9) 16 (29,1) 7 (12,7) 4 (7,3) 5 (9,1) 4 (7,3) 44 (80,0) 7 (12,7) Tabela II. Stężenia cytokin prozapalnych i regulatorowych w nadsączach krwi pełnej w grupie badanej i kontrolnej Grupa badana Układ doświadczalny układ bez stymulacji mitogenem t IL-6 ± SEM [ng/ml] TNFα ± SEM [pg/ml] Grupa badana N=55 21h 63,1 ± 7,05 345,3 ± 39,38 72h 136,9 ± 29,89 132,2 ± 28,11 Grupa kontrolna N=21 21h 57,7 ± 7,03 396,9 ± 63,48 72h 141,3 ± 26,53 141,9 ± 17,84 Grupa badana Układ doświadczalny układ ze stymulacją fitohemaglutyniną (PHA) t IL-6 ± SEM [ng/ml] TNFα ± SEM [pg/ml] Grupa badana N=55 21h 94,6 ± 15,34 478,9 ± 68,51 72h 147,5 ± 33,81 173,6 ± 44,58 Grupa kontrolna N=21 21h 84,6 ± 11,25 494,1 ± 84,26 72h 166,5 ± 30,62 180,4 ± 25,19

4 38 PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS Tabela III. Wydzielanie IL-6 w nadsączach krwi pełnej w mieszanych układach doświadczalnych Badany układ doświadczalny układ bez stymulacji mitogenem Badana cytokina t Układ badawczy (N = 24) Średnia wartość stężenia ± SEM p IL-6 [ng/ml] 21h 72h Krew pełna (WB) 42,6±5,74 Krew pełna + NCC (WBNCC) 57,8±8,68 Krew pełna (WB) 42,6±5,74 Krew pełna + TMC (WBTMC) 54,4±7,96 Krew pełna (WB) 58,0±13,97 Krew pełna + NCC (WBNCC) 63,1±15,26 Krew pełna (WB) 58,0±13,97 Krew pełna + TMC (WBTMC) 62,8±11,94 0,004 0,01 Badany układ doświadczalny układ ze stymulacją fitohemaglutyniną (PHA) 21h Krew pełna (WB) 51,3±4,44 Krew pełna + NCC (WBNCC) 69,6±10,27 Krew pełna (WB) 51,3±4,44 Krew pełna + TMC (WBTMC) 68,9±9,01 IL-6 [ng/ml] 72h Krew pełna (WB) 82,1±19,60 Krew pełna + NCC (WBNCC) 69,0±16,17 Krew pełna (WB) 82,1±19,60 Krew pełna + TMC (WBTMC) 70,2±12,89 choć zaobserwowano tendencję do wyższych wartości średnich stężeń badanych cytokin w grupie badanej. Wartości średnich stężeń wydzielanych IL-6 i TNF w badanych układach doświadczalnych przedstawiono w tabeli II. W przeprowadzonych doświadczeniach oceniono stężenie IL-6 i TNFα w nadsączach krwi pełnej, w dwóch punktach czasowych (w 21 h i 72 h inkubacji), w mieszanych układach badawczych bez stymulacji mitogenem oraz po stymulacji fitohemaglutyniną (PHA). Porównano średnie wartości stężeń cytokin prozapalnych i regulatorowych, w określonym czasie inkubacji, w układach doświadczalnych utworzonych tylko z krwi pełnej i po dodaniu do krwi pełnej wyizolowanych nabłonkowych komórek nowotworowych (TMC), w zależności od czasu inkubacji. Wykonano również ocenę średnich wartości stężeń badanych interleukin po dodaniu do krwi pełnej komórek prawidłowego nabłonka krtani (NCC), jako układów badawczych kontrolnych. Analiza danych wykazała znamienny wzrost wartości średniego stężenia IL-6 w nadsączach układów mieszanych krwi pełnej, w układach badawczych bez stymulacji PHA, po dodaniu do krwi pełnej wyizolowanych nabłonkowych komórek nowotworowych (TMC) (p = 0,004), jak też komórek prawidłowego nabłonka krtani (NCC) (p = 0,01), ocenionych w 21 h inkubacji. Wzrost wydzielania IL-6 był wyższy w kontrolnym układzie mieszanym krwi pełnej z komórkami prawidłowymi NCC w porównaniu z układem badawczym z komórkami nowotworowymi TMC. W analizowanych układach badawczych, ocenionych w 72 h inkubacji nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic między średnimi wartościami stężeń IL-6 (p ), chociaż wartości średnich stężeń dla IL-6 były wyższe w układach mieszanych. W analizowanych układach badawczych stwierdzono wzrost wartości średniego stężenia IL-6 w nadsączach układów mieszanych, po dodaniu do krwi pełnej wyizolowanych nabłonkowych komórek nowotworowych (TMC), i komórek prawidłowego nabłonka krtani (NCC), ocenionych zarówno w 21h jak i 72h inkubacji, w układach badawczych po stymulacji PHA. Różnica wydzielania IL-6 w badanych doświadczeniach nie była jednak znamienna statystycznie (p ). Wyniki wydzielania IL-6 w nadsączach krwi pełnej w mieszanych układach doświadczalnych przedstawiono w tabeli III. Analiza danych wykazała znamienny spadek wartości średniego stężenia TNFα w nadsączach układów mieszanych krwi pełnej, w układach badawczych bez

5 PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS 39 Tabela IV. Wydzielanie TNFα w nadsączach krwi pełnej w mieszanych układach doświadczalnych Badany układ doświadczalny układ bez stymulacji mitogenem Badana cytokina t Układ badawczy (N = 24) Średnie stężenie ± SEM p 21h Krew pełna (WB) 410,1±73,68 Krew pełna + NCC (WBNCC) 267,2±47,10 Krew pełna (WB) 410,1±73,68 Krew pełna + TCC (WBTMC) 286,9±58,29 0,001 0,001 TNFα [pg/ml] 72h Krew pełna (WB) 243,7±53,99 Krew pełna + NCC (WBNCC) 143,7±25,01 Krew pełna (WB) 243,7±53,99 Krew pełna + TCC (WBTMC) 136,7±30,15 0,03 0,01 Badany układ doświadczalny układ ze stymulacją fitohemaglutyniną (PHA) 21h Krew pełna (WB) 642,7±139,71 Krew pełna + NCC (WBNCC) 366,8±68,74 Krew pełna (WB) 642,7±139,71 Krew pełna + TCC (WBTMC) 369,2±62,08 < 0,001 < 0,001 TNFα [pg/ml] 72h Krew pełna (WB) 324,7±100,14 Krew pełna + NCC (WBNCC) 158,5±34,97 Krew pełna (WB) 324,7±100,14 Krew pełna + TCC (WBTMC) 177,1±38,04 0,02 0,02 stymulacji PHA, po dodaniu do krwi pełnej wyizolowanych nabłonkowych komórek nowotworowych (TMC) (p = 0,001), oraz komórek prawidłowego nabłonka krtani (NCC) (p = 0,001), ocenionych w 21h inkubacji. W analizowanych układach badawczych, ocenionych w 72h inkubacji stwierdzono również istotny statystycznie spadek średnich wartości stężeń TNFα po dodaniu do krwi pełnej wyizolowanych nabłonkowych komórek nowotworowych (TMC) (p = 0,03), i komórek prawidłowego nabłonka krtani (NCC) (p = 0,01). Wartości średnich stężeń TNFα w układach komórkowych mieszanych były zbliżone. W analizowanych układach badawczych stwierdzono spadek wartości średniego stężenia TNFα w nadsączach układów mieszanych, po dodaniu do krwi pełnej wyizolowanych komórek nabłonkowych krtani, ocenionych zarówno w 21 h oraz 72 h inkubacji, w układach badawczych po stymulacji PHA. Analiza statystyczna wykazała znamienny spadek wartości średniego stężenie TNFα w nadsączach układów mieszanych krwi pełnej po dodaniu do krwi pełnej wyizolowanych nabłonkowych komórek nowotworowych (TMC) (p < 0,001) jak i komórek prawidłowego nabłonka krtani (NCC) (p < 0,001), ocenionych w 21 h inkubacji. W analizowanych układach badawczych, ocenionych w 72h inkubacji stwierdzono także istotne statystycznie zmniejszenie wartości średnich stężeń TNFα, zarówno po dodaniu do krwi pełnej wyizolowanych nabłonkowych komórek nowotworowych (TMC) (p = 0,02) oraz komórek prawidłowego nabłonka krtani (NCC) (p = 0,02). Wyniki wydzielania TNFα w nadsączach krwi pełnej w mieszanych układach badawczych przedstawiono w tabeli IV. Dyskusja Komórki immunokompetentne, a w szczególności limfocyty T, zarówno pomocnicze CD4+, jak i limfocyty cytotoksyczne CD8+ pełnią istotną rolę w immunologicznej komórkowej odpowiedzi przeciwnowotworowej [1-24]. Komórki te nasilają lub hamują odpowiedź immunologiczną, działając zarówno we krwi krążącej, jak też w miejscu rozrostu procesu nowotworowego, poprzez wydzielanie określonych cytokin regulacyjnych, prozapalnych, biorących udział w procesie angiogenezy czy apoptozy m.in. TNF-α, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 [1-24]. Ostatnie doniesienia dotyczące oceny wydzielania cytokin w różnych nowotworach m.in. raku płuca, raku szyjki macicy i jajnika wskazują, że interleukiny wydzielane przez limfocyty T, zarówno w badaniach limfocytów naciekających guzy (TIL

6 40 PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS tumor infiltrating lymphocytes), limfocytów krążących we krwi oraz limfocytów w przerzutowo zmienionych regionalnych węzłach chłonnych mają istotne znaczenie w mechanizmach regulacyjnych w układzie komórka nowotworowa immunokompetentne komórki gospodarza [25 27]. Ich poznanie pozwoliłoby na lepsze zrozumienie regulacji miejscowej komórkowej odpowiedzi immunologicznej, zachodzącej w przebiegu procesu nowotworowego. W przyszłości badania nad immunologią nowotworów umożliwią poznanie mechanizmów immunologicznych w przebiegu choroby nowotworowej, ale również praktyczne wykorzystanie omawianych zjawisk m.in. wybór optymalnego modelu leczenia, prognozowanie przebiegu choroby, postęp w immunoterapii w chorobach nowotworowych. W dostępnym piśmiennictwie można znaleźć tylko nieliczne prace, w których oceniane było wydzielanie różnych cytokin w hodowlach komórek nowotworowych wyizolowanych bezpośrednio z guza. Częściej badane są interakcje międzykomórkowe z zastosowaniem wyprowadzonych linii komórkowych, co nie może pozostać bez wpływu na uzyskiwane wyniki. Porównywanie danych analizowanych w tych pracach, nawet jeśli dotyczą one tego samego nowotworu, w tym przypadku raka płaskonabłonkowego krtani, różnią się i nie mogą stanowić jednoznacznego punktu odniesienia w prowadzonej dyskusji. Nie bez znaczenia pozostaje dobór i niejednorodność grup badawczych, zastosowanie odmiennych technik oceny stężeń oraz profil analizowanych cytokin. Yano i wsp. [28] analizując chorych z rakiem płuca oznaczyli ten sam poziom IFN-α w hodowli limfocytów z krwi obwodowej, jak i naciekających guz po stymulacji przeciwciałami anty-cd3, oceniając stężenia IFN-α w supernatancie hodowli, ale jednocześnie nie stwierdzili produkcji IFN-α bez stymulacji. Roussel i wsp. [29] wykazali, że gen IFN-α nie wykazywał zwiększonej ekspresji w limfocytach T u pacjentów z rakiem płuca. Palmer i wsp. [30] sugerują, że produkowane przez komórki nowotworowe cytokiny m.in. IL-10 wpływają supresyjnie na różnicowanie limfocytów T oraz na produkcję cytokin. Inni autorzy analizowali wydzielanie IFN-α i IL-4 przez limfocyty krążące we krwi obwodowej, limfocyty obecne w regionalnych węzłach chłonnych objętych przerzutem oraz naciekające guz. Badania Ito i wsp. [25] wykazały, że dominującą populacją są limfocyty wydzielające IFN-α. Nakamura i wsp. [31] podkreślają jednak, że komórki te nie wykazują wystarczających właściwości cytotoksycznych przeciwko autologicznym komórkom nowotworu. Liczni autorzy sugerują, że jedną z przyczyn jest fakt, iż limfocyty T rozpoznają tylko niespecyficzne antygeny na powierzchni komórek guza. Bardziej prawdopodobny mechanizm polega na blokowaniu cytotoksycznej odpowiedzi przez zmniejszoną prezentację antygenów nowotworowych lub immunosupresyjne działanie czynników wydzielanych przez guz tj. IL-10 lub TGF-α [32, 31]. W innych badaniach w inwazyjnym raku sutka stwierdzono znaczną ekspresję genów TNF-α, IL-2 i IFN-γ, podczas gdy w guzach jajnika ekspresja tych genów była niewielka. Badania te dowodzą, że różnice w ekspresji genów cytokinowych w komórkach naciekających guz mogą wynikać ze zdolności komórek nowotworowych do aktywowania i regulowania funkcji komórek immunokompetentnych [1-27]. W piśmiennictwie podkreśla się znaczenie cytokin prozapalnych w regulowaniu mechanizmów związanych z progresją guza i dalszą prognozą u pacjentów z chorobą nowotworową [3, 5 11, 13, 15, 17-21]. Podwyższony poziom cytokin IL-6 i IL-8 w modelu in vivo raka płaskonabłonkowego głowy i szyi oraz rolę interleukin prozapalnych jako czynników sprzyjających występowaniu przerzutów wykazali Wolf i wsp. [5]. Znaczenie wydzielanych cytokin, w tym prozapalnych (IL-2, IL-6, IL-8, IL-12 i IFNγ), w progresji guza i powstawaniu przerzutów w raku trzustki potwierdzili również Bellone i wsp. [8]. Pries i wsp. [6, 7] także podkreślili istotne znaczenie cytokin zapalnych i proangiogennych w regulacji agresywności wzrostu guza nowotworowego oraz odpowiedzi na leczenie (radio- i chemioterapię). Liczni badacze poszukują związku między poziomem wydzielanych cytokin przez limfocyty krwi obwodowej i podścieliska nowotworowego a przebiegiem klinicznym choroby oraz rozległością miejscową i węzłową guza [10, 11, 13, 16 21]. Lathers i wsp. [10, 13] w badaniach ekspresji cytokin: IL-2, IFNγ, IL-4, IL-6, IL-10 w rakach płaskonabłonkowych regionu głowy i szyi, także potwierdzili występowanie związku między poziomem cytokin w surowicy krwi chorych i zaawansowaniem zmian nowotworowych T i N. Autorzy zanotowali wzrost wydzielania badanych cytokin wraz z wyższym stopniem zaawansowania zmian. Podobnie, wysokie stężenia IL-6 w surowicy krwi pacjentów z zaawansowanym rakami płaskonabłonowymi regionu głowy i szyi zanotowali Sparano i wsp. [11]. Autorzy potwierdzili wzmożone wydzielanie IL-6 i IL-10 w badanej grupie chorych a wzrost poziomu cytokin korelował z wyższym stopniem cechy T i N. Ueda i wsp. [21] potwierdzili zastosowanie oznaczania stężenia w surowicy chorych IL-6 i IL-8 jako wskaźników przebiegu choroby nowotworowej u pacjentów z rakiem jelita grubego. Badacze zanotowali znamienny związek poziomu IL-8 w surowicy z histologicznym typem guza i stopniem zaawansowania zmian oraz wykazali korelację wysokiego stężenia IL-6 i IL-8 z obecnością przerzutów węzłowych. Wielu autorów podkreśla, że kontakt komórek immunokompetentnych z komórkami nowotworowymi może być przyczyną upośledzonej odpowiedzi immunologicznej na rozwijający się proces nowotworowy. Ponieważ limfocyty T cytotoksyczne pełnią główną rolę w immunologicznej odpowiedzi przeciwnowotworowej, to właśnie zmiana w wydzielaniu cytokin jest bezpośrednio związana

7 PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS 41 z zaburzeniem cytotoksycznych właściwości limfocytów T. Wnioski 1. W badaniach in vitro, komórki raka płaskonabłonkowego krtani wykazują wpływ na aktywność komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, modyfikując wydzielanie przez nie cytokin prozapalnych IL-6 i TNF-α. 2. Obecność komórek nowotworowych w hodowli limfocytów T powoduje zmniejszone wydzielanie IL-6 oraz zwiększone wydzielanie TNF-α. PIŚMIENNICTWO 1. Płużańska A, Dyczka J. Immunologia i immunoterapia nowotworów. W Immunologia kliniczna. Kowalski M. (red.). Mediton; Fukuyama T, Ichiki Y, Hamada S, Shigematsu Y, Baba T, Nagata Y i wsp. Cytokine production of lung cancer cell lines: Correlation between their production and the inflammatory/immunological responses both in vivo and in vitro. Cancer Sci. 2007; 98(7): Pries R, Thiel A, Brocks C, Woldenberg B. Secretion of tumor-promoting and immune suppresive cytokines by cell lines of head and neck squamous cell carcinoma. In Vivo 2006; 20(1): Jiang C, Ye D, Qiu W, Zhang X, Zhang Z, He D i wsp. Response of lymphocyte subsets and cytokines to Shenyang prescription in Sprague-Dawley rats with tongue squamous cell carcinomas induced by 4NQO. BMC Cancer 2007; 7: Wolf JS, Li G, Varadhachary A, Petrak K, Schneyer M, Li D i wsp. Oral lactoferrin results in T-cell dependent tumor inhibition of head and neck squamous cell carcinoma in vivo. Clin. Cancer Res. 2007; 1, 13(5): Pries W, Wollenberg B. Cytokines in head and neck cancer. Cytokine Growth Factor Rev. 2006; 17(3): Pries R, Nitsch S, Wollenberg B. Role of cytokines in head and neck squamous cell carcinoma. Expert Rev. Anticancer Ther. 2006; 6(9): Bellone G, Smirne C, Mauri FA, Tonel T, Carbone A, Buffolino A i wsp. Cytokine expression profile in human pancreatic carcinoma cells and in surgical specimens: implications for survival. Cancer Immunol. Immunother. 2005; 11: Thomas GR, Chen Z, Leukinova E, Van Waes C, Wen J. Cytokines IL-1 alpha, IL-6, and GM-CSF constitutively secreted by oral squamous carcinoma induce down-regulation of CD80 costimulatory molekule`expression: restoration by interferon gamma. Cancer Immunol. Immunother. 2004; 53(1): Lathers DM, Young MR. Increased aberrance of cytokine expression in plasma of patients with more advanced squamous cell carcinoma of head and neck. Cytokine 2004; 7, 25(5): Sparano A, Lathers DM, Achilles N, Petruzzelli GJ, Young MR. Modulation of Th1 and Th2 cytokine profiles and their association with advanced head and neck squamous cell carcinoma. Otolaryngol. Head Neck Surg. 2004; 131(5): Toutirais O, Chartier P, Dubois D, Bouet F, Leveque J, Catros-Quemener V, Genetet N. Constitutive expression of TGF-beta1, interleukin-6 and interleukin-8 by tumor cells as a major component of immune escape in human ovarian carcinoma. Eur. Cytokine Netw. 2003; 14(4): Lathers DM, Achille NJ, Young MR. Incomplete Th2 skewing of cytokines in plasma of patients with squamous cell carcinoma of head and neck. Hum. Immunol. 2003; 64(12): Pignataro L, Corsi MM, Sambataro G, Porcaro L, Tredici P, Broich G. Plasmatic cytokine network in patients with laryngeal carcinoma after surgical treatment. Anticancer Res. 2001; 21(5): Chen Z, Malhotra PS, Thomas GR, Ondrey FG, Duffey DC, Smith CW i wsp. Expression of proinflammatory and proangiogenic cytokinez in patients with head and neck cancer. Clin. Cancer Res. 1999; 5(6): Ku JL, Kim WH, Lee JH, Park HS, Kim HM, Sung MW, Park i wsp. Establishment and characterization of human laryngeal squamous cell carcinoma cell lines. Larygoscope 1999; 109(6): Heimdal JH, Aarstad HJ, Klementsen B, Oloffson J. Disease stage related in vitro responsiveness of peripheral blood T-lymphocytes in patients with head and neck carcinoma. Acta Otoalryngol. 1998; 118(6): Karcher J, Reissem C, Daniel V, Herold-Mende C. Cytokine expression of transforming growth factor-beta2 and interleukin-10 in squamous cell carcinomas of the head and neck. Comparison of tissue expression and serum levels. HNO 1999; 47(10): Chopra V, Dinh TV, Hannigan EV. Circulating serum levels of cytokinez and angiogenic factors in patients with cervical cancer. Cancer Invest. 1998; 16(3): Oka M, Yamamoto K, Takahashi M, Hakozaki M, Abe T, Lizuka N i wsp. Relationship between serum levels of interleukin 6, various disease parameters and malnutrition in patients with esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Res. 1996; 56 (12): Ueda T, Shimada E, Urakawa T. Serum levels of cytokines in patients with colorectal cancer: possible involvement of interleukin-6 and interleukin-8 in hematogenous metastasis. J. Gastroenterol. 1994; 29(4): Chen Z, Colon I, Ortiz N, Callister M, Dong G, Pegram MY i wsp. Effects of interleukin-1, interleukin-1 receptor antagonist and neutralizing antibody on proinflammatory cytokine expression by human squamous cell carcinoma lines. Cancer Res. 1998; 58: Woods KV, El-Nagger A, Clayman G, Grimm EA. Variable expression of cytokines in human head and neck squamous cell carcinoma cell lines and consistent expression in surgical specimens. Cancer Res. 1998; 58:

8 42 PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS 24. Golusiński W, Szyfter K, Biczysko W. Badania genetyczne i immunologiczne. W Rak krtani i gardła dolnego. Janczewski G, Osuch-Wójcikiewicz E. (red.). α-medica press Ito N, Suzuki Y, Taniguchi Y, Ishiguro K, Nakamura H, Ohgi S. Prognostic significance of T helper 1 and 2 and T cytotoxic 1 and 2 cells in patients with non-small cell lung cancer. Anticancer Res. 2005; 25: Sheu BC, Lin RH, Lien HC, Ho HN, Hsu SM, Huang SC. Predominant Th2/Tc2 polarity of tumor-infiltrating lymphocytes in human cervical cancer.j Immunol. 2001; 167(5): Santin AD, Hermonat PL, Ravaggi A, Bellone S, Roman JJ, Smith CV i wsp. Phenotypic and functional analysis of tumor-infiltrating lymphocytes compared with tumorassociated lymphocytes from ascitic fluid and peripheral blood lymphocytes in patients with advanced ovarian cancer. Gynecol Obstet Invest. 2001; 51(4): Yano T, Yasumoto K, Togami M, Ishida T, Kimura G, Sugimachi K i wsp. Properties of recombinant interleukin- 2-cultured tumor-infiltrating lymphocytes in human lung cancer. Int. J. Cancer 1989; 43: Roussel E, Gingras MC, Grimm EA, Roth JA. High expression of adhesion molecules/activation markers with little interleukin-2, interferon-, and tumor necrosis factor gene activation in fresh tumor-infiltrating lymphocytes from lung adenocarcinoma. Cancer Immunol. Immunother. 1995; 41: Palmer EM, Seventr GA. Human T helper cell differentation is regulated by the combined action of cytokines and accessory cell dependent costimulatory signals. J. Immunol. 1997; 158: Nakamura H, Ishiguro K, Mori T. Different immune function of peripheral blood, regional lymph node, and tumor infiltrating lymphocytes in lung cancer patients. Cancer 1988; 62: Bellone G, Turletti A, Artusio E, Mareshi K, Carbone A., Tibaudi D i wsp. Tumor-associated transforming growth factor-β and interleukin-10 contribute a systemic Th2 immune phenotype in pancreatic carcinoma patients. Am. J. Pathol. 1999; 155: