środowiskowych Henryk Różycki

Transkrypt

1 Fizjologiczny (metaboliczny) fingerprinting wykorzystanie systemu BIOLOG do identyfikacji bakterii oraz do charakterystyki mieszanych zespołów drobnoustrojów środowiskowych Henryk Różycki Zasada fingerprintingu metabolicznego wykorzystuje zjawisko zwiększonej aktywności metabolicznej w obecności badanego źródła węgla (konkretnie: zwiększona aktywność dehydrogenazy, wykrywana redukcją fioletu tetrazoliowego do fioletowo zabarwionego formazanu), testowanej w standaryzowanym układzie zminiaturyzowanym (testowe płytki mikrotitracyjne z 96 studzienkami o poj.150 µl: I-sza kontrolna, w pozostałych: 95 różnych źródeł węgla). Choć testowanie wykorzystywania różnych źródeł węgla i energii jest znane i stosowane (tak w badaniach fizjologii mikroorganizmów, jak i w diagnostyce mikrobiologicznej) od dawna, to opracowany przez korporację BIOLOG fizjologiczny (metaboliczny) fingerprinting ma następujące zalety w porównaniu z testowaniem tradycyjnym: a) testowanie wykorzystywania bardzo dużej liczby źródeł węgla (95) w układzie zminiaturyzowanym umożliwia dużą produktywność kosztem niewielkiego nakładu pracy; b) bardzo staranny dobór źródeł węgla o największej sile dyskryminującej (np. podczas identyfikacji); c) dokładna standaryzacja (źródła węgla i pożywka podstawowa są w formie zliofilizowanej w studzienkach wystarczy dodać standardowej zawiesiny młodych, żywych komórek bakterii): miarą wykorzystywania źródła C jest redukcja (reakcja barwna) fioletu tetrazoliowego przez dehydrogenazę; d) wspomaganie komputerowe możliwość identyfikacji bakterii w oparciu o obiektywne, wspomagane komputerowo metody numeryczne i probabilistyczne; e) możliwość ilościowej oceny zdolności wykorzystywania źródeł węgla przy wykorzystaniu automatycznych czytników płytek mikrotitracyjnych; ważne nie tylko przy identyfikacji bakterii, ale także przy fizjologicznym (metabolicznym), ilościowym fingerprintingu mieszanych zespołów drobnoustrojów w środowiskach naturalnych (woda, gleba, ścieki).

2 Dzięki wyżej wymienionym cechom, fizjologiczny (metaboliczny) fingerprinting daje pewniejsze, wiarygodniejsze i bardziej powtarzalne wyniki testowania wykorzystywania różnych źródeł węgla od klasycznych metod mikrobiologicznych. System BIOLOG został wyjściowo opracowany do identyfikacji bakterii (Bochner, 1989a, 1989b; Biolog 1993, 2001). Uwzględniając różnice w spektrach wykorzystywanych źródeł węgla pomiędzy bakteriami Gram-dodatnimi i Gramujemnymi, opracowano dwa rodzaje płytek: dla bakterii G(-): GN2 i dla bakterii G(+): GP2 różniące się nieco zestawami użytych źródeł C. Mapa substratów dla płytki GN2 jest następująca: Z kolei mapa substratów dla płytki GP2 poniżej: 2

3 Procedura identyfikacji bakterii przy użyciu systemu BIOLOG jest następująca: I. Wstępne zbadanie morfologii badanego szczepu i jego reakcji Grama (ważne: przy wyborze rodzaju płytek GN2 lub GP2). II. Zaszczepienie szczepu na płytki ze specjalną pożywką agarową [Biolog Universal Growth agar (BUG)], sprzedawaną przez firmę BIOLOG. III. Hodowla w odpowiedniej temperaturze (szczepy kliniczne: w o C; środowiskowe w o C), przez możliwie najkrótszy czas (poniżej doby!) w celu uzyskania bardzo młodych hodowli. IV. Zebranie wzrostu bakterii z płytek za pomocą sterylnych tamponików kosmetycznych i zawieszenie ich w specjalnym płynie do sporządzania szczepionki (Biolog Inoculation Fluid). V. Doprowadzenie uzyskanej zawiesiny do odpowiedniej gęstości optycznej [zależnie od tego, czy to bakterie G(-), czy G(+)], przy użyciu turbidymetru BIOLOG]. VI. Zaszczepienie płytek (odpowiednich! w zależności od reakcji Grama) za pomocą uzyskanej zawiesiny, przy użyciu wielokanałowej pipety automatycznej po 150 µl do każdej studzienki. 3

4 VII. Inkubacja płytek w temperaturze, jak w p. III. VIII. Pierwszy odczyt po 4-6 godzinach wyniki wprowadzane albo ręcznie, albo przy użyciu automatycznego czytnika płytek; pomyślna identyfikacja przy podobieństwie spektrum wykorzystywania źródeł węgla szczepu badanego do wzorca [Hipotetycznego Organizmu Modalnego Hypothetical Modal Organism (HMO) danego gatunku lub spektrum zgodności ( consensus pattern ) dla danego gatunku] nie mniejszym niż 75%. IX. Drugi odczyt po godzinach wyniki wprowadzane albo ręcznie, albo przy użyciu automatycznego czytnika płytek; pomyślna identyfikacja przy podobieństwie spektrum wykorzystywania źródeł węgla szczepu badanego do wzorca [Hipotetycznego Organizmu Modalnego Hypothetical Modal Organism (HMO) danego gatunku lub spektrum zgodności ( consensus pattern ) dla danego gatunku] nie mniejszym niż 50%. Schematyczny diagram podstawowych procedur przy identyfikacji z wykorzystaniem systemu BIOLOG jest następujący: Współczesne bazy danych systemu BIOLOG (z którymi są porównywane spektra wykorzystywania źródeł C badanych szczepów podczas odczytów, o których jest mowa w p. VIII i IX), obejmują prawie 2000 gatunków. Obejmuje to nie tylko bakterie tlenowe, dla których opracowano dwa podstawowe typy płytek [GN2 (G(-)), GP2 (G(+))], ale także beztlenowce (opracowano oddzielny typ płytek) i grzyby nitkowate (również inne płytki; wykorzystywany jest tylko pomiar turbidymetryczny, a nie reakcja dehydrogenazowa). Trzy lata temu, opracowano identyfikacyjne płytki testowe BIOLOG III-ciej generacji (Gen III), nie wymagające wstępnego rozróżnienia pomiędzy bakteriami Gram-dodatnimi i Gram-dodatnimi, dające się nastawić w ciągu 1 minuty z bazą szczepów bakterii obejmującą 1350 gatunków (Biolog, 2009). Mapa substratów jest tu następująca: 4

5 Charakter testów dla szczepu wzorcowego przedstawia poniższa ilustracja: Automatyczny system BIOLOG (z czytnikiem płytek może być również wykorzystywany do ilościowego, fizjologicznego (metabolicznego) fingerprintingu mieszanych zespołów drobnoustrojów w środowiskach naturalnych (woda, gleba, ścieki). 5

6 Różnice pomiędzy metabolicznym fingerprintingiem dla czystych szczepów i dla całych zbiorowisk mikroorganizmów przedstawił na schemacie Garland (1997): Metabolicznego fingerprintingu po raz pierwszy użyli Garland i Mills (1991), stosując płytki GN do porównania spektrów wykorzystywania źródeł węgla przez mieszane populacje drobnoustrojów glebowych, ryzoplanowych i wodnych; do redukcji 6

7 wielowymiarowości danych (aż 95 źródeł C!) zastosowano tu metodę analizy składowych głównych [ Principal Component Analysis (PCA)]. Obecnie do tego typu badań opracowano specjalny typ płytek: Ecoplates, gdzie uwzględnionych jest nie 95, lecz 31 starannie dobranych różnych źródeł C, powtórzonych 3-krotnie (w celu umożliwienia wiarygodniejszych analiz statystycznych: 3 powtórzenia na 1 płytce). Mapa substratów na ekopłytkach jest następująca: 7

8 Przykład wykorzystania ekopłytek do oceny zależności pomiędzy profilami metabolicznymi, a typem gleby, przedstawili Girvan i współpr (2003): Ostatnio w korporacji BIOLOG opracowuje się technologię macierzy fenotypowych ( Phenotypic Microarrays ). Analogicznie do techniki mikromacierzy DNA stosuje się technologię reakcji dehydrogenazowej, w skali wysoce masowej jako względnie uniwersalną metodę badania ekspresji genów, nie tylko do badań nad drobnoustrojami, ale także np. przy poszukiwaniu leku przeciw rakowi itp. (w macierzach fenotypowych możliwe jest wykonanie do 2000 testów). Literatura 1. Biolog, 1993: BIOLOG MicroStation System Release 3.50 (Users Manual). BIOLOG, Inc., Hayward, California, USA.. 2. Biolog, 2001: BIOLOG - MicroLog System, Release 4.2 User Guide BIOLOG, Inc., Hayward, California, USA. 3. Biolog, 2009: Biolog, Inc. Bacterial Identification. Microbial Identification. Phenotype MicroArray Biolog. (12 maja 2009). 4. Bochner B.R., 1989a: Sleuthing out bacterial identities. Nature, 339:

9 5. Bochner B.R., 1989b: Breathprints at the microbial level. ASM News, 55: Garland J.L., 1997: Analysis and interpretation of community-level physiological profiles in microbial ecology. FEMS Microbiol. Ecol., 24: Garland J.L., Mills A.L., 1991: Classification and characterization of heterotrophic microbial communities on the basis of patterns of community-level sole-carbonsource utilization. Appl. Environ. Microbiol., 57(8): Girvan M.S., Bullimore J., Pretty J.N., Osborn A.M., Ball A.S., 2003: Soil type is the primary determinant of the composition of the total and active bacterial communities in arable soils. Appl. Environ. Microbiol., 69(3):