MALOWANIE CHROMOSOMÓW I PRZEDWCZESNA KONDENSACJA CHROMATYNY - NOWE METODY DOZYMETRII BIOLOGICZNEJ

Transkrypt

1 MALOWANIE CHROMOSOMÓW I PRZEDWCZESNA KONDENSACJA CHROMATYNY - NOWE METODY DOZYMETRII BIOLOGICZNEJ Sylwester Sommer, Maria Wojewódzka, Iwona Buraczewska, Grażyna Kobiałko, Joanna Pontek, Irena Szumiel, Andrzej Wójcik Instytut Chemii i Techniki Jądrowej, Warszawa ^= ^. o o o Abstract CHROMOSOME PAINTING AND PREMATURELY CONDENSED CHROMOSOMES (PCC) - NEW METHODS OF BIOLOGICAL DOSIMETRY Classic methods of biological dosimetry - micronucleus and dicentric assay pose several problems. In the case of micronucleus there is a wide range of spontaneous frequencies and smoking and age are powerfull contributing factors. In the case of dicentrics - low mitotic index in some individuals especially in the elderly or accidently exposed to high radiation doses. So, there are 2 quite new molecular techniques which at least in part solve these problems: chromosome painting and PCC. Chromosome painting by employing chromosome-specific DNA probes allow easy identification and quantification of translocations. Recently, it was shown that calyculin A or okadaic acid, inhibitors of 1 and 2A protein phosphatases, induce PCC in peripheral blood cells. This is an easy biodosimetric method with a high PCC index and independent of the ability of cells to divide e.g. after high (20 Gy) doses, when the mitotic index is extremly low. 1. CELE DOZYMETRII BIOLOGICZNEJ Szerokie zastosowanie technologii jądrowych w medycynie, przemyśle i nauce powoduje ciągłe ryzyko niekontrolowanego narażenia człowieka na promieniowanie jonizujące. W przypadku takiego podejrzenia względy medyczne i prawne wymagają odtworzenia pochłoniętej dawki. Nawet jeżeli rekonstrukcja dawki na podstawie dozymetrii fizycznej lub znajomości aktywności źródła promieniowania jest możliwa, to tylko dozymetria biologiczna pozwala oszacować rzeczywistą dawkę, jaką otrzymała dana osoba. Wiedza ta jest niezbędna dla lekarzy, którzy muszą zdecydować jakie procedury medyczne, np. przeszczep szpiku kostnego lub komórek pnia, czy leczenie (np. czynnikami wzrostu) należy zastosować [1]. Odrębnym problemem, w którego rozwiązaniu mogą być pomocne techniki dozymetrii biologicznej, jest ocena promieniowrażliwości osobniczej pacjentów przed poddaniem ich radioterapii [2]. Wiadomo, że pacjentów poddawanych radioterapii cechuje różna promieniowrażliwość. Dla niektórych z nich efekty uboczne standardowo stosowanej radioterapii mogą przewyższać jej korzyści. Znając wyniki badań in vitro można u takich osób modyfikować dawki frakcyjne, a także dawkę całkowitą. 333

2 Istniejące techniki dozymetrii biologicznej, takie jak analiza mikrojąder lub chromosomów dicentrycznych i pierścieni podlegają pewnym ograniczeniom, omówionym poniżej. 2. MIKROJĄDRA Analiza mikrojąder polega na obliczeniu częstości mikrojąder (fragmentów, a nawet całych chromosomów pozostałych po podziale mitotycznym poza jądrami rodzicielskimi i widocznych po wybarwieniu barwnikiem Giemzy w cytoplazmie) w limfocytach krwi obwodowej (LKO). Analizę prowadzi się głównie w limfocytach T, stymulowanych do podziału fitohemaglutyniną, następnie poddanych działaniu cytochalazyny B (hamuje podział komórki, nie zaburzając podziału jądra) i utrwalonych po 72 godzinach standardowymi metodami cytogenetycznymi (rys. 1). Rys. 1. Mikrojądra, oznaczone strzałkami w dwujądrzastym limfocycie ludzkim. Częstość mikrojąder obliczana w komórkach dwujądrzastych (tj. w komórkach które podzieliły się raz) jest proporcjonalna do otrzymanej dawki. Wysokość dawek odczytuje się z krzywej kalibracyjnej sporządzonej dla krwi napromienionej in vitro znanymi dawkami. Metoda jest prosta i tania. Podlega jednak wielu ograniczeniom. Wiele czynników wpływa na częstość spontanicznych mikrojąder, np. palenie papierosów, wiek czy zmienność międzyosobnicza [3, 4]. W rezultacie częstość spontanicznych mikrojąder jest bardzo różna u poszczególnych osób, co powoduje niską czułość metody w zakresie niskich dawek promie- 334

3 niowania jonizującego [5]. Próbuje się podnieść czułość metody poprzez analizę mikrojąder nie zawierających centromerów [5-7]. Opiera się to na spostrzeżeniu, że popromienne mikrojądra powstają głównie z fragmentów acentrycznych, podczas gdy spontaniczne - z całych chromosomów zawierających centromery. Jednak takie podejście, angażujące nowoczesne techniki, takie jak FISH (znakowanie centromerów fluorescencyjnymi sondami), jest drogie i pracochłonne. 3. ANALIZA CHROMOSOMÓW DICENTRYCZNYCHI PIERŚCIENI Częstość chromosomów dicentrycznych i pierścieni w LKO jest uznawana przez Międzynarodową Agencję Energii Atomowej za wiarygodny wskaźnik dawki pochłoniętej [8]. Określa się częstość dicentryków (rys. 2) i pierścieni w LKO, stymulowanych do podziału fitohemaglutyniną, Rys. 2. Dicentryk i fragment acentryczny (oznaczone strzałkami) w metafazie limfocytu ludzkiego. poddanych blokowi colcemidowemu po 46 godz. hodowli, utrwalonych standardowymi metodami cytogenetycznymi i barwionych Giemzą. Częstość dicentryków i pierścieni jest proporcjonalna do otrzymanej dawki, którą odczytuje się z odpowiednich krzywych kalibracyjnych. Metoda jest bardzo czuła (wykrywa dawki rzędu 0,1 Gy) i niezbyt trudna. Jednak znane są jej liczne ograniczenia. Wymienić tu można niski indeks mitotyczny (częstość komórek które weszły w mitozę) u niektórych osób, szczególnie w starszym wieku oraz po napromienieniu wysokimi dawkami (powyżej 3 335

4 Gy) promieniowania [9]. Następnym problemem jest, że badane są tylko komórki osiągające mitozę, a więc pewna część komórek z aberracjami może zostać selektywnie pominięta, gdy np. charakteryzują się opóźnieniem cyklu komórkowego [9]. Dicentryki i pierścienie należą do tzw. aberracji niestabilnych. Półokres przebywania limfocytów w krwi obwodowej szacuje się na od 130 dni do 3 lat [10, 11]. Są one stopniowo zastępowane przez komórki dojrzewające w szpiku. Jednak aberracje niestabilne uniemożliwiają podział komórek, powodując ich śmierć, tzw. śmierć mitotyczną. Tak więc, nowe limfocyty powstałe w szpiku i wchodzące do krwi obwodowej pozbawione są dicentryków i pierścieni. W konsekwencji częstość aberracji niestabilnych w LKO spada z czasem. Analiza dicentryków i pierścieni nie nadaje się zatem do oszacowania dawki pochłoniętej w przypadkach kiedy między badaniem a ekspozycją upłynął zbyt długi okres czasu. Otrzymuje się wtedy zaniżone wyniki [12]. Opisane powyżej trudności można częściowo ominąć, stosując nowoczesne techniki cytogenetyczne, takie jak malowanie chromosomów i przedwczesna kondensacja chromatyny (PCC) oraz połączenie obu tych technik. 4. MALOWANIE CHROMOSOMÓW Malowanie chromosomów polega na wyznakowaniu wybranych par chromosomów sondami DNA, wyznakowanymi barwnikami fluorescencyjnymi. Pozwala to na rozróżnienie poszczególnych chromosomów i ich fragmentów oraz analizę aberracji chromosomowych, zarówno niestabilnych (pierścienie i dicentryki), jak i stabilnych (translokacje). Oszacowanie poziomu translokacji było do niedawna możliwe tylko poprzez zastosowanie techniki prążkowania chromosomów. Nakład pracy związany z tego typu badaniami praktycznie uniemożliwiał zastosowanie ich w celach dozymetrycznych. Teraz, dzięki istnieniu sond malujących poszczególne chromosomy i techniki hybrydyzacji in situ (FISH) możliwe jest efektywne badanie translokacji. Zliczenie liczby translokacji ma tę zasadniczą przewagę nad zliczeniem dicentryków i pierścieni, że są to tzw. aberracje stabilne, nie powodujące śmierci mitotycznej dzielących się komórek. Dojrzewające w szpiku i śledzionie limfocyty będą więc miały podobny poziom translokacji jak stopniowo przez nie zastępowane LKO. Badanie translokacji lepiej nadaje się więc do dozymetrii wykonywanej po jakimś czasie od napromienienia niż analiza dicentryków. Jednak również ta metoda nie jest pozbawiona ograniczeń. 336

5 Po pierwsze fakt, że aberracje stabilne nie są gubione" przez dzielące się komórki powoduje, że w badanej puli znajdują się komórki bądź ich klony napromienione w różnej fazie cyklu komórkowego w szpiku. Zgodnie z podstawową regułą radiobiologii - regułą Bergonie i Tribondeaux - komórki szybko się dzielące są bardziej promieniowrażliwe niż komórki w interfazie cyklu komórkowego. Tak więc, po upływie pewnego czasu od ekspozycji mamy do czynienia z co najmniej 2 populacjami komórek: niezsynchronizowanymi, niedojrzałymi, napromienionymi w czasie podziałów komórkami ze szpiku oraz będącymi w interfazie, mniej promieniowrażliwymi komórkami, które w trakcie napromienienia już były obecne we krwi obwodowej. W jakim stopniu to zastrzeżenie, oparte na rozważaniach teoretycznych, faktycznie wpływa na dokładność oznaczenia dawki - wymaga dalszych badań. Po drugie, częstość spontanicznych translokacji jest 3-5-krotnie wyższa niż częstość dicentryków [13]. Może to powodować niejednoznaczność w interpretacji wyników w zakresie niskich dawek. Po trzecie, badania opisaną metodą są koszowne. Możliwe i praktykowane jest malowanie sondami wszystkich chromosomów (multicolour FISH) i badanie wszystkich aberracji, ale jest to bardzo drogie. Tańszą metodą jest badanie popromiennych translokacji tylko w wybranych chromosomach, ale wybór chromosomów stwarza nową trudność. Wiadomo, że częstość translokacji w poszczególnych chromosomach jest różna i nie odpowiada ich udziałowi w genomie. W dodatku dane o zwiększonej, bądź zmniejszonej promieniowrażliwości poszczególnych chromosomów są sprzeczne [14, 15]. W Zakładzie Radiobiologii i Ochrony Zdrowia IChTJ prowadzimy prace nad częstością translokacji w losowo wybranych chromosomach 2, 8 i 14, wpisując się w nurt tego typu badań. 5. PRZEDWCZESNA KONDENSACJA CHROMATYNY (PCC) W dzielących się komórkach kondensacja chromatyny jest wczesnym etapem mitozy. PCC polega na pobudzeniu do kondensacji materiału genetycznego komórek nie będących w mitozie. Uzyskuje się to w dwojaki sposób: albo przez fuzję komórek interfazowych (w których chcemy spowodować kondensację chromatyny) z komórkami mitotycznymi (przy użyciu polietylenu glikolu, pola elektrycznego lub wirusa Sendai jako czynników ułatwiających fuzję międzykomórkową), albo poprzez działanie na komórki inhibitorami fosfataz typu l i 2A, takimi jak kalikulina A i kwas okadajowy [16, 17]. W celach dozymetrycznych wywołuje się PCC w LKO. Po utrwaleniu standardowymi metodami cytogenetycznymi bada 337

6 się częstość fragmentów acentrycznych, zwanych fragmentami PCC. Jest ona proporcjonalna do dawki promieniowania [18]. Technika PCC polegająca na fuzji z komórkami mitotycznymi jest trudna metodycznie i dlatego nigdy nie znalazła szerszego zastosowania. Dopiero odkrycie, że inhibitory fosfataz wywołują PCC spowodowało wdrożenie metody do dozymetrii biologicznej. Zarówno kalikulina A, jak i kwas okadajowy wywołują PCC (rys. 3) w komórkach stymulowanych do podziału przez fitohemaglutyninę i hodowanych in vitro przez 2 dni. Metoda jest prosta i dzięki niej otrzymujemy indeksy komórek o skondensowanych chromosomach przewyższające klasyczne" indeksy mitotyczne. Zasadniczą zaletą PCC jest, że uniezależnia ona rekonstrukcję dawki od zdolności komórek do podziału, nawet w przypadku dawek rzędu 20 Gy, kiedy zdolności limfocytów do podziału są bardzo ograniczone [19]. PCC stosuje się zatem do szacowania wysokich dawek promieniowania. Rys. 3. Przedwczesna kondensacja chromatyny (PCC). Chromosomy skondensowane dzięki działaniu kalikuliny A. Strzałkami zaznaczono fragmenty PCC (dodatkowe fragmenty acentryczne powstałe w wyniku sztucznej kondensacji). Można połączyć metodę PCC z malowaniem chromosomów. Pozwala to na zliczenie nie tvlko całkowitej liczby fragmentów w komórce, ale także na ocenę liczby wymian i udziału poszczególnych chromosomów w ich powstaniu. W Zakładzie Radiobiologii i Ochrony Zdrowia IChTJ podjęto próbę przygotowania stosownych krzywych kalibracyjnych dla dozymetrii na podstawie liczby fragmentów PCC, przy czym kondensację chromosomów uzyskuje się przy pomocy kalikuliny A. Badamy też udział chromosomów 2, 8 i 14 w powstawaniu fragmentów PCC przy użyciu techniki malowania chromosomów. 338

7 Praca finansowana z środków KBN (projekt badawczy 6P05A11920). LITERATURA [1], Lloyd D.C.: Chromosomal analysis to assess radiation dose. Stem Cells. 15 (Suppl 2), (1997). [2], Coco-Martin J.M., Begg A.C.: Detection of radiation-induced chromosome aberrations using fluorescence in situ hybridization in druginduced premature chomosome condensations of tumour cell lines with different radiosensitivities. Int. J. Radiat. Biol., 71., 3, (1997). [3]. Gantenberg H.W., Wuttke K., Streffer C., Miiller W.U.: Micronuclei in human lymphocytes irradiated in vitro or in vivo. Radiat. Res., 128, (1991). [4]. Thierens H., Vral A., De Ridder L.: Biological dosimetry using the micronucleus assay for lymphocytes: interindividual differences in dose response. Health Phys., 61., (1991). [5]. Wójcik A., Kowalska M., Boużyk E., Buraczewska L, Szumiel L: Analiza występowania centomerów w mikrojądrach metodą FISH dla celów dozymetrii biologicznej. Raport końcowy projektu badawczego KBN nr 4 P05A (2000). [6]. Norppa H., Renzi L., Lindholm C.: Detection of whole chromosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by antikinetochore staining and in situ hybridization. Mutagenesis, 8, (1993). [7]. Vral A., Thierens H., De Ridder L.: In vitro micronucleus-centromere assay to detect radiation-damage induced by low doses in human lymphocytes. Int. J. Radiat. Biol., (1997). [8]. Biological dosimetry: chromosome aberrations analysis for dose assessment. International Atomic Energy Agency Technical Report No 260. IAEA, Vienna [9]. Durante M., Furusawa Y., Gotoh E.: Technical Raport: A simple method for simultaneous interephase-metaphase chromosome analysis in biodosimetry. Int. J. Radiat. Biol., 74, 4, (1998). [10]. Ramalho A.T., Nascimento A.C., Natarajan A.T.: Chromosomal aberrations. Red. G. Obe, A.T. Natarajan. Springer-Verlag, 1990, s [11]. Buckton K.E.: Chromosome aberrations in patients treated with X- irra-diation for ankylosing spondylitis. In: Radiation-induced chromosome damage in man. Red. T. Ishihara, M.S. Sasaki. Alan R. Liss, New York 1983, s

8 [12]. Darroudi F.: Practical use, recent and future techniques of biodosimetry. Leiden [13]. Darroudi F., Natarajan A.T.: Biological dosimetric studies in the Chernobyl Radiation Accident, on populations living in the contaminated areas (Gomel region) and in Estonian clean-up workers, using FISH technique. The radiological consequences of the Chernobyl accident [14]. Barrios L., Miro R., Caballin M.R., Fuster C., Gueda F., Subias A., Egozgue J.: Cytogenic effects of radiotherapy. Breakpoint distribution in induced chromosome aberrations. Cancer Genet. Cytogen., 41,61-70(1989). [15]. Knehr S., Zitzelsberger H., Braselmann H., Nahrstedt U., Bauchinger M.: Chromosome analysis by fluorescence in situ hybridization: further indications for a non-dna-proportional involvment of single chromosomes in radiation-induced structural aberrations. Int. J. Radiat. Biol., 70, (1996). [16]. Johnson R.T., Rao P.N.: Mammalian cell fusion: induction of premature chromosome condensation in interphase nuclei. Nature, 226, (1970). [17]. Gotoh E., Asakawa Y., Kosaka H.: Inhibition of protein serine/threonine phosphatases directly induces premature chromosome condensation in mammalian somatic cells. Biomed. Res., 16, (1995). [18]. Darroudi F., Natarajan A.T.: Proceeding of the 10th International Conference on High Levels of Natural Radiation. IAEA publication, Vienna 1993, s [19]. Kanda R., Hayata I., Lloyd D.C.: Technical Report: Easy biodosimetry for high-dose radiation exposures using drug-induced, prematurely condecsed chromosomes. Int. J. Radiat. Biol., 7_5, 4, (1999). 340