Politechnika Gdańska Wydział Chemiczny Katedra Chemii Analitycznej. Rozprawa doktorska

Transkrypt

1 Politechnika Gdańska Wydział Chemiczny Katedra Chemii Analitycznej Rozprawa doktorska OPRACOWANIE NOWYCH PROCEDUR ROZDZIELANIA I OZNACZANIA WIELOSKŁADNIKOWYCH MIESZANIN Z ZASTOSOWANIEM KOLUMNOWEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ Z PRZEPŁYWEM ZWROTNYM ELUENTU mgr inŝ. GraŜyna Romanik Promotor: prof. dr hab. inŝ. Marian Kamiński Gdańsk 2009

2 Dziękuję Panu prof. dr hab. inŝ. Marianowi Kamińskiemu za ogrom przekazanej wiedzy, cierpliwość, wyrozumiałość i pomoc w napisaniu rozprawy. Piotrowi za stworzenie warunków pozwalających oddać się w duŝej mierze pracy i za wsparcie w trudnych chwilach Pracownikom z Katedry Chemii Analitycznej i Doktorantom, w szczególności Justynie, Angelice, Kamili za stworzenie przyjaznej atmosfery pracy i pomoc. Całemu zespołowi profesora Kamińskiego, w szczególności Anicie za dasz rade, Krzyśkowi za pomoc w korektach pracy, Maciejowi za uśmiech, Panu Wiesławowi za przekazaną wiedzę oraz ludziom przewijającym się przez pok. 8 i 9, za Ŝyczliwość i podtrzymywanie na duchu. Prace wraz z podziękowaniami dedykuję Mamie bez której nie byłabym w miejscu, w którym obecnie jestem.

3 SPIS TREŚCI 1. WPROWADZENIE PRZEGLĄD LITERATURY POJĘCIA- SKŁAD GRUPOWY I SKŁAD GRUPOWO STRUKTURALNY- TECHNIKI I METODY ROZDZIELANIA I OZNACZANIA SKŁADU GRUPOWEGO- ROZUMIENIE KLASYCZNE I ROZSZERZONE Techniki i metody oparte na chromatografii planarnej Techniki i metody oparte na kolumnowej chromatografii cieczowej Techniki i metody rozdzielania grupowego z wykorzystaniem chromatografii z fazą ruchomą w stanie nadkrytycznym Techniki i metody spektroskopii i spektrofotometrii wykorzystane do oznaczania składu grupowego Techniki i metody łączone PRZEPŁYW ZWROTNY ELUENTU W KOLUMNIE CHROMATOGRAFIA WIELOWYMIAROWA Zasady konstruowania chromatogramu w przypadku chromatografii dwuwymiarowej TECHNIKI I METODY DETEKCJI WYKORZYSTYWANE W CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ Detektor refraktometryczny METODY ANALIZY ILOŚCIOWEJ W HPLC CZĘŚĆ TEORETYCZNA WSPÓŁCZYNNIK ZAŁAMANIA ŚWIATŁA Podstawowe definicje Wpływ temperatury, ciśnienia i długość fali na wartość współczynnika załamania światła Addytywność współczynnika załamania światła ZASADA BEZKALIBRACYJNEGO OZNACZENIA SKŁADU PRÓBEK WG KONCEPCJI SYNOVIEC A W WARUNKACH KOLUMNOWEJ ELUCYJNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ TEORETYCZNA MOśLIWOŚĆ WYKORZYSTANIA WZORCA WEWNĘTRZNEGO W KONCEPCJI SYNOVIEC A METODYKA WYZNACZANIA STĘśEŃ SUBSTANCJI W HPLC WYKORZYSTANIE DETEKTORA SPEKTROFOTOMETRYCZNEGO DO OZNACZANIA BEZKALIBRACYJNEGO Podstawowe definicje Widmo absorpcji substancji lub grup substancji Oznaczanie bezkalibracyjne z wykorzystaniem detektora spektrofotometrycznego METODY IDENTYFIKACJI SKŁADNIKÓW ANALITU LUB GRUP SKŁADNIKÓW W CHROMATOGRAFII WYKORZYSTANIE UKŁADÓW RÓWNAŃ DO OZNACZANIA SKŁADU SKOMPLIKOWANYCH MIESZANIN OGÓLNA CHARAKTERYSTYKA MATERIAŁÓW WYKORZYSTYWANYCH W BADANIACH SPECYFIKI FARMACEUTYCZNE Potrzeba oznaczania komponentów leków w formie Ŝelu lub maści, a takŝe składników kremów i podobnych specyfików farmaceutycznych i kosmetycznych

4 4.2 ESTRY METYLOWE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH, MONO-, DI- TRIACYLOGLICEROLE Oznaczanie komponentów próbek zawierających lipidy POLIETYLOGLIKOLE ŚCIEKI Z OKSYDACJI ASFALTÓW, JAKO PRZYKŁAD ŚCIEKÓW PRZEMYSŁOWYCH UZASADNIENIE CELOWOŚCI PODJĘTYCH BADAŃ I STOSOWANYCH TECHNIK I METOD BADAWCZYCH CEL PRACY I CELE CZĄSTKOWE CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA MATERIAŁY Rozpuszczalniki i eluenty Substancje i roztwory wzorcowe i próbki badane Kolumny chromatograficzne, płytki TLC Aparatura i wyposaŝenie dodatkowe METODY POSTĘPOWANIA Wyznaczanie czasu i objętości martwej kolumn chromatograficznych Wyznaczanie sprawności kolumn chromatograficznych Przepływ zwrotny eluentu w kolumnie chromatograficznej Procedura oznaczania wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych Izolacja wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych z próbek asfaltów Procedura oznaczania WWA Procedura badania efektywności stosowania przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie w układach faz odwróconych (RP) Procedura badania efektywności stosowania przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie w układach faz normalnych (NP) Specyfiki farmaceutyczne Badanie rozpuszczalności składników oraz produktów Chromatografia wykluczania Chromatografii wykluczania z oddziaływaniami adsorpcyjnymi Chromatografia w układach faz odwróconych Zawartość wody w próbkach Oznaczanie dietyloaminy Obliczenie zawartości poszczególnych składników specyfików farmaceutycznych Estry metylowe kwasów tłuszczowych, mono-, di- triacyloglicerole Dobór warunków rozdzielania z zastosowaniem chromatografii planarnej Rozdzielanie i oznaczanie lipidów i pochodnych z wykorzystaniem chromatografii cienkowarstwowej sprzęŝonej z detektorem płomieniowo- jonizacyjnym Rozdzielanie lipidów i pochodnych z wykorzystaniem chromatografii cieczowej w układzie faz normalnych Rozdzielanie z wykorzystaniem chromatografii wykluczania Glikole polietylenowe

5 Rozdzielanie glikoli polietylenowych z wykorzystaniem chromatografii wykluczania Rozdzielanie glikoli polietylenowych z wykorzystaniem chromatografii wykluczania z kontrolowaną adsorpcją Rozdzielanie glikoli polietylenowych z wykorzystaniem chromatografii oddziaływań hydrofilowych Przygotowanie ekstraktów z próbek konserwowanego drewna Ścieki po oksydacji asfaltów Przygotowanie próbek do badań substancji trudnolotnych Analiza chromatograficzna- HPLC i GC Obliczenie stopnia oczyszczenia ścieków Badania dotyczące skuteczności stosowania oraz modyfikacji koncepcji Synoviec a OPRACOWANIE STATYSTYCZNE WYNIKÓW WYNIKI I DYSKUSJA Badania nad celowością stosowania przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie chromatograficznej, zamiast skoku siły elucji, w celu zapewnienia stabilności aktywności sorpcyjnej Oznaczanie WWA w asfaltach Badanie efektywności stosowania przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie chromatograficznej Oznaczanie komponentów specyfików farmaceutycznych Badania rozpuszczalności próbek i ich składników Oznaczanie składu specyfików farmaceutycznych Estry metylowe kwasów tłuszczowych mono- di- tri-acyloglicerole Dobór warunków rozdzielania grupowego acylogliceroli i ich pochodnych Badania z zastosowaniem chromatografii cieczowej z wykorzystaniem pręcików pokrytych sorbentem oraz detektora płomieniowo- jonizacyjnego- TLC- FID Oznaczanie glikoli polietylenowych w próbkach drewna i kąpielach konserwujacych Ścieki po oksydacji asfaltów STRESZCZENIE I WNIOSKI KOŃCOWE SPIS LITERATURY ZESTAWIENIE SKRÓTÓW I AKRONIMÓW DOROBEK NAUKOWY

6 1. Wprowadzenie W praktyce analitycznej, często, spotyka się zadania typu z czego składa się i w jakich proporcjach znajdują się składniki próbki, np. osadu, ekstraktu roślinnego, produktu technicznego, surowca technologicznego itp. Nie rzadko teŝ otrzymuje się zadania typu: ustalenie składu chemicznego oleju, osadu, specyfiku farmaceutycznego, asfaltu drogowego itd. Oczekiwane od analityka przez nie analityków udzielenie precyzyjnej odpowiedzi i wymaganie to jest traktowane jako oczywistość, na zasadzie skoro jesteś analitykiem to nie powinno sprawić tobie trudności określenie jakie składniki wchodzą w skład dostarczonej próbki i w jakich stęŝeniach się tam znajdują. Stwierdzenie, Ŝe problem jest z pewnością bardzo trudny, a być moŝe nierozwiązywalny (przecieŝ opisanych jest ponad 6,5 miliona związków chemicznych), spotyka się ze strony zainteresowanego z pozornym zrozumieniem, jednak jednocześnie z powątpiewaniem czy rzeczywiście jesteś analitykiem. Wymaganie jak najbardziej szczegółowego opisu składu osadu warunkuje moŝliwość określenia przyczyny jego powstawania, czy opis składu produktu technologicznego, np. oleju smarowego, czy asfaltu, warunkuje moŝliwość ustalenie technologii otrzymywania produktu. Stąd poprawne wykonanie takich zadań jest często warunkiem postępu w technice i technologii. Ma, więc, duŝe znaczenie udzielenie informacji, jakie składniki mogą znajdować się w dostarczonej próbce, a których występowanie nie jest moŝliwe. Analityk prosi z kolei o opis składu grupowego. Takie pytania są próbą zmniejszenia obszaru problemu analitycznego. W przypadku moŝliwości otrzymania poprawnej i wyczerpującej odpowiedzi moŝliwość poprawnego oznaczenia składu wieloskładnikowych mieszanin róŝnego rodzaju składników, o róŝnym zakresie polarności, hydrofobowości, róŝnych zakresach masy cząsteczkowej, wyraźnie wzrasta. Umiejętność wykonania tego typu analityki ma następujące konkretne zastosowania praktyczne, przy czym poniŝsza lista nie wyczerpuje całego zakresu: - wyjaśnienie, co jest kontaminentem oraz przyczyną zanieczyszczenia gleby, wody, produktu otrzymywanego w procesie technologicznym, a często moŝna w ten sposób odpowiedzieć na pytanie-, kto jest temu winny lub w jaki sposób mogło do tego dojść; 4

7 - wyjaśnienie, z czego skład się osad procesowy, który powoduje zmniejszenie droŝności, czy zatykanie przewodów procesowych, kanałów, wymienników ciepła, kominów itp.; - wyjaśnienie, co jest przyczyną awarii, zakłóceń procesowych; - określenie składu metabolicznego określonych tkanek roślinnych, czy zwierzęcych, hodowli bakteryjnych, owocników grzybów itp.; - określenie składu specyfiku farmaceutycznego, czy kosmetycznego, niepoŝądanych zanieczyszczeń leku itp., a takŝe wyjaśnienie jak technologia została zastosowana do otrzymywania surowców, czy składników; - stwierdzenie faktu sfałszowania produktu lub tak zwanej podróbki, a takŝe sposobu postępowania w celu dokonania tego wykroczenia, czy przestępstwa, w tym oceny adekwatności dowodu w postępowaniu sądowym; - ustalenie czy nie nastąpiła pomyłka, w czasie tzw. nalewu produktu do opakowań jednostkowych, tzn. czy partia opisana odpowiednią etykietą, rzeczywiście zawiera odpowiedni produkt, półprodukt, czy dodatek uszlachetniający; - określenie składu ścieków procesowych i oparów nad powierzchnią lustra ścieków, oparów powstających podczas nalewu asfaltu, składu produktów naftowych o niskiej lotności i dodatków uszlachetniających oleje; - i wiele innych. W konsekwencji problem analityczny sprowadza się do: - identyfikacji składników lub grup składników, a więc obejmuje ogólnie analitykę jakościową; - dokonania rozdzielenia na poszczególne składniki lub co najmniej grupy składników, a więc obejmuje problem separacji; - dobrania odpowiednich metodyk, detektorów czy instrumentów analitycznych do wykonania identyfikacji składników/ grup składników, a więc obejmuje problem identyfikacji i detekcji; 5

8 - w końcu, konieczne jest równieŝ dokonanie oznaczania zawartości określonych składników i grup składników, a więc ma miejsce problem kalibracji lub bezkalibracyjnego oznaczania zawartości składników i grup składników. Przedmiotem niniejszej pracy jest opanowanie, a przynajmniej uzyskanie znacznego postępu w poznaniu zasad postępowania, prowadzących do umiejętności wykonywania analityki składu szczegółowego i grupowego wieloskładnikowych mieszanin komponentów róŝnego typu produktów technicznych, osadów i cieczy procesowych, a takŝe ekstraktów z tkanek roślinnych, zwierzęcych i grzybowych, jak równieŝ w przypadku wielu innych zastosowań. Opisany problem analityczny jest szczególnie trudny z powodów: - najczęściej znamy tylko niektóre składniki badanej mieszaniny, a co do pozostałych mamy tylko określony poziom prawdopodobieństwa występowania (jeŝeli nie znamy Ŝadnych składników to problem jest raczej nierozwiązalny); - mieszanina jest na tyle wieloskładnikowa, Ŝe nie istnieje nawet potencjalna moŝliwość rozdzielenia, czy wyodrębnienia wszystkich komponentów, wówczas konieczne jest wykorzystanie rozdzielania grupowego i posiłkowania się dodatkowo składem grupowo- strukturalnym; - składniki mieszaniny są bardzo zróŝnicowane pod względem polarności, hydrofobowości, masy cząsteczkowej, pręŝności par, tendencji do tworzenia hydratów itp., a niekiedy w określonych warunkach, których dobrze nie znamy, mogą ze sobą wzajemnie reagować lub w czasie przechowywania, albo w okresie zdarzenia, które naleŝy opisać miały miejsce reakcje rozkładu, utleniania itp.; - nawet, jeśli wszystkie składniki badanego produktu znamy, to nie posiadamy ich wzorców, stąd nie moŝna wyznaczyć ich współczynników kalibracyjnych. Pod względem optymalnego wykorzystania: - narzędzi identyfikacji jakościowej; - narzędzi rozdzielania grupowego i szczegółowego ; - narzędzi detekcji oraz kalibracji składu ilościowego; 6

9 w badaniach szczególny nacisk został połoŝony na okoliczność bogatego składu mieszanin, znaczne zróŝnicowanie właściwości fizykochemicznych składników badanych mieszanin, oraz okoliczność braku wzorców wielu składników mieszanin. W przypadku składników naleŝących do róŝnych grup, stopień zróŝnicowania właściwości fizycznych i chemicznych jest znaczny. W przypadku składników naleŝących do jednej grupy, stopień zróŝnicowania jest niewielki, jednak w obu przypadkach zwiększa się stopień trudności rozdzielenia wszystkich komponentów. Z tych powodów narzędzia obliczeniowe, separacyjne i detekcyjne, konieczne do zastosowania, powinny charakteryzować się z jednej strony uniwersalnością, by mogły obejmować wszystkie składniki badanej mieszaniny, z drugiej strony wysoką selektywnością i specyficznością, by umoŝliwiały dokonanie identyfikacji oraz oznaczenia. Dotyczy to zarówno określonych grup substancji lub składników mieszaniny w warunkach, gdy rozdzielenie ich od innych komponentów nie jest moŝliwe, lub jest bardzo trudne, a takŝe gdy zawartość określonych składników lub grup składników jest bardzo niska, poniewaŝ te selektywne i specyficzne narzędzia analityczne są najczęściej jednocześnie wysoce czułe. W zakresie narzędzi słuŝących do badania składu jakościowego, a takŝe do detekcji zastosowano w pracy: - spektrofotometrię w zakresie nadfioletu i światła widzialnego z detektorem z linijką fotoelementów (UV- VIS/DAD); - chromatografię gazową sprzęŝoną ze spektrometrią mas (GC- MS); - pomiar wartości refrakcji molowej i współczynnika załamania światła; - wyznaczenie wartości współczynników retencji składników, bądź grup składników w określonych standaryzowanych warunkach rozdzielania, a takŝe parametrów retencji względnej. W przypadku tego typu badań korzystne jest takŝe zastosowanie chromatografii cieczowej sprzęŝonej ze spektrometrią mas (LC- MS). W niniejszej pracy zrezygnowano jednak ze stosowania tej techniki, ze względu na brak dostępu do odpowiedniej aparatury, a takŝe dlatego, Ŝe opracowane procedury i metodyki są tak zaplanowane, aby identyfikacja za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu 7

10 jądrowego (NMR), absorpcyjnej spektroskopii z transformacją Fouriera (FTIR), dyfrakcji rentgenowskiej oraz LC- MS, nie była konieczna. W zakresie narzędzi słuŝących do rozdzielania zastosowano: - wysokosprawną kolumnową elucyjną chromatografię cieczową (HPLC); - chromatografię planarną (cienkowarstwową, TLC), w wykonaniu klasycznym na płytce lub tzw. folii, oraz z wykonaniem na pręcikach pokrytych warstwą SiO 2 (TLC- FID); - wysokosprawną chromatografię gazową z kolumnami kapilarnymi (GC); - wirowanie, filtrację, itd. Rozdzielanie wykonywano w: - układach faz normalnych (NP- HPLC); - układach faz odwróconych (RP- HPLC); - układach oddziaływań hydrofilowych (HILIC); - warunkach chromatografii wykluczania (SEC/ GPC) bez i z uwzględnieniem oddziaływań adsorpcyjnych (SEC/ GPC/ NP lub RP). Rozdzielanie wykonywano z zastosowaniem jednej kolumny, bądź szeregowo połączonych kilku kolumn chromatograficznych tego samego typu, lub w warunkach chromatografii wielowymiarowej, przy czym podjęto próbę określenia najbardziej korzystnego uniwersalnego układu kolumn. Badaniom poddano takŝe moŝliwość i celowość wykorzystywania przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie chromatograficznej, w celu otrzymania grupy składników o wysokiej retencji i ich izolacji, albo dalszego rozdzielania w innych układach rozdzielczych. Stosowanie przepływu zwrotnego w kolumnie badano takŝe w aspekcie zwiększenia precyzji wyznaczania parametrów retencji i zachowania dłuŝszego okresu Ŝywotności kolumny. W zakresie narzędzi słuŝących do kalibracji oznaczania zawartości składników i grup składników w badanych mieszaninach zastosowano, tak klasyczne metody oznaczania: 8

11 - metodę krzywej kalibracyjnej; - metodę normalizacji prostej (GC-FID) i ze współczynnikami kalibracyjnymi, które wymagają posiadania lub otrzymania we własnym zakresie wzorców składników lub grup składników; jak i narzędzia niekonwencjonalne, umoŝliwiające dokonanie bezkalibracyjnego oznaczania, z wykorzystaniem koncepcji Synoviec a- moŝliwość wykonania oznaczenia zawartości objętościowej składników z zastosowaniem co najmniej dwóch rozdzielań z eluentami o róŝnym składzie i róŝnych wartościach współczynnika załamania światła, zapewniających jednakową retencję składników lub grup składników. W niniejszej pracy podjęto próbę rozszerzenia zakresu stosowania tej koncepcji dla metodyki wzorca wewnętrznego, a takŝe dla warunków róŝnej retencji tych samych pików chromatograficznych w dwóch układach chromatograficznych o zróŝnicowanych selektywnościach i znanych wartościach współczynnika załamania światła kaŝdego z eluentów. W części teoretycznej wyprowadzono odpowiednie zaleŝności obliczeniowe, a w części doświadczalnej sprawdzono ich poprawność i zakres przydatności. Do oznaczania składu mieszanin zbadano takŝe moŝliwość wykorzystania, opisanego w części teoretycznej, postulatu ułoŝenia i rozwiązania większej liczby równań niŝ wynosi liczba oznaczanych składników mieszaniny. W ten sposób jest moŝliwe ustalenie wielu wartości z kaŝdej niewiadomych i wyeliminowanie wartości obarczonych największym błędem. W zakresie pozostałych narzędzi słuŝących do detekcji i oznaczania zastosowano dodatkowo róŝnicowy detektor refraktometryczny (RID), jako detektor uniwersalny, którego sygnał jest zbliŝony do stęŝenia oznaczanego analitu oraz wyodrębnienie grup substancji lub poszczególnych substancji, z zastosowaniem chromatografii semipreparatywnej. W przypadku badania składu materiałów o skomplikowanym składzie często konieczne jest zastosowanie najpierw rozdzielania grupowego oraz wielowymiarowej chromatografii cieczowej. Wówczas, gdy nie jest moŝliwe, albo jest bardzo trudne i niezwykle czasochłonne rozdzielenie wszystkich składników mieszaniny, wtedy naleŝy najpierw wykonać 9

12 rozdzielanie grupowe. W wielu zadaniach analitycznych moŝna na tym poprzestać. Czasem, dodatkowo, trzeba rozdzielić i oznaczyć określone indywidua. Wówczas poza rozdzielaniem grupowym trzeba jeszcze, niektóre grupy, rozdzielić na poszczególne składniki. Konieczne jest, więc, wtedy stosowanie co najmniej dwuwymiarowego rozdzielania, gdy pierwszy etap jest rozdzielaniem grupowym, a drugi szczegółowym. Rozdzielanie grupowe naleŝy w tym przypadku rozumieć szeroko, tak w sposób klasyczny opisany poniŝej, tzn., jako rozdzielanie składników mieszaniny o zróŝnicowanej polarności, ale takŝe z uwzględnieniem innych kryteriów opisu zróŝnicowania grupowego składników badanego materiału np. na składniki tego samego, albo innego rodzaju, substancje o róŝnej masie cząsteczkowej, składniki o róŝnym zakresie hydrofobowości, itp. 10

13 2 Przegląd literatury 2.1 Pojęcia- skład grupowy i skład grupowo strukturalny- techniki i metody rozdzielania i oznaczania składu grupowego- rozumienie klasyczne i rozszerzone Pojedyncze związki chemiczne występujące w wieloskładnikowych mieszaninach, takich jak: produkty naftowe, ekstrakty roślinne róŝnego rodzaju, ścieki i osady, specyfiki farmaceutyczne, oleje i tłuszcze czy estry metylowe kwasów tłuszczowych (FAME), często wykazują podobne właściwości sorpcyjne. W przypadku tego typu materiałów, bardzo często, oznaczane są jedynie wybrane składniki mieszany, gdyŝ oznaczanie składu szczegółowego jest w wielu przypadkach bardzo trudne, a czasem dotychczas, niemoŝliwe [1-10]. Z tego powodu wprowadzono pojęcie składu grupowego. Oznaczenie polega na ustaleniu zawartości poszczególnych grup związków chemicznych. Wykorzystanie rozdzielania grupowego i oznaczanie grup substancji jest szczególnie przydatne w przypadku skomplikowanych mieszanin i jest stosowane albo jako pierwszy etap procesy analitycznego, albo stanowi zadanie analityczne [1-10]. Celowość wykonywania często oznaczania jedynie składu grupowego jest spowodowana względami praktycznymi. Otrzymuje się najbardziej potrzebne informacje o badanym materiale, a jednocześnie, ogranicza się do minimum liczbę informacji tak, aby moŝna było je w sposób optymalny wykorzystać. Informacja o składzie grupowym produktu często wystarcza by określić jego przydatność jako materiału do dalszej obróbki, a takŝe by dokonać wyboru i optymalizacji warunków procesu technologicznego. Pozwala to na racjonalne komponowanie produktów będących mieszaninami komponentów, gdy wzajemne proporcje grup komponentów decydują o jakości i właściwościach uŝytkowych produktu. W przypadku produktów naftowych określenie składu grupowego jest teŝ podstawą do oceny ich termicznej i oksydacyjnej stabilności [2, 3]. Oznaczenie składu grupowego umoŝliwia identyfikację źródła skaŝenia środowiska np. materiałami ropopochodnymi [4, 5]. Wykorzystanie danych dotyczących składu grupowego umoŝliwia identyfikację sfałszowania produktów oraz określenie w jaki sposób i w jakim zakresie zafałszowanie zostało wykonane [6, 7]. 11

14 W przypadku przetwórstwa ropy naftowej stosowane jest pojęcie składu grupowostrukturalnego. Polega na określeniu procentowego udziału w badanym materiale atomów węgla naleŝących do poszczególnych grup funkcyjnych w cząsteczkach. Oznacza się zawartość węgla parafinowego- CP, naftenowego- CN, aromatycznego- CA oraz niekiedy pierwszo-, drugo- czy trzeciorzędowego. Skład grupowo-strukturalny informuje o elementach strukturalnych frakcji naftowej, a nie o procencie masowym (objętościowym) danej grupy węglowodorów w badanej próbce [7-9]. Rozdzielanie grupowe realizowane w celu uzyskania separacji pod względem polarności substancji przeprowadzane jest z wykorzystaniem róŝnicowania oddziaływań adsorpcyjnych [10]. Stosuje się polarną fazę stacjonarną i bezwodną, nisko-, bądź średnio- polarną fazę ruchomą [11]. Rozdzielanie skomplikowanych mieszanin moŝliwe jest dzięki zróŝnicowaniu energii oddziaływań cząsteczek fazy ruchomej i składników rozdzielanej mieszaniny w stosunku do powierzchni fazy stacjonarnej. NaleŜy uwzględnić przede wszystkim oddziaływania dyspersyjne, elektrostatyczne i wiązania wodorowe. W przypadku bardzo słabych oddziaływań adsorpcyjnych między substancjami rozdzielanymi, a fazą stacjonarną, konieczne jest stosowanie eluentów o jak najniŝszej sile elucyjnej i jak najniŝszej zawartości wody. Eluent powinien, jednocześnie, zapewniać wystarczającą rozpuszczalność rozdzielanych substancji. Stosuje się wówczas niepolarne i nisko polarne rozpuszczalniki z szeregu eluotropowego Syndera [12], takie jak n-heksan, n-heptan, eter dietylowy, eter metylowo- tertbutylowy, chloroform, czy, dichlorometan, przy czym głównym składnikiem eluentu jest alkan. Jeszcze niŝszą siłę elucyjną wykazują fluoroalkany. Na selektywność ma wówczas wpływ głównie rodzaj zastosowanej fazy stacjonarnej, jak równieŝ zawartość wody w eluencie, a takŝe rodzaj i zawartość modyfikatora eluentu. Energia oddziaływań jest orientacyjnie uszeregowana następująco: Ŝel krzemionkowy > tlenek glinu > NH 2 > DIOL > CN. Do oznaczania składu grupowego, bardziej korzystne od naturalnych adsorbentów, wydają się być chemicznie związane fazy stacjonarne, poniewaŝ aktywność, tzn. retencja i selektywność, Ŝelu krzemionkowego i tlenku glinu oraz innych naturalnych adsorbentów, jest bardzo silnie zaleŝna od zawartości wody w fazie ruchomej. Niewielkie zmiany zawartości wody w eluencie wpływają niekorzystnie na powtarzalność rozdzielania grupowego [13]. Substancje wysoko polarne silnie oddziałują z fazą stacjonarną, w związku z tym ich współczynniki retencji są wysokie. Jeśli tak silnie oddziałują z fazą stacjonarną, Ŝe 12

15 k>>10, naleŝy je eluować silniejszym eluentem. WiąŜe się to z koniecznością rekondycjonowania kolumny chromatograficznej przed kolejnym rozdzielaniem, albo koniecznością zastosowania kolejnej kolumny, wypełnionej świeŝo aktywowanym sorbentem, jak to wykonuje się w przypadku metodyki opisanej w normie ASTM D 2007 [14], ASTM D-4120 [15], i z wykorzystaniem podobnych metodyk rozdzielania. Alternatywą dla stosowania skokowej zmiany siły elucji moŝe być wykorzystanie przepływu zwrotnego fazy ruchomej w kolumnie. Wówczas, jak wynika z badań Kamińskiego i Kartanowicza, moŝna dokonać elucji wszystkich składników pozostających jeszcze w kolumnie i rozpuszczalnych w eluencie [16, 17]. Problemy związane ze stosowaniem przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie HPLC są miedzy innymi przedmiotem badań niniejszej pracy (rozdział 2.2). W przypadku rozdzielania grupowego wieloskładnikowych mieszanin, uzyskanie koniecznej selektywności wymaga zastosowania kilku szeregowo połączonych kolumn [18, 19]. W przypadku mieszanin wieloskładnikowych, celowe jest więc stosowanie chromatografii wielowymiarowej, tzn. optymalnie zaprojektowanej procedury przełączania kolumn (rozdział 2.3). Układ wielokolumnowego chromatografu cieczowego powinien zapewniać moŝliwość zastosowania elucji gradientowej w kaŝdym z etapów rozdzielania, co moŝe mieć zastosowania do rozdzielania grupowego roślinnych metabolitów pierwotnych i wtórnych oraz innych substancji pochodzenia naturalnego. Przegląd literatury pozwolił upewnić się, Ŝe techniką potencjalnie zdolną do zapewnienia zadawalającego stopnia rozdzielania grupowego skomplikowanych mieszanin, moŝe być jedynie technika wysokosprawnej chromatografii cieczowej w warunkach układów faz normalnych (NP- HPLC). Technika NP- HPLC umoŝliwia rozdzielenie składników mieszanin pod kątem zróŝnicowania ich polarności (składniki grupy charakteryzują się zbliŝoną polarnością). Rozdzielanie grupowe w zakresie polarności składników mieszaniny moŝe być teŝ wykonywane z zastosowaniem techniki chromatografii z eluentem w stanie nadkrytycznym (SFC). W chromatografii gazowej do rozdzielania grupowego stosuje się bardzo polarne fazy stacjonarne. Mimo to ma miejsce istotny wpływ lotnych analitów na kolejność elucji, stąd typowe rozdzielanie grupowe moŝna wykonać tylko dla substancji o podobnych temperaturach wrzenia. 13

16 W przypadku rozdzielania składników rozpuszczalnych tylko w wodzie, z powodu nie rozpuszczania się ich w niepolarnym eluencie, celowe jest zastosowanie do rozdzielania w zaleŝności od hydrofobowości związków chemicznych, chromatografii w układzie faz odwróconych, bądź oddziaływań hydrofilowych. W odpowiednio dobranych warunkach moŝna w tedy rozdzielić składniki pod względem zmian ich hydrofobowości. Korzystnym rozwiązaniem moŝe być wykorzystanie chromatografii wykluczania, tak aby komponenty rozdzielić pod względem masy molekularnej Techniki i metody oparte na chromatografii planarnej Technika chromatografii planarnej (cienkowarstwowej) jest stosowana do rozdzielania grupowego od dawna. Znane są dwa rodzaje zastosowań chromatografii cienkowarstwowej do oznaczania składu grupowego niskolotnych produktów naftowych. Pierwszy wariant to wysokosprawna chromatografia cienkowarstwowa (HPTLC). Zwiększenie potencjału rozdzielczego, spowodowane postępem w instrumentalizacji i dostępem do nowych sorbentów o wysokiej jakości, umoŝliwiło szybkie i tanie oznaczenie ilościowe. MoŜliwość tę wykorzystał Cebolla i współpracownicy uŝywając płytek do HPTLC pokrytych Ŝelem krzemionkowym i siarczanem berberyny do oznaczenia parafin i naftenów oraz płytek z naniesioną na Ŝel krzemionkowy kofeiną do oznaczania wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych i związków polarnych [19]. Jako detektora uŝyto densytometru. Metoda ta, choć obiecująca, daje jedynie wyniki szacunkowe. Drugim wariantem jest wykorzystanie wielostopniowego rozdzielania na kwarcowych pręcikach pokrytych cienką warstwą sorbentu z detekcją za pomocą detektora płomieniowo jonizacyjnego (FID) [3, 20, 21]. Uzyskuje się często rozdzielenie praktycznie do linii bazowej. Wadą techniki TLC- FID jest stosunkowo niska precyzja oznaczania, szczególnie podczas oznaczania składników o niskich zawartościach grup. Przy zawartości określonej grupy (w materiałach naftowych) na poziomie około 2.5% wagowych w materiale powtarzalność sięga nawet 35% oznaczanej zawartości [22]. Technika chromatografii planarnej stosowana jest jako wstępna, umoŝliwiająca dobór warunków rozdzielania składników, bądź grup składników skomplikowanych, często nieznanych pod względem składu mieszanin. 14

17 Rozdzielanie substancji na cienkich warstwach fazy stacjonarnej wykonywano i wykonuje się, niekiedy wielokrotnie, rozwijając chromatogram w tej samej lub róŝnych fazach ruchomych. Wykorzystuje się teŝ rozdzielanie dwuwymiarowe (2D- TLC) [23, 24]. Chromatografia cienkowarstwowa moŝe być i jest równieŝ wykorzystywana do celów semipreparatywnych, w tym do przygotowania próbki do analizy [25]. Wykorzystanie chromatografii planarnej, z fazą sorpcyjną naniesioną na pręciki kwarcowe oraz rozwijaniem kilkustopniowym, eluentami o malejącej lub rosnącej sile elucji, z elucją do róŝnej wysokości pręcików, umoŝliwia rozdzielenie skomplikowanych mieszanin. W prosty sposób moŝna wtedy rozdzielić anality bez stosowania elucji gradientowej Techniki i metody oparte na kolumnowej chromatografii cieczowej Pierwsze wzmianki stosowania kolumnowej elucyjnej chromatografii cieczowej do rozdzielania grupowego i zbierania poszczególnych frakcji występują juŝ w okresie stosowania jedynie klasycznej chromatografii kolumnowej z kolumnami szklanymi [26]. Jako sorbent stosowano głównie Al 2 O 3 i SiO 2. Frakcje wymywano wielostopniowo rozpuszczalnikami o rosnącej sile elucji. Oznaczenia końcowego dokonano grawimetrycznie. Detektory, między innymi spektrofotometryczne (UV- VIS), bądź pomiar średniej wartości współczynnika załamania światła poszczególnych frakcji, wykorzystywane były w celu wyznaczania momentu zbierania poszczególnych frakcji. Klasyczna elucyjna chromatografia kolumnowa, w skali preparatywnej, mimo powszechnego ciągle stosowania, w laboratoriach naftowych do analityki składu grupowego cięŝkich frakcji i produktów ropy naftowej, ma istotne wady. NajwaŜniejsze, to długi czas analizy, znaczne koszty, duŝe zuŝycie ekotoksycznych eluentów. W przypadku stosowania kolumn o zbyt małej sprawności i selektywności rozdzielczość pomiędzy poszczególnymi grupami jest niezadowalająca i wyniki oznaczeń składu grupowego są tylko orientacyjne. Rozdzielczość kolumny w duŝej mierze zaleŝy od marki adsorbentu, a nawet od szarŝy produkcyjnej. W chromatografii oddziaływań hydrofilowych (HILIC) główną role odgrywają wiązania wodorowe i oddziaływania dipol- dipol, których energia zaleŝy 15

18 od kwasowości bądź zasadowości składników układu oraz rozdzielanych substancji. Energia oddziaływań typu dipol- dipol zaleŝy od ładunku lub momentu dipolowego działających na siebie cząsteczek lub jonów, ich polaryzowalności i stałej dielektrycznej. Oddziaływania indukcyjne, jeśli występują, mają takŝe znaczenie, jednak w mniejszym stopniu. UwaŜa się, Ŝe na powierzchni hydrofilowej fazy stacjonarnej tworzy się cienka warstwa zaadsorbowanej wody [27]. Pozwala to bardziej polarnym analitom na podział pomiędzy hydrofilową warstwą wodną na powierzchni fazy stacjonarnej i mniej hydrofilowy eluent, którym jest z reguły mieszanina woda: acetonitryl, z duŝą zawartością acetonitrylu. Kolejność eluowania substancji jest najczęściej odwrotna niŝ w układzie faz normalnych tzn. hydrofilowe związki wykazują większą retencję niŝ związki hydrofobowe. Wzrost zawartości dodatku organicznego w eluencie podwyŝsza retencję, odwrotnie jak w chromatografii w układach faz odwróconych [27] Techniki i metody rozdzielania grupowego z wykorzystaniem chromatografii z fazą ruchomą w stanie nadkrytycznym Chromatografia cieczowa z faza ruchomą w stanie nadkrytycznym (SFC) jest połączeniem właściwości technik chromatografii gazowej i cieczowej (LC), co umoŝliwia stosowanie jej w opcji połączenia zalet obu technik. W ten sposób SFC staje się ostatnio, na razie jednak dość powoli, cennym uzupełnieniem technik chromatograficznych. Technika SFC stosowana jest, dotychczas, głównie do rozdzielania tych substancji, których nie moŝna analizować lub analiza wykonywana jest z trudem przy stosowaniu GC, a takŝe tych substancji nisko i średnio polarnych, których rozdzielanie za pomocą HPLC jest trudne lub trwa bardzo długo [28]. JednakŜe, w najbliŝszym czasie naleŝy spodziewać się intensywnego rozwoju zastosowań tej techniki, zwłaszcza w skali preparatywnej. Co waŝne, w przypadku SFC moŝliwe i powszechne jest uŝycie detektora płomieniowojonizacyjnego, a kolumny nie róŝnią się od stosowanych w technice HPLC. Udało się m.in. rozdzielić na poszczególne grupy węglowodorów ropę naftową, korzystając z układu złoŝonego z dwóch kolumn, wypełnionej Ŝelem krzemionkowym modyfikowanym grupami cyjanopropylowymi oraz jonowymiennej, ze związanymi na 16

19 powierzchni sorbentu jonami srebra. Asfalteny i Ŝywice wymyto z pierwszej kolumny dzięki zastosowaniu przepływu zwrotnego [49]. Podczas badań nad moŝliwością wykorzystania SFC, z fazą ruchomą w postaci CO 2, do selektywnego usuwania niepoŝądanych składników olejów bazowych uzyskano rozdzielenie pomiędzy parafinami, węglowodorami aromatycznymi i związkami polarnymi. Na efekt rozdzielenia miała wpływ temperatura i ciśnienie eluentu oraz polarność adsorbentów [29]. Technika SFC nie jest techniką łatwą technicznie, ani prostą. W zakresie doboru optymalnych warunków rozdzielania, określenie optymalnych warunków analitycznych, wymaga wszechstronnej wiedzy i doświadczenia, ze względu na złoŝoność aparatury, konieczność uwzględniania wielu parametrów podczas wykonywania analiz, takich jak, temperatura, ciśnienie, rodzaj i zawartość modyfikatora w eluencie, typ wypełnienia kolumny, warunki pracy detektora i inne. Pomimo tego, jest to technika bardzo obiecująca Techniki i metody spektroskopii i spektrofotometrii wykorzystane do oznaczania składu grupowego Do oznaczania składu grupowego, lub tylko do oznaczania wybranych grup składników, wykorzystuje się teŝ techniki spektroskopowe bez dokonywania rozdzielenia albo po wykonaniu rozdzielenia grupowego z zastosowaniem chromatografii [30]. Za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera moŝna na przykład oznaczyć zawartość asfaltenów w próbkach ropy naftowej [31]. Metoda dała wyniki porównywalne z wynikami otrzymywanymi metodami standardowymi, okazała się od nich szybsza i wyeliminowała uŝycie rozpuszczalników. Techniki NMR i IR nadają się do wyznaczania zawartości poszczególnych rodzajów węgla i powiązań między atomami węgla i wodoru (tzn. do oznaczania tzw. składu grupowo strukturalnego). Nie mogą, natomiast, słuŝyć do rozróŝnienia cząsteczek węglowodorów, np. alkilobenzenów czy alkilonaftalenów. Znając cięŝar cząsteczkowy próbki, zastosowanie techniki spektroskopii w zakresie nadfioletu (UV), moŝna dodatkowo oszacować zawartość poszczególnych węglowodorów aromatycznych. Próbki poddawane analizie muszą być całkowicie rozpuszczalne w określonym rozpuszczalniku, w tym przypadku- w cykloheksanie [32]. 17

20 2.1.5 Techniki i metody łączone Rozdzielanie i oznaczanie składu złoŝonych mieszanin chemicznych, szczególnie o szerokim zakresie lotności, wymaga w praktyce, zastosowania łączonych technik rozdzielania oraz technik i metod detekcji. W literaturze istnieje juŝ bardzo wiele publikacji, gdzie do rozdzielania w etapie przygotowania próbki lub/i oznaczenia składników lub grup składników analitu, zastosowano róŝne kombinacje połączenia takich technik rozdzielania jak, ekstrakcję do fazy stałej (SPE), technikę wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) (w układach faz normalnych, odwróconych i warunkach jonowymiennych- NP, RP, IC), technikę kapilarnej chromatografii gazowej (CGC), technikę elektroforezy kapilarnej (CE), technikę ekstrakcji do fazy w stanie nadkrytycznym (SFE), technika chromatografii cieczowej z zastosowaniem eluentu w stanie nadkrytycznym (SFC), technikę chromatografii wykluczania (SEC/GPC), a nawet technikę frakcjonowania przepływowego w polu (FFF). Jest teŝ wiele prac, gdzie ma miejsce połączenie, w celu rozdzielania, róŝnych warunków z wykorzystaniem tej samej techniki, np. GC- GC (z szeregowo połączonymi kolumnami, polarną i niepolarną), LC/IC- LC/RP, LC/HIC- LC/RP itp. Dodatkowo, albo z wykorzystaniem do rozdzielania tylko jednej określonej techniki, łączy się kilka róŝnych technik detekcji, zwłaszcza technikę uniwersalną, często o niezbyt wysokiej czułości z technikami wysoce selektywnymi, a jednocześnie z reguły, wysoce czułymi. Kapilarną chromatografię gazową uwaŝa się jako jedną z najsprawniejszych technik analitycznych- o najwyŝszym potencjale rozdzielczym. Jest ona szeroko stosowana zarówno w badaniach naukowych jak i w analityce rutynowej. Od lat 60 tych ubiegłego wieku, po wynalezieniu detektora płomieniowojonizacyjnego (FID) i kolumn kapilarnych, stała się szeroko akceptowanym narzędziem analitycznym. Nie moŝna jej, jednak, wykorzystać w przypadku substancji wysokowrzących lub niestabilnych termicznie. NaleŜy pamiętać, Ŝe w przypadku obecności wysokowrzących analitów, konieczne jest wcześniejsze przygotowanie próbki do analizy, poprzez usunięcie frakcji wysokowrzącej albo zastosowanie techniki ekstrakcji do fazy nadpowierzchniowej. Stosowanie jednej techniki rozdzielczej, w przypadku analizy skomplikowanych mieszanin substancji, jest często niewystarczające. Poprawę zdolności rozdzielczej umoŝliwia sprzęgnięcie ze sobą róŝnych rodzajów kolumn chromatograficznych, bądź róŝnych układów rozdzielczych, a takŝe róŝnych 18

21 technik chromatograficznych. Dzięki temu moŝna wykorzystać róŝne mechanizmy rozdzielania [33]. Chromatografia cieczowa w sprzęŝeniu z techniką chromatografii gazowej stosowana bywa na etapie przygotowania próbki przed analizą końcową wykonywaną z zastosowaniem GC. SprzęŜenie obu technik łączy ich zalety. W przypadku chromatografii cieczowej jest to moŝliwość duŝych objętości dozowania, jak równieŝ róŝnorodność mechanizmów rozdzielania. Dzięki temu moŝemy uzyskać selektywne frakcjonowanie, oczyszczanie czy wstępne wzbogacanie próbek. Połączenie chromatografii cieczowej i gazowej moŝe być realizowane na dwa sposoby: on- line (polegające na zautomatyzowaniu wszystkich etapów analizy) i off- line (wykonanie poszczególnych etapów analizy manualnie). Zestawienie zalet i wad tych dwóch sposobów przedstawiono w tabeli 1. Tabela 1 Zestawienie zalet i wad sposobów realizacji sprzęŝenia HPLP GC [36]. Sposób realizacji sprzęŝenia HPLC - GC Metoda pośredniamanualna (off- line) Bezpośrednie połączenie (on- line) Zalety - MoŜliwość przygotowania kilku próbek - Optymalizacja poszczególnych etapów procedury - Elastyczność etapów metody - Proste wyposaŝenie - MoŜliwość automatyzacji procesu - Analiza całej próbki - Skrócenie czasu analizy - Zmniejszenie ryzyka strat analitów i zanieczyszczenia próbki - Poprawa precyzji analizy Wady - Brak automatyzacji - Metoda czasochłonna i pracochłonna - Operowanie duŝą objętością próbki - Ryzyko zanieczyszczenia i strat analitów - Specjalne wyposaŝenie - Mała elastyczność procedury - Utrudniona optymalizacja poszczególnych etapów Najbardziej powszechnym i najprostszym rozwiązaniem, szczególnie w przypadku małej ilości próbek, jest wariant off-line. Metody manualne pozwalają na optymalizację poszczególnych czynności i nie wymagają kosztownych i/lub specjalistycznych rozwiązań technicznych. Prosty sposób realizacji wymaga jednak, wielu czasochłonnych czynności laboratoryjnych, mogących być źródłem zanieczyszczeń i/lub strat analitów. Z kolei połączenie on-line zapewnia uproszczenie wykonywanych czynności przez automatyzację poszczególnych etapów, co zwiększa powtarzalność, a analizy wykonywane są w krótszym czasie. Istotną wadą tego rozwiązania jest złoŝona i droga aparatura, trudności związane z urządzeniem łączącym oba chromatografy, tzw. 19

22 interfejsem oraz wyborem techniki umoŝliwiającej wprowadzenie próbki o objętości od kilkudziesięciu do kilkuset µl, jak równieŝ, nieraz, skomplikowana obsługa [34]. Szczegółowy opis poszczególnych technik moŝna znaleźć w literaturze [35-42]. 20

23 2.2 Przepływ zwrotny eluentu w kolumnie. Technika przepływu zwrotnego eluentu, elution - back flush w kolumnie chromatograficznej (EBF), polega na wykonaniu elucji wstecznej wszystkich składników pozostających w kolumnie, po zakończeniu rozdzielania. Znalazła ona wiele waŝnych zastosowań w chromatografii gazowej- zwłaszcza wielowymiarowej [43-45]. W chromatografii cieczowej jest rzadko wykorzystywana, głównie z obawy przed zmianą struktury wypełnienia kolumny. Wysoka retencja analitów jest niekorzystna, nie tylko ze względu na zbyt długi czas analizy, lecz takŝe na zuŝycie zbyt duŝych ilości rozpuszczalników, często bardzo kosztownych. WiąŜe się to równieŝ z obniŝonym poziomem granicy detekcji dla substancji silnie sorbowanych, w wyniku duŝego rozmycia pików o wysokich wartościach k. Rozwiązaniem zapewniającym moŝliwość optymalizacji warunków rozdzielania jest powszechne stosowanie programu elucji gradientowej albo skokowej[46-51], w przypadku GC temperatury, w przypadku LC składu elentu, a w przypadku SFC temperatury i ciśnienia rozdzielania. W przypadku stosowania elucji gradientowej w chromatografii cieczowej po zakończeniu analizy siła elucji fazy ruchomej jest znacznie wyŝsza niŝ w momencie dozowania próbki. Jednocześnie, aktywność sorpcyjna powierzchni wypełnienia jest obniŝona zaraz po powrocie do początkowego eluentu. Powoduje to konieczność rekondycjonowania wypełnienia kolumny eluentem o wyjściowym składzie, przed kolejną analizą chromatograficzną [52, 53]. WydłuŜa to czas analizy i zwiększa zuŝycie rozpuszczalników. Alternatywnym sposobem, rozwiązującym problem elucji z kolumny chromatograficznej związków chemicznych (składników dozowanej mieszaniny) silnie oddziałujących z fazą stacjonarną, jest technika przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie. Technika przepływu zwrotnego, tzw. elucja wsteczna, jest techniką zmiany kierunku przepływu eluentu w kolumnie, za pomocą zaworu wielodroŝnego, który dodatkowo przyłączony jest do chromatografu, między dozownikiem, a kolumną i detektorem (Rys. 1). Zmiana kierunku przepływu fazy ruchomej w kolumnie powinna prowadzić do wyeluowania wszystkich substancji, które silnie oddziałują z fazą stacjonarną. Warunkiem koniecznym wyeluowania w przepływie zwrotnym wszystkich substancji chemicznych wprowadzonych z próbką do kolumny jest ich rozpuszczalność 21

24 w eluencie. Warunkiem koniecznym i dostatecznym jest brak reakcji chemicznej między oznaczanymi składnikami, a grupami funkcyjnymi fazy stacjonarnej. Rysunek 1 Schemat połączeń zaworu sześciodroŝnego wbudowanego w układ prostego chromatografu cieczowego, składający się z pompy, kolumny, termostatu, detektora UV- DAD i RID, zapewniające realizację przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie HPLC. Do zalet stosowania przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie powinno zaliczyć sie miedzy innymi: - Zapewnienie elucji wszystkich substancji wprowadzonych do kolumny, niezaleŝnie od energii oddziaływań z fazą stacjonarną, pod warunkiem, Ŝe są rozpuszczalne w eluencie, nie następuje ich wytrącanie w momencie dozowania ani nie ma miejsca chemisorpcja. Systematyczne stosowanie przepływu zwrotnego powinno zapewnić stabilność aktywności sorpcyjnej wypełnienia kolumny, bez stosowania kolumn ochronnych. Szczególnie korzystne powinno być naprzemienne dozowanie rozdzielanej mieszaniny raz po jednej, raz po drugiej stronie kolumny, co dotychczas nie jest przewidywane w literaturze. - Zapewnienie moŝliwości oceny charakteru profilu przepływu eluentu w kolumnie i wyznaczenia sprawności kolumny w sposób nieobciąŝony wpływem profilu przepływu eluentu [54]. - Zapewnienie moŝliwości wprowadzenia wszystkich składników pozostałych w kolumnie i do kolumny i+1, gdy stosowana jest wielowymiarowa chromatografia 22

25 kolumnowa w skali analitycznej lub preparatywnej, co daje moŝliwość ich dalszego rozdzielania w warunkach innego układu chromatograficznego. - Zapewnienie moŝliwości elucji grupy składników pozostałych w kolumnie po rozdzielaniu innych grup lub substancji chemicznych, wykorzystujących mniejsze powinowactwo sorpcyjne do powierzchni wypełnienia kolumny i dokonanie oznaczenia tej grupy [55, 56], albo wyodrębnienia określonej grupy składników w warunkach chromatografii preparatywnej. Dzięki powyŝszemu i dodatkowo moŝliwości zastosowania zwiększonego natęŝenia przepływu eluentu, jest moŝliwe skrócenie czasu rozdzielania. Przy spełnieniu określonych warunków stosowania przepływu zwrotnego powinno to teŝ umoŝliwić zmniejszenie zuŝycia składników eluentów [57, 58]. Systematyczne stosowanie przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie, w warunkach elucji izokratycznej powinno być skutecznym sposobem utrzymywania stałej aktywności powierzchni sorpcyjnej kolumny chromatograficznej. W tym celu w warunkach elucji gradientowej korzystne powinno być wykonywanie przepływu zwrotnego z zastosowaniem eluentu o wysokiej sile elucji- w celu zmniejszenia czasu elucji oraz szerokości strefy substancji lub grupy substancji pozostałych w kolumnie i eluowanych w przepływie zwrotnym eluentu [59, 60]. Konieczne jest nadanie określonego, jednoznacznego sensu powyŝszym stwierdzeniom. Dotychczas w literaturze nie ma doniesień na temat skuteczności stosowania EBF, nie określono granicznej energii oddziaływań, która powodowałaby pozostawanie związków chemicznych w kolumnie chromatograficznej, pomimo stosowania EBF. Jednak temat ten jest poza zakresem niniejszej rozprawy doktorskiej. 23

26 2.3 Chromatografia wielowymiarowa W przypadku, gdy rozdzielaniu chromatograficznemu poddawane są skomplikowane mieszaniny związków chemicznych lub grup substancji, o róŝnych właściwościach chemicznych i fizycznych (np. produkty naftowe, ścieki szczególnie wielofazowe, niektóre ekstrakty roślinne, specyfiki farmaceutyczne itp.), konieczne jest zastosowanie wielowymiarowego rozdzielania, tzn. układu kilku kolumn i zaworów przełączających drogi przepływu eluentu. Stosuję się kilka połączonych ze sobą kolumn (róŝnego typu), bądź poszczególne frakcje poddaje kolejno rozdzielaniu chromatograficznemu. W zaleŝności od rodzaju składników badanej mieszaniny, moŝna wykorzystać chromatografię wykluczania, adsorpcyjną, powinowactwa, oddziaływań hydrofilowych czy hydrofobowych lub jonowymienną, bądź par jonowych. W wyniku zastosowania chromatografii wielowymiarowej ulega poprawie zdolność rozdzielcza i tzw. pojemność względem pików (ang. peak capacity) układu rozdzielczego. W optymalnych warunkach pojemność pikowa (pojemność względem pików) wielowymiarowego rozdzielania moŝe być, teoretycznie, równa iloczynowi pojemności pikowej poszczególnych kolumn, stosowanych do rozdzielania. Do chromatografii wielowymiarowej naleŝą równieŝ techniki łączone, opisane w rozdziale 2.1.5, w związku z tym posiada ona wszystkie zalety, ale teŝ i określone wady technik łączonych. Wyzwaniem wielowymiarowej chromatografii cieczowej jest całkowita automatyzacja rozdzielania i analizy. UmoŜliwi to wykluczenie skomplikowanych i czasochłonnych czynności jak frakcjonowanie eluatu i odparowanie rozpuszczalnika stosowanego w pierwszej kolumnie, rozpuszczenie próbki w eluencie z drugiego szeregu układu kolumn, wprowadzenie odpowiednich frakcji do właściwej kolumny, itd. Obecnie ze względu na coraz częstsze badania składu skomplikowanych mieszanin stosuje się podwójnie sprzęŝoną chromatografie cieczową. W tabeli 2 zestawiono przykłady opublikowanych rozdzielań z wykorzystaniem wielowymiarowej chromatografii cieczowej: LCxLC. 24

27 Tabela 2 Przykłady rozdzielań z wykorzystaniem chromatografii wielowymiarowej w HPLC. Substancje rozdzielane Matryca analitycz na Przygotowanie próbki Kolumna 1 LC1 Kolumna 2 LC2 Detekcja Pozycja literatury deksametazon tkanka ekstrakcja ciecz- Ph CN UV 61 bydlęca ciecz ibuprofen surowica ekstrakcja ciecz- pary jonowe C18, C18 UV 62 ludzka ciecz RP18 alkohol etoksylowy - - NH2 C18 63 peptydy białka po trawieniu SEC C 18 MS 64 enzymatycznym Ro osocze - IC C18 UV-DAD 65 pas estrogen cytozol - TSK-3000 SynChropak UV 66 SW AX-1000 aflatoksyna mocz rozcieńczenie i SB, SA C1, C2, C3, FLD 67 M1 ludzki odwirowanie C4 metabolity ekstrakty ekstrakcja/ługow NP-TLC RP-TLC - 68 roślinne roślinne anie neopterin surowica odwirowanie C18 IP C18 FLD 69 ludzka metyrapol surowica ludzka, mocz ekstrakcja cieczciecz Ŝel krzemionkowy Chiralcel OJ UV 70 W przypadku chromatografii gazowej stosowanie układu kolumn połączonych w trybie on- line jest z jednej strony łatwiejsze, niŝ w chromatografii cieczowej, ze względu na wykorzystanie w kolejnym etapie wielowymiarowego rozdzielania i analizy zawsze tego samego gazu nośnego (eluentu), oraz braku konieczności zerowania detektora przy zmianie natęŝenia przepływu gazu nośnego. Z drugiej jednak strony, pojawiają się komplikacje związane z szybkim dyfuzyjnym rozmyciem stref substancji chemicznych zatrzymanych w pierwszej kolumnie w okresie trwania rozdzielania w kolejnej. W chromatografii cieczowej często ma miejsce zmiana składu eluentu lub programu elucji w drugim stopniu rozdzielania. Stosowane kolejno fazy ruchome powinny mieć podobne właściwości fizykochemiczne, w zakresie wpływu na linie bazową detektora i czułość detekcji, a takŝe podobną lepkość oraz muszą być wzajemnie mieszalne. Układy chromatograficzne powinny być najczęściej tak dobrane, aby anality silniej oddziaływały z powierzchnią wypełnienia w drugiej kolumnie. Wykonanie rozdzielań wielowymiarowych wymaga odpowiedniej konstrukcji układu aparatu i systemu przełączania kolumn. Do dozowania i przełączania kolumn w chromatografii cieczowej wykorzystuje się róŝnej konstrukcji zawory wielodroŝne. 25

28 Na rysunku 2 i 3 zamieszczono przykłady opisanych w literaturze, złoŝonych układów kolumn stosowanych do rozdzielania wielowymiarowego [17]. Rysunek 2 Schemat wielowymiarowego układu kolumn z wykorzystaniem dwóch zaworów siedmiodroŝnych. Rysunek 3 Schemat wielowymiarowego układu kolumn do rozdzielania z sześciodroŝnymi zaworami róŝnej konstrukcji. 26

29 Oba układy umoŝliwiają takŝe stosowanie przepływu zwrotnego eluentu, w niektórych kolumnach. W literaturze przedstawiono wiele propozycji układów kolumn i zaworów przełączania przepływu eluentu w chromatografii wielowymiarowej. Nie opracowano jednak dotychczas propozycji układu uniwersalnego. Chromatografia wielowymiarowa jest teŝ stosowana w układach z wbudowanymi kolumienkami do ekstrakcji do fazy stałej (SPE), w których następuje wzbogacanie i wstępne frakcjonowanie grup analitów, lub tylko wstępne wzbogacanie. Przykład układu ze sprzęŝeniem techniki HPLC z SPE jest przedstawiony na rysunku 4. Rysunek 4 Schemat przedstawiający wykorzystanie zaworu sześciodroŝnego w przypadku sprzęŝenia techniki SPE z HPLC. Układy on- line charakteryzują się wieloma zaletami, opisanymi w rozdziale Pierwszym etapem, w tego typu procedurach analitycznych, jest wzbogacanie 27

30 i izolacja analitów na przedkolumnie. W momencie przełączenia zaworu, wprowadza się do układu chromatograficznego, eluent o zwiększonej sile elucji (z zastosowaniem drugiej pompy), co powoduje desorpcję analitów z przedkolumny i wprowadzenie ich do, właściwej, kolumny chromatograficznej [71-74]. Obecnie dąŝy się do zautomatyzowania i zminiaturyzowania, nie tylko procesu chromatograficznego, lecz równieŝ etapu przygotowywania próbek do analizy. Na podstawie przeglądu literatury, oraz analizy róŝnych procedur wielowymiarowego rozdzielania techniką chromatografii cieczowej, moŝna stwierdzić, iŝ uniwersalny układ wielokolumnowego aparatu HPLC powinien charakteryzować się następującymi cechami: - moŝliwością wykorzystywania kilku kolumn róŝnego typu, - strefa dozowania oraz frakcje mogą być wprowadzane do dowolnej kolumny oraz mogą omijać dowolną kolumnę, - moŝliwością rejestracji profilu dozowania, - moŝliwością realizacji przepływu zwrotny eluentu w dowolnej kolumnie, lub układzie kolumn, - było by teŝ bardzo korzystne, gdyby niektóre frakcje przed skierowaniem ich do rozdzielania w kolejnej kolumnie zostały automatycznie odparowane i rozcieńczone nowym eluentem Zasady konstruowania chromatogramu w przypadku chromatografii dwuwymiarowej W analizie z wykorzystaniem techniki LC x LC frakcje eluentu opuszczające kolumnę pierwszą, są periodycznie próbkowane i wprowadzone do kolejnej kolumny w formie wąskich pasm (Rys. 5). 28

31 Rysunek 5 Schemat próbkowania i podział na pasma opuszczające pierwszą kolumnę rozdzielczą, podlegające dalszemu rozdzielaniu. Na rysunku 6 pokazano kolejno chromatogramy optymalne dla frakcji kolumny 1. Rysunek 6 Zestawienie chromatogramów otrzymanych na wylocie drugiej kolumny dla rozdzielania odpowiednich frakcji. Analiza realizowana jest poprawnie, gdy pik o takiej samej retencji obserwowany jest na kilku chromatogramach. Analiza danych otrzymywanych w formie chromatogramów jest bardzo trudna. Dlatego wyniki przedstawia się w formie chromatogramów konturowych w odwzorowaniu poziomym, przedstawionym na rysunku 7. Intensywność barw odpowiada stęŝeniu w odpowiednich częściach pików, podobnie jak barwy na mapie geograficznej wyznaczające profile wzniesień w terenie. Rysunek 7 Wizualizacja w odwzorowaniu poziomym po zastosowaniu dwu wymiarowego rozdzielania w dwóch róŝnych układach chromatograficznych. 29

32 2.4 Techniki i metody detekcji wykorzystywane w chromatografii cieczowej Podstawowe cechy, które powinien posiadać kaŝdy detektor, to wysoka uniwersalność, a w przypadku analityki śladowej, wysoka czułość. Czułość detektora charakteryzuje się stosunkiem wartości sygnału (S) do poziomu szumów (Sz). Z czułością wiąŝe się poziom wykrywalność detektora (granica detekcji, LOD) tj. najmniejsza ilość substancji wywołująca sygnał, którego amplituda jest ok. trzy razy większa od poziomów szumów detektora. Granica oznaczalności (LOQ) jest ok. 2-3 razy większa od granicy wykrywalności. Inne wymagania, to stabilność wskazań, a takŝe sygnał powinien być dobrze odtwarzalny dla takich samych stęŝeń lub ilości substancji przepływających przez celkę pomiarową. Zakres liniowości powinien być jak największy, tzn. sygnał detektora powinien być liniowo proporcjonalny w stosunku do szybkości doprowadzania masy do naczyńka pomiarowego (dm/dτ)- detektor masowy [75] albo stęŝenia analitu (c i τ)- detektor stęŝeniowy. Oznaczanie powinno prowadzić się w zakresie liniowości wskazań detektora. Inne cechy detektora to selektywność rozumiana jako Si/Sj [76, 77]. W chromatografii cieczowej detektorem najbardziej zbliŝonym do uniwersalnego jest spektrometr mas (MS), a takŝe laserowy światła rozproszonego (LLSD), oraz w warunkach elucji izokratycznej detektor refraktometryczny (RID). JednakŜe, całkowicie uniwersalny nie jest Ŝaden z nich. Dotychczas nie opracowano Całkowicie uniwersalnego detektora. W zaleŝności od rodzaju oznaczanych związków chemicznych, tzn. składu badanej mieszaniny, czy stosowania programowania składu eluentu (program elucji gradientowej) uŝywa się lub uŝywało się, następujących detektorów HPLC: spektrofotometryczny w zakresie nadfioletu i/lub światła widzialnego (UV, UV-VIS), w tym z wykorzystaniem matrycy fotoczujników nazywany typu DAD [78], refraktometryczny- róŝnicowy typu odchyleniowego lub refraktometryczny z pryzmatem Fressnel a (RID) [79], fluorescencyjny (FLD) [80], spektrometr mas (MS) [81], laserowy światła rozproszonego (LLSD) [82], 30

33 elektrochemiczny typu amperometrycznego lub voltamperometrycznego (EC) [83], płomieniowo- jonizacyjny do chromatografii cieczowej z transportem eluatu (LC-FID)- praktycznie zapomniany, choć byłby bardzo praktyczny w wielu zastosowaniach [84], pomiaru stałej dielektrycznej (DCD)- praktycznie zapomniany [85], detektor spektrofotometryczny w zakresie średniej podczerwieni (IRD) bardzo rzadko stosowany [86], pomiaru lepkości- stosowany tylko w badaniach polimerów[87], wielokanałowego pomiaru intensywności rozproszenia światła- stosowany równieŝ w badaniach polimerów [88], koronowego elektryzowania molekuł i cząstek substancji rozdzielanych [89], radiometryczny. W tabeli 3 zestawiono najwaŝniejsze cechy powyŝszych detektorów. Szczególnie przydatne, ze wzglądu na znaczący stopień uniwersalności, do oznaczania grup substancji są detektory: spektrometr mas, laserowy światła rozproszonego, koronowy elektryzowania mgły i płomieniowo- jonizacyjny (chociaŝ obecnie niestosowany, celowy wydaje się powrót do jego stosowania w nowoczesnej konstrukcji). Przy czym sprzęŝenie LC- MS jest ciągle jeszcze, i zapewne długo jeszcze będzie, bardzo korzystnym sposobem detekcji. 31

34 Tabela 3 Typy detektorów wykorzystywane w chromatografii cieczowej z uwzględnieniem charakterystyk przydatności do rozdzielania grupowego. Typ detektora Zakres przydatności Granica oznaczalności Zakres liniowości Uwagi Typ (M-masowy, C-stęŜeniowy) Pozycja literatury -fotoabsorpcjometryczny -spektrofotometryczny UV- VIS oraz UV- VIS typu DAD -z filtrami dla jednej lub kilku długości fali pomiarowi podlega absorpcja światła w zakresie zwykle od 200 nm, niekiedy od 180nm zwykle do 400 nm, a nawet do 1000 nm około 0,2 ng/ml około jednostki absorbancji dość mało wraŝliwy na zmiany natęŝenia przepływu fazy ruchomej i na zmiany temperatury eluentu - jest czuły w sposób selektywny na grupy chromoforowe i zupełnie nieczuły na substancje zawierające jedynie wiązania alifatyczne, czyli na parafiny, izoparafiny, nafteny, a takŝe alkohole, aminy czy cukry C 76, 92 - molowa absorbancja substancji jest zaleŝna od struktury cząsteczki, co powoduje, Ŝe sygnał nie jest jednoznacznie skorelowany z zawartością grupy substancji refraktometryczny (RID) -róŝnicowy odchyleniowy (powszechnie stosowany) -róŝnicowy z pryzmatem Fressnel a (obecnie nie stosowany) najbardziej uniwersalny i najbardziej rozpowszechniony, przydatnym potencjalnie do oznaczania składu grupowego składników ropy naftowej w całym zakresie lotności oraz róŝnych materiałów, w tym dodatków do olejów, polimerów, biopolimerów itp., a takŝe jonów około 0,7 g/ml około jednostki refrakcji (JR) najnowsze konstrukcje JR charakteryzuje się względnie niską czułością - silna zaleŝność przebiegu linii bazowej wraz ze zmianą składu fazy ruchomej - w przypadku elucji gradientowej, czy skokowej jego zastosowanie jest niemoŝliwej C 93, 94 32

35 fluorescencyjny (FLD) selektywny, bardzo wysoka czułość, tylko dla substancji fluoryzujących naturalnie, bądź odpowiednich pochodnych spektrometr mas (MS) selektywny wobec substancji ulegających jonizacji i defragmentacji laserowy światła rozproszonego (LLSD) stosuje się coraz częściej w HPLC ze względu na uniwersalność, wykorzystywany w przypadku substancji niskolotnych około 0,8 pg/ml do 0,1 pg/ml bardzo wraŝliwy na aromatyczne i arylowe zanieczyszczenia rozpuszczalników stosowanych jako faza ruchoma - jest czuły w sposób selektywny tylko wobec substancji wykazujących albo dla których wywołano fluorescencję na drodze derywatyzcji, co pozwala na oznaczanie bez derywatyzacji niewielkiej liczby substancji - fluorescencja substancji jest zaleŝna od struktury cząsteczki, co powoduje, Ŝe sygnał nie jest jednoznacznie skorelowany z zawartością grupy substancji około 0,1 pg/ml detektor uniwersalny i bardzo czuły, jednak nadal bardzo kosztowny i ciągle w fazie rozwoju - zastosowanie do oznaczania składu grupowego, niektórych rodzajów niskolotnych substancji, a szczególnie produktów naftowych, uniemoŝliwia okoliczność, Ŝe klasyczne detektory LC- MS posiadają zbyt mała energię jonizacji, co nie pozwala na jonizację, a tym bardziej na defragmentację tak trwałych związków chemicznych, jak alkany i nafteny, a takŝe niektóre jednopierścieniowe węglowodory aromatyczne czyli tzw. monoaromaty pg/ml nieliniowy - wadą jest nieliniowość odpowiedzi, ale obecnie w dobie szybkich procesorów, drugorzędną - w zastosowaniu do oznaczania składu grupowego niskolotnych produktów naftowych stwierdzono, jednak, złą odtwarzalność wyników, z powodu zróŝnicowania właściwości powierzchniowo czynnych związków w zaleŝności od róŝnic śladowych zawartości składników grupy, czego powodem jest najprawdopodobniej powierzchniowo czynne działanie niektórych składników grupy substancji, powodujące C 80 M 95, 96 M 97, 98 33

36 elektrochemiczny (EC) selektywny stosowany tylko w przypadku substancji łatwo redukowalnych bądź utlenialnych płomieniowo- jonizacyjny do chromatografii cieczowej z transportem eluatu i odparowaniem eluentu (FID- LC) pomiaru stałej dielektrycznej (DCD) potencjalnie detektor najbardziej odpowiedni do oznaczania składu grupowego, ale tylko produktów niskolotnych, dla średniolotnych konieczność kalibracji oznaczanie substancji róŝniących się stałą dielektryczną od stałej dielektrycznej eluentu około 1 pg/ml 10 2 dla najniŝszych stęŝeń (w szerokim zakresie stęŝeń nieliniowy, prawo Nersta) zróŝnicowanie wielkości kropel mgły opuszczającej nebulizer, które w konsekwencji w róŝny sposób rozpraszają światło - jest czuły w sposób selektywny- detektor wysoce selektywny, szczególnie w wersji voltamperometrycznej - przepływ elektronów zaleŝny jest od typu substancji, struktury cząsteczki, co powoduje, Ŝe sygnał nie jest jednoznacznie skorelowany z zawartością grupy substancji - trudny w stosowaniu- moŝliwość zatrucia elektrod, około 1ng/ml charakteryzuje się szerokim zakresem liniowości odpowiedzi brak danych brak danych - jest czuły w stosunku do wszystkich grup węglowodorów - moŝe być stosowany w warunkach elucji gradientowej albo elucji skokowej - brak na razie na rynku, tego typu detektorów, gdyŝ Ŝadna z oferowanych dawniej konstrukcji nie była udana - moŝe być stosowany do oznaczania składu grupowego z pewnymi zastrzeŝeniami - wymaga stosowania elucji izokratycznej oraz eluentów o stałej dielektrycznej niŝszej co najmniej dwa razy od oznaczanych grup substancji, co ogranicza moŝliwość jego zastosowania do oznaczania składu grupowego niektórych tylko materiałów C-dla bardzo małych stęŝeń, M- w szerokim zakresie stęŝeń 83 M 77,99 C

37 detektor spektrofotometryczny w zakresie średniej podczerwieni (IR) oznaczanie substancji, które posiadają charakterystyczne widma w średniej podczerwieni brak danych brak danych - powaŝną wadą jest konieczność stosowania, poza kilkoma wyjątkami, czterochlorku węgla, fluoroalkanów, albo disiarczu węgla jako eluentu - stosowanie detektora ogranicza się do kilku przypadków procedur analitycznych opisanych w literaturze C 101, 102 koronowego elektryzowania molekuł/ cząstek substancji rozdzielanych stosuje się coraz częściej w HPLC ze względu na uniwersalność około 1 pg/ml brak danych - czułość podobna dla róŝnych substancji naleŝących do róŝnych grup - odpowiedź detektora prawie nie zaleŝy od budowy chemicznej analitów, a sygnał jest wprost proporcjonalny do ilości oznaczonej substancji w próbce M 103, 104 moŝliwe zastosowanie metody normalizacji prostej (bez współczynników korekcyjnych) do oznaczania substancji - badania wykazały małą powtarzalność wskazań w warunkach układów faz normalnych radiometryczny Selektywność- ogromna, przydatny tylko dla substancji znaczonych Najczulszy, od ok. 2000rozkł./min konieczny scyntylator M 75 35

38 Ograniczenie stosowalności poszczególnych detektorów do oznaczania składu grupowego wiąŝe się z takimi problemami jak: selektywność sygnału w stosunku do rozdzielanych grup substancji, w przypadku rozdzielania grupowego najlepiej by było gdyby detektor był całkowicie nieselektywny, tak aby sygnał był wyłącznie proporcjonalny do stęŝenia (detektory stęŝeniowe) bądź szybkości dozowania masy(detektory masowe) substancji do naczyńka pomiarowego, zakres liniowości, korzystna jest wysoka wartość tego parametru, rodzaj substancji podlegających detekcji i oznaczaniu (lotne, średniolotne, niskolotne), rodzaj stosowanych eluentów i ich czystość, stosowanie programu elucji (moŝliwość rozdzielania w warunkach tylko izokratycznych lub takŝe gradientowych) [50, 51] Detektor refraktometryczny Detektory refraktometryczne stosowane w chromatografii cieczowej mogą być zbudowane w oparciu o dwie róŝne zasady pomiaru. Pierwsza, to technika pomiaru kąta odchylenia wiązki światła (detektory odchyleniowe). Wykorzystuje się wielokrotne załamanie wiązki promieniowania, najczęściej monochromatycznego, przechodzącego przez eluat przepływający przez komorę pomiarową naczyńka. Pomiar ma miejsce względem czystego eluentu płynącego lub znajdującego się w formie unieruchomionej w części odniesienia naczyńka pomiarowego. W innych detektorach, typu Fressnel a wykorzystuje się zasadę odbicia i podwójnego załamania światła. Obecnie są jedynie wykorzystywane detektory w wersji róŝnicowej, dwuwiązkowej. Pomiarowi podlega róŝnica współczynników załamania światła eluatu i eluentu. Detektor RID jest bardzo wraŝliwy na wahania składu fazy ruchomej i temperaturę, która powinna być stała w granicach 0,0005-0,001 C. Większość eluentów i substancji rozdzielanych charakteryzuje się wartością współczynnika temperaturowego refrakcji na poziomie ok jednostek refrakcji na 1ºC. By osiągnąć czułość 10-7 jednostek refrakcji (JR) wymagane jest by temperatura była stała na poziomie 0,001ºC [77]. Przy czym handlowe detektory pracują zazwyczaj w temperaturze 35ºC albo 70ºC. 36

39 Na rysunku 8 przedstawiono schemat działania detektora refraktometrycznego typu odchyleniowego. Rysunek 8 Schemat działania detektora refraktometrycznego typu odchyleniowego oraz przebieg wiązki światła przez kiuwetę pomiarową z odchyleniem promienia, gdy w części pomiarowej znajduje się eluat o innym współczynniku załamania światła[105]. Światło emitowane przez źródło jest ograniczone do równie odległej wiązki przez grupę przesłon (kolimator) i następnie przechodzi przez kiuwetę przepływową. Kiuweta ma dwie komory: odniesienia (R) i pomiarową (M), które są przedzielone ukośnie usytuowanym kawałkiem płytki ze szkła albo kwarcu. W komorze odniesienia znajduje się eluent, a przez komorę pomiarową przepływa eluat tzn. eluent zawierający oznaczane substancje. W miarę zmiany składu fazy ruchomej światło ulega zróŝnicowanemu odchyleniu. Soczewki ogniskują światło na fotoelementach. Sygnał, tzn. róŝnica energii świetlnej podającej na te fotoelementy jest sumowany, wzmacniany i przesyłany do rejestratora, integratora, albo do przetwornika analogowo-cyfrowego komputerowego systemu rejestracji i przetwarzania danych. 37

40 2.5 Metody analizy ilościowej w HPLC Oznaczanie składu mieszaniny substancji, z reguły wiąŝe się z koniecznością rozdzielenia na poszczególne składniki lub grupy substancji. MoŜliwe jest wtedy ustalenie zawartości analitu w badanej próbce, czyli dokonanie oznaczenia- analizy ilościowej. Wyznaczenie zaleŝności pomiędzy wartością sygnału detektora, a stęŝeniem/ masą składnika, przepływającego przez naczyńko pomiarowe detektora, pozwala na wykonanie kalibracji. W praktyce uŝywa się czterech zasad (reguł) oznaczania ilościowego (tabela 4) [75, 77, 106, 107]: metoda krzywej kalibracyjnej (tzw. metoda wzorca zewnętrznego ), metoda wzorca wewnętrznego, metoda normalizacji (najczęściej metoda normalizacji ze współczynnikami korekcyjnymi), metoda dodatku wzorca. Metody oznaczania składu skomplikowanych mieszanin- produktów wieloskładnikowych, zwłaszcza gdy wykonywane jest oznaczanie grupowe, są często w ten sposób opracowane, Ŝe oznaczenie końcowe nie prowadzi do uzyskania rzeczywistej wartości stęŝeń składników czy grup substancji, a do oznaczania ich zawartości względem zawartości określonych- reprezentantów składników lub grup. Wyjątek stanowi metoda grawimetryczna, która polega na zbieraniu frakcji zawierających odpowiednie grupy i oznaczeniu wagowym. Metoda ta jest, jednak, pracochłonna, kosztowna, niekorzystna dla środowiska i człowieka oraz niemoŝliwa do zastosowania w przypadku lotnych substancji (gdy temperatura wrzenia lub sublimacji nie przekracza około 300ºC), a w przypadku substancji średniolotnych o temperaturze wrzenia/ sublimacji lub rozkładu w zakresie ºC wymaga kalibracji lub wyznaczania stopnia odzysku. 38

41 Tabela 4 Metody oznaczania ilościowego w HPLC Metoda Opis krzywej kalibracyjnej wzorca wewnętrznego metoda normalizacji dodatku wzorca Stosując tę metodę w przeliczeniu na zawartość przedstawicieli składników lub, nie oznacza się rzeczywistego stęŝenia, a zawartość względną. Uzyskiwany wynik odzwierciedla, wówczas umowną zawartość substancji w badanym materiale. Zaletą jest porównywalność otrzymanych wyników i prosty sposób postępowania kalibracyjnego. Metoda jest łatwa do odtworzenia w innym laboratorium Trudność stanowi znalezienie analitu, który wykazuje podobne właściwości do badanych substancji, lecz jednocześnie rozdziela się od pozostałych składników badanej mieszaniny w stosowanych warunkach chromatograficznych. Wzorzec wewnętrzny powinien charakteryzować się znaną chemiczną strukturą, być dostępny o wysokiej czystości. Zastosowanie tej metody kompensuje błędy związane z utratą analitów podczas jej przechowywania na etapie przygotowywania próbki lub niepowtarzalnego dozowania szczególnie bardzo małych ilości. Techniki rozcieńczania izotopowego, które często są stosowane w technice MS, są odmianą metody standardu wewnętrznego. W rozcieńczeniu izotopowym wzorzec wewnętrzny jest tą samą substancją lecz zbudowaną z izotopu takiego jak deuter, tryt lub radio-izotopy. W przypadku wykorzystywania radioizotopów stosuje się detektor radiometryczny- najczulszy ze wszystkich istniejących umoŝliwiający oznaczenie nawet 50 cząsteczek. Stosując tę metodę nie oznacza się rzeczywistego stęŝenia grupy, lecz stęŝenie orientacyjne, w przypadku stosowania tzw. normalizacji prostej dla wszystkich detektorów oprócz FID- LC w przypadku węglowodorów i detektor CORONA- dla wszystkich analitów. Tak jak postępuje się w chromatografii gazowej GC, z wykorzystaniem detektora płomieniowo-jonizacyjnego FID, grupy oznaczanych substancji muszą się charakteryzować zbliŝonymi wartościami współczynnika odpowiedzi, w przeciwnym razie trzeba zastosować normalizację ze współczynnikami korekcyjnymi. Konieczna jest wówczas, znajomość tzw. współczynnika odpowiedzi. Metodę wykorzystuje się, gdy oznaczeniu poddaje się wieloskładnikowe próbki róŝniące się składem matrycy, która jest dodatkowo złoŝona lub nieznana. Warunkiem koniecznym, umoŝliwiającym, stosowanie tej metody jest wprost proporcjonalna zaleŝność rejestrowanego sygnału od stęŝenia oraz zerowy sygnał ślepej próby. Na podstawie uzyskanych chromatogramów wykreśla się zaleŝność przyrostu powierzchni/ wysokości pików od ilości analitu dodanego do próbki (składnika oznaczanego). 39

42 3 Część teoretyczna 3.1 Współczynnik załamania światła Podstawowe definicje Współczynnik załamania światła n 2 ośrodka 2 względem ośrodka 1 dla długości fali światła padającego λ 1 określa następująca zaleŝność: n 2 = c c 1 2 sinα λ = = 1 sin β λ 2 [ ] gdzie: c 1, c 2 - prędkość światła, odpowiednio, w ośrodku 1 i 2, α kąt padania światła, β kąt załamania, jeŝeli światło przechodzi z ośrodka 1 do 2, λ 1 / λ 2 długość fali promienia świetlnego, odpowiednio, w ośrodku 1 i 2. Współczynnik załamania światła wyznaczony względem próŝni nazywa się bezwzględnym współczynnikiem załamania N, który podawany jest przede wszystkim dla gazów. Natomiast dla cieczy i ciał stałych wyznacza się zwykle współczynnik załamania n względem powietrza, poniewaŝ róŝnica pomiędzy N i n, w tych przypadkach jest na ogół bardzo niewielka i wynosi ok. 0,03% [108]. N = N pow n [ ] gdzie : N- bezwzględny współczynnik załamania danej cieczy lub ciała stałego, N pow - bezwzględny współczynnik załamania względem powietrza, n- współczynnik załamania światła w cieczy lub ciele stałym względem powietrza. W warunkach laboratoryjnych przy stosowaniu linii D widma sodu N=1,00027n. 40

43 Wartości liczbowe n dla ciekłych związków chemicznych wahają się od 1,30 do 1,80 dla ciał stałych od 1,30 do 2,5 [109] Wpływ temperatury, ciśnienia i długość fali na wartość współczynnika załamania światła Na wartość współczynnika załamania światła wpływa w bardzo istotnym stopniu temperatura. W przypadku związków ciekłych, wzrost temperatury o 1 C powoduje, na ogół, obniŝenie wartości n o 3, do 5, Niektóre jednak ciecze, szczególnie w pobliŝu temperatury wrzenia wykazują większe obniŝenie n, sięgające Ciała stałe mogą mieć wartość dn/dt zarówno dodatnią jak i ujemną [110]. Ciśnienie w mniejszym stopniu wpływa na współczynniki załamania światła cieczy czy ciał stałych. Wzrost ciśnienia cieczy o 1 atm. powoduje wzrost n o około Współczynnik załamania światła zaleŝy równieŝ od długości fali świetlnej. Efekt ten nazywany jest dyspersją współczynnika załamania światła. Wartość n wzrasta ze spadkiem długości fali światła. RóŜnica miedzy nλ 1 nλ 2 nazywa się ogólnie dyspersją ( rozszczepieniem światła ) [111] Addytywność współczynnika załamania światła W sytuacji, gdy cząsteczki substancji nie wykazują w roztworze silniejszych oddziaływań międzycząsteczkowych, wartość współczynnik załamania światła roztworu jest wartością wynikająca z prawa addytywności, tzn. zaleŝy liniowo od molowego składu roztworu i współczynników załamania światła czystych składników tworzących roztwór. Ta cecha wykorzystywana jest do ilościowych oznaczeń składu róŝnych roztworów metodą refraktometryczną. Warunkiem dokładności takich oznaczeń jest tylko wartość róŝnicy współczynników załamania światła oznaczanych składników (im większa tym lepiej) [112]. Korzystnie, gdy rozpuszczalnik ma współczynnik załamania światła w sposób istotny róŝy od oznaczanych substancji. W przypadku chromatografii cieczowej w układach faz normalnych, czy chromatografii wykluczania w warunkach liofilowych, oddziaływania międzycząsteczkowe są niewielkie lub wyeliminowane. Stosowanie jednak detektora refraktometrycznego, chromatografii w układach faz odwróconych wiąŝe się ze stosowaniem fazy ruchomej, w której skład wchodzi woda. Tworzenie się wiązań wodorowych powoduje, Ŝe mogą 41

44 wystąpić wyraźne odstępstwa od prawa addytywności. W takich przypadkach nie moŝna, w prosty sposób, obliczyć współczynnika załamania światła dla mieszanin, nawet, gdy znany jest ich skład molowy. Konieczne jest eksperymentalnie wyznaczanie wartości współczynników załamania światła. 42

45 3.2 Zasada bezkalibracyjnego oznaczenia składu próbek wg koncepcji Synoviec a w warunkach kolumnowej elucyjnej chromatografii cieczowej Równanie Clausius- Mosotti opisuje zaleŝność współczynnika załamania światła substancji lub mieszaniny substancji, wychodząc z relacji między podatnością molekuł w polu elektrycznym, wektorowym przesunięciem elektrycznym i polaryzacją: χ = 3 4 π M ε ' 1 ρ ε ' + 2 N o [3.2-3] gdzie: χ - podatność cząsteczki, M- masa molowa substancji, N o - liczba Avogadro, ρ- gęstość substancji, ε - stała dielektryczna. JeŜeli przyjmiemy, Ŝe: - dla ciał przezroczystych przenikalność magnetyczna w przybliŝeniu wynosi 1, - mieszanina substancji lub roztworów jest jednorodna (suma iloczynów ułamka molowego substancji i podatności substancji), - stęŝenie objętościowe substancji i w mieszaninie wynosi C i, - mieszanina jest dwuskładnikowa, złoŝona z analitu (x) i eluentu (1), - mieszanina jest rozpuszczalna w eluencie, to, po uproszczeniu równania [3.2-3] i podstawieniu zmiennych pomocniczych otrzymujemy: K' 1 i n1 1 1 ( F F ) K ' n = C [3.2-4] x x 1 gdzie: 43

46 6n1 K' = n 1 2 ( + 2) 2 1, 2 n1, x 1 F 1, x =, 2 n + 2 n 1, x ( n ) 1 = x n 1, przy czym x oznacza analizowaną substancję chemiczną. Z powyŝszego równania moŝna obliczyć współczynnik załamania światła badanej substancji znając współczynnik załamania świtała jednego z eluentów, stęŝenie objętościowe substancji badanej (C x ) w roztworze eluentu oraz średnie wartości sygnału detektora RID dla badanej substancji, czyli róŝnice współczynnika załamania światła między eluentem, a roztworem badanej substancji w eluencie, wyznaczoną na podstawie chromatogramu tzw. przebiegu piku chromatograficznego, średnia wysokość piku przekształconego do formy prostokątnej określona w jednostkach refrakcji średnia całkowa względem czasu amplitudy sygnału detektora w zakresie przebiegu piku ( trwania piku). Wykonując oznaczenie badanej substancji z zastosowaniem dwóch róŝnych eluentów moŝemy obliczyć stęŝenie objętościowe analitu C x z zaleŝności [3.2-5], uzyskanej po podstawieniu poniŝszych równań do formuły [3.2-4]: ( F F ) K ' n + C F 1 1 x 1 K ' 1 n1 = C x x 1 Fx = C x oraz K ' n + C F 2 2 x 2 Fx = C x C x K' 1 n K' F F = [3.2-5] 2 1 n gdzie: 6n2 K' = n 2 2 ( + 2) 2 2 ( n ) n = 2 x n 2,, 44

47 F 2 2 n2 1 = n Zastępując n 1, n 2 powierzchnią piku S x,1, S x,2 badanej substancji w dwóch róŝnych eluentach: K ' S 1 K' S 2 x,1 x,2 = C x = C x ( F F ) x 1 ( F F ) x 2 [3.2-6] [3.2-7] oraz powierzchnie pików eluentów, odpowiednio (pierwszego w drugim S 1,2 i drugiego w pierwszym S 2,1 )- w sposób opisany równaniami [3.2-8] i [3.2-9]: K ' S 1 K ' S 2 2,1 1,2 = C = C ( F F ) 2 1 ( F F ) oraz przez przyrównanie wyraŝeń [3.2-8] i [3.2-9] otrzymujemy: 1 2 [3.2-8] [3.2-9] K K ' 1 ' 2 S 1,2 = [3.2-10] S 2,1 przyrównując F x z równań [3.2-6], [3.2-7] otrzymujemy: C x = K' 1 S K' S x,1 F F x,2 [3.2-11] i podstawiając formuły [3.2-8]- [3.2-10] do równania [3.2-11] otrzymujemy: S x,1 Sx,2 C = x C + [3.2-12] S2,1 S1,2 Z równania [3.2-12] moŝna obliczyć stęŝenie objętościowe badanej substancji znając powierzchnie jej pików w dwóch eluentach (S x,1 i S x,2 ) oraz powierzchnie pików jednego eluentu w drugim (S 1,2 i S 2,1 ) przy określonym stęŝeniu objętościowym C roztworów eluentów A i B uŝytych do kalibracji. Przekształcając formuły [3.2-6] i [3.2-7] otrzymujemy zaleŝność: 45

48 K' S K' 1 2 S x,1 x,2 = ( Fx F1 ) ( F F ) x 2 [3.2-13] więc: F x = K ' 2 S2 F1 K ' 1 S1 F K ' S K ' S [3.2-14] z którego moŝna obliczyć F x, a następnie współczynnik załamania światła badanej substancji z zaleŝności [3.2-4]. Przedstawione formuły mają waŝne znaczenie w chromatografii cieczowej. UmoŜliwiają oznaczenie (zawartość objętościową względem stęŝenia objętościowego) substancji lub grup substancji bez ich identyfikacji oraz bez kalibracji, albo umownych przedstawicieli grup. Szczególne znaczenie ma dla oznaczania składu grupowego, a w szczególności składu grupowego ropy naftowej, metabolitów roślinnych oraz innych substancji o skomplikowanej matrycy, gdy większość albo wszystkie składniki mieszaniny są nieznane, albo, gdy są znane, lecz nie posiadamy ich wzorców [113]. Zastosowanie tego postępowania wydaje się teŝ szczególnie interesujące w chromatografii wykluczania (Ŝelowej) [114], gdzie wiele eluentów daje ten sam przebieg chromatogramów, a eluenty te róŝnią się wartością współczynnika załamania światła. MoŜna wówczas wyznaczyć przebieg stęŝenia frakcji o róŝnych masach molekularnych w sposób nie wymagający znajomości zaleŝności współczynnika załamania światła od masy molekularnej, nie posiadając wzorców badanych polimerów. 46

49 3.3 Teoretyczna moŝliwość wykorzystania wzorca wewnętrznego w koncepcji Synoviec a. Bardzo cenną zaletą koncepcji Synoviec a jest, w przypadku analizy nieznanych pod względem składu mieszanin, moŝliwość wyznaczenie bezwzględnych wartości współczynników załamania światła analitów w postaci cieczy lub hipotetycznych cieczy w temperaturze, w której odbywa się detekcja w detektorze refraktometrycznym. Takie obliczenia moŝna wykonać, stosując technikę chromatografii cieczowej z detekcją refraktometryczną i rozdzielając tę samą próbkę w dwóch róŝnych eluentach o zbliŝonej sile elucyjnej. Eluenty te powinny wykazywać bardzo zbliŝoną selektywność oraz znane, a zarazem róŝne, współczynniki załamania światła [113]. Wyznaczając powierzchnię piku pochodzącego od próbki rozdzielanej z zastosowaniem dwóch róŝnych eluentów, moŝna obliczyć w/ w bezwzględne wartości współczynnika załamania światła, zgodnie z formułą [3.4-23]: ne2 ne 1 n = ne 1 + [3.4-23] S1 (1 ) S 2 gdzie: n- współczynnik załamania światła analitu mieszaniny, bądź określonej substancji, stanowiącej konkretny pik chromatograficzny, n e1,e2 -współczynniki załamania światła eluentu 1 i 2, S 1,2 powierzchnie pików substancji badanej, odpowiednio w eluentach 1 i 2. Koncepcja Synoviec a opracowana była dla eluentów jednoskładnikowych, w przypadku eluentów dwuskładnikowych, tworzących jakiekolwiek wiązania lub oddziaływania wewnętrzne (ciepło mieszania róŝnych eluentów), obliczenie współczynnika załamania światła jest niezwykle złoŝone. NaleŜy wówczas, w sposób doświadczalny, wyznaczyć jak najdokładniej wartości współczynników załamania światła dla mieszanin rozpuszczalników o składzie eluentu. 47

50 Ze względu na moŝliwość odstępstw od prawa addytywności współczynnika załamania światła, korzystne wydaje się wprowadzenie wzorca wewnętrznego, o znanym stęŝeniu objętościowym i znanej wartości załamania światła. Wówczas obliczenie wartości współczynników załamania światła oddzielnie dla substancji wzorcowej i analizowanej powinno być moŝliwe, w prosty sposób wyznaczając stęŝenie objętościowe analizowanej próbki na podstawie zaleŝności [3.4-24]. Warunkiem jest jednak, najprawdopodobniej, brak silnych oddziaływań analitów ze składnikami eluentu, co wymaga wykonania odpowiednich badań. c c x wz n n x = [3.4-24] wz gdzie: n wz, x - współczynnik załamania światła substancji wzorcowej i substancji analizowanej, wyznaczone według zaleŝności [3.4-23], C wz, x - stęŝenie objętościowe substancji wzorcowej i substancji analizowanej lub odpowiednich grup substancji. WaŜne jest, aby wzorzec wewnętrzny miał podobne właściwości do substancji analizowanych i był rozdzielany od pozostałych substancji, grup substancji badanej mieszaniny. Korzystne wydaje się równieŝ zastosowanie niewielkiego przeładowania objętościowego tak, aby kształt piku substancji wzorcowej wykazywał plateau (Rys.9). Rysunek 9 Przykładowy chromatogram rozdzielania mieszany dwóch substancji (a) i (b) z dodatkiem wzorca wewnętrznego (wz), gdy objętość dozowania wzorca jest wysoka. 48

51 3.4 Metodyka wyznaczania stęŝeń substancji w HPLC Wyznaczenie stęŝenia analitu w próbce dozowanej do kolumny, moŝliwe jest na podstawie pola powierzchni piku (S) i średniej całkowej absorpcji (Â), jak równieŝ wysokości piku (H), lecz wyłącznie w przypadku pików w postaci rozkładu Gaussa. Wyznaczenie stęŝenia określonej substancji chromatografowanej moŝna teŝ dokonać na podstawie piku chromatograficznego oraz sprawności kolumny (N), gdy załoŝy się całkowitą zgodność dyspersji w kolumnie z teorią półki teoretycznej. Gdy moŝliwe jest wyznaczenie stęŝenia analitu w maksimum piku (c m ) oraz znana jest objętość dozowania próbki v i, stęŝenie c i moŝna bardzo łatwo obliczyć z równania [3.3-15] [115]: c v N c = i i m VR 2π [3.3-15] gdzie: c m stęŝenie analitu i w maksimum piku, c i - stęŝenie analitu i w próbce dozowanej do kolumny, v i - objętość próbki dozowanej do kolumny, V R - objętość retencji analitu i, N- liczba półek teoretycznych kolumny. Uwzględniając prawo zachowania masy otrzymujemy: V P = V R 2π N [3.3-16] gdzie V P oznacza objętość eluatu w zakresie trwania piku o całkowicie gaussowskim kształcie. W przypadku pików gaussowskich i nie gaussowskich oraz dysponowania cyfrowym systemem rejestracji i przetwarzania danych, istnieje jeszcze jedna, nawet znacznie prostsza moŝliwość praktycznego wykorzystania pojęcia średniej całkowej. 49

52 Bez wgłębiania się w jakąkolwiek teorię, a opierając się jedynie na intuicyjnym, logicznym rozumowaniu, moŝna napisać: ĉ p = c i v i / v P [3.3-17] gdzie: c i stęŝenie analitu i w próbce dozowanej do kolumny, v i - objętość próbki dozowanej do kolumny, ĉ p - średnia całkowa stęŝenia analitu w zakresie trwania piku, tzn.: w dt [3.3-18] gdzie: t p - czas początku piku, t k - czas końca piku, C x (t) - stęŝenie (wysokość piku) w czasie t, V P - objętość eluatu w zakresie trwania piku, w- natęŝenie przepływu eluentu. Problem analityczny polega, jedynie i aŝ, na umiejętności przyporządkowania stęŝenia analitu wartości wysokości sygnału detektora. Inna zasada teoretyczna oparta jest na komputerowym modelowaniu kolumny. Ze względu na złoŝone procesy zachodzące podczas rozdzielania chromatograficznego, model teoretyczny, nawet przy załoŝeniu tłokowego profilu przepływu eluentu w kolumnie, musi uwzględniać wiele składowych (oddziaływania w fazie ruchomej, stacjonarnej) oraz dyfuzję wirową i opory przenikania masy w fazie ruchomej, a takŝe procesy termodynamiczne odpowiadające za selektywność układu oraz czynniki. Kinetyczne, uwzględniające konwekcję, dyfuzję i kinetykę oddziaływań. Ze względu na przepływowy charakter technik chromatograficznych (przepływ fazy ruchomej przez kolumnę) zachodzące procesy są nierównowagowe. W takim przypadku bilans masy dla róŝniczkowej jednostki masy eluentu dopływającego i wypływającego z/do róŝniczkowego przekroju poprzecznego kolumny, róŝniczkową zmianę masy analitu moŝna obliczyć na podstawie równania [3.3-19]: 50

53 ρi = divρiu + ri t [3.3-19] gdzie: ρ i gęstość, u- chwilowa liniowa prędkość przepływu eluentu, r i - ilość substancji dopływającej lub wypływającej do/z elementu eluentu o objętości d w jednostce czasu. W przypadku roztworów, gęstość cieczy moŝna zastąpić stęŝeniem składnika próbki: ρ i = M i c i [3.3-20] gdzie M i - masa cząsteczkowa. Wówczas: ρi = divρ u + i t i, j M v i i, j Rj [3.3-21] gdzie: ν- współczynnik stechiometryczny. Biorą powyŝsze pod uwagę De Vault w 1943r. przekształcił powyŝsze równanie dla warunków chromatografii [116, 117]. Niestety, jest ono w sposób analityczny nierozwiązywalne. Dla bardzo uproszczonych modeli, na przykład jednoskładnikowej próbki moŝna go rozwiązać. Bardziej skomplikowane sytuacje wymagają zastosowania metod numerycznych, które modelują cykliczne przechodzenie próbki z fazy ruchomej do stacjonarnej i w literaturze inŝynierii chemicznej moŝna znaleźć wiele rozwiązań wykonanych numerycznie, lecz dla konkretnych warunków granicznych i brzegowych. Istnieją równieŝ oprogramowania komputerowe pozwalające na otrzymanie dokładnych rozwiązań ogólnych dla określonych warunków rozdzielania. Problemem jest konieczność znajomości wielu trudno dostępnych danych fizycznych i kinetycznych. 51

54 Cykliczne przejścia analitów, z fazy stacjonarnej do ruchomej i na odwrót, wzdłuŝ długości kolumny chromatograficznej, powoduje krótkotrwale, tymczasowe ustalanie się równowagi termodynamicznej (model Craiga) [118]. Długość kolumny chromatograficznej, w której następuje ustalanie równowagi od punktu całkowitej nierównowagi, toŝsama jest z wysokością półki teoretycznej (H), gdzie: H=Lc/N [3.3-22] JeŜeli oznaczymy prawdopodobieństwo przebywania cząsteczki próbki w fazie ruchomej bądź stacjonarnej, odpowiednio jako p i q, to suma tych prawdopodobieństw będzie wynosiła 1. Zgodnie z tym, jeŝeli załoŝymy, Ŝe proces chromatograficzny stanowią dwie półki teoretyczne, to po ustaleniu stanu równowagi, stęŝenie próbki (o stęŝeniu p na wejściu do pierwszej półki) w fazie stacjonarnej drugiej półki wyniesie pq, zaś w fazie ruchomej p 2. Przy załoŝeniu, Ŝe półek teoretycznych w kolumnie chromatograficznej jest duŝo więcej niŝ dwie, to całkowita ilość próbki w kolumnie wynosi: (q+p) r =1 [3.3-23] gdzie r- liczba półek teoretycznych (odpowiadających objętości retencji). Z zasad kombinatoryki wynika, Ŝe prawdopodobieństwo, iŝ cząsteczka po r krokach znajduje się w N półce teoretycznej wynosi[119]: P r N N r p = r! q [3.3-24] N!( r N)! W idealnych warunkach chromatograficznych (dla tłokowego profilu przepływu eluentu w kolumnie i dla całkowicie liniowej izotermy sorpcji) rozmieszczenie składnika i próbki wzdłuŝ kolumny powinno przyjmować postać rozkładu statystycznego Gaussa (piki symetryczne). W rzeczywistości, ze względu przepływ cieczy, powyŝszej opisana sytuacja ustalania się stanu równowagi, jest praktycznie niemoŝliwa. Stąd rozkład Gaussa przybiera postać: 52

55 ( V V ) c 1 R ivi 2 2σ ( V ) c = e [3.3-25] w σ 2πN gdzie: σ- odchylenie standardowe stęŝenia analitu w zakresie trwania piku, w- objętościowa prędkość przepływu eluentu. Podejścia przedstawione powyŝej, wykorzystywane do obliczenia stęŝenia rozdzielonych analitów, jak równieŝ obliczenie masy lub liczby moli analitu, na podstawie stosunku średniej całkowej powierzchni piku do objętości eluentu, upraszczają w duŝej mierze oddziaływania zachodzące w kolumnie. Wówczas, gdy pik jest bardzo rozmyty (niewielka liczba półek teoretycznych, mniej od około 500), bądź asymetryczny (nieliniowość izotermy sorpcji lub/i nietłokowy profil przepływu eluentu w kolumnie) obliczenie stęŝenia analitu w maksimum piku na podstawie równania [3.3-25] wiąŝe się zawsze z duŝym błędem. W kaŝdej z opisanych powyŝej sytuacji, jedynym przydatnym dla analityka postępowaniem jest wykorzystanie średniej całkowej wg równania [3.3-17] do bezkalibracyjnego obliczania stęŝenia analitu w próbce dozowanej do kolumny gdy jakimkolwiek sposobem dysponujemy zaleŝnością fizycznej wartości sygnału detektora od stęŝenia analitu w eluencie. 53

56 3.5 Wykorzystanie detektora spektrofotometrycznego do oznaczania bezkalibracyjnego Koncepcja Synoviec a wykorzystuje róŝnice w odpowiedzi detektora refraktometrycznego, dla określonego składnika mieszaniny albo grupy substancji w róŝnych eluentach o róŝnych wartościach współczynnika załamania światła i o podobnej sile elucji. Warunkiem koniecznym, aby moŝna było wykorzystywać opisaną koncepcję, jest róŝna wartość odpowiedzi detektora dla dwóch eluentów o zbliŝonej sile elucji i selektywności. Im większa róŝnica współczynnika załamania światła w przypadku stosowanych rozpuszczalników tym dokładniejsze powinny być rezultaty. Alternatywą dla stosowania detektora refraktometrycznego moŝe być stosowanie detektor spektrofotometrycznego do bezkalibracyjnego oznaczania analitów Podstawowe definicje Absorpcja światła to pochłanianie promieniowania elektromagnetycznego o określonej długości fali lub widmie przez roztwory analitów lub grup analitów. W wyniku tego, natęŝenie światła przechodzącego przez celkę pomiarową zmniejsza się. Zasadę powyŝszych zjawisk opisują prawa absorpcji światła, tzw. Prawa Lamberta- Beer a [120] Widmo absorpcji substancji lub grup substancji Absorbancja promieniowania światła w określonych zakresach długości fali jest cechą charakterystyczną dla konkretnych analitów lub grup analitów. Substancja absorbuje promieniowanie UV, a niekiedy widzialne, gdy posiada w swojej budowie grupy chromoforowe. Najczęściej są to pierścienie aromatyczne, wiązania wielokrotne, grupy karbonylowe, grupy nitrowe i inne. W tabeli 5 zestawiono przykłady grup chromoforowych. 54

57 Tabela 5 Zestawienie przykładowych typów chromoforów i związków absorbujących promieniowanie świetlne w zakresie UV. Molowy współczynnik. absorpcji chromofor przykład Długość fali λ max [nm] ε max [dm 3 mol -1 cm -1 ] etylen aceton kwas octowy acetamid octan etylu chlorek acetylu acetonitryl 167 brak danych azometan nitrometan azotyn butylu naftalen benzen ZaleŜność wartości absorpcji światła wyraŝonej w jednostkach absorbancji w funkcji długości fali nosi nazwę widma (Rys. 10). 55

58 Rysunek 10 Widmo absorbancji benzo[j]fluorantenu. Na podstawie widma moŝemy wyznaczyć długości fali światła, dla których absorpcja będzie maksymalna. Wykorzystanie w analityce tych długości fali wiąŝe się z zachowaniem liniowości odpowiedzi i wysokiej czułości detektorów spektrofotometrycznych Oznaczanie bezkalibracyjne z wykorzystaniem detektora spektrofotometrycznego Stosowanie detektora spektrofotometrycznego umoŝliwia wykonywanie oznaczania bezkalibracyjnego, choć w praktyce analitycznej jest ono dotychczas praktycznie niestosowane, gdyŝ warunkiem stosowania jest znajomość małych współczynników absorpcji analitów. MoŜna wykorzystać zaleŝności, określone prawem absorpcji światła wyraŝonej w jednostkach absorbancji oraz addytywności absorpcji światła. c A εb = [ ] gdzie: A- absorbancja wiązki monochromatycznej [jednostka absorbancji], ε- molowy współczynnik absorpcji [dm 3 mol -1 cm -1, w jednostkach układu SI m 2 mol -1 ], b- grubość warstwy roztworu absorbującej światło. 56

59 Zawsze znane są wymiary naczyńka pomiarowego detektora. W przypadku zastosowania wzorca o znanym współczynniku ekstynkcji molowej i znanym stęŝeniu, a dodatkowo wykazujący tą samą retencję co oznaczana substancja, wartość tą moŝna wyznaczyć eksperymentalnie. Jedynym sensownym sposobem oznaczania bezkalibracyjnego z zastosowaniem detektora spektrofotometrycznego jest wykorzystanie zaleŝności [ ] c = Â λ V εv L i k p [ mol / ml] [ ] gdzie: Â λ - średnia całkowa absorpcji fali światła λ przez analit oznaczany [jedn. absorbancji], ε λ - molowy współczynnik absorpcji dla substancji oznaczanej [dm 3 mol -1 cm -1 lub w jednostkach SI m 2 mol -1 ], V p - objętość eluatu w czasie trwania piku [ml], V i - objętość dozowanej próbki do kolumny chromatograficznej [ml], L k - długość kolumny chromatograficznej [cm]. Największy problem polega na dokładnej znajomości wartości ε λ oraz na niezwykle dokładnym wyznaczeniu objętości wprowadzanej próbki do kolumny, Vi. Detektory spektrofotometryczne oraz typu DAD umoŝliwiają analizę widma, co umoŝliwia wyznaczenie optymalnych długości fali absorbowanej przez analit. Ze względu na wpływ rodzaju stosowanego rozpuszczalnika próbki na kształt widma absorpcji, widmo powinno być otrzymywane w stosowanych do rozdzielania warunkach chromatograficznych. Konieczne i bardzo celowe, jest sporządzanie baz danych uwzględniających właściwości i retencję substancji analizowanych z wykorzystaniem technik chromatografii cieczowej. Na podstawie analizy właściwości fizycznych i chemicznych analitów w przyszłości będzie moŝna, bez wykorzystania metod kalibracyjnych, oznaczać i identyfikować substancje. 57

60 3.6 Metody identyfikacji składników analitu lub grup składników w chromatografii Chromatografia to narzędzie analityczne umoŝliwiające oznaczanie składników, bądź grup składników, ale takŝe identyfikację analizowanych mieszanin. Chromatogram przedstawia zaleŝność wartości sygnału detektora w funkcji czasu a w istocie w funkcji objętości elucji. Jest to niewiele informacji, lecz na ich podstawie moŝna przynajmniej w przybliŝeniu równieŝ zidentyfikować anality. Identyfikacja odbywa się na podstawie porównania albo czasu lub objętości albo współczynników retencji albo retencji względnej dla substancji oznaczanej z wartościami otrzymanymi dla substancji wzorcowej. WaŜne jest, aby składniki próbki rozdzielały się. Stosuje się raczej porównanie parametrów względnych niŝ wartości czasu lub objętości retencji z powodu eliminacji w ten sposób zmienności czasu retencji, która moŝe być spowodowana nieprecyzyjną pracą pampy, czy zakłóceniami związanymi z niedokładnym odtwarzaniem składu eluentu lub program elucji. Niektóre ze stosowanych w chromatografii detektorów umoŝliwiają dodatkowe potwierdzenie identyfikacji, wykonanej na podstawie parametrów retencyjnych za pomocą innych danych. MoŜna to wykonać na podstawie widm (UV-VIS,MS, fluorescencji, voltamperogramów inwersyjnych, NMR, IR), a takŝe za pomocą reakcji charakterystycznych wywołujących barwę. NaleŜy, jednak pamiętać, iŝ widma mogą ulegać przesunięciom lub zniekształceniom, ze względu na wpływ oddziaływań analitów z fazą ruchomą, albo na jonizację cząsteczek.. Spektrometria mas to jedna z niewielu technik umoŝliwiająca oznaczanie struktur substancji juŝ po analizie chromatograficznej. Niestety technika ta nie moŝe być wykorzystywana do identyfikacji wszystkich analitów, ze względu na brak jonizacji np. monoaromatów, jak wspomniano wcześniej. W zakresie technik metod identyfikacji oraz oznaczania grup i poszczególnych substancji. korzystne byłoby opracowanie parametru retencji wyznaczanego w warunkach dwuwymiarowego rozdzielania odpowiadającego indeksowi Kovatsa stosowanemu w chromatografii gazowej. Szczególnie waŝne znaczenie poznawcze miałoby przy tym, znalezienie na drodze półempirycznej takich parametrów retencji substancji rozdzielanych, aby ich wartość była specyficzna tylko dla badanych 58

61 substancji, typu zastosowanej fazy stacjonarnej oraz dla zastosowanego eluentu, albo programu elucji i nie zaleŝała od technologii produkcji sorbentu, tzn., od producenta sorbentu i od szarŝy produkcyjnej. Konieczne wydaje się teŝ opracowanie wielopoziomowych, systematycznie wzbogacanych i weryfikowanych pod względem wiarygodności danych komputerowych, baz parametrów operacyjnych, właściwości fizykochemicznych, widm UV- VIS (a takŝe w miarę potrzeby- MS, NMR), parametrów retencji względnej analitów i grup analitów, jako danych identyfikacyjnych, a takŝe baz danych kalibracyjnych, struktur molekularnych oraz róŝnego rodzaju innych właściwości chromatograficznych substancji. Jednak, ten ostatni postulat pozostaje poza zakresem badań niniejszej pracy. 59

62 3.7 Wykorzystanie układów równań do oznaczania składu skomplikowanych mieszanin Chromatografia to grupa technik rozdzielania szczególnie przydatna do rozwiązywania zadań analitycznych opisanych substancji, grup substancji i produktów na wstępie. Wykorzystanie optymalnego zestawu detektorów i optymalnie dobranych warunków detekcji umoŝliwia otrzymanie dodatkowych informacji jakościowych, oprócz tych, jakie przynoszą wartości parametrów retencji, a takŝe określenie zawartości składników mieszaniny w szerokim zakresie stęŝeń. Na podstawie otrzymanych chromatogramów oblicza się parametry retencji analitów oraz ich zawartości korzystając z wartości pola powierzchni, bądź wysokości pików. Jest to łatwe w przypadku, gdy substancje ulegają całkowitemu rozdzieleniu. W przypadku braku pełnego rozdzielania pików analitów moŝna zastosować chromatografię wielowymiarową (najczęściej dwuwymiarową, ale takŝe wyŝszego stopnia). Uzyskuje się chromatogramy dwuwymiarowe opisane w rozdziale 2.3.1, umoŝliwiające obliczenie stęŝeń, na podstawie sumy pół powierzchni lub sumy wysokości pików. Do oznaczania składu skomplikowanych mieszanin, moŝna równieŝ zastosować dwuwymiarową lub wielowymiarową kalibrację [ ]. Zadaniem tego typu kalibracji jest ustalenie modelu zaleŝności pomiędzy zawartościami (stęŝeniami) składników w poszczególnych próbkach, a wartościami absorpcji promieniowania przy róŝnych długościach fali. Jakość i wiarygodność modeli kalibracyjnych zaleŝy od wielu czynników, do których zalicza się zarówno reprezentatywność materiału badawczego (próbek), jak i rozmaite aspekty procedury budowy modelu. Dane wektorowe uzyskiwane na podstawie widm absorpcji lub emisji (spektrofotometria, spektrofluorymetria, podczerwień, bliska podczerwień), czy skanów elektrochemicznych (voltamperogramy) mogą zostać wykorzystane ze względu na prostotę stosowania i łatwość interpretacji [122]. Wielowymiarowa kalibracja wykorzystywana jest w przypadku mieszanin o skomplikowanym składzie, w zakresie medycyny, botaniki czy produktów rafineryjnych. W przypadku analityki składu mieszaniny substancji o znanych składnikach, nawet bez ich całkowitego rozdzielania wielowymiarowa analiza otrzymanych chromatogramów powinna pozwolić na oznaczanie ich zawartości w badanej próbce. Wielowymiarowość oznacza w tym przypadku zastosowanie kilku układów 60

63 rozdzielczych, gdzie składniki mieszaniny będą rozdzielane pod względem róŝnych właściwości, róŝnic polarności, hydrofobowości, oddziaływań hydrofilowych, jonowymiennych czy pod względem zróŝnicowania mas cząsteczkowych. Utworzenie układu równań, uwzględniającego powierzchnie pików lub wysokości pików lub grup pików poszczególnych składników lub grup składników mieszaniny oraz współczynniki kalibracyjne dla substancji wzorcowych, powinno umoŝliwić obliczenie zawartości analitów. Celowe będzie wykorzystanie do tego programów algebry komputerowej oraz zasad wykonywania obliczeń przybliŝonych. WaŜne jest, aby liczba równań była równa lub wyŝsza od liczby niewiadomych. Przyjmijmy, iŝ wykonujemy rozdzielanie, w róŝnych układach chromatograficznych, skomplikowanej mieszaniny składników z zastosowaniem dwóch detektorów, selektywnego i uniwersalnego. Otrzymujemy chromatogramy przedstawione na rysunku 11. A- DETEKTOR I B- DETEKTOR II X: Y: Z: Rysunek 11 Przykładowe chromatogramy rozdzielania skomplikowanej mieszaniny w trzech układach chromatograficznych X, Y, Z, z zastosowaniem dwóch detektorów A- detektora uniwersalnego, B- detektora selektywnego. 61

64 Na podstawie chromatogramów, dla kilku układów chromatograficznych L z zastosowaniem kilku detektorów j otrzymujemy zaleŝności: X: c I a =k a1i F I a1 +k a2i F I I a2 + k a3i F a3 c I b =k b1i F I I b1 + k b2i F b2 c I c =k c1i F I c1 + k c2i F I I c2 + k c3i F c3 Y: c I a =k b1i F I I b1 + k a2i F a2 c I b =k a1i F I I a1 +k b2i F b2 c II II a =k a1 II F a1 c II II b =k b1 II F b1 c II c =k c1 II F II c1 + k c2 II F II II c2 + k c3 II F c3 c II a =k b1 II F II b1 + k c2 II F II II c2 + k c3 II F c3 c II b =k a1 II F II II a1 + k c1 II F c1 c c I =k c1i F c1 I + k c2i F c2 I + k c3i F c3 I + k a3i F a3 I Z: c a I =k a1i F a1 I + k a2i F a2 I +k c2i F c2 I c b I =k a3i F a3 I +k b1i F b1 I + k c3i F c3 I c c I =k b2i F b2 I + k c1i F c1 I c a II =k c1 II F c1 II c b II =k a1 II F a1 II +k b1 II F b1 II c c II =k c2 II F c2 II +k c3 II F c3 II j Odpowiednie wartości współczynników kalibracyjnych k i dla detektora j są takie same dla układów chromatograficznych/ warunków chromatograficznych X, Y, Z, eluent nie powoduje wytworzenia sygnału przez detektor. Jeśli powoduje, warunki nie są takie same i naleŝy uwzględnić to w powyŝszych równaniach, co komplikuje wyprowadzone zaleŝności. Stąd trzeba dobrać tylko takie warunki detekcji gdzie eluent nie ma wpływu na sygnał detektora. Korzystne jest, w przypadku gdy eluent ma wpływ na sygnał detektora, dobranie takich warunków detekcji (nawet o niŝszej czułości) by takiego wpływu nie było. Ostatecznie zmienne dla pracy na bazie powierzchni pików to: - grupy substancji oznaczanych: a, b, c, - l - substancje oznaczane: a 1, b 1, c 1, - i - detektory: I, II,... - j - kolumny/ układy rozdzielcze: X, Y, Z, - L - stęŝenia grup substancji: c a, c b, c c, - c j l (L)= c j i (L) - stęŝenie składników: c a1, c a2, c a3, - c j i (L)= F j i (L) k j i (L) - powierzchnia pików: F a = F j ai, F b = F j j bi, - F i (L) - współczynniki kalibracyjne: k I a, k II a, k I b, k II b, - k j i (L). 62

65 Jeśli przymnie się powyŝsze oznaczenia moŝna dla kaŝdego z chromatogramów, wykonanych w róŝnych układach rozdzielania X, Y, Z: L, z zastosowaniem detektora j napisać: c l = c i [3.8-28], c i = F i j k i j [3.8-29]. W przypadku pików rozdzielonych naleŝy wyznaczyć wartość c i. W przypadku pików nierozdzielonych naleŝy rozwiązać, po wykonaniu rozdzielań w układach rozdzielczych X, Y, Z ( w tym przypadku trójwymiarowy układ rozdzielczy ), z zastosowaniem detektora j - układ równań liniowych, postaci: X: F j l (X)= F j i (X) Y: F j l (Y)= F j i (Y) Z: F j l (Z)= F j i (Z) podstawiając jako dane wartości, wyznaczonych podczas kalibracji, współczynników kalibracyjnych k j i, które w przypadku dobrania odpowiednich warunków detekcji i braku wpływu składu eluentu na sygnał detektora, mają takie same wartości w kaŝdym z zastosowanych wymiarów rozdzielania. Rozwiązaniem powyŝszych układów równań mogą być wartości poszukiwanych stęŝeń składników i mieszaniny, tzn. wartość c i, a stąd c l, gdy chodzi o uzupełnienie kalibracji- wartości brakujących współczynników kalibracyjnych k j i, a gdy wartości detekcji zaleŝą od warunków rozdzielania- wartość k j l [L]. Dodatkowo przy zastosowaniu zasad opisanych w rozdziale 3.4 istnieje moŝliwość zastosowania w obliczeniach znanych wartości parametrów fizyko- chemicznych substancji oraz wyznaczenia nieznanych parametrów fizyko- chemicznych rozdzielanych składników mieszaniny. Idea opisana powyŝej moŝe takŝe zostać zastosowana w tym celu, jednak wymaga następującej modyfikacji: - dla pików izolowanych o znanym stęŝeniu składników rozdzielonych w próbce dozowanej trzeba wyznaczyć średnie całkowe stęŝenia składnika: 1 par i = t t t ki pi pardt i [3.8-30] 63

66 i skorzystać z zaleŝności: par ν i i = ν p par i [3.8-31] gdzie par i - oznaczenie standardowe. JeŜeli detektorem jest spektrofotometr typu UV- VIS/DAD lub innego typu detektor umoŝliwiający otrzymanie widma lub nałoŝonych widm określonych składników rozdzielanej mieszaniny i jeŝeli składniki mieszany róŝnią się widmami, to moŝna dodatkowo ułoŝyć i rozwiązać układu równań typu: c i ε λ i l k w i = c ν i i [3.8-32] bazujące na wartościach sumy absorpcji światła częściowo nałoŝonych na widmach. Na tej podstawie w zaleŝności od potrzeby moŝna wyznaczyć, albo stęŝenie substancji c i, albo współczynnik absorpcji molowej dla substancji, przy określonej długości fali, a wybierając określoną wartość λ detekcji- takŝe wartość k i j. λ ε i 64

67 4 Ogólna charakterystyka materiałów wykorzystywanych w badaniach 4.1 Specyfiki farmaceutyczne Leki bywają podawane w róŝny sposób. Jedne z form to maści i Ŝele. śele są koloidalną dyspersją ciała stałego w cieczy, przy czym w przeciwieństwie do roztworów koloidalnych, obie fazy są fazami ciągłymi. Cząstki ciała stałego, w układzie tym, łączą się siłami Van der Waalsa bądź wiązaniami wodorowymi lub oddziaływaniami dyspersyjnymi [124]. W postaci Ŝeli występują bardzo często specyfiki farmaceutyczne, których uŝycie wiąŝe się z efektami leczniczymi. Idea przez- skórnego podania niektórych leków jest bardzo stara, a ostatnio znowu coraz bardziej stosowana. Podstawową barierę hamującą wchłanianie substancji leczniczych przez skórę stanowi zewnętrzna warstwa komórek naskórka, stąd moŝna w ten sposób podawać jedynie substancje przenikające przez skórę. Wchłanianie leku przez skórę zaleŝy od właściwości fizykochemicznych substancji leczniczych, rodzaju podłoŝa i jego właściwości, wzajemnego oddziaływania lek- podłoŝe- skóra, jak równieŝ obecności substancji pomocniczych, które stanowią składniki Ŝelu [125] Potrzeba oznaczania komponentów leków w formie Ŝelu lub maści, a takŝe składników kremów i podobnych specyfików farmaceutycznych i kosmetycznych. Potrzeba wykorzystania tego typu analityki jest przede wszystkim związana z kontrolą jakości w/w produktów. Niekiedy znaczenie ma takŝe potrzeba zbadania ewentualnego sfałszowania produktu, jego zepsucia się w wyniku skaŝenia, a takŝe zbadanie składu w celu opisu składu produktów konkurencyjnych lub wyjaśnienia technologii ich otrzymywania. Tego rodzaju zadania analityczne naleŝą do szczególnie trudnych ze względu na najczęściej szeroki zakres mas molekularnych komponentów, ich polarność, hydrofilowość i hydrofobowość oraz wielofazowość postaci fizycznej. Często teŝ niektóre składniki są bardzo trudno albo nierozpuszczalne w cieczach, a jeśli rozpuszczalne to w formie roztworów koloidalnych. 65

68 Konieczne jest więc stosowanie róŝnych technik rozdzielania, w tym chromatografii. Celowe wydaje się zastosowanie rozdzielania w kilku układach chromatograficznych róŝniących się rodzajem oddziaływań sorpcyjnych: - chromatografii wykluczania/ŝelowej (SEC/GPC), tak w warunkach hydrofilowych, jak i liofilowych; - układów faz normalnych (NP), szczególnie w warunkach oddziaływań hydrofilowych (HILIC),a takŝe dla komponentów nisko- i średniopolarnych- chromatografii adsorpcyjnej w układach faz normalnych, z wykorzystaniem faz stacjonarnych: Ŝel krzemionkowy, Ŝel krzemionkowy modyfikowany grupami cyjanopropylowymi, aminowymi, czy typu DIOL, z niepolarnymi fazami ruchomymi, takimi jak n-heksan, n-heptan i ich mieszaninami z eterem metylowo tert-butylowym, tetrahydrofuranem; ograniczeniem układu jest mała rozpuszczalność komponentów farmaceutycznych w n- heksanie czy n-heptanie; - układów faz odwróconych; - celowe moŝe być teŝ dla określenia zawartości niektórych składników zastosowanie warunków oddziaływań hydrofobowych (HIC), jonowymiennych (IEC), czy wykluczania jonów (IExclC). Przegląd literatury wykazał, iŝ istnieje wiele prac nad oznaczaniem określonych wybranych składników specyfików farmaceutycznych, szczególnie substancji czynnych co jest wymagane przez Farmakopeję. Niestety, w literaturze brak jest informacji na temat sposobów postępowania jakie naleŝy zastosować dla rozdzielania i oznaczania wszystkich komponentów omawianego typu specyfików farmaceutycznych, czy produktów kosmetycznych. W tabeli 6 zestawiono najwaŝniejsze przykłady techniki rozdzielania i oznaczania określonych składników specyfików farmaceutycznych opisane w literaturze oraz zastosowane techniki detekcji i kalibracji. 66

69 Tabela 6 Przykłady układów chromatograficznych wykorzystywanych do oznaczania składników specyfików farmaceutycznych i kosmetycznych w postaci Ŝeli, maści i kremów. Substancja rozdzielana Próbka Przygotowanie próbki Kolumn a triamcinolon, metylo- i propyloparaben, hydrokortyzon octowy kompleksowane Ŝelazo krem- Triamcinolon Ŝel pod prysznic, mydło Układ chromatograficzny/eluent lub program elucji Detekcja Literatur a rozpuszczenie C18 ACN:H 2 O 40:60(v/v) UV 126 rozpuszczenie w eluencie filtracja przez filtr 0,45 µm IP-C18 MeOH:bufor 10:90(v/v) 20mM wodorosulfonian tetrabutyloaminy, 15mM mrówczan sodu ph4 (kw. mrówkowy) UV 127 witamina A krem -ekstrakcja do MeOH+CH 3 Cl C18 A: MeOH: H 2 O 10mM octanu aminy 70;30 (v/v) B: MeOH: CH 3 Cl 40:60 (v/v) 15min 100%A do 100%B, 15 min. 100%B UV 128 metylo-dibromoglutaronitryl metylo-, porpyloparaben, octan hydrokortyzonu mirystynian nikotyny składniki czynne kremów kwas sorbinowy chinokaina HCl chlorokrezol, chloroksynelol krem do ciała krem farmaceutyczny preparat dermatologiczny kremy lecznicze krem farmaceutyczny kremy farmaceutyki ekstrakcja w 60C, 10 min do 80%MeOH ekstrakcja do ACN 10min. ultradźwięki odwirowanie ekstrakcja w fazie ruchomej ekstrakcja oznaczanych substancji do eluentu ekstrakcja do eluentu ekstrakcja do 0,1 N HCl odwirowanie w warunkach 2000obr./min., 10 min. ekstrakcja do DMSO 10 min w łaźni ultradźwiękowej C 8 Aceton: H 2 O (2mM chlorek sodu, 20mM sulfonianu sodu) 40:60 (v/v) EC 129 C18 MeOH:ACN: H 2 O 15:27:58(v/v/v) UV 130 C18 0,01%TFA:ACN 2:98 (v/v) UV 131 SPE Brak danych UV 132 PLRP-S C18 ODS ACN:bufor fosforowy (ph 7): H 2 O 1:5:94(v/v/v) ACN: 0,01 M octan sodu trihdrat 45:55(v/v) 0,02 zawiera 0,06%(w/v) sól sodowa kwasu heptan sulfonowego ph 4,5 kwas octowy A: ACN:THF 95:5 (v/v) B: bufor fosforanowy trimetyloaminy (ph 3, 0,05 M) UV 133 UV 134 FLC Derywatyzacja

70 68 A B (52:48, v:v)

71 4.2 Estry metylowe kwasów tłuszczowych, mono-, di- triacyloglicerole Lipidy stanowią duŝą i bardzo zróŝnicowaną pod względem chemicznym grupę naturalnych związków organicznych, których wspólną cechą jest ich lipofilowość. O przynaleŝności substancji grupy do lipidów decyduje nie tyle budowa chemiczna, co właściwość fizykochemiczna, jaką jest rozpuszczalność w rozpuszczalnikach lipofilowych. Przy czym do tej grupy zalicza się wyłącznie substancje będące metabolitami pierwotnymi bądź wtórnymi świata roślinnego i zwierzęcego. Są to na ogół cząsteczki zawierające długołańcuchowe kwasy tłuszczowe. Oprócz hydrofobowych łańcuchów węglowodorowych cząsteczki lipidów mogą zawierać w swoim składzie hydrofilowe grupy polarne, np. estrowe, fosforanowe, wodorotlenowe, aminowe i in. Typowe lipidy, jakimi są tłuszcze, wydobywa się z surowców naturalnych, między innymi, przez ekstrakcję rozpuszczalnikami lipofilowymi. NaleŜy pamiętać, Ŝe niektóre składniki nielipidowe, np. węglowodory, karotenoidy, woski równieŝ łatwo rozpuszczają się w rozpuszczalnikach hydrofobowych. Podczas ekstrakcji materiału liofilowymi rozpuszczalnikami, takŝe inne bardziej polarne substancje naturalne, zwłaszcza w obecności towarzyszących im średnio polarnych związków chemicznych, szczególnie przy zastosowaniu średnio i wyŝej polarnych rozpuszczalników organicznych przechodzą do roztworu. W roślinach lipidy są obecne przede wszystkim w nasionach i w miąŝszu niektórych owoców, a w organizmach zwierząt w róŝnych narządach lub jako wyodrębniona tkanka. Ze względu na budowę chemiczną lipidy moŝna podzielić na lipidy proste- estry kwasów tłuszczowych i alkoholi (lipidy właściwe oraz woski właściwe), lipidy złoŝone fosfolipidy, glikolipidy, lipidy pochodne, tzn. pochodne lipidów prostych i złoŝonych, powstałe przede wszystkim w wyniku ich hydrolizy Oznaczanie komponentów próbek zawierających lipidy Rozdzielenie składników ekstraktu zawierającego lipidy na poszczególne grupy jest współcześnie wykonywane głównie z zastosowaniem HPLC. Jest, mimo to, procesem trudnym i czasochłonnym. Bardzo duŝa rozpiętość polarności poszczególnych klas lipidów powoduje konieczność zastosowania co najmniej dwu składnikowego eluentu i najczęściej elucji gradientowej lub skokowej. 69

72 Chromatografia adsorpcyjna na Ŝelu krzemionkowym (kolumnowa i cienkowarstwowa) jest w tym celu, takŝe obecnie, bardziej powszechnie wykorzystywaną techniką rozdzielania. Stosuje się wypełnienia takie jak: Ŝel krzemionkowy, fluorisil, celulozy jonowymienne i lipofilowe Ŝele dekstranowe. Chromatografia adsorpcyjna przy uŝyciu kolumn wypełnionych Ŝelem krzemionkowym jest najbardziej powszechnie stosowaną i prawdopodobnie najlepszą, bo najtańszą techniką preparatywnego rozdzielania i oczyszczania lipidów. śel krzemionkowy jest adsorbentem stosunkowo polarnym. Niepolarne lipidy są adsorbowane przez złoŝe i mogą być efektywnie oddzielone od silniej adsorbowanych lipidów polarnych. W celu wymycia róŝnych klas lipidów przez kolumnę przepuszcza się rozpuszczalniki o rosnącej polarności. W tabeli 7 przedstawiono kolejność elucji poszczególnych klas lipidów z kolumny wypełnionej Ŝelem krzemionkowym. Tabela 7 Układy rozpuszczalników zalecane do frakcjonowanej elucji lipidów z kolumny wypełnionej aktywowanym Ŝelem krzemionkowym. Nr frakcji Faza ruchoma Klasa lipidów 1 1% eter etylowy/eter naftowy Parafiny 2 2% eter etylowy/eter naftowy Skwalen, woski, estry kwasów tłuszczowych 3 3% eter etylowy/eter naftowy Estry cholesterolu 4 4% eter etylowy/eter naftowy Triacyloglicerole, kwasy tłuszczowe 5 8% eter etylowy/eter naftowy Sterole 6 25% eter etylowy/eter naftowy Diacyloglicerole 7 100% eter etylowy Monoacyloglicerole 8 5% metanol/chloroform Ceramidy, kwas fosfatydowy, kardiolipiny 9 20% metanol/chloroform Fosfatydyloetanoloamina, fosfatydyloseryna, fosfatydyloinozytol 10 30% metanol/chloroform Fosfatydylocholina 11 50% metanol/chloroform Sfingomielina 12 70% metanol/chloroform Lizofosfatydylocholina Po rozdzieleniu, frakcje muszą zostać poddane analizie pod kątem obecności i zawartości poszczególnych grup lipidów w badanym materiale biologicznym. Do tego celu moŝna zastosować chromatografię cienkowarstwową na płytkach z Ŝelem krzemionkowym. Jako faza ruchoma najczęściej wykorzystywany jest układ 70

73 rozpuszczalników złoŝony z heksanu, eteru etylowego i kwasu octowego. Taki układ umoŝliwia rozdział triacylogliceroli, estrów steroli, estrów kwasów tłuszczowych i kwasów tłuszczowych. Natomiast bardziej polarne lipidy takie jak: glicerofosfolipidy i sfingolipidy pozostają na starcie. Do badania toŝsamości związków stosuje się równoległe rozwijanie substancji wzorcowych. Przykłady praktycznego zastosowania metod chromatograficznych w rozdzielaniu poszczególnych grup lipidów przedstawia tabela. 8 Na podstawie przedstawionych przykładów wynika, iŝ okres rozwoju badań nad lipidami skupiał się w latach 80-tych. Jednak problematyka zbyt długiego czasu i skomplikowanej analizy pozostała. Nadal wykorzystuje się najpierw separację polarnych lipidów od pozostałych. Rozdzielanie wstępne na płytkach TLC jest bardzo powszechne, lecz wiąŝe się z pracochłonnością. Po ekstrakcji z płytek rozdzielanych substancji, następuje ich transestryfikacja i oznaczanie z wykorzystaniem detektora FID [ ], lecz równieŝ, rzadziej stosowanego detektora spektrometrii mas [147, 148]. Ilościowe oznaczanie lipidów jest określane z wykorzystaniem chromatografii gazowej, gdzie następuje oznaczanie estrów metylowych kwasów tłuszczowych [149]. Chromatografia cieczowa jest równieŝ coraz częściej wykorzystywana do oznaczania jakościowego i ilościowego lipidów. Wykorzystuje się między innymi układ faz odwróconych, gdzie po wstępnej izolacji (2,6-di-tert-butylo-p-krezol, SPE kolumna DIOL, heksan: dichlorometan- 9:1 (v/v)) i transmetylacji, następuje rozdzielanie gradientowe (aceton: acetonitryl- 20:80 (v/v) do aceton: acetonitryl 45:55 (v/v) w 12 minut i aceton: acetonitryl 80:20 (v/v) w 60 minut) [150]. Zaczęto równieŝ stosować przy wstępnej izolacji filtry membranowe, które oddzielają produkty reakcji interestryfikacji, a te następnie są oznaczane, równolegle w układzie faz normalnych i odwróconych [151]. 71

74 Tabela 8 Przykłady praktycznego zastosowania metod chromatograficznych w rozdzielaniu lipidów Technika chromatograficzna Rozdzielane klasy lipidów Faza stacjonarna Faza ruchoma Detekcja Literatura SFC mono -, di -, tri - acyloglicerole SiO 2 CH 3 CO 2 FID 136 GC fused silica FID 137 HPLC lipidy niepolarne; kolejność elucji triacyloglicerole, gradient heksan: metanol (9:13 v/v) do diacyloglicerole, kwas stearynowy, wolne kwasy etanolu 70% FID 138 tłuszczowe, monoacyloglicerole lipidy niepolarne, a takŝe lipidy polarne tj. fosfatydyloetanoloaminy, lipoproteiny, fosfatydyloinozytol, fosfatydyloseryna, fosfatydylocholina, sfingomielina fosfatydyloetanoloaminy, izofosfatydylocholina, fosfatydyloinozytol, fosfatydyloseryna, fosfatydylocholina, sfingomielina fosfatydyloetanoloaminy, fosfatydyloglicerol, fosfatydyloseryna + triacyloglicerydy (nierozdzielone), fosfatydylocholina śel krzemionkowy heksan/izopropanol/h 2 O (6:8:0,75 v/v) do heksan/izopropanol/h 2 O (6:8:1,4 v/v) w 20 min. ACN/MeOH/ 85% H 3 PO 4 (130:5:1,5 v/v) lub ACN/MeOH/ 85% H 3 PO 4 (730:10:9 v/v) NH 2 A chloroform; B MeOH/ H 2 O (25:1 v/v) gradient liniowy od 0 do 80% B w 25 min. UV VIS 139 UV-VIS 140 FID 141 mono -, di -, tri - acyloglicerole ODS 80% B w 25 min. ACN/H 2 O = 67:33 (v/v) UV-VIS 142 fosfatydyloetanoloaminy, fosfatydyloglicerol, fosfatydyloseryna + triacyloglicerydy (nierozdzielone), fosfatydylocholina DIOL A acetonitryl; B acetonitryl/h 2 O (3,5:1 v/v); 4,2 min. izokratycznie A:B = 88:12 (v/v), a następnie gradient liniowy w 8 min. Do A:B = 25:75 (v/v) CN 90% A (acetonitryl) oraz 10% B acetonitryl/h 2 O (5:1 v/v); 90/10 A w B 5 min., a następnie gradient liniowy przez 12,5 min. do A:B =25:75 (v/v) UV-VIS

75 4.3 Polietyloglikole Glikol polietylenowy (PEG) i inne poliglikole o róŝnym stopniu spolimeryzowania mają coraz szersze zastosowanie. Są składnikami leków lub kosmetyków. Stosuje się je jako polarne fazy stacjonarne w chromatografii gazowej i są m.in., wykorzystywane do konserwacji drewnianych zabytków, zwłaszcza naraŝonych na działanie wody. Dokładne oznaczanie zawartości tych substancji w róŝnego typu analitach, a szczególnie łącznie z produktami przemian poliglikoli, m.in., w badaniach trwałości konserwacji drewna, jest powaŝnym problemem analitycznym, dalekim od pełnego opanowania. Drewno archeologiczne to drewno pozostające dłuŝszy czas w wilgotnej glebie, bądź pod wodą. Drewno znajdujące się dłuŝszy czas pod wpływem takich warunków, jest osłabione w wyniku działania bakterii degradujących ścianę komórkową drewna. Wypłukane zostają z niego wszystkie składniki rozpuszczalne w wodzie- sole mineralne, skrobia, garbniki, substancje nadające kolor. Po dłuŝszym okresie czasu zachodzi równieŝ hydroliza celulozy, pozostawiając jedynie sieć złoŝoną z ligniny. Drewno staje się bardziej porowate i przepuszczalne dla wody [152]. Standardowa procedura konserwacji drewna archeologicznego polega na kąpieli zabytku w roztworach PEG. Po wstępnym oczyszczaniu powierzchni przedmiotu zanurza sie go w gorącej (60-80 C) kąpieli w roztworach PEG o wzrastającym stęŝeniu polimeru i wzrastającej średniej masie molowej. Proces taki z reguły jest czasochłonny i w zaleŝności od wielkości konserwowanego przedmiotu moŝe trwać od pół roku do kilku lat. Jako rozpuszczalników, uŝywa się alkoholu, bądź wody. Najpowszechniej stosowane PEG do konserwacji to PEG o średniej masie molowej, od 3000 do 6000g/mol [153]. Glikol polietylenowy jest prostym polimerem liniowym o wzorze ogólnym: OH-(-CH 2 -CH 2 -O) m -CH 2 CH 2 -OH Szerokie zastosowanie PEG wiąŝe się z jego dobra rozpuszczalności w wodzie, jak i w rozpuszczalnikach organicznych tj. toluenie, chlorku metyleny, etanolu, acetonie. PowyŜsza właściwość spowodowana jest obecnością, sąsiadujących ze sobą, hydrofilowej grupy estrowej i hydrofobowej, etylenowej. Ponadto ustalono, Ŝe w temperaturze niŝszej od temperatury topnienia PEG, entropia mieszania się PEG 73

76 z wodą jest ujemna prawie w pełnym zakresie stęŝeń. Entropia rozpuszczania się PEG w wodzie jest równieŝ ujemna, niezaleŝne od masy molowej polimeru, w zakresie stęŝeń od ok. 90% do kilku% masowych PEG [154]. Do oznaczania glikoli polietylenowych moŝna wykorzystać miedzy innymi, spektroskopię w średniej podczerwieni z transformacją Fouriera [155], kolorymetrię [156], turbidymetrię [157] czy elektroforezę kapilarną [158]. Obecnie, jednak, do oznaczania PEG, powszechnie stosuje się chromatografię cieczową [ ]. 74

77 4.4 Ścieki z oksydacji asfaltów, jako przykład ścieków przemysłowych Asfalty powstają z naturalnego surowca, jakim jest ropa naftowa, a dokładnie z pozostałości próŝniowej po destylacji. W ramach pozyskiwania produktów o odpowiednich właściwościach uŝytkowych, czasami, asfalty poddaje się utlenianiu strumieniem powietrza (oksydacji asfaltów). Oksydacja asfaltów pozwala na lepsze wykorzystanie surowca, poniewaŝ w jej trakcie kierunek przemian biegnie według schematu: OLEJE śywice ASFALTENY LOTNE ZWIĄZKI ORGANICZNE i H 2 S Rysunek 12 Schemat przemian zachodzących w asfalcie w czasie procesu utleniania. MoŜna wyszczególnić trzy główne typy reakcji zachodzące w tym procesie, mające zasadniczy wpływ na końcowe właściwości produktu. Są to reakcje utleniania w czasie, których powstają kwasy karboksylowe, ketony, estry, alkohole i fenole. Drugim typem, są reakcje reformingowe, czyli cyklizacja, dealkilowanie i odwodornienie. Trzecim typem są reakcje kondensacji struktur aromatycznych, które biegną równolegle z dehydratacją tychŝe cząsteczek [163]. Proces oksydacji pozwala na podniesienie średniej masy molekularnej asfaltów, a co za tym idzie, poprawę ich właściwości uŝytkowych, jednak wiąŝe się z powstawaniem uciąŝliwych i o bliŝej nieznanym składzie ścieków. Oksydacja asfaltów polega na przepuszczeniu, przez podgrzany do temperatury C gudron, strumienia powietrza. Proces ten moŝna prowadzić w sposób okresowy, lub ciągły. W przypadku procesu okresowego, reaktor jest napełniany surowcem, następnie poddawany utlenianiu do uzyskania wymaganych parametrów. Natomiast w przypadku pracy ciągłej, surowiec jest podawany od góry reaktora, przeciwprądowo względem powietrza. W czasie procesu do reaktora wprowadzą się równieŝ wodę, która ma zapobiegać koksowaniu się asfaltu wewnątrz reaktora. Ze względu na egzotermiczny proces utleniania asfaltów wprowadzanie wody spełnia teŝ rolę regulacji temperatury. MoŜemy zidentyfikować trzy składowe strumienia gazu opuszczającego 75

78 reaktor- przegrzana para wodna, substancje będące lotnymi produktami rozkładu i utleniania składników surowca, jak i mgła olejowa porywana przez strumień gazu. [164, 165]. Strumienie gazowe powstające podczas oksydacji podlegają dalszej obróbce, oczyszczaniu bądź np. spalaniu. W przypadku ścieków z instalacji 1000 (instalacja 1000 oznaczenie zakładowe Grupy Lotos S.A.) kierowany jest na skruber, w którym myty jest wodą technologiczną. Powoduje to zatrzymanie mgły olejowej oraz mniej lotnych związków organicznych. Nie zatrzymane lotne składniki organiczne pochodzące ze z procesu oksydacji asfaltów, a takŝe H 2 S, SO 2 są spalane jak w innych wypadkach w dopalaczu. Powstające w ten sposób ścieki charakteryzują się odczynem lekko kwaśnym. Jako, Ŝe przepływ wody przez skruber jest ciągły, a woda nie jest recyrkulowana, powstający w ten sposób strumień jest dość duŝy i wynosi ok. 18 ton na godzinę. Na instalacji 1020 (instalacja 1020 oznaczenie zakładowe)- w skruberze prowadzone jest mycie powstających oparów 50%, wodnym roztworem ługu sodowego, co zwiększa efektywność usuwania związków o charakterze kwaśnym, a w szczególności siarkowodoru. Tego typu rozwiązanie zapewnia ograniczenie emisji SO 2 i SO 3 do powietrza. Niezabsorbowane niskowrzące substancje organiczne trafiają na dopalacz. Roztwór w skruberze jest recyrkulowany, co oznacza okresowe zrzuty ścieków jak i duŝo mniejsze zuŝycie wody. Powstałe ścieki zawierają zwiększoną ilość fazy organicznej, którą w znacznej części stanowi olej asfaltowy, a ścieki często są w postaci silnie zemulgowanej. W tabeli 9 przedstawiono parametry ogólne powyŝszych ścieków. 76

79 Tabela 9 Parametry ścieków z instalacji 1000 i Analizy wykonane w laboratorium LOTOS Lab Spka z o.o. Parametry Jednostka Instalacja 1000 Instalacja 1020 Wartość średnia Wartość maksymalna Wartość średnia Wartość maksymalna odczyn, ph - 5,3 8,0 11,2 13 Chemiczne zapotrzebowanie tlenu (BZT) Biochemiczne zapotrzebowanie tlenu (BZT 5 ) mg O 2 /dm 3 mg O 2 /dm 3 Substancje ropopochodne mg /dm azot amonowy (N-NH 4 ) mg /dm 3 5,2 8,3 84,3 330 Azot ogólny (Nog) mg /dm 3 14,1 28,0 155,8 297,0 zawiesina ogólna mg /dm 3 307, , indeks fenolowy mg /dm 3 8,2 22,0 38,6 86 siarczki (-S) mg /dm 3 4,8 45,0 1073,7 3770,0 siarczany (--SO 4 ) mg /dm 3 134,0 134,0 - - fosfor całkowity mg /dm 3 3,5 11,9 20,8 30,0 azotany mg /dm 3 6,3 6,3 - - azotyny mg /dm 3 0,12 0, chrom mg /dm 3 0,1050 0,1800 0,2209 0,7400 nikiel mg /dm 3 0,1908 0,4620 0,4253 1,55 cynk mg /dm 3 0,0250 0,0400 0,0805 0,1920 wanad mg /dm 3 0,0577 0,0960 0,0467 0,0700 miedź mg /dm 3 0,0305 0,0500 0,1200 0,2600 ogólny węgiel organiczny OWO (TOC) substancja ekstrahujące się eterem naftowym mg /dm 3 553,7 880,0 5755, mg /dm 3 568,0 641,0 2956, Niestety wraz z powstającymi ściekami do powietrza emitowane są opary. NaleŜy podkreślić, iŝ istnieje róŝnica pomiędzy oparami emitowanymi z fazy wodnej, i z fazy olejowej. W skład fazy olejowej wchodzą w znacznej części nierozpuszczalne w wodzie alkany oraz długołańcuchowe alkohole. Główną część masy fazy olejowej stanowią składniki charakterystyczne dla pozostałości próŝniowej, czyli olej asfaltowy, Ŝywice i w niewielkiej ilości asfalteny. 77

80 Sposoby postępowania ze strumieniem gazu opuszczającym odoranty opiera się głównie na analizie sensorycznej. Coraz częstsze zastosowanie mają tzw. "nosy elektroniczne", które zastępują węch ludzki z jednocześnie obniŝonym progiem wykrywalności. Wysoka cena zestawu czujników, niewystarczająca czułość i selektywność, a takŝe konieczność stosowania równocześnie wielu czujników o róŝnej selektywności ogranicza ich przydatność. Do niedawna uwaŝano, Ŝe jedyną wiarygodną metodą oznaczeń emisji i imisji odorów, oraz skuteczności dezodoryzacji jest analiza sensoryczna bezpośrednie oceny wraŝeń węchowych, wykonywane w standardowych warunkach przez odpowiednio liczne grupy ludzi. Nowoczesne elektroniczne nosy są coraz częściej wykorzystywane do badań jakości artykułów spoŝywczych, w przemyśle farmaceutycznym i kosmetycznym. Są jednak uŝyteczne równieŝ podczas pomiarów stopnia zanieczyszczenia ścieków, procesowych gazów odlotowych, wody i powietrza. Najczęściej stosowanymi metodami pomiarów odorometrycznych są metody rozcieńczeń (czystym powietrzem lub czystą wodą, w zaleŝności od rodzaju badanej próbki). Określa się w ten sposób "odległość" od progu wyczuwalności. Badania próbek, zawierających ilość odorantów powyŝej wartości nadprogowej, obejmują pomiary stęŝeń oraz oceny jakościowych cech wraŝenia- intensywność, rodzaj, oraz stopień odczuwanej niechęci. NaleŜy podkreślić, Ŝe analiza odoru na drodze analitycznej i oznaczanie zawartości odorantów w ściekach, jest rzadko wykonywana ze względu na ilość związków chemicznych w odorach, a szczególnie z powodu trudności ich identyfikacji. 78

81 5 Uzasadnienie celowości podjętych badań i stosowanych technik i metod badawczych Przedstawione powyŝej wymagania, przykłady zastosowań, przesłanki i argumenty, uzasadniają celowość dalszych badań nad poznaniem optymalnych zasad i warunków wykorzystania chromatografii, w tym wysokosprawnej chromatografii cieczowej, do rozdzielania i oznaczania składu grupowego i szczegółowego skomplikowanych mieszanin substancji, w takich materiałach, jak specyfiki farmaceutyczne, lipidy i ich pochodne, w tym estry metylowe kwasów tłuszczowych, glikole polietylenowe, w ich zastosowaniu do konserwacji drewna, czy ścieki powstające podczas oksydacji asfaltów. Przy czym, badania nie powinny ograniczać się tylko do opanowania optymalnych warunków rozdzielania, ale równieŝ do optymalizacji techniki i warunków identyfikacji składników, grup składników oraz detekcji i kalibracji. JednakŜe, problemowi rozdzielania naleŝy poświęcić szczególną uwagę, poniewaŝ to rozdzielenie decyduje o moŝliwości identyfikacji i oznaczenia. Na podstawie wykonanych badań powinny zostać opracowane odpowiednie ogólne reguły postępowania analitycznego, a na tej bazie odpowiednie procedury analityczne, bądź powinny zostać zebrane informacje umoŝliwiające ich opracowanie. Przedmiotem badań tej pracy jest przede wszystkim opracowanie nowych, selektywnych warunków rozdzielania mieszanin o skomplikowanym składzie. To powinno zapewnić opracowanie, w ramach niniejszej pracy, nowych procedur zastosowania techniki chromatografii cieczowej w analityce technicznej i procesowej, tzn. w kontroli jakości i kontroli procesów produkcji materiałów, a takŝe w kontroli procesów degradacji oraz identyfikacji skaŝeń środowiska. W związku z tym, w drugiej kolejności i w ograniczonym zakresie, postanowiono zająć się w tej pracy problemem detekcji i kalibracji. Procedury analityczne opracowane w ramach niniejszej rozprawy powinny zostać w ten sposób przygotowane by z powodzeniem zastąpiły, niezwykle czasochłonne i kosztowne w realizacji, procedury stosowane dotychczas. NajwaŜniejszą zaletą opracowanych procedur będzie krótki czas oznaczania i moŝliwość stosowania powszechnie dostępnych detektorów refraktometrycznego (RI), a takŝe spektrofotometrycznego z matrycą fotodiodową (UV-DAD). 79

82 Wyniki badań powinny, pozwolić uzyskać takŝe waŝne informacje i dane o charakterze poznawczym w zakresie adsorpcji i chromatografii w szeroko pojętym znaczeniu, zarówno analitycznym, jak równieŝ dla problemu identyfikacji, detekcji czy oznaczania indywiduów i grup substancji. 80

83 6 Cel pracy i cele cząstkowe Celem pracy jest opracowanie nowych procedur stosowania chromatografii cieczowej do rozdzielania i oznaczania składu skomplikowanych mieszanin analitów. Cele cząstkowe pracy to: 1. Opracowanie ogólnych zasad przygotowania próbki i analityki oraz wybranych standardowych procedur, umoŝliwiających oznaczanie składu wieloskładnikowych materiałów, bądź analitów, uwzględniających etap przygotowania próbki, rozdzielania i oznaczenia, a takŝe identyfikacji składników i grup składników ; 2. Zbadanie celowości i skuteczności wykorzystania przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie chromatograficznej i koncepcji Synoviec a, opracowanie własnych jej modyfikacji ; 3. Zbadanie przydatności układu wielokolumnowego chromatografu cieczowego, z zastosowaniem przełączania kolumn i przepływu zwrotnego eluentu, do rozdzielania i oznaczania tego rodzaju analitów. Badania zostaną wykonane dla następujących próbek, z uwzględnieniem następujących celów szczegółowych : A. Specyfiki farmaceutyczne - Dobór najbardziej efektywnej techniki i warunków roztwarzania składników Ŝeli, maści, oraz kremów w róŝnego typu rozpuszczalnikach z wykorzystaniem ultradźwięków oraz mikrofal, z uwzględnieniem wpływu takich czynników, jak temperatura i mechaniczne wytrząsanie; - Opracowanie procedur rozdzielania i oznaczania składu specyfików farmaceutycznych, w tym szczególnie, dobór selektywnych chromatograficznych układów rozdzielczych; - Zbadanie przydatności stosowania przepływu zwrotnego do elucji składników silnie oddziałujących z fazą stacjonarną; - Zaproponowanie ogólnego schematu ideowego postępowania analitycznego, zapewniającego wykonanie analizy składu specyfików farmaceutycznych. 81

84 B. Lipidy i ich pochodne - Zbadanie, z zastosowaniem techniki planarnej chromatografii cieczowej (TLC), zmian selektywności rozdzielania grupowego lipidów i ich pochodnych w układach adsorpcyjnych faz normalnych (NP), z wykorzystaniem aktywowanych płytek chromatograficznych bez wcześniejszej aktywacji, a takŝe wpływu dodatku kwasów do eluentów na rozdzielanie niektórych pochodnych lipidów; - Opracowanie selektywnych procedur, umoŝliwiających oznaczanie zanieczyszczeń w postaci mono-, di-, tri- acylogliceroli, bądź kwasów tłuszczowych, polioksygliceroli, gliceryny w tłuszczach i estrach metylowych kwasów tłuszczowych (FAME), z wykorzystaniem wysokosprawnej kolumnowej chromatografii cieczowej (HPLC) w układach faz normalnych (NP), techniki chromatografii wykluczania oraz techniki planarnej chromatografii cieczowej z detektorem płomieniowo- jonizacyjnym (TLC- FID); - Zbadanie moŝliwości wykorzystania przepływu zwrotnego do elucji grupowej silnie oddziałujących z adsorbentem składników w mieszaninie lipidów. C. Glikole polietylenowe (PEG) - Opracowanie procedury rozdzielania i oznaczania polietyloglikoli w drewnie poddanego procesowi konserwacji, z wykorzystaniem chromatografii wykluczania (SEC/GPC) i chromatografii wykluczania z oddziaływaniami adsorpcyjnymi, w podwyŝszonej temperaturze- wysokotemperaturowa chromatografia wykluczania (HT- SEC/GPC); - Opracowanie wstępnych warunków analityki dotyczącej określenia powstałych składników oraz stopnia degradacji termicznej PEG z zastosowaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej oddziaływań hydrofilowych (HILIC), z wykorzystaniem, dodatkowo, zasad spektrofotometrii i detektora UV- VIS typu DAD; - Wykorzystanie koncepcji Synoviec a do bezkalibracyjnego oznaczania polietyloglikoli 400 i 4000 w ekstraktach drewna konserwowanego i zbadanie w ten sposób efektowności selektywnej izolacji poszczególnych frakcji PEG w róŝnych warunkach ekstrakcji (przygotowania próbki do badań). 82

85 D. Ścieki powstające podczas oksydacji asfaltów - Identyfikacja składników odorotwórczych ścieków z wykorzystaniem techniki chromatografii gazowej sprzęŝonej ze spektrometrią mas (GC- MS); - Zbadanie moŝliwości wykorzystania wysokosprawnej chromatografii cieczowej, z zastosowaniem przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie do rozdzielania grupowego i analityki procesowej ścieków powstających podczas oksydacji asfaltów, w procesie ich pre- oczyszczania; - Zbadanie moŝliwości wykorzystania chromatografii gazowej z detektorem FID oraz opracowanie optymalnych warunków analitycznych rozdzielania i oznaczania składu lotnych składników ścieków powstających w procesie oksydacji asfaltów; - Opracowanie procedury analitycznej umoŝliwiającej określanie efektywności oczyszczania ścieków, jak równieŝ określenie stopnia redukcji złowonności najwaŝniejszych, lotnych składników organicznych, przyczyn ich powstawania w nielotnym materiale asfaltowym, fazy gazowej wydzielanej podczas nalewu asfaltów do cystern; - Wykorzystanie koncepcji Synoviec a w oznaczaniu grupowym składników ścieków. 83

86 7 Część doświadczalna 7.1 Materiały Rozpuszczalniki i eluenty n heksan do HPLC Merck (Niemcy), dichlorometan cz.d.a. POCH (Polska), dichlorometan do HPLC Merck (Niemcy), 2-propanol P.P.H. Standard (Polska), formamid cz.d.a. POCH (Polska), tetrahydrofuran do HPLC Merck (Niemcy), metanol cz.d.a. POCH (Polska), metanol czystości gradient grade Merck (Niemcy), acetonitryl czystości ultra gradient grade Merck (Niemcy), kwas trifluorooctowy czystości gradient grade Merck (Niemcy), kwas octowy cz.d.a. POCH (Polska), dimetylosulfotlnek POCh (Polska), woda dejonizowana otrzymana z urządzenia Mili Q produkcji Milipore (USA) Substancje i roztwory wzorcowe i próbki badane - etylobenzen POCh (Polska), o- nitroanilina POCh (Polska), ester etylowy/ metylowy/propylowy kwasu 4- hydroksybenzoesowego Merck (Niemcy), o-ksylen POCh (Polska), 1- metylonaftalen Merck (Niemcy), cykloheksan POCh (Polska) - kwas benzoesowy POCh (Polska), 1-naftyloamina POCh (Polska), 8-hydroksychinolina POCh (Polska) - koronen Merck (Niemcy), benzen Merck (Niemcy), benzo(g,h,i)perylen Merck (Niemcy), mieszanina kalibracyjna zawierająca naftalen, acenaftylen, acenaften, fluoren, fenantren, antracen, fluoranten, piren, benzo(a)antracen, chryzen, benzo(b)fluorantenu, benzo(k)fluorantenu, benzo(a)pirenu, dibenzo(a,h)antracen, indeno(1,2,3-cd)piren, benzo(g,h,i)perylen, o stęŝeniu 2000 µg/ml kaŝdego z wzorców Supelco (USA), chlorek sodu POCh (Polska), benzo(e)piren, benzo(j)fluoranten Merck (Niemcy); - dwa specyfiki farmaceutyczne- maść i Ŝel, w których skład wchodziły substancje zestawione w tabeli 10 (dostarczone przez firmę Oceanic); 84

87 Tabela 10 Składniki specyfików farmaceutycznych SPECYFIK 1 SPECYFIK 2 fosforan kindamycyny alantoina carbopol 934P glikol propylenowy makrogol, Renex PEG 400 woda diklofenak dietyloamina alkohol izopropylowy eter cetostearylowy makrogolu carbopol glikol propylenowy korkozylokaprylokapronian olej parafinowy woda - wzorce glikoli polietylenowych 400 Da i 4000 Da, POCh (Polska), Hostacor substancja antykorozyjna, dostarczone przez Centralne Muzeum Morskie w Gdańsku (CMMG); - próbki ekstraktów z drewna łodzi konserwowanej w CMMG; - kwasy tłuszczowe po odwodnieniu, emulgator, estry metylowe kwasów tłuszczowych, tłuszcze: palma rafinowana, palma bielona, olej palmowy dostarczone przez firmę ZPT OLVIT (Gdańsk); - kwas octowy POCh (Polska), kwas mlekowy POCh (Polska),, alkohol etylowy POCh (Polska), 2-butanon (MEK) POCh (Polska),, cykloheksanon POCh (Polska), fenol POCh (Polska), cykloheksanol POCh (Polska), aldehyd benzylowy POCh (Polska), eter metylowo- tertbutylowy (MTBE) Merck (Niemcy), dibenzotiofen Merck (Niemcy), kwas ortofosforowy POCh (Polska); - próbki ścieków z instalacji oksydacji asfaltów 1020, 1000 dostarczone przez Grupę Lotos S. A. (Gdańsk); Kolumny chromatograficzne, płytki TLC Eurospher 100 CN, 7 µm, 250 mm x 4 mm Knauer (Niemcy), LiChrospher 100 RP 18e, 5 µm, 250 mm x 4 mm Merck (Niemcy), Chromaolith 100 RP 18e monolityczna, 50 mm x 2 mm Merck (Niemcy), LiChrospher100 RP-18, 3 µm, 125 x 4 mm (MERCK Niemcy), HP Cartridge, Lichrospher 100, -CN 5µm (Hewlett Packard); analityczne kolumny do chromatografii wykluczania LiChrogel PS 1 i PS 4, 5 µm,

88 x 7 mm, Merck (Niemcy), preparatywna kolumna do chromatografii wykluczania LiChrogel PSMIX, 10 µm, 250 mm x 25 mm, Merck (Niemcy), LiChrogel PSMIX, PS1 oraz PS4 250 mm x 7 mm, Merck (Niemcy), semipreparatywna kolumna LiChrospher Si60, 10 µm, 250 x 16 mm (pakowana w zespole prof. M. Kamińskiego), Nucleosil 50, 3µm, 250x4mm, (pakowana w zespole prof. M. Kamińskiego), kolumna analityczna HPLC dedykowana do rozdzielania WWA: Spherisorb PAH, 5 µm, 250 mm x 4.6 mm Waters (USA), płytki szklane do HPTLC CN F254 S Merck (Niemcy), płytki aluminiowe do TLC, Si60, F254 Merck (Niemcy), o wymiarach 20 x 20cm, pręciki Chromarod Si III, produkcji IATRON LABORATORIES, INC (Japonia) Aparatura i wyposaŝenie dodatkowe - Gradientowy chromatograf cieczowy LaChrom Merck-Hitachi (Niemcy) wyposaŝony w: czterokanałowy system elucji gradientowej z zaworami proporcjonującymi (tzw. gradient niskociśnieniowy), pompę L-7100, zawór dozujący Rheodyne Rh-7725i z pętlą dozującą 20 µl, kolumnę chromatograficzną, termostat L-7350 z systemem chłodzenia 7350i, detektor refraktometryczny L-7490, detektor UV- DAD 7450A, oprogramowanie HSM oraz, dodatkowo, w sześciodrogowy, dwupołoŝeniowy zawór V 7226 Knauer (Niemcy) do przełączania kierunku przepływu eluentu w kolumnie; - Gradientowy chromatograf cieczowy LaChrom Merck-Hitachi (Niemcy) wyposaŝony w: czterokanałowy system do elucji gradientowej z zaworami proporcjonującymi (tzw. gradient niskociśnieniowy), pompę L-6200, zawór dozujący Rheodyne Rh-7725i z pętlą dozującą 50 µl, kolumnę chromatograficzną, termostat, detektor UV DAD 7450A, detektor fluorescencyjny F 1050, oprogramowanie HSM oraz, dodatkowo, w sześciodrogowy dwupołoŝeniowy zawór V 7226 Knauer (Niemcy), do zmiany kierunku przepływu fazy ruchomej w kolumnie (backflash); - Chromatograf cieczowy wyposaŝony w: pompę model 300C Gynkotek (Czechy), zawór dozujący Rheodyne Rh-7725i z pętlą dozującą 100 µl, kolumnę do chromatografii Ŝelowej, detektor refraktometryczny Waters (Czechy), integrator D Merck-Hitachi (Niemcy); - Gradientowy chromatograf cieczowy LaChrom Ultra (VWR-Hitachi) wyposaŝony w dwie pompy L-2100, dozownik repetycyjny (autosampler) L- 2200, termostat do kolumn L-2300, detektor UV L-2400 oraz system akwizycji i analizy danych dla zestawu LaChrom Ultra Chrom Elite Merck (Niemcy); 86

89 - Automatyczny dozownik próbek Ses 3200/IS-01, suszarka Rod Dryer TK-8, aparat Iateoscan MK-5 produkcji Iatro (Japonia), przetwornik analogowo-cyfrowy do rejestracji chromatogramów i program komputerowy do integracji powierzchni pików; KF Coulometr Metrohm, 703 Ti Stand Metrohm (Szwajcaria); - ph- metr Microprocessor ph/mv/ C Meter, KI8817 Hanna (USA), elektrody BlueLine Schott (Niemcy); - Łaźnia ultradźwiękowa model XL 2020 Sonificator Misonix (USA); - Aparat do ekstrakcji wspomaganej promieniowaniem mikrofalowym MARS 5 CEM (USA); - Zestaw do ekstrakcji Soxhleta Labart (Polska); - Wyparka obrotowa Heidolph (Niemcy); - Wytrząsarka, Grant GSL4000, Wolf Laboratories (Wielka Brytania); - Wirówka Biofuge 28RS, Heraeus Sepatech Kendro (USA); - Zestaw do odparowywania nadmiaru rozpuszczalnika w strumieniu azotu, w skład, którego wchodzą: butla z gazem obojętnym (N 2 ), pokrywa firmy J.T.Baker (Niemcy) wykonana z poliamidu, wyposaŝona w igły oraz podłączenie gazu; metalowy statyw, w którym umieszcza się kolbki z ekstraktem, wypływ azotu, umieszczone nad powierzchnią odparowywanej cieczy; - Zestaw komór do rozwijania chromatogramów cienkowarstwowych na pręcikach lub płytkach TLC IATRON LABORATORIES INC. (Japonia); 87

90 7.2 Metody postępowania Wyznaczanie czasu i objętości martwej kolumn chromatograficznych Czas martwy t 0 wyznaczono dla kaŝdej ze stosowanych kolumn HPLC, jako czas retencji piku 50 µl powietrza w przypadku kolumn pracujących w układzie faz normalnych, bądź piku wodnego roztworu azotanu sodu (5mg/ml), w przypadku kolumn do układów faz odwróconych Wyznaczanie sprawności kolumn chromatograficznych Testowanie sprawności kolumn chromatograficznych wykonano w warunkach przedstawionych w tabeli 11. Tabela 11 Warunki wyznaczenia sprawności kolumn Skład i stęŝenie mieszaniny testującej Eluent Temperatura [ C] Objętościowe natęŝenie fazy ruchomej [ml/min.] Detekcja Kolumny RP etylobenzen 0,097 mg/ml o- nitroanilina 0,062 mg/ml ester etylowy kwasu 4-hydroksybenzoesowego 0,031 mg/ml ester propylowy kwasu 4- hydroksybenzoesowego 0,031 mg/ml metanol: woda 60:40 (v/v) 25 1ml/min dla kolumn o średnicy 4 i 4,6 mm; 4,5 ml/min dla kolumn preparatywnych UV- VIS typu DAD 254nm Kolumny NP o-ksylen 1,247mg /ml 1-metylonaftalen 0,705mg/ml fenantren 0,102mg /ml cykloheksan 45,807mg/ml heksan:dioksa n 85:15 (v/v) 25 1ml/min dla kolumn o średnicy 4 i 4,6 mm; UV- VIS typu DAD 254nm 4,5 ml/min dla kolumn preparatywnych Sprawność kolumn chromatograficznych w postaci liczby półek teoretycznych (N) obliczono na podstawie zaleŝności , a współczynnik asymetrii (A S ) na podstawie zaleŝności N = 5,545 (l R / w 1/2 ) 2 [ ] A S (0,1) / (0,5) = b/a [ ] 88

91 gdzie: l R - odległość maksimum piku od momentu dozowania; w 1/2 - szerokość piku w połowie wysokości (obliczona na podstawie chromatogramu); b- szerokość piku wyznaczona odpowiednio w 10% i 50% wysokości piku od strony zstępującej do osi piku (linii pionowej rzutowanej z wierzchołka); a- szerokość piku wyznaczona odpowiednio w 10% i 50% wysokości piku od strony wstępującej do osi piku Przepływ zwrotny eluentu w kolumnie chromatograficznej Procedura oznaczania wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych Izolacja wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych z próbek asfaltów W przypadku oznaczania zawartości wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych w próbkach asfaltów i podobnych produktach naftowych, zawierających bardzo duŝy nadmiar podstawionych alifatycznie tzw. PCA, konieczne jest zastosowanie specjalnej procedury przygotowania próbki, zapewniającej usunięcie substancji przeszkadzających oraz wzbogacenie analitów (przygotowanie próbki do analizy), przed końcowym oznaczaniem. Izolację analitów z próbek asfaltów wykonano według procedury opracowanej w ramach rozprawy doktorskiej Gilgenast [166]. W I- szym etapie przygotowania próbki zastosowano preparatywną kolumnę Lichrogel PS MIX, 250x25.4mm, dp=10µm, dichlorometan jako eluent oraz szeregowo połączone detektory: refraktometryczny i UV- VIS/ DAD. Granice elucji analitów z grupy WWA wyznaczono w oparciu o wartości czasu retencji koronenu i benzenu. Roztwory produktów naftowych w dichlorometanie (stęŝenie roztworów: 0,05g/ml) zmieszano w stosunku objętościowym 1:1 z roztworem wzorców koronenu i benzenu o stęŝeniu 0,025 g/ml w dichlorometanie. Wszystkie roztwory rozdzielano w temperaturze 20 C. Objętościowe natęŝenie przepływu fazy ruchomej wynosiło 4,5 ml/min- warunki chromatografii w skali semipreparatywnej. Objętość dozowanej próbki wynosiła 600 µl. Doświadczalnie wyznaczono opóźnienie transportowe między naczynkiem detektora refraktometrycznego, a wylotem z kapilary odprowadzającej eluat. Czas ten wynosił 3s. 89

92 Zbierano niskomolekularną frakcję zawierającą m. in. anality z grupy WWA, w zakresie elucji koronenu oraz benzenu, uwzględniając czas opóźnienia transportowego. Usuwano w ten sposób z próbki wszystkie składniki o masie molekularnej wyŝszej od koronenu. W celu usunięcia polarnych składników z frakcji zebranej w warunkach chromatografii wykluczania, poddano ją adsorpcji w warunkach kolumnowej chromatografii cieczowej układu faz normalnych. Frakcję uzyskaną w warunkach wykluczania odparowano do sucha w strumieniu azotu, w temperaturze pokojowej, a następnie rozpuszczono w 840 µl n-heksanu. Zastosowano semipreparatywną kolumnę o wymiarach 200x16,8 mm, oraz szeregowo połączone detektory UV- VIS typu DAD (długość fali λ = 254 nm) i detektor refraktometryczny. Zakres elucji związków z grupy WWA, wyznaczono w oparciu o czas retencji naftalenu i dibenzo(a, h)antracenu (modyfikacja w stosunku do procedury [166], gdzie zamiast dibenzo(a, h)antracenu stosowano koronen, natomiast zamiast naftalenu stosowano benzen), w temperaturze 20 C, z n-heksanem jako eluentem. Objętościowe natęŝenie przepływu fazy ruchomej wynosiło 4,5 ml/min, a objętość dozowanej próbki 700 µl. Tak, jak w przypadku chromatografii wykluczania, wyznaczono czas opóźnienia transportowego, który był pomijalnie mały. Zbierano frakcje w zakresie elucji początku piku naftalenu oraz końca piku dibenzo(a, h)antracenu uzyskując w ten sposób próbkę zawierającą anality z grupy WWA, ale pozbawioną balastowych, bardzo nisko polarnych węglowodorów alifatycznych i monoaromatycznych oraz wysokopolarnych składników materiałów badanych na zawartość WWA. Po czasie 15 minut przełączano zawór przepływu zwrotnego (EBF), zapewniając w ten sposób elucję z kolumny wszystkich silnie sorbowanych do powierzchni fazy stacjonarnej składników próbki i utrzymywanie niezmiennej powierzchni sorpcyjnej Procedura oznaczania WWA W ramach niniejszej rozprawy doktorskiej zmodyfikowano procedurę rozdzielania wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych, w stosunku do metodyki opracowanej przez Gilgenast [166]. Modyfikacja polegała na zastosowaniu trójskładnikowej fazy ruchomej: metanol, acetonitryl i woda, zamiast dotychczas stosowanej fazy dwuskładnikowej acetonitryl- woda. Zastosowano kolumnę typu 90

93 RP- 18 dedykowanej rozdzielaniu WWA (PAH). Rozdzielanie prowadzono w warunkach elucji skokowej ACN:MeOH:H 2 O 50: 20: 30 (v/v/v)- 10 minut, ACN:MeOH:H 2 O 65: 15: 20 (v/v/v)- 5minut i ACN:MeOH:H 2 O 100: 0: 0 (v/v/v)- 7 minut. Temperatura analizy to 30 C. Łączny czas rozdzielania wynosił 22 minuty. Wartości współczynników retencji (k) oraz współczynnik rozdzielenia (α) obliczano z zaleŝności odpowiednio i : k i = (t i t 0 )/ t 0 [ ], α = k j /k i [ ], gdzie: t i - czas retencji substancji i ; t 0 - czas martwy kolumny; k i, k j - współczynnik retencji, odpowiednio substancji później (j) i wcześniej (i) eluowanej. Identyfikację związków z grupy WWA obecnych w analizowanych próbkach oparto o: - porównanie czasu retencji odpowiednich pików na chromatogramach z wartością czasu retencji substancji wzorcowych. - porównanie widm w zakresie od 220 nm do 500 nm, w tym długości fali maksimum widm poszczególnych pików z widmami wzorców z grupy WWA Procedura badania efektywności stosowania przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie w układach faz odwróconych (RP) W badaniach nad efektywnością stosowania przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie w układzie faz odwróconych wykorzystano hydrofobowy, obojętny chemicznie związek- ester propylowy kwasu 4-hydroksybenzoesowego, jak równieŝ związek kwasowy- kwas benzoesowy. Zbadano rozpuszczalność wyŝej wymienionych związków, w eluentach umieszczonych w tabeli 12, przygotowując 2 ml nasyconych roztworów kwasu benzoesowego oraz estru propylowego kwasu 4-hydroksybenzoesowego. Próbki następnie poddano wirowaniu (5000 obr./min., 5 minut), zdekantowano i otrzymane roztwory rozcieńczono 50- krotnie (próbki stosowane do badań). Suchą pozostałość suszono w 100 C do stałej 91

94 masy. Wysuszone substancje zwaŝono i wyznaczono rozpuszczalność poszczególnych analitów. Przygotowane roztwory poddano analizie chromatograficznej z zastosowaniem kolumny typu RP- 18e 5µm 125x4mm oraz eluentów zestawionych w tabeli 12. Tabela 12 Zestawienie warunków rozdzielania stosowanych podczas badania retencji estru propylowego kwasu 4- hydroksybenzoesowego oraz kwasu benzoesowego w przepływie zwrotnym w kolumnie RP. Kolumna chromatograficzna Temperatura [ C] Objętościowy przepływ fazy ruchomej Związek chemiczny Eluent (v/v) ACN:H2O 5:5 ph=2,7 CH3COOH RP-18e 5µm 125x 4 mm 30 C 1,5 ml/min kwas benzoesowy ester propylowy kwasu 4- hydroksybenzoe sowego ACN:H2O 4:6 ph=2,7 CH3COOH ACN:H2O 2:8 ph=2,7 CH3COOH ACN:H2O 5:5 ACN:H2O 4:6 ACN:H2O 2:8 Na podstawie otrzymanych chromatogramów obliczono współczynniki retencji dla badanych związków i wykreślono zaleŝność: ln(k)=f(x) [ ] gdzie x- ułamek rozpuszczalnika o wyŝszej sile elucji, wchodzącego w skład eluentu. Na podstawie powyŝszej zaleŝności wybrano do badań eluenty tak, aby współczynnik retencji badanych związków chemicznych wynosił 5; oraz był bardzo wysoki. Wybrano warunki, dla których współczynnik retencji badanych substancji wynosił 5 oraz mieścił się w granicach Dla takich warunków rozdzielano porównywano powierzchnie pików substancji analizowanych bez i z zastosowaniem przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie. W badaniach wykorzystano detektor spektrofotometryczny z matrycą fotodiodową, który dzięki wysokiej czułości pozwolił na dokładne określenie początku i końca pików chromatograficznych otrzymanych w warunkach zwykłej elucji i w warunkach przepływu zwrotnego. 92

95 Odzysk obliczona jako stosunek stęŝenia substancji badanej otrzymanej podczas rozdzielania chromatograficznego z zastosowaniem EBF i bez zastosowania EBF. Przy czym stęŝenie substancji otrzymanej w przepływie zwrotnym obliczono ze wzoru: c i =F i k i [ ] gdzie: k i = (k i t Ri )/t Ri [ ] c i -stęŝenie substancji otrzymanej bez stosowania EBF, c i i -stęŝenie substancji otrzymanej ze stosowaniem EBF, k i - współczynnik kalibracji dla substancji badanej w układzie bez stosowania EBF, k i - współczynnik kalibracji dla substancji badanej w układzie ze stosowanym EBF, F i - powierzchnia piku substancji otrzymanej ze stosowaniem EBF, t Ri czas retencji dla środka cięŝkości piku substancji otrzymanej bez stosowania EBF, t Ri czas retencji dla środka cięŝkości piku substancji otrzymanej ze stosowaniem EBF, PowyŜsze wartości przedstawiono graficznie na rysunku 13. Rysunek 13 Przykładowe chromatogramy rozdzielania substancji bez i z zastosowaniem EBF Procedura badania efektywności stosowania przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie w układach faz normalnych (NP) Do badania efektywności stosowania przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie w układach faz normalnych wykorzystano α- naftyloaminę oraz 8- hydroksychinolinę. 93

96 Procedura postępowania w przypadku badań w układach faz normalnych była taka sama jak w układach faz odwróconych. Warunki elucji stosowane w tych badaniach przedstawiono w tabeli poniŝej. Tabela 13 Zestawienie warunków badania retencji α- naftyloaminy i 8- hydroksychinoliny z zastosowaniem przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie NP. Kolumna chromatograficzna Temperatura [ C] Objętościowy przepływ fazy ruchomej Związek chemiczny Eluent α- naftyloamina SiO 2 5µm 250x 4 mm 30 C 1,5 ml/min 8- hydroksychinolina heksan: izopropanol 90:10 (v/v) heksan: izopropanol 95:5 (v/v) heksan: izopropanol 98:2 (v/v) Na podstawie otrzymanych chromatogramów obliczono współczynniki retencji dla analizowanych związków, a następnie wykreślono zaleŝność. ln(k)=f(x) [ ] gdzie: x- ułamek molowy rozpuszczalnika bardziej polarnego wchodzącego w skład eluentu. Odysk obliczono, podobnie jak w przypadku układu faz odwróconych, jako stosunek stęŝeń substancji poddawanych analizie chromatograficznej bez i z zastosowaniem EBF. StęŜenia wyznaczono na podstawie powierzchni pików, przy uwzględnieniu poprawki opisanej w rozdziale

97 7.2.4 Specyfiki farmaceutyczne Badanie rozpuszczalności składników oraz produktów. W celu zbadania rozpuszczalności składników specyfików farmaceutycznych oraz specyfików, do rozpuszczalników róŝnego typu, dodawano stopniowo komponenty badanych próbek lub produkty (do 5ml po 10mg substancji). W badaniach uwzględniono następujące rozpuszczalniki: woda, acetonitryl, tetrahydrofuran, dichlorometan, metanol, izopropanol, formamid, heksan. Badaniom poddano równieŝ szybkość rozpuszczania biorąc pod uwagę takie techniki roztwarzania, jak wytrząsanie, homogenizacja mechaniczna w warunkach wysokich prędkości ścinania, zastosowanie ultradźwięków, mikrofal. Wykorzystane techniki i badane warunki zestawiono w tabeli 14. Tabela 14 Typy ekstrakcji i warunki stosowane w badaniach nad szybkością rozpuszczania próbek rzeczywistych. Typ ekstrakcji Rozpuszczalnik Temperatura Czas Ekstrakcja w aparacie soxhleta woda 90 C 1, 2 godziny Maceracja z wytrząsaniem woda 50 C 4, 7, 15 godziny Ekstrakcja wspomagana ultradźwiekami (w łaźni ultradźwiękowej) woda 90 C 3, 5, 7 minut Ekstrakcja wspomagana mikrofalami woda 90 C 3, 5, 7 minut Homogenizacja woda 90 C 3, 5, 7 minut Efektywność zastosowanych technik oceniano na podstawie sumy powierzchni wszystkich pików chromatograficznych. W tym celu zastosowano ultraszybką chromatografię cieczową w układzie faz odwróconych z wykorzystaniem kolumny monolitycznej RP18e (50x2mm) oraz mieszaninę acetonitryl: woda (6:4 v/v) jako fazę ruchomą. 95

98 Chromatografia wykluczania Badane próbki rozpuszczono w tetrahydrofuranie (około 50mg/ml i 5mg/ml). Próbki w objętości 50 µl wprowadzano do czterech szeregowo połączonych kolumn chromatograficznych, dwóch LiChrogel PS1 i dwóch LiChrogel PS4, wypełnionych kulistymi cząstkami z porowatego kopolimeru styren diwinylobenzen. Kolumny te umoŝliwiają selektywne rozdzielenie substancji róŝniących się masą cząsteczkową w zakresie od 100 do 10 5 daltonów. Wylot kolumny był połączony z detektorem refraktometrycznym, którego sygnał w niewielkim stopniu zaleŝy od masy cząsteczkowej takich substancji jak lipidy i ich pochodne, niewiele róŝniące się masą cząsteczkową. Objętościowe natęŝenie przepływu fazy ruchomej, którą był tetrahydrfuran, wynosiło 1,5 ml/min. Zawartość składników nierozpuszczalnych w tetrahydrofuranie oznaczono masowo z zastosowaniem grawimetrii Chromatografii wykluczania z oddziaływaniami adsorpcyjnymi W badaniach zastosowano kolumnę wypełnioną Ŝelem krzemionkowym modyfikowanym grupami cyjanopropylowymi (typu CN), a jako fazę ruchomą wodę. Objętościowe natęŝenie przepływu fazy ruchomej wynosiło 1,2 ml/min. Do kolumny wprowadzano 20µl roztworów wodnych substancji wzorcowych o stęŝeniu 50 i 5mg/ml oraz próbek materiałów badanych o stęŝeniu 50, 25, 5 mg/ml. W przypadku nierozpuszczalnych w wodzie korkozylokaprylokapronianu i oleju parafinowego do oznaczenia ich zawartości wykorzystano analizę grawimetryczną Chromatografia w układach faz odwróconych Do rozdzielania składników specyfików, w układzie faz odwróconych, zastosowano kolumnę typu RP- 18 z Ŝelem krzemionkowym modyfikowanym grupami oktadecylowymi, z mieszaniną acetonitryl: woda (6:4 v/v) jako fazą ruchomą. Objętościowe natęŝenie przepływu fazy ruchomej wynosiło 1,2 ml/min. Do kolumny wprowadzano 20 µl roztworów wodnych substancji wzorcowych o stęŝeniu 50, 25, 10 i 5mg/ml oraz próbek badanych o stęŝeniu 50, 25, 5 mg/ml Zawartość wody w próbkach Zawartości wody w próbkach specyfików oznaczono metodę Karla- Fishera. Ze względu na duŝą zawartość wody w maściach, analizie poddawano 0,5% roztwory 96

99 specyfików w metanolu. Dodatkowo, wykonano analizę zawartości wody w metanolu, jako ślepą próbę. Otrzymane wyniki zawartości wody w metanolu uwzględniono przy obliczaniu zawartości wody w próbkach specyfików farmaceutycznych Oznaczanie dietyloaminy Ze względu na brak pozytywnych rezultatów oznaczenia dietyloaminy z wykorzystaniem techniki chromatografii cieczowej wykonano pomiar ph wodnego roztworu specyfiku 2 oraz sporządzonych roztworów kalibracyjnych (0,05; 0,1; 0,2; 0,4% zawartości dietyloaminy w wodzie). Na podstawie 4 punktowej krzywej kalibracyjnej określono zawartość dietyloaminy Obliczenie zawartości poszczególnych składników specyfików farmaceutycznych Na podstawie otrzymanych wyników rozdzielania grupowego, bądź szczegółowego z wykorzystaniem techniki chromatografii cieczowej, oznaczania składników grawimetrycznie (zarówno grupowo i szczegółowo, w zaleŝności od rozpuszczalności) oraz oznaczania wody metodą Karla- Fishera wyprowadzono układ równań umoŝliwiający obliczenie zawartości poszczególnych składników specyfików farmaceutycznych (program algebry komputerowej). ZałoŜenia wykorzystane podczas obliczania zawartości poszczególnych składników specyfików opisano w rozdziale Estry metylowe kwasów tłuszczowych, mono-, di- triacyloglicerole Dobór warunków rozdzielania z zastosowaniem chromatografii planarnej Wstępny dobór optymalnych warunków rozdzielania mono-, di-, triacylogliceroli (MAG, DAG, TAG), kwasów tłuszczowych (FA), estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME) i glicerolu z zastosowaniem chromatografii cieczowej w układzie faz normalnych wykonano za pomocą techniki chromatografii cienkowarstwowej (NP- TLC). W badaniach zastosowano płytki chromatograficzne pokryte Ŝelem krzemionkowym, oraz mieszaniny 3% i 5% izopropanolu w heksanie (v/v). Zbadano wpływ dodatku modyfikatorów kwasowych, takich jak kwasu octowego (0,5%) i kwasu trifluorooctowego (TFA) (0,075%). 97

100 Badania wykonywano z zastosowaniem płytek chromatograficznych nieaktywowanych i aktywowanych przez wygrzewanie w suszarce (5h, 110 C). Retencję substancji rozdzielanych w warunkach TLC określono za pomocą współczynnika R f i k wyraŝonego równaniem i : R f = a/b [ ], k= (1-R f )/R f [ ] gdzie: a- droga przebyta przez środek plamy substancji, b- droga przebyta przez czoło fazy ruchomej Rozdzielanie i oznaczanie lipidów i pochodnych z wykorzystaniem chromatografii cienkowarstwowej sprzęŝonej z detektorem płomieniowo- jonizacyjnym Do rozdzielania lipidów i ich pochodnych nadal, często, wykorzystuje się chromatografię planarną. Ze względu na specyfikę oddziaływań występujących w chromatografii planarnej, wpływ stopnia nasycenia komory parami eluentu na rozdzielanie analitów, przenoszenie optymalnych warunków rozdzielania z TLC do chromatografii kolumnowej nie daje identycznych rezultatów. Korzystne jest zastosowanie odmiany chromatografii planarnej- chromatografii cienkowarstwowej z zastosowaniem kwarcowych pręcików pokrytych fazą stacjonarną, sprzęŝonej z detektorem płomieniowo jonizacyjnym. W analizach wykorzystano pręciki pokryte Ŝelem krzemionkowym, a jako fazę ruchomą zastosowano mieszaninę heksan: izopropanol 95:5 (v/v) z 0,075% dodatkiem TFA. Bezpośrednio przed kaŝdą analizą chromatograficzną pręciki aktywowano w płomieniu wodorowym detektora FID. Po aktywacji nakładano na pręciki plamki za pomocą aplikatura mechanicznego, dozując na kaŝdy pręcik 1µl roztworu o stęŝeniu około 0,5 mg/ml heksanu. W celu przyśpieszenia odparowywania rozpuszczalnika, powierzchnię pręcika ogrzewano strumieniem ciepłego powietrza. Następnie płytkę suszono w suszarce w 50 ºC przez 5 minut i wstawiano do eksykatora na 10 minut. Po tym czasie płytkę wieszano nad rozpuszczalnikiem w komorze chromatograficznej (10 minut) i poddawano rozwijaniu. Detekcja następowała podczas przejścia kaŝdego 98

101 pręcika, w czasie 35 sekund, przez płomień wodorowy detektora FID z jednoczesną cyfrową rejestracją sygnału elektrometru. Rozdzielnie i oznaczania kaŝdej próbki wykonano trzykrotnie Rozdzielanie lipidów i pochodnych z wykorzystaniem chromatografii cieczowej w układzie faz normalnych W celu rozdzielenia MAG, DAG, TAG, FA, FAME, zastosowano kolumnową elucyjną chromatografię cieczową w układzie faz normalnych, z wykorzystaniem przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie (EBF), aby wyeluować związki chemiczne silnie oddziałujące z fazą stacjonarną. Wykorzystano kolumnę na bazie Ŝelu krzemionkowego oraz mieszaninę heksanu i izopropanolu 95:5 (v/v), z dodatkiem modyfikatora kwasowego, TFA na poziomie 0,075%. Objętościowe natęŝenie przepływu fazy ruchomej wynosiło 1ml/min.. Rozdzielania i oznaczania wykonywano w temperaturze pokojowej z zastosowaniem detektora refraktometrycznego. Objętość dozowania- 50µl Rozdzielanie z wykorzystaniem chromatografii wykluczania W badaniach zastosowano równieŝ chromatografię wykluczania. Zastosowano cztery połączone szeregowo kolumny na bazie kopolimeru styren- diwinylobenzen (2xPS1 i 2xPS4), tetrahydrofuran jako eluent oraz detektor refraktometryczny, w temperaturze pokojowej, a objętościowe natęŝenie przepływu fazy ruchomej wynosiło 0,8 i 1,2 ml/min. Objętość dozowanej próbki- 50 µl Glikole polietylenowe Rozdzielanie glikoli polietylenowych z wykorzystaniem chromatografii wykluczania Próbki umieszczono w 5 ml tetrahydrofuranu lub dichlorometanu. Szczelnie zamknięte kolbki z roztworami umieszczono w łaźni ultradźwiękowej na 15 minut, w celu rozpuszczenia całego osadu. Następnie pobrano 2 ml ekstraktu i przesączono przez teflonowy filtr membranowy 0,46µm. Próbki o objętości 100 µl wprowadzano do dwóch szeregowo połączonych kolumn chromatograficznych SEC-HPLC typu PS-1, wypełnionych kulistymi cząstkami kopolimeru styrenu diwinylobenzenu. Wylot kolumny połączony był z detektorem refraktometrycznym, którego sygnał w małym 99

102 stopniu zaleŝy od masy cząsteczkowej PEG, gdy te się niewiele róŝnią. Przepływ eluentu wynosił 1,5 ml/min. Wartości czasu retencji substancji badanych, były porównywane z odpowiadającymi im wartościami czasu retencji otrzymanymi dla wzorców. Oznaczanie odbywało się na podstawie siedmiopunktowej krzywej kalibracyjnej, uzyskanej dla próbek wzorcowych PEG-u 400 i 4000 (stęŝenia w zakresie od 3 do 50 mg/ml eluentu). Badania uwzględniały wstępne wytypowanie eluentu, sprawdzenie wpływu powierzchni pików pochodzących od związków w ekstraktach z drewna konserwowanego oraz dodatkowych substancji dodawanych podczas przechowywania drewna w roztworach PEG Rozdzielanie glikoli polietylenowych z wykorzystaniem chromatografii wykluczania z kontrolowaną adsorpcją. Stosowanie kolumn na bazie kopolimeru styren- diwinylobenzen wiąŝe się z wysokim kosztem ich zakupu. W związku z tym, zbadano moŝliwość wykorzystania kolumny typu Ŝel krzemionkowy do rozdzielania glikoli polietylenowych. Rozdzielaniu podawano PEG 400 i 4000 w układzie chromatograficznym, gdzie stosowano formamid, bądź mieszaninę formamid: THF jako fazy ruchome (0.4 ml/min.). Zbadano równieŝ wpływ temperatury na rozdzielczość pików chromatograficznych przez stopniowe podwyŝszanie temperatury co 10, od 20 do 60 C. Do kolumny chromatograficznej wprowadzano 20 µl roztwory PEG, o stęŝeniu 30 mg/ml w przypadku PEG 400 i 10mg/ml w przypadku PEG Rozdzielanie glikoli polietylenowych z wykorzystaniem chromatografii oddziaływań hydrofilowych. W przypadku rozdzielania PEG, o małych masach cząsteczkowych i wysokiej polarności, zastosowano kolumnę na bazie Ŝelu krzemionkowego modyfikowanego grupami propyloaminowymi, oraz 5% wodę w acetonitrylu. Objętościowe natęŝenie przepływu fazy ruchomej wynosiło 1,5 ml/min, a temperatura analizy chromatograficznej 20 C. W badaniach zastosowano detektor refraktometryczny i UV- VIS typu DAD. 100

103 Przygotowanie ekstraktów z próbek konserwowanego drewna. Próbki zakonserwowanego drewna otrzymano w ramach współpracy z Centralnym Muzeum Morskim w Gdańsku. Próbki drewna to próbki rdzeniowe, pobrane przy pomocy świdra Presslera, z łodzi poddanej konserwacji (pochodzącej z podwodnego stanowiska archeologicznego). Pierwszy etap konserwacji łodzi rozpoczął się w 2005 roku z zastosowaniem glikolu polietylenowego (PEG- u) 400. Drugi etap obejmował: końcowe nasycanie PEG- iem 400 do stęŝenia 41,3%, wypompowanie roztworu PEG- u 400 z wanny, wpompowanie PEG- u 4000 o stęŝeniu 42% i podwyŝszanie stęŝenia PEG- u do 49,7%. Konserwacja przebiegała w specjalnie do tego celu wykonanej wannie ze stali nierdzewnej o wymiarach 6m x 1,5m x 1,2m. Na jej półkach umieszczono drewniane elementy łodzi, a następnie zanurzono w roztworze konserwującym, który podgrzewano do temperatury 55-57ºC za pomocą węŝownicy wypełnionej wodą grzewczą. Powolne zatęŝanie roztworu odbywało się przez dodawanie nowej porcji PEG- u 4000 i powolne odparowywanie odpowiedniej ilości wody. W czasie tego etapu konserwacji zuŝyto 3 tony PEG- u, z którego przygotowano 5m³ roztworu. Pobrane próbki dzielono na odcinki 1-2 cm, waŝono i następnie kaŝdy odcinek krojono na cienkie plasterki. KaŜdą próbkę zalano 4 ml wody i ekstrahowano PEG przez 50 godzin w cieplarce w temperaturze 55 C. Roztwory następnie przefiltrowano przez lejek Schotta, a opiłki zalano 2 ml wody i ekstrahowano PEG w tych samych warunkach. Po przefiltrowaniu roztworu suszono przesącz do stałej masy Ścieki po oksydacji asfaltów Przygotowanie próbek do badań substancji trudnolotnych Ściek z instalacji 1020 Ścieki pobrane z instalacji zawierają w swoim składzie oprócz związków organicznych równieŝ nieorganiczne, szczególnie wodorotlenek sodu, siarkowodór oraz węglany. W celu usunięcia części nieorganicznej oraz z konieczności takŝe lotnych składników ścieków, próbki (7 ml) ścieku 1020 o ph ok.13 przedmuchano gazem obojętnym (azotem), a następnie zakwaszono do ph 3,5 za pomocą 95% H 2 SO 4 (250 µl) i ponownie przedmuchano azotem. W ten sposób usunięto wszystkie siarczki oraz praktycznie wszystkie lotne składniki organiczne, których zawartość w ścieku była 101

104 oznaczana niezaleŝnie z zastosowaniem GC. Następnie ph próbki ustalono na poziomie 5,55 za pomocą 45% NaOH (60 µl). Przed analizą chromatograficzna wykonywaną techniką HPLC próbkę filtrowano przez filtr teflonowy (Millex-LCR Filter, 0.45 µm, Hydrophilic PTFE, 13 mm, non-sterile) i rozcieńczano 10-cio krotnie eluentem. Ściek z instalacji 1000 Próbki ścieków rozcieńczano w eluencie w stosunku objętościowym 1:1 i filtrowano przez filtr teflonowy (Millex-LCR Filter, 0.45 µm, Hydrophilic PTFE, 13 mm, nonsterile) Analiza chromatograficzna- HPLC i GC Zbadano retencję 13 związków chemicznych, przedstawicieli potencjalnych składników ścieków (kwas octowy, kwas mlekowy, alkohol etylowy, 2-butanon, fenol, cykloheksanon, cykloheksanol, dibenzotiofen, MTBE, etyloparaben, β- naftol, ester propylowy kwasu 4- hydroksybenzoesowego (propyloparaben), aldehyd benzylowy). Badane próbki oraz substancje wzorcowe wprowadzano pojedynczo do kolumny Lichrospher RP-18, 5 µm, 125x4mm, w warunkach izokratycznych z mieszaniną metanol-woda (60:40) + 0,01% H2SO4, ph 3 jako eluentem, przy przepływie fazy ruchomej 1,0 ml/min, z zastosowaniem detektora spektrofotometrycznego z matryca fotodiodową (UV- VIS/ DAD) oraz detektora refraktometrycznego. Badania obejmowały równieŝ zastosowanie kolumny na bazie Ŝelu krzemionkowego modyfikowanego grupami cyjanopropylowymi oraz wykorzystanie modyfikatorów kwasowych fazy ruchomej (mieszaniny metanolu z wodą przy objętościowym przepływie fazy ruchomej 1 ml/min.), takich jak kwas TFA, ortofosforowy lub siarkowy. Usunięcie siarczków, węglanów oraz grup hydroksylowych i ustawienie ph na wartość równą wartości ph eluentu było konieczne z tego powodu, Ŝe jony S 2-, HS -, CO , HCO 3 oraz OH - posiadają własne widma w zakresie UV, które maskują widma substancji organicznych. Badaniom podlegały równieŝ substancje organiczne emitowane do powietrza przez ściek, w zaleŝności od wartości ph. Wykorzystano technikę analizy fazy nadpowierzchniowej i technikę chromatografii gazowej- GC- MS oraz GC- FID. Próbki ścieków surowych termostatowano w temperaturze 50 C. Następnie próbkę fazy nadpowierzchniowej dozowano do chromatografu z kolumną kapilarną i detektorem 102

105 FID lub MS. Składniki oparów były rozdzielane na kolumnie kapilarnej firmy Supelco, o parametrach: 30m x 0,25mm x 0,1µm grubość filmu z fazą stacjonarna 20% difenylosiloksan, 80% dimetylosiloksan (SPB 20). Aparat, na którym wykonywano badania, posiadał detektor FID oraz specjalną przystawkę do dozowania fazy naddowierzchniowej. Tak z zastosowaniem HPLC, jak i GC przede wszystkim porównano sumy powierzchni odpowiednich pików poszczególnych substancji i grup substancji, w czasie trwania procesu pre- oczyszczania, przyjmując, Ŝe skład próbki surowej, przed oczyszczaniem i nie pozbawionej lotnych składników, odpowiada 0% redukcji lotnych składników oparów. W badaniach podatności na utlenianie lotnych składników siarkoorganicznych oraz siarkowodoru, zastosowano technikę analizy fazy nadpowierzchniowej w sprzęŝeniu techniki GC z pulsacyjnym detektorem płomieniowo jonizacyjnym (PFPD). Ten detektor jest całkowicie selektywny na siarkę (współczynnik selektywności dla siarki większy niŝ 10 5 ) oraz pozwala oznaczać związki siarki na bardzo niskich poziomach stęŝeń. Wykrywalność podawana przez producenta to 1 pg S/sek. Analizowana próbka ścieku w objętości 10 ml została umieszczona w fiolce, o objętości 15ml, zamkniętej szczelnie membraną silikonowo- teflonową. Próbka była termostatowana 1 godzinę w temperaturze 80 C. W badaniach wykorzystano kolumnę kapilarną do chromatografii gazowej 60m x 0,32mm x 1,0µm HP1 (Hewlett- Packard, USA) oraz program temperaturowy: temperatura początkowa/czas utrzymywania- 40 C /7min., narost temperatury- 5 C/min do 260 C, temperatura końcowa/czas utrzymywania- 300 C /5min., Czas całkowity analizy- 55,7min. Metodyka opracowana w ramach pracy magisterskiej Grzegorza Boczkaja [167]. Dodatkowo dla tych próbek wykonano analizę fazy nadpowierzchniowej w wykorzystaniem GC- MS. Wykorzystano program temperatury: 50 C- 1min, następnie wzrost temperatury 7 C/min- 280 C oraz zatrzymanie 15 min, kolumna- HP1-MS 30m, 0,25mm ID, film1µm, gaz nośny: hel, przepływ 1,0 ml/min, detektor: MS z analizatorem kwadrupolowym jonów, temperatury: analizator AAS 150 C, źródło jonów 220 C, linia łącząca GC z MS 300 C. 103

106 Obliczenie stopnia oczyszczenia ścieków Opisane procedury analityczne wykorzystano m. in. w celu oceny stopnia oczyszczania ścieków. Poza tą pracą przeprowadzano przede wszystkim badania utleniania składników ścieków z instalacji 1020, ale takŝe ścieków z instalacji 1000 oraz z odwodnienia zbiornika tzw. slopów ciemnych. Przed procesem oczyszczania ścieku usunięto zemulgowano fazę organiczną przy pomocy polielektrolitu kationowego. Zmiany stęŝeń poszczególnych składników i grup składników były oznaczane z zastosowaniem normalizacji prostej. Przyjęto, Ŝe skład próbki surowej to 100%, a stopień redukcji, to procent o jaki spadła powierzchnia odpowiedniego piku poszczególnych składników i grup składników: SR%=(1-A n /A 0 )100% [ ] Badania dotyczące skuteczności stosowania oraz modyfikacji koncepcji Synoviec a Obliczenie stęŝenia substancji w mieszaninie wzorcowej oraz grup substancji w ściekach powstałych po oksydacji asfaltów, wykonywano na podstawie zaleŝności Otrzymane wyniki w przypadku badania ścieków wzorcowych porównano ze stęŝeniami rzeczywistymi odpowiednich składników ścieku modelowego. Znajomość współczynnika załamania światła stosowanych eluentów, jako wartości wyznaczonych w warunkach pracy detektora refraktometrycznego, umoŝliwiłaby oznaczenie objętościowych zawartości badanych substancji w próbce dozowanej do kolumny HPLC i, co równie waŝne, rzeczywistych wartości ich współczynników załamania światła (równanie , a następnie ). W związku z tym, wyznaczono zmianę sygnału detektora RID w zaleŝności od wartości współczynnika załamania światła dla róŝnych eluentów i róŝnych substancji testujących o znanych stęŝeniach i wartościach współczynnika załamania światła. Dozowano tak wysokie objętości poszczególnych substancji, by miało miejsce, tzw. przeładowanie objętościowe kolumny, czyli plateau piku (dla fenolu). To pozwoliło przyjąć, Ŝe wartość n wynosi n 0 /1+k. UmoŜliwiło to wyliczenie zawartości kwasu octowego i 2-butanonu w mieszaninie wzorcowej, przy zastosowaniu fenolu jako wzorca wewnętrznego. 104

107 Dodatkowo na podstawie przeglądu literaturowego (współczynniki absorpcji molowej) oraz zaproponowanego wzoru opisanego zaleŝnością obliczono zawartość kwasu octowego, fenolu i butanonu w mieszaninie wzorcowej. Otrzymane wyniki, dzięki zastosowaniu modyfikacji koncepcji Synoviec a i wykorzystaniu detektora UV/VIS- DAD porównano z zawartością rzeczywistą, tychŝe substancji, oraz zawartością obliczoną według koncepcji Synoviec a. W przypadku substancji posiadających inne współczynniki retencji dla dwóch stosowanych układów chromatograficznych (z mieszaninami metanol:woda, oraz acetonitryl: woda jako eluentami, z kolumną typu RP- 18e) zastosowano poprawkę wykorzystywaną w przypadku stosowania przepływu zwrotnego eluentu, według wzoru Weryfikację otrzymanych wyników sprawdzono stosując test t- studenta z załoŝeniem poziomu ufności p=95%. 105

108 7.3 Opracowanie statystyczne wyników Opracowania statystycznego wyników pomiarów dokonano w oparciu o narzędzia dostępne w programie Microsoft Excel w pakiecie Analiza Danych. Obliczano wartości średnie, odchylenie standardowe (Sr), bądź względne odchylenia standardowe (RSD) oraz parametry opisujące regresję liniową, tj. wartości współczynnika nachylenia i współczynnika korelacji. Wyniki zamieszczone w tabelach i na wykresach (jeśli nie podano inaczej) są wartością z co najmniej dwóch niezaleŝnych oznaczeń, których róŝnica jest nie większa niŝ 5%. 106

109 7.4 Wyniki i dyskusja Badania nad celowością stosowania przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie chromatograficznej, zamiast skoku siły elucji, w celu zapewnienia stabilności aktywności sorpcyjnej Badania wykonane w ramach pracy doktorskiej Kartanowicza [17], a takŝe Gilgenast [166], a takŝe prace Kamińskiego [55] wykazały, Ŝe konsekwentne stosowanie przepływu zwrotnego eluentu w układach faz normalnych zapewnia bardzo dobrą powtarzalność czasu retencji analitów. Przy czym, warunkiem jest dozowanie, kolejno, badanych próbek raz na jedną, raz na drugą stronę kolumny. W ramach badań niniejszej pracy postanowiono sprawdzić efektywność takiego postępowania takŝe dla układów faz odwróconych. Taką potrzebę stwierdzono, gdy w czasie oznaczania kolejnych próbek produktów na obecność WWA obserwowano systematyczne obniŝanie czasu retencji analitów, mimo przemywania kolumny 100% ACN po zakończeniu kaŝdego dozowania Oznaczanie WWA w asfaltach W ramach tych badań dokonano modyfikacji, procedury oznaczania 18- tu WWA opracowanej w ramach rozprawy doktorskiej Gilgenast [166], w celu poprawy rozdzielczości pików, a przede wszystkim zmniejszenia czasu rozdzielania. Badania wykazały, Ŝe dodanie do eluentu metanolu, umoŝliwia oznaczanie wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych w czasie 20 minut przy przepływie eluentu- 2 ml/min. W ten sposób oszczędza się przede wszystkim czas, w niewielkim stopniu takŝe ilość zuŝywanych rozpuszczalników. Na rysunku 14 przedstawiono chromatogram UV- DAD uzyskany dla rozdzielania mieszaniny wzorców WWA. 107

110 Rysunek 14 Przykład chromatogramu uzyskanego podczas analizy próbki zawierającej 18 WWA i 1- nitropiren, stęŝenie 16 WWA 2,13 µg/ml, benzo(j)fluoranten 2,15 µg/ml, benzo(e)piren 2,08 µg/ml, 1-nitropiren 1,4 µg/ml. Piki chromatograficzne: 1 - naftalen, 2 - acenaftylen, 3 - acenaften, 4 - fluoren, 5 - fenantren, 6 - antracen, 7 - fluoranten, 8 nitropiren, 9 - piren, 10 - benzo(a)antracen, 11 - chryzen, 12 benzo(j)fluoranten, 13 benzo(e)piren 14 - benzo(b)fluoranten, 15 - benzo(k)fluoranten, 16 - benzo(a)piren, 17 - dibenzo(a,h)antracen, 18 - benzo(g,h,i)perylen, 19 - indeno(1,2,3-cd)piren, kolumna Spherisorb PAH 5µm,250x4,6 mm, eluent: 0-10min. MeOH:ACN:H 2 O 20:50:30 (v/v/v), 10,1-15 min. MeOH:ACN:H 2 O 20:65:15 (v/v/v), 15,1-22 ACN 100%, objętościowe natęŝenie przepływ eluentu 2 ml/min. Zmodyfikowana procedura analityczna, podobnie jak procedura Gilgenast, bazuje na elucji skokowej, zamiast elucji gradientowej. Powtarzalność czasu retencji analizowanych substancji jest lepsza w warunkach programu elucji skokowej, niŝ elucji gradientowej. Wynika to z ciągle jeszcze niedoskonałej synchronizacji pracy zaworów proporcjonujących z cykliczną pracą pompy w aparatach HPLC, wyposaŝonych w tzw. niskociśnieniowy system gradientu z zaworami proporcjonującymi po stronie ssącej pompy. Optymalny program elucji skokowej jest następujący: 0-10min. MeOH:ACN:H 2 O 20:50:30 (v/v/v), 10,1-15 min. MeOH:ACN:H 2 O 20:65:15 (v/v/v), 15,1-22 ACN 100%. Zastosowanie opracowanego programu elucji oraz kolumny RP- 18e, umoŝliwiła rozdzielenie 18- tu WWA i 1-nitropirenu, których współczynniki rozdzielania i retencji (selektywności) przedstawiono w tabeli

111 Tabela 15 Współczynnik retencji (k) i współczynnik rozdzielenia (α) dla WWA i 1-nitropirenu. Lp. Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne Współczynnik retencji (k) Współczynnik rozdzielenia (α) 1 Naftalen 2,99 2 Acenaftylen 3,62 1,21 3 Acenaften 5,11 1,41 4 Fluoren 5,37 1,05 5 Fenantren 6,62 1,23 6 Antracen 8,11 1,23 7 Fluoranten 10,36 1,28 Wz. wew. Piren 10,85 1, nitropiren 12,24 1,13 9 Benzo(a)antracen 15,35 1,25 10 Chryzen 15,86 1,03 11 Benzo(j)fluoranten 18,22 1,15 12 Benzo(e)piren 18,72 1,03 13 Benzo(b)fluoranten 18,98 1,01 14 Benzo(k)fluoranten 19,47 1,03 15 Benzo(a)piren 20,22 1,04 16 Dibenzo(a, h)antracen 21,22 1,05 17 Benzo(g,h,i)perylen 22,47 1,06 18 Indeno(1,2,3-cd)piren 22,72 1,01 Opracowaną procedurę wykorzystano podczas oznaczania WWA w asfaltach drogowych, bezaromatycznych plastyfikatorach gumy oraz w innych niskolotnych produktach naftowych. W przypadku próbek rzeczywistych procedura, obejmowała dodatkowo etap mycia kolumny chromatograficznej- 10 minut 100% acetonitryl. Zastosowanie eluentu o wysokiej sile elucji nie daje, jednak, zadowalających efektów usuwania z kolumny substancji silnie oddziałujących z fazą stacjonarną. Okazało się, iŝ czas retencji tych samych substancji w kolejnych rozdzieleniach i oznaczeniach chromatograficznych systematycznie spada. W tabeli 16 zestawiono współczynniki retencji i selektywności dla WWA występujących w asfalcie, otrzymanych dla kolejnych oznaczeń. 109

112 Tabela 16 Zestawienie współczynników retencji (k) i współczynników rozdzielenia (α) WWA występujących w asfalcie drogowym 35/50 otrzymanych podczas kolejnych oznaczeń z wykorzystaniem etapu mycia kolumny 100% ACN. WWA występujące w próbce asfaltu drogowego 35/50 Analiza wzorców Analiza 3 Analiza 4 Analiza 5 Analiza 6 Analiza 11 Średnie Odchylenie standardowe k α k α k α k α k α k α k α k α Fenantren 6,62-6,14-5,98-5,81-5,64-4,31-5,75-0,73 - Antracen 8,11 1,23 7,3 1,19 7,14 1,19 6,8 1,17 6,64 1,18 5,14 1,19 6,86 1,19 0,86 0,020 Fluoranten 10,36 1,28 9,46 1,3 8,3 1,16 7,95 1,17 7,48 1,13 6,8 1,32 8,39 1,23 0,99 0,082 Piren 10,85 1,02 11,13 1,18 11,08 1,55 10,63 1,34 10,29 1,38 7,8 1,15 10,30 1,27 1,38 0,190 Chryzen 15,86-14,94-14,78-14,7-14,61-13,17-14,68-0,72 - Dibenzo(a, h)antracen 21,22-20,09-20,03-19,93-18,93-18,93-19,86-0,60-110

113 Współczynniki retencji substancji systematycznie maleją, co dla fenanteru, fluorantenu i dibenzo(a,h)antracenu przedstawiono na rysunku 15. MoŜna stwierdzić, Ŝe w przypadku oznaczania WWA w nielotnych produktach naftowych, mimo zastosowania 2- etapowej procedury przygotowania próbki, mycie kolumny RP acetonitrylem, jest niewystarczające. Podczas kolejnych analiz zmniejsza się hydrofobowość powierzchni sorpcyjnej kolumny chromatograficznej w wyniku adsorpcji zanieczyszczeń próbki. Spowodowane jest to pozostawaniem w kolumnie silnie oddziałujących z fazą stacjonarną zanieczyszczeń próbki. W związku z tym, ma miejsce niekorzystny spadek rozdzielczości kolumny. Dodatkowo, niepowtarzalne wartości czasu i współczynników retencji uniemoŝliwiają wykorzystanie autosamplera, automatyzację analizy oraz stosowanie detektora spektrofotometrycznego UV- VIS. Konieczne jest stosowanie detektora typu DAD, aby na podstawie widm substancji dokonywać ich identyfikacji. Rysunek 15 Zmiany współczynnika retencji fenantrenu, fluorantenu i benzo(a, h) antracenu w kolejnych analizach chromatograficznych Rozwiązaniem opisanego powyŝej problemu okazało się zastosowanie przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie chromatograficznej (EBF) po zakończeniu kaŝdego kolejnego oznaczania. Próbkę, dla której wyniki przedstawiono powyŝej, poddano kolejnym rozdzielaniom z zastosowaniem przepływu zwrotnego po 22 minucie. W tabeli 17 zestawiono współczynniki retencji otrzymane w kolejnych analizach chromatograficznych. 111

114 Tabela 17 Zestawienie współczynników retencji (k) i współczynników rozdzielenia (α) WWA występujących w asfalcie drogowym 35/50 otrzymanych podczas kolejnych rozdzielań i oznaczeń (analiz) z zastosowaniem przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie. WWA występujące w próbce asfaltu drogowego 35/50 Analiza wzorców Analiza 3 Analiza 4 Analiza 5 Analiza 6 Analiza 11 Średnie Odchylenie standardowe k α k α k α k α k α k α k α k α Fenantren 8,02-8,06-7,93-8,13-8,09-8,10-8,06-0,08 - Antracen 9,81 1,23 9,78 1,21 9,58 1,21 9,91 1,22 9,80 1,21 9,83 1,21 9,79 1,22 0,12 0,004 Fluoranten 12,67 1,28 12,70 1,30 12,41 1,29 12,87 1,30 12,72 1,30 12,78 1,30 12,69 1,30 0,17 0,004 Piren 13,78 1,02 13,73 1,08 13,63 1,10 13,81 1,07 13,74 1,08 13,77 1,08 13,74 1,07 0,07 0,011 Chryzen 17,24-17,26-17,13-17,48-17,30-17,34-17,29-0,13 - Dibenzo(a, h)antracen 21,62-21,65-21,60-21,83-21,67-21,71-21,68-0,09-112

115 Zastosowanie przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie chromatograficznej skutkuje wyraźną poprawą powtarzalności parametrów retencji, jak wynika z tabeli 17 i rysunku 16. Współczynniki retencji wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych nie ulegają zmniejszeniu podczas długotrwałego stosowania tej samej kolumny chromatograficznej. ZauwaŜalne jest niewielkie zróŝnicowanie wartości czasu retencji dla jednego i drugiego kierunku przepływu eluentu w kolumnie. MoŜe to być spowodowane, nieznacznym pęknięciem złoŝa w kolumnie po jednej jej stronie. Dzięki zastosowaniu przepływu zwrotnego moŝemy równieŝ określać, jakość i stopień zuŝycia wypełnienia kolumny HPLC- analitycznej lub preparatywnej [57]. Rysunek 15 Zmiany współczynnika retencji fenantrenu w kolejnych analizach chromatograficznych z zastosowaniem przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie. Stosowanie przepływu zwrotnego eluentu nie jest dotychczas powszechne w HPLC. JuŜ tylko na podstawie powyŝszych wyników widać, Ŝe moŝe być niezwykle celowe zainstalowanie do układu chromatografu cieczowego dodatkowego zaworu przełączającego kierunek przepływu eluentu w kolumnie. Większość producentów aparatury HPLC nie oferuje dotychczas przystawki w podstawowym układzie chromatograficznym. Kapilary stosowane do przyłączenia zaworu przepływu zwrotnego eluentu do kolumny, powinny być o małej średnicy wewnętrznej, tak, aby nie zwiększać rozmycia substancji. NaleŜy jednak pamiętać, iŝ moŝna stosować zawór przepływu zwrotnego wyłącznie, gdy wszystkie komponenty próbki dobrze rozpuszczają się w eluencie. W przeciwnym razie moŝna doprowadzić do zatkania kapilar i wzrostu ciśnienia. Dodatkowo, 113

116 w momencie przestawiania zaworu przepływu zwrotnego będą obserwowane skoki ciśnienia. Zgłaszane są teŝ wątpliwości, czy podczas przepływu zwrotnego zostaną wyeluowane z kolumny wszystkie anality do niej wprowadzone i czy stopień odzysku składników o bardzo wysokiej retencji będzie zadowalający Badanie efektywności stosowania przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie chromatograficznej Podstawowym warunkiem stosowania przepływu zwrotnego jest dobra rozpuszczalność analizowanych próbek w eluencie. Ze względu na to, w pierwszej fazie badań nad efektywnością stosowania przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie chromatograficznej, zbadano rozpuszczalności analitów w eluentach o róŝnym składzie, zaleŝności przedstawiono na rysunku 17 i 18. Rysunek 17 ZaleŜność rozpuszczania kwasu benzoesowego i estru propylowego kwasu 4- hydroksyl benzoesowego w mieszaninach acetonitryl: woda o róŝnym składzie. Rysunek 18 ZaleŜność rozpuszczania 1-naftyloaminy i 8-hydroksychinoliny w mieszaninach heksan: izopropanol o róŝnym składzie. 114

117 PowyŜsze wykresy posłuŝyły do sporządzenia roztworów substancji wykorzystywanych do badań. Chodziło o to by wartości k substancji eluowanych w przepływie zwrotnym były wysokie oraz by stęŝenia roztworów dozowanych były niŝsze niŝ rozpuszczalności substancji testowych w odpowiednim eluencie. Ze względu na dobrą rozpuszczalność substancji, we wszystkich potencjalnych eluentach, przygotowano roztwory o stęŝeniu około 10mg/ml. Takie roztwory moŝna wykorzystać w badaniach, zarówno z zastosowaniem niskich, jak równieŝ wysokich, wartości siły elucji faz ruchomych. Otrzymane pola powierzchni moŝna porównać bez ryzyka ich zmniejszenia, w wyniku wytrącania substancji w słabszych eluentach. Mieszaniny rozpuszczalników stosowane podczas badania efektywności stosowania przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie (EBF) wybrano na podstawie wykresów zaleŝności zmiany współczynników retencji substancji od ułamka molowego (NP), bądź objętościowego (RP) składnika fazy ruchomej (rysunek 19 i 20). Rysunek 19 Zmiany współczynnika retencji α- naftyloaminy i 8-hydroksychinoliny w funkcji ułamka molowego izopropanolu w mieszaninach heksan: izopropanol. 115

118 Rysunek 20 Zmiany współczynnika retencji estru propylowego kwasu 4-hydroksybenzoesowego i kwasu benzoesowego w funkcji ułamka molowego izopropanolu w mieszaninach acetonitryl:woda ( w przypadku kwasu benzoesowego eluent o ph=2,7). Na podstawie przebiegu zaleŝności log(k)=f(x) dla kwasu benzoesowego, 1-naftyloaminy oraz 8- hydroksychinoliny, widać, Ŝe dla badanych w tej pracy związków chemicznych niemoŝliwe jest uzyskanie wartości k wyŝszych od 250, nawet dla czystego n- heksanu, jako eluentu. W przyszłych badaniach trzeba będzie zastosować w tym celu substancje o wyŝszej polarności, co jednak najprawdopodobniej będzie związane z bardzo niską rozpuszczalnością badanych substancji testujących w takim eluencie. Badania wykonane poza ta pracą przez Kamińskiego ze stosowaniem przepływu zwrotnego, dla etanolu z n- heksanem jako eluentem, wykazały, Ŝe takŝe dla potencjalnej wartości k równe ok stopień odzysku w przepływie zwrotnym wynosi 100%, chociaŝ szerokość i stopień asymetrii piku etanolu były bardzo wysokie. Warunki elucji zastosowane w badaniu efektywności EBF zestawiono w tabeli 18. W tabeli umieszono równieŝ wartości stopni odzysku otrzymane z zastosowaniem przepływu zwrotnego. W przypadku elucji propyloparabenu stopień odzysku wynosi powyŝej 99%, nawet w przypadku wysokiej retencji tej substancji, dla której współczynnik retencji wynosi 175. Elucja tej substancji bez zastosowania przepływu zwrotnego eluentu wynosiłaby wówczas około 2 godziny. W przypadku elucji kwasu benzoesowego stopień odzysku, jako ilość substancji uzyskanej w przepływie zwrotnym w stosunku do ilości uzyskanej bez stosowania przepływu zwrotnego, wynosi ponad 96%. Zmniejszenie powierzchni piku moŝe być spowodowane, jak wspomniano, trudnościami z dokładnym określeniem punktu końca integracji piku otrzymanego w warunkach przepływu zwrotnego. Pik kwasu 116

119 benzoesowego jest w warunkach przepływu zwrotnego bardzo asymetryczny po stronie zstępującej piku w stosunku do piku otrzymanego dla estru propylowego kwasu 4- hydroksybenzoesowego, co wiąŝe się z silniejszym oddziaływaniem tego związku chemicznego z polarnymi resztkowymi grupami OH fazy stacjonarnej. W przypadku wysokosprawnej chromatografii cieczowej w układzie faz normalnych, jako substancje do badań wybrano α- naftyloaminę oraz 8- hydroksychinolinę. Jak wspomniano powyŝej, nie wykazują one aŝ tak bardzo wysokiej retencji w n- heksanie, by potencjalne wartości k przekraczały Charakteryzują się bardzo wysoką asymetrią pików, juŝ dla niskich wartości k, bez stosowania przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie i wykazują wysokie rozmycie po stronie zstępującej pików, więc charakteryzują się wysokim poziomem nieliniowości izoterm adsorpcji. Jak widać z tabeli 18, w przypadku elucji obu tych substancji stopień odzysku, podczas stosowania przepływu zwrotnego wynosi w większości przypadków- prawie 100%. W przypadku silnie rozmytych, asymetrycznych, pików istnieje moŝliwość niedokładnego określenia punktu końca piku a stąd niedokładnej integracji. Eluat zawierający niskie stęŝenie analitu ma wpływ na wartość współczynnika załamania światła i stąd na sygnał detektora UV przy bardzo niskiej absorpcji światła, co jest efektem znanym w spektrofotometrii. To moŝe powodować pewne zaniŝanie powierzchni otrzymanych pików. Czym później zostaje zastosowany przepływ zwrotny, tym większy błąd moŝna w ten sposób popełnić przy integracji, ze względu na powstające coraz niŝsze piki chromatograficzne o zwiększonej dyspersji (rysunek 21). Podczas przepływu zwrotnego rozmycie piku chromatograficznego, ze względu na długi czas elucji, jest stosunkowo znaczne i w przypadku pików wykazujących asymetrię po stronie zstępującej bez przepływu zwrotnego obserwuje się asymetrię po obu stronach piku, jednak po stronie zstępującej asymetria pozostaje znacznie silniejszą. Opisane powyŝej wyniki badań oraz spostrzeŝenia upewniają, dodatkowo, Ŝe stopień odzysku substancji eluowanych w przepływie zwrotnym wynosi w praktyce 100%. JednakŜe, bezsporne tego potwierdzenie wymaga wykonania badań w skali preparatywnej całkowicie nielotnymi substancjami jako traserami i wykonania grawimetrycznego oznaczenia. Takie badania są przewidywane w najbliŝszym czasie juŝ poza zakresem niniejszej pracy. 117

120 Tabela 18 Zestawienie wartości stopni odzysku obliczonych dla warunków stosowania przepływu zwrotnego i oznaczaniu kwasu benzoesowego, propyloparabenu, 1-naftyloaminy, 8-hydroksychinoliny w warunkach elucji z przepływem zwrotnym. Substancja Kolumna Eluent (v/v) k Stopień odzysku [%] kwas benzoesowy acetonitryl: woda 8:92, punkt EBF po k=2,5 25- wartość obliczona 96,8 kwas benzoesowy ester propylowy kwasu 4-hydroksybenzoesowego ester propylowy kwasu 4-hydroksybenzoesowego RP18e, 5µm, 125x4 mm (RP) acetonitryl: woda 18:82, punkt EBF po k=2,5 acetonitryl: woda 2:8, punkt EBF po k=2,5 acetonitryl: woda 32:68, punkt EBF po k=2,5 8, wartość obliczona 12 97,3 99,2 99,4 ester propylowy kwasu 4-hydroksybenzoesowego acetonitryl: woda 39:61, punkt EBF po k=2,5 5,5 99,8 1-naftyloamina heksan: izopropanol 99,2: 0,8, punkt EBF po k=2,5 3,9 97,5 1-naftyloamina heksan: izopropanol 99,61: 0,39, punkt EBF po k=2,5 9,5 93,2 1-naftyloamina SiO 2, 3µm, Heksan, punkt EBF po k=0, wartość obliczona 92,5 1-naftyloamina 250x4 mm Heksan, punkt EBF po k=2, wartość obliczona 98,3 8-hydroksychinolina (NP) heksan: izopropanol 99,9: 0,1, punkt EBF po k=2,5 1,35 96,5 8-hydroksychinolina Heksan, punkt EBF po k=0,76 3,3- wartość obliczona 99,8 8-hydroksychinolina Heksan, punkt EBF po k=2,52 3,3- wartość obliczona 96,7 118

121 Rysunek 21 Chromatogram z zastosowaniem detektora UV-DAD dla długości fali 310nm dla 8- hydroksyhinoliny eluowanej z kolumny chromatograficznej z Ŝelem krzemionkowym z zastosowaniem przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie, wykonanym w róŝnych punktach czasu elucji oraz bez elucji zwrotnej, eluent: heksan, 1,5 ml/min., punkt BF w 3 i 6 minucie. Na podstawie badań niniejszej pracy moŝna sformułować bardzo waŝny wniosek, Ŝe substancje, które rozpuszczają się w eluencie, zostają całkowicie wymyte z kolumny z wykorzystaniem przepływu zwrotnego eluentu w postaci jednego piku chromatograficznego, niezaleŝnie od tego na ile nieliniowa jest izoterma sorpcji oraz w zakresie potencjalnych wartości k do co najmniej Ostateczne potwierdzenie tego wniosku wymaga, jednak, wykonania oznaczeń techniką grawimetryczną. Przeprowadzone badania potwierdzają korzyści ze stosowanie przepływu zwrotnego eluentu (EBF), szczególnie w analizie składu grupowego. Przede wszystkim upewniają, Ŝe nawet dla bardzo asymetrycznych pików oraz warunków bardzo wysokiej, potencjalnej wartości współczynnika retencji k wartości stopnia odzysku wynoszą praktycznie 100%. Rozmycie moŝna zmniejszyć przez zastosowanie w warunkach przepływu zwrotnego silniejszego eluentu do wymycia substancji silnie oddziałujących z fazą stacjonarną, tak jak to się wykonuje w warunkach elucji jednokierunkowej, lecz wówczas naleŝy kondycjonować kolumnę eluentem o składzie wyjściowym, co w praktyce zwiększa zuŝycie eluentu. Jednak w przypadku preparatywnego otrzymywania substancji o wysokiej retencji, jako grupy, moŝe to być celowe. NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe nie powinno stosować się przepływu zwrotnego eluentu w kolumnach pakowanych o wysokiej przepuszczalności tzn., stosunkowo słabo upakowanych. Wartość zredukowanej przepuszczalności (Ø) kolumny powinna być wyŝsza od ok. 750, a najczęściej ten parametr dla dobrze wypełnionych kolumn HPLC wynosi około obliczony dla wypełnienia kolumny z eliminacją oporów 119

122 przepływu w kapilarach i elementach łączących kolumnę z pompą i wylotem detektora. W przypadku wartości niŝszej niŝ 750, złoŝe podczas stosowania przepływu zwrotnego eluentu, moŝe ulec degradacji, jak to zdarzało się niekiedy podczas badań. Zjawisko moŝe nastąpić z powodu skoków ciśnienia podczas zmiany kierunku przepływu eluentu w kolumnie. Tego rodzaju skoki ciśnienia są tym wyŝsze im wyŝsze wartości objętościowego natęŝenia przepływu fazy ruchomej w kolumnie, im bardziej lepki eluent, im mniejsza wielkość ziaren wypełnienia. Powstałe w ten sposób uszkodzenie wypełnienia kolumny jest trudne do usunięcia i najczęściej kolumna musi zostać ponownie wypełniona. Celowe jest, więc, wykonanie testu sprawności oraz przepuszczalności kolumny przed zastosowaniem przepływu zwrotnego (EBF) i nie stosowanie z przepływem zwrotnym kolumn o zredukowanej przepuszczalności wypełnienia niŝszej niŝ ok

123 7.4.2 Oznaczanie komponentów specyfików farmaceutycznych. Celem tej części pracy jest sprawdzenie w praktyce, opracowanych teoretycznie zasad ustalania składu skomplikowanych mieszanin składników o róŝnych zakresach polarności. Warto zwrócić uwagę, Ŝe problem ten nie istnieje w przypadku kolumn monolitycznych i ich coraz bardziej powszechne stosowanie spowoduje z pewnością coraz częstsze stosowanie przepływu zwrotnego eluentu w kolumnowej chromatografii cieczowej, jak to bardzo często ma miejsce w kolumnowej chromatografii gazowej. NaleŜy na koniec tej części pracy zwrócić uwagę, Ŝe poza przypadkami wykonywania analityki składu grupowego, systematyczne stosowanie przepływu zwrotnego eluentu w warunkach kolumnowej elucyjnej chromatografii cieczowej pozwala zachować wysoką czystość powierzchni fazy stacjonarnej oraz stałą aktywność powierzchni sorpcyjnej kolumny, a stąd bardzo dobrą powtarzalność wartości czasu retencji poszczególnych pików chromatograficznych. Warunkiem jest dozowanie próbki kolejno, po jednej i po drugiej stronie kolumny Badania rozpuszczalności próbek i ich składników Jeden z celów cząstkowych badań niniejszej pracy, to próba znalezienia rozpuszczalnika, w którym wszystkie składniki maści będą się rozpuszczać. Zbadano szereg rozpuszczalników, między innymi wodę, acetonitryl, tetrahydrofuran, dichlorometan, metanol, izopropanol, formami, heksan, jednak nie znaleziono rozpuszczalnika dla wszystkich składników. Większość składników rozpuszcza się jedynie częściowo w w/w rozpuszczalnikach. Dodatkowo, tzw. carbopole tworzą Ŝel z wodą, nawet przy małych zawartościach komponentu, co spowodowało konieczność sporządzania roztworów o bardzo małych stęŝeniach. W związku powyŝszym naleŝy równieŝ poddawać analizie próbki rzeczywiste o róŝnych stęŝeniach, aby mieć pewność, Ŝe wszystkie anality są rozpuszczone w eluencie. Pomocą w tego typu badaniach jest stosowanie lasera wirówki oraz mikroskopu w celu stwierdzenia, odpowiednio za pomocą efektu rozproszenia światła, powstawania osadu oraz występowania ruchów Browna, czy mamy do czynienia z zawiesiną czy z roztworem koloidalnym albo właściwym roztworem. Nierozpuszczalną frakcję próbki naleŝy usunąć, najlepiej przez odwirowanie i zdekantowanie supernatantu. Dopiero tak przygotowane próbki moŝna poddać analizie z wykorzystaniem techniki 121

124 wysokosprawnej chromatografii cieczowej, z wykorzystaniem róŝnych układów rozdzielczych. Badania obejmowały równieŝ porównanie efektywności wykorzystania takich technik roztwarzania lub ekstrakcji wspomaganych czynnikami zewnętrznymi, jak podwyŝszona temperatura, ultradźwięki, mieszanie mechaniczne, mikrofale. Wyniku uzyskane dla specyfiku 2 przedstawione są na rysunku 22. Rysunek 22 Efektywność roztwarzania składników próbki z zastosowaniem róŝnych technik ekstrakcji/ ługowania. Zastosowanie ekstrakcji z wykorzystaniem maceracji w podwyŝszonej temperaturze oraz techniki ekstrakcji w aparacie Soxhleta nie wymaga specjalistycznej aparatury, są to proste, łatwe w wykonaniu oraz ciągle powszechnie stosowane techniki. Wadą maceracji i ekstrakcji w aparacie Soxhleta jest czasochłonność operacji. W wyniku tego efektywność roztwarzania jest bardzo niska. W przeciwieństwie do konwencjonalnych technik ekstrakcyjnych, techniki wykorzystujące ultradźwięki czy promieniowanie mikrofalowe pozwoliły na uzyskanie znacznie wyŝszej efektywności ekstrakcji/roztwarzania. Podobnie stosowanie homogenizatora mechanicznego przyspiesza rozpuszczanie substancji. Jako czynnik wspomagający rozpuszczanie najbardziej korzystne okazało się zastosowanie ultradźwięków. JuŜ w ciągu 4 minut moŝna osiągnąć rozpuszczenie wszystkich komponentów badanych próbek (tych, które są rozpuszczalne). W przypadku 122

125 zastosowania aparatu Soxhleta identyczny wynik otrzymuje się po 24 godzinnej ekstrakcji. Na podstawie powyŝszych badań stwierdzono, Ŝe optymalną procedurą przygotowania próbek do analizy chromatograficznej jest zawieszanie w eluencie, następnie umieszczenie w łaźni ultradźwiękowej na 4 minuty, odwirowywanie supernatantu. Tak przygotowane próbki poddawano analizie chromatograficznej Oznaczanie składu specyfików farmaceutycznych Chromatografia wielowymiarowa jest coraz częściej powszechnie stosowana do rozdzielania skomplikowanych mieszanin. W przypadku, gdy nie wszystkie składniki próbki rozpuszczają się w eluencie pozostaje zastosowanie kilku układów chromatograficznych, w wyniku, czego rozdzielaniu i analizie poddaje się komponenty i mieszaniny składników, rozpuszczalnych w określonym eluencie. Wyniki kilku tego typu rozdzielań, wykonanych w róŝnych układach chromatograficznych, są podstawą do rozwiązania układów równań liniowych i opisu składników mieszaniny. Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, iŝ stosowane układy chromatograficzne powinny róŝnić się rodzajem oddziaływań, dlatego zastosowano rozdzielanie, w następujących warunkach: - w układzie faz odwróconych, RP- HPLC z wykorzystaniem faz stacjonarnych typu Ŝel krzemionkowy modyfikowany grupami oktadecylowymi, oktylowymi lub fenylowymi i mieszanin acetonitryl: woda, metanol: woda w róŝnych proporcjach, jako fazy ruchome; - pod względem masy molekularnej, czyli wykorzystanie chromatografii wykluczania/ŝelowej (SEC/GPC), z wykorzystaniem fazy stacjonarnej- kopolimer styrenu diwinylobenzenu i terahydrofuranu lub dichlorometanu, jako eluentu; - w układzie faz normalnych, z wykorzystaniem następujących faz stacjonarnych: Ŝel krzemionkowy, Ŝel krzemionkowy modyfikowany grupami cyjanopropylowymi, aminowymi, typu DIOL, z niepolarnymi fazami ruchomymi, takimi jak n-heksan lub n-heptan i ich mieszaninami z eterem metylowo tert-butylowym (MTBE), tetrahydrofuranem (THF). Ograniczeniem stosowania układu NP. jest mała rozpuszczalność komponentów farmaceutycznych w n-heksanie czy n-heptanie, a takŝe niska w rozpuszczalniku takim jak MTBE; 123

126 - w układzie połączenia oddziaływań chromatografii wykluczania z jednoczesną, kontrolowaną adsorpcją, wykorzystując takie fazy stacjonarne jak SiO 2, CN, DIOL, NH2 i inne, z polarnymi fazami ruchomymi, takimi jak: mieszaniny heksanu i izopropanolu. Dodatkowo, w przypadku oznaczania składników lotnych korzystne jest zastosowanie techniki chromatografii gazowej z analizą fazy nadpowierzchniowej. Oprócz technik chromatografii naleŝy takŝe wziąć pod uwagę inne techniki analityczne. MoŜna w łatwy sposób oznaczyć zawartość wody metodą Karla- Fishera, bądź za pomocą pomiaru ph oznaczyć stęŝenie dimetyloaminy, jeśli jest jedyną substancją zasadową. Zastosowanie chromatografii, wiąŝe się z koniecznością kalibracji. W tym celu zastosowano chromatografy czystych składników specyfików, jako substancje wzorcowe oraz metodę krzywej kalibracyjnej na podstawie powierzchni pików. Próbki roztworów specyfików farmaceutycznych rozdzielano w trzech układach chromatograficznych: - chromatografii wykluczania z tetrahydrofuranem, jako eluentem oraz szeregowo połączonymi kolumnami dwiema PS1 i dwiema PS4; - chromatografii wykluczania z kontrolowaną adsorpcją, z wykorzystaniem kolumny typu CN, z wodą, jako eluentem; - chromatografii w układzie faz odwróconych z kolumną typu C18 oraz mieszaniną acetonitryl: woda 6:4 (v/v), jako eluentem; Wyniki przestawiono na rysunku

127 1A 1B 2B 2A 1C 2C 125

128 Rysunek 23 RID chromatogramy rozdzielania specyfiku farmaceutycznego 1 i 2 z zastosowaniem układów chromatograficznych: A- GPC/SEC-HPLC (kolumny 2xPS1+2xPS4, eluent- THF), B- RP- HPLC (kolumna C18, eluent: acetonitryl: woda 6:4 ph=7,6), C- GPC z kontrolowaną adsorpcją (kolumna CN, eluent: woda), substancje rozdzielane A-kindamycyny fosforan, B-alantoina, C-carbopol 934P, D-glikol propylenowy; E-makrogol Renex PEG 400 F-woda, G-diklofenak dimetyloaminy; H- izopropanol, I-dietyloamina, J-makrogol eter cetostearylowy, K-carbopol 974 NF, L-korkozylokaprylokapronian, Ł- parafina ciekła. 126

129 Zawartość substancji lub grup substancji nierozpuszczalnych w stosowanych eluentach oznaczano grawimetrycznie. Wyznaczano procent nierozpuszczalnej części specyfiku, co stanowiło ilość substancji lub grup substancji. W przypadku specyfiku 1 nierozpuszczalne w THF były alantoina, kindamycyny fosforan, carbopol, co stanowiło 3,37% masy próbki specyfiku. Komponenty specyfiku 2 był w większości były rozpuszczalne w THF, oprócz carbopolu, który stanowił 2,97% masy próbki. Analiza otrzymanych wyników, dla trzech róŝnych układów chromatograficznych, techniki Karla- Fishera oraz pomiaru ph roztworów wodnych i rozwiązanie układu równań przedstawionego w rozdziale 3.8, umoŝliwiło obliczenie zawartości poszczególnych analitów w próbkach badanych specyfików. Wyniki, zestawiono w tabeli 19. Tabela 19 Zawartość poszczególnych składników specyfików farmaceutycznych Specyfik 1 składniki [%] RSD kindamycyny fosforan 1,08 0,01 alantoina 0,37 0,01 carbopol 934P 2,02 0,01 glikol propylenowy 11,48 0,06 makrogol, Renex PEG ,20 0,05 woda 72,80 1,26 Specyfik 2 diklofenak 0,96 0,01 dietyloamina 0,29 0,01 alkohol izopropylowy 16,40 0,15 makrogol eter cetostearylowy 1,88 0,01 carbopol 2,97 0,01 glikol propylenowy 10,20 0,09 korkozylokaprylokapronian 7,98 0,01 olej parafinowy 0,11 0,01 woda 59,40 1,19 Na podstawie przeprowadzonych badań moŝna zaproponować przedstawiony na rysunku 23 schemat ideowy procedury postępowania podczas oznaczania składników skomplikowanych mieszanin. 127

130 Zbadanie rozpuszczalności składników oraz badanych próbek. Następnie badane próbki w postaci roztworów w eluentach poddać rozdzielaniu w kilku niezaleŝnych układach separacyjnych. W przypadku oznaczania składników specyfików farmaceutycznych albo grup lipidów i niektórych innych materiałów, zamiast RP- HPLC, korzystne jest zastosowanie chromatografii wykluczania z kontrolowanymi oddziaływaniami adsorpcyjnymi. Rozdzielaniom chromatograficznym poddawać naleŝy roztwory komponentów badanych materiałów oraz wyciągi/ekstrakty z badanych materiałów do cieczy, które są rozpuszczalnikiem chociaŝby jednego ze składników. Doświadczenia potwierdziły korzyści z zastosowania przepływu zwrotnego w kolumnie, co umoŝliwiło wyeluowanie składników silnie sorbowanych na powierzchni fazy stacjonarnej. W przypadku składników częściowo rozpuszczanych w eluencie celowe jest zastosowanie metody kolejnych rozcieńczeń z kontrolą liniowości odpowiedzi detektora. Schematycznie stosowane czynności moŝna przedstawić według schematu na rysunku 24. Rysunek 24 Schemat postępowania podczas oznaczania składników skomplikowanych mieszanin. 128

131 7.4.3 Estry metylowe kwasów tłuszczowych mono- di- tri-acyloglicerole Innym zadaniem analitycznym dotyczącym oznaczania składu grupowego oraz zawartości wieloskładnikowych mieszanin substancji, jest analityka składu estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME), tzn. materiału dodawanego do paliwa Diesla, lub mogącego stanowić to paliwo. W ramach tej rozprawy doktorskiej postawiono sobie za cel cząstkowy, opracowanie standardowych procedur rozdzielania i oznaczania zawartości mono-, di-, triacylogliceroli, oraz estrów metylowych kwasów tłuszczowych, kwasów tłuszczowych czy glicerolu w FAME. Wykonanie tej analityki, w sposób moŝliwie jak najprostszy, będzie przydatne takŝe do wykonywania zadań dotyczących kontroli procesów przetwarzania i rafinacji tłuszczów w przemyśle tłuszczowym, a nie tylko dla kontroli jakości estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME), jako komponentu tzw. paliwa rolniczego. tego typu analityka moŝe teŝ, dotyczyć oznaczania ogólnej zawartości grup lipidów i ich pochodnych w materiałach biologicznych, albo w ściekach i odpadach. Opracowane procedury mogą być równieŝ przydatne w medycynie np. dla oznaczania grup lipidów w osoczu krwi, czy w tkance mózgowej. Dotychczas oznaczanie glicerydów oraz kwasów tłuszczowych jest wykonywane, jak to opisano w części opisu literatury niniejszej pracy, z zastosowaniem chromatografii gazowej na drodze bezpośredniego rozdzielania lotnych kwasów tłuszczowych, albo przekształcenia nielotnych kwasów tłuszczowych do ich lotnych estrów. Uprzednio musi zostać wykonane zmydlanie acylogliceroli, tzn. często nie tylko tri- acylogriceroli, ale takŝe mono- i di-acylogriceroli. Jest teŝ wiele publikacji, gdzie wykorzystuje się chromatografię cieczową i układy faz odwróconych (RP- HPLC), do bezpośredniego rozdzielania i oznaczania acylogriceroli, w warunkach elucji gradientowej. W starszych procedurach moŝna teŝ znaleźć wiele procedur rozdzielczych i analitycznych z zastosowaniem warunków układów faz normalnych oraz elucji skokowej lub gradientowej do bezpośredniego rozdzielania i oznaczania glicerydów. Są to wszystko czaso- i pracochłonne procedury, ich zaletą jest moŝliwość otrzymania stosunkowo szczegółowych informacji o składzie badanego materiału, jednak w sposób niełatwy. W wielu przypadkach wystarczy jednak oznaczanie tylko składu grupowego tych materiałów, co wydaje się prostsze w przypadku wykorzystania chromatografii wykluczania z uwzględnieniem częściowych oddziaływań adsorpcyjnych (GPC/SEC- 129

132 NP). Otrzymane informacje w wielu przypadkach powinny być wystarczające, a procedury analityczne niezwykle proste Dobór warunków rozdzielania grupowego acylogliceroli i ich pochodnych Wstępny dobór składników i składu eluentu dla chromatografii kolumnowej w układach faz normalnych wykonano z zastosowaniem zwykłej chromatografii planarnej (TLC). Wpłynęło to na skrócenie czasu i zmniejszenie kosztów badań, poniewaŝ- jak wiadomo- na jednej płytce TLC moŝna rozdzielać kilka próbek równocześnie i widać czy na starcie nie pozostają plamki substancji bardzo silnie sorbowanych. Wartości liczbowe parametrów Rf i k uzyskanych dla róŝnych warunków rozdzielania w układzie faz normalnych z zastosowaniem chromatografii cienkowarstwowej zestawiono w tabeli 20. Zamieszczono tam takŝe wartości k obliczone na podstawie Rf. Tabela 20 Wartości współczynników Rf oraz k dla mon-, di- tri-acylogliceroli (MAG, DAG, TAG), estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME), kwasów tłuszczowych (FA) oraz glicerolu. WARTOŚCI Rf i k 97% n-hekasny 3% izopropanolu 95% n-hekasnu 5% izopropanolu substancje 0,5%CH 3 COOH 0,075% TFA 0,5% CH 3 COOH 0,075% TFA płytki nieaktywowane płytki aktywowane Rf Rf Rf Rf Rf TAG 0,28 DAG 0,05 MAG 0,04 FAME 0,02 FA 0 glicerol 0 2,57 0,48 1,1 19,0 0,21 3,8 24,0 0,11 8,1 49,0 0,03 32, ,56 0,8 0,57 0,8 0,58 0,7 0,30 2,3 0,33 2,0 0,35 1,9 0,16 5,3 0,21 3,8 0,23 3,3 0,13 6,7 0,04 24,0 0,18 4,6 0,04 24,0 0-0,40 1,

133 Badania obejmowały wykorzystanie róŝnych zawartości izopropanolu w eluencie, jako modyfikatora zwiększającego silę elucji fazy ruchomej, jak równieŝ dodatek do eluentu dwóch rodzajów kwasu- octowego i trifluorooctowego. W przypadku stosowania Ŝelu krzemionkowego jako fazy stacjonarnej, korzystne jest zastosowanie silniejszego eluentu mieszaniny heksanu i izopropanolu w stosunku objętościowym 95:5 oraz modyfikatora kwasowego- kwasu trifluorooctowego. W przypadku stosowania pręcików z naniesioną fazą stacjonarną konieczne jest aktywowanie powierzchni pręcików przez poddanie ich ogrzewaniu i jednoczesnym spalaniu zanieczyszczeń w płomieniu wodorowym (3 razy przez 50 sekund). Glicerol bardzo silnie adsorbuje się na Ŝelu krzemionkowym, dlatego niemoŝliwa jest jego elucja z zastosowaniem opracowanych procedur opisanych warunków w kierunku zwykłego rozwijania chromatogramu. W tym wypadku korzystne jest zastosowanie przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie w warunkach kolumnowej chromatografii, co umoŝliwia elucję tej substancji z kolumny, pomimo jej bardzo wysokiej retencji. Rezultatu rozdzielania składników FAME w zbliŝonych do optymalnych warunkach, opracowanych w ramach badań niniejszej pracy przedstawiono na rysunku 25. Na podstawie chromatogramu jest moŝliwe obliczenie zawartości grup w/w składników, ale zawartość trój glicerydów jest oznaczana dość mało dokładnie, natomiast zawartość gliceryny jest oznaczana razem z zawartością kwasów tłuszczowych. 131

134 Rysunek 25 Chromatogram RID rozdzielania składników technicznego FAME w warunkach kolumnowej elucyjnej chromatografii cieczowej w układzie faz normanych (NP.- HPCL) dla Ŝelu krzemionkowego jako fazy stacjonarnej oraz dla eluentu n-heksan: izopropanol 95: 5 (v/v) z 0,075% TFA, 1ml/min., A- FAME, B- triacyloglicerole, C- diacyloglicerole, D- monoacyloglicerole, E- kwasy tłuszczowe i glicerol. Zastosowane warunki rozdzielania umoŝliwiają zadowalająco rozdzielić MAGi, DAGi, TAGi i FAME. Do analityki składu grupowego FAME jest to wystarczające. Współczynniki retencji i rozdzielenia zestawiono w tabeli 21. W celu elucji składników silnie oddziałujących z fazą stacjonarną zastosowano przepływ zwrotny eluentu w kolumnie chromatograficznej, po czasie, odpowiadającym k=7. Jednak, moŝna to przyśpieszyć, przełączając zawór zwrotny po ośmiu minutach analizy. Tabela 21 Wartości współczynnika k i α dla mon-, di- tri-acylogliceroli (MAG, DAG, TAG), estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME), rozdzielonych w układzie NP- HPLC. substancje t [min.] k α TAG 2,2 0,47 - FAME 2,4 0,60 1,29 DAG 4 1,67 2,78 MAG 5 2,33 1,40 W przypadku opisanego problemu analitycznego alternatywą dla zastosowania chromatografii w układzie faz normalnych (NP.- HPLC) moŝe być wykorzystanie chromatografii wykluczania (SEC/GPC). Korzystne jest zastosowanie połączenia szeregowo czterech kolumn chromatograficznych wypełnionych kopolimerem styren 132

135 diwinylobenzen o niskim zakresie wielkości porów (PS1 i PS4), a jako eluentu zastosowanie czterowodorofuranu (THF). Na rysunku 26 zamieszczono przykład rozdzielania próbek zawierających MAG, DAG, TAG, FA, FAME z zastosowaniem SEC/GPC. Rysunek 26 Chromatogramy RID rozdzielania składników 1- FAME techniczne, 2- olej palmowy rafinowany, 3- FAME, uzyskany z zastosowaniem 4 połączonych szeregowo kolumn PS1x 2 i PS4 x2, eluent: THF 0,8 ml/min., A- FAME, B- triacyloglicerole, C- diacyloglicerole, D- monoacyloglicerole, E- kwasy tłuszczowe, F- glicerol, G- polioksyglicerydy. 133

136 Wykorzystanie chromatografii wykluczania umoŝliwia równieŝ oznaczanie polioksygliceroli, powstających podczas rafinacji olejów spoŝywczych rysunek Badania z zastosowaniem chromatografii cieczowej z wykorzystaniem pręcików pokrytych sorbentem oraz detektora płomieniowojonizacyjnego- TLC- FID Z przeglądu literatury wynika, iŝ chromatografia planarna jest powszechnie stosowana do rozdzielania grupowego [144] frakcji MAG, DAG, TAG, FAME, FA. W związku z tym postanowiono zastosować w badaniach takŝe tę technikę w celu sprawdzenia czy nie okaŝe się i w jakim stopniu, konkurencyjna wobec techniki HPLC. W przypadku pozytywnych wyników moŝna by stosować w/w techniki zamiennie, w zaleŝności od wyposaŝenia laboratorium i dostępności odpowiedniej aparatury. Przykładowy chromatogramów TLC- FID otrzymanych dla tych badań przedstawiono na rysunkach 27 i 28. Rysunek 27 Chromatogram TLC- FID rozdzielania składników olej palmowy- bielony z zastosowaniem Ŝelu krzemionkowego jako fazy stacjonarnej na kwarcowych pręcikach, eluent: mieszanina n-heksan: izopropanol 95: 5 (v/v) z 0,075% TFA, A- FAME, B- tri- acyloglicerole, C- diacyloglicerole, D- mono- acyloglicerole. 134

137 Rysunek 28 Chromatogram TLC- FID rozdzielania składników olej palmowy- bielony z zastosowaniem Ŝelu krzemionkowego jako fazy stacjonarnej na kwarcowych pręcikach, eluent: mieszanina n-heksan: izopropanol 95: 5 (v/v) z 0,075% TFA, A- FAME, B- tri- acyloglicerole, C- diacyloglicerole, D- mono- acyloglicerole, E- kwasy tłuszczowe i glicerol. Stosując technikę TLC- FID do rozdzielania acylogliceroli i ich pochodnych, naleŝy pamiętać, Ŝe zmiana czasu kondycjonowania pręcików w komorze nad rozpuszczalnikiem nie wpływa na przeciętne udziały powierzchnia pików poszczególnych grup substancji lecz pogarsza się powtarzalność wyników oznaczeń. Natomiast takie parametry jak zawartość wody w eluencie, a szczególnie stęŝenie próbki nanoszonej na pręcik mają wpływ na stopień rozdzielenia pików. Otrzymane wyniki wykazują, Ŝe precyzja oznaczeń składu grupowego oznaczania MAG, DAG, TAG, FAME, FA metodą TLC- FID wyznaczona dla odchylenia standardowego mieści się w granicach do około 5% (± 2,5%) zawartości oznaczanych grup związków chemicznych i jest wyraźnie gorsza od rezultatów otrzymanych techniką HPLC. Analiza chromatograficzna zarówno z wykorzystaniem kolumnowej chromatografii cieczowej jak równieŝ chromatografii cienkowarstwowej TLC- FID umoŝliwia oznaczenie grupowej zawartości acylogliceroli i ich pochodnych w próbkach FAME. Pozwala to na ocenę jakości FAME. Przedstawione procedury są konkurencyjne do procedury przedstawionej w normie EN w której zanieczyszczania FAME, oznacza się z wykorzystaniem GC z wcześniejszą pre- kolumnową derywatzacją związków chemicznych do lotnych, pirydynowych pochodnych. 135

138 7.4.4 Oznaczanie glikoli polietylenowych w próbkach drewna i kąpielach konserwujacych Glikole polietylenowe moŝna rozdzielić pod względem masy cząsteczkowej, gdy zastosujemy chromatografie wykluczania i kolumny wystarczająco selektywne oraz wysokosprawne typu PS o niskim zakresie średnicy porów w materiale wypełnienia na bazie kopolimeru styren- diwinylobenzen. Na rysunku 29 przedstawiono przykład chromatogramu otrzymanego dla mieszaniny dwóch polietyloglikoli o masach 400 Da i 4000 Da, stosowanych w praktyce w procesie konserwacji drewna archeologicznego. Rysunek 29 NałoŜenie dwóch chromatogramów rozdzielania PEG 400 i 4000, z zastosowaniem chromatografii wykluczania (Ŝelowej) i dwóch kolumn Lichrogel PS1połączonych szeregowo; THF jako eluentu, przepływ 0,8 ml/min. MoŜna stosować w tym celu między innymi chromatografię w warunkach układów faz odwróconych z elucją gradientową oraz detektor LLSD, co wydłuŝa czas oznaczania i nie moŝna wykorzystać detektora refraktometrycznego. Metodyka opracowana w ramach niniejszej pracy ma jeszcze jedną powaŝną zaletę, moŝna z jej zastosowaniem wykorzystać kalibracyjne oznaczanie z wykorzystaniem koncepcji Synovic a. Opracowaną metodykę zastosowano do oznaczania PEG 400 i PEG 4000 w ekstraktach wodnych z drewna konserwowanego. Przed analizami końcowymi przeprowadzono częściową walidację metodyki. Wstępna walidacja dotyczyła zastosowania róŝnych eluentów do rozdzielania PEG 400 i 4000 oraz ich ewentualnych pochodnych i dodatków stosowanych w konserwacji.. W przypadku chromatografii wykluczania 136

139 alternatywą dla stosowania terahydrofuranu jako eluentu jest zastosowanie dichlorometanu. Dla wodnych ekstraktów z drewna konserwowanego (pobieranych z róŝnych próbek drewna, mających potencjalnie róŝne stęŝenie w/w PEG) wykonano oznaczenie tych polietyloglikoli z zastosowaniem metody krzywych kalibracyjnych dla co najmniej 5 stęŝeń PEG, w zakresie przewidywanych zawartości PEG w próbkach ekstraktów. W tabeli 22 zestawiono równania otrzymanych krzywych kalibracyjnych oraz współczynniki korelacji, granice detekcji i oznaczalności. We wszystkich przypadkach współczynniki korelacji wynoszą powyŝej 0,999, jednak granice oznaczalności w przypadku stosowania DCM jako eluentu są niŝsze. 137

140 Tabela 22 Zestawienie równań krzywych kalibracyjnych, wartości granicy oznaczalności (LOQ) i wykrywalności (LOD) dla PEG 400 i 4000 w dichlorometanie i tetrahydrofuranie jako eluencie. Eluent Związek chemiczny krzywa kalibracyjna R 2 LOD [mg/ml] LOQ [mg/ml] DCM THF PEG 4000 y=142666x ,9998 0,46 1,38 PEG 400 y=71697x ,9996 0,35 1,05 PEG 4000 y=149142x ,9999 0,93 2,79 PEG 400 y=104559x ,92 2,76 Tabela 23 Zestawienie wyników wartości zawartości PEG 400 i 4000 w ekstraktach z próbek 5, 12, 18 drewna, otrzymanych z zastosowaniem dichlorometanu (D) i terahydrofuranu (T) jako eluentu. Próbka/liczba PEG 4000 PEG 400 niezaleŝnych oznaczeń c próbki [mg/ml] stęŝenie [mg/ml] % % uwzgl. 0 odchylenie standardowe stęŝenie [mg/ml] % % uwzgl. 0 odchylenie standardowe 5D 39,5 18,6 47,17 44,65 0,15 10,6 26,89 25,82 0,24 12D 25,7 17,9 69,59 65,72 0,50 4,1 15,80 14,15 0,05 18D 68,2 44,5 65,19 63,74 0,29 9,0 13,25 12,63 0,09 5T 33,7 15,2 45,18 39,99 1,27 11,3 33,51 29,36 0,75 12T 24,5 17,3 70,79 63,65 1,69 3,9 15,94 10,23 0,17 18T 44,7 30,1 67,39 63,47 0,66 8,2 16,64 13,79 0,68 138

141 W przypadku rozdzielania składników próbek rzeczywistych, dodatkowo na chromatogramie pojawia się pik nie pochodzący od PEG, lecz od Hostacoru- środka antykorozyjnego, co przedstawia rysunek 30. Widać teŝ z niego, Ŝe zwiększenie objętościowego natęŝenia fazy ruchomej z 0,8 do 1,5 ml/min nie powoduje pogorszenia rozdzielania PEG. Rysunek 30 Chromatogram RID rozdzielania próbki ekstraktu z drewna archeologicznego z zastosowaniem dwóch kolumn do chromatografii wykluczania (PS1) połączonych szeregowo; THF jako eluent, przepływ 1,5 ml/min W tabeli 23 zestawiono otrzymane wartości zawartości PEG dla w/w trzech próbek z zastosowaniem tych samych kolumn i dwóch róŝnych eluentów- THF i DCM. Odchylenie standardowe w przypadku stosowania dichlorometanu (DCM) jest mniejsze niŝ w przypadku tetrahydrofuranu (THF). Dodatkowo wyniki oznaczeń PEG są nieco wyŝsze w obu przypadkach ze względu na niewielki zawartości substancji ekstrahowaych z drewna, jednak mniejsza ich ilość jest ekstrahowana z zastosowaniem dichlorometanu. Z tych powodów korzystniejsze jest stosowanie dichlorometanu, jako eluentu niŝ THF- u. TakŜe znacznie łatwiej oddestylować i odzyskiwać DCM, niŝ THF. W przypadku THF jest to utrudnione, tak ze względu na wyŝszą temperaturę wrzenia niŝ DCM, jak i na tworzące się nadtlenki, które trzeba redukować np. roztworem jodku potasu, a następnie konieczne jest odwodnienie THF. Kolumny na bazie kopolimeru styren- diwinylobenzen są stosunkowo kosztowne. W związku z tym zbadano moŝliwość wykorzystania wysokosprawnej kolumny (N>25000) wypełnionej Ŝelem krzemionkowym do rozdzielania glikoli 139

142 polietylenowych oraz formamidu jako eluentu o wysokiej polarności, zapewniającego brak adsorpcji badanych poliglikoli. Na rysunku 31 przedstawiono chromatogramy otrzymane w powyŝszych warunkach elucji i rozdzielania. Dodatkowo doświadczenie prowadzono w 5 temperaturach. Rysunek 31 NałoŜenie chromatogramów RID rozdzielania próbki mieszaniny PEG 400 i 4000 z zastosowaniem kolumny SiO 2, formamidu jako eluentu, przepływem 0,4 ml/min., A-20 C, B-30 C, C- 40 C, D- 50 C, E- 60 C. Zwiększenie temperatury powoduje poprawne rozdzielenie PEG 4000 i 400. PEG 4000 wykazuje niŝszą retencję od PEG400. Wskazuje to na mechanizm rozdzielania identyczny jak w przypadku chromatografii wykluczania, czyli na zasadzie efektu sita molekularnego. Nie moŝna wykluczyć, a wręcz są prawdopodobne, dodatkowe oddziaływania adsorpcyjne, które są, jak wiadomo, słabsze im wyŝsza jest temperatura rozdzielania. W przypadku układu faz normalnych wydaje się, Ŝe PEG 4000 powinno silniej oddziaływać z polarną faza stacjonarną, gdzie obie molekuły posiadają po dwie grupy OH, ale PEG 4000 znacznie więcej nieco polarnych połączeń C-O-C, chociaŝ, z drugiej strony, PEG 4000 powinien być bardziej hydrofobowy od PEG 400. Zastosowanie formamidu jako eluentu, ze względu na jego wysoką lepkość, powoduje wzrost ciśnienia nawet do około 400 barów, w temperaturze 20 C. Praca aparatury chromatograficznej przy tak wysokich ciśnieniach jest niekorzystna. Ze względu na to zastosowano jako eluent mieszaninę formamidu z tetrahydrofuranem, w stosunku 1:1- chromatografy na rysunku 32. NaleŜy zauwaŝyć iŝ stosowanie w fazie 140

143 ruchomej dodatkowo innego typu rozpuszczalników niŝ formamid, moŝe wpłynąć na polepszenie rozdzielczości, przez występowanie dodatkowo oddziaływań adsorpcyjnych (jeŝeli dodatek jest słabszym eluentem, o mniejszej sile elucji) w stosunku do PEG 4000, niŝ 400. Dodatek do formamidu THF powoduje zmniejszenie ciśnienia poniŝej 200 bar (20 C). Rozdzielenie PEG następuje dopiero po podwyŝszeniu temperatury analizy do 30 C. NiezaleŜnie od temperatury zastosowanie THF powoduje rozdzielenie frakcji PEG 400 na 2 składniki, co moŝna zaobserwować jako wybrzuszenie na piku odpowiadającego PEG 400. Zastosowanie stosunku 1:1 rozpuszczalników nie powoduje zmiany elucji PEG, jednak wzrost ilości THF do 70% powoduje, iŝ oddziaływania z fazą stacjonarną są silniejsze dla PEG 4000, który elucje z kolumny po PEG 400. Rysunek 32 Chromatogram RID rozdzielania próbki mieszaniny PEG 4000 (pierwszy pik) i 400 (drugi pik) z zastosowaniem kolumny z Ŝelem krzemionkowym i formamid: tetrahydrofuran 1:1 (v/v) jako eluentu, 0,4 ml/min., A-20 C, B-30 C, C-40 C, D- 50 C, E- 60 C. Rozdzielanie i oznaczanie jednocześnie poliglikoli i produktów ich przemianynieznacznie tylko róŝniących się masą molekularną od PEG- jest trudniejszym problemem separacyjnym od powyŝszego. Mieszaniny substancji zawierające PEG oraz mniej i bardziej polarne od PEG składniki będące produktami utleniania i wewnętrznych przemian PEG o bardzo podobnej masie molekularnej, nie rozdzielają się z wykorzystaniem chromatografii wykluczania. Zastosowanie chromatografii wykluczania okazało się nieskuteczne. Korzystne jest natomiast zastosowanie takich faz stacjonarnych, jak CN, DIOL, NH 2, albo NO 2 oraz taki dobór eluentu, aby oprócz 141

144 wykluczania, miały jednocześnie miejsce oddziaływania adsorpcyjne, zapewniające rozdzielenie PEG i składników róŝniących się polarnością od PEG. W przypadku rozdzielania PEG, o małych masach cząsteczkowych i wysokiej polarności, co następuje w tym przypadku mamy raczej do czynienia z mechanizm oddziaływań hydrofilowych (HILIC) niŝ ze zwykłą adsorpcja. Przykład zastosowania takich warunków rozdzielania PEG i podobnych przedstawiono na rysunku 33, gdzie zastosowano kolumnę typu NH 2 na bazie Ŝelu krzemionkowego modyfikowany grupami propyloaminowymi, oraz 5% wody w acetonitrylu, jako eluent. Rysunek 33 RID chromatogram, PEG 400 i produktów jego degradacji: 1-wykluczane wysokomolekularne produkty degradacji, 2,3-mniej polarne produkty degradacji, 4- PEG 400, 5-polarne produkty degradacji, A- chromatogram detektora HPLC- DAD w odwzorowaniu warstwicowym dla PEG 400 z produktami degradacji, kolumna NH 2, eluent: 5% H 2 O w ACN, 1,5 ml/min. Celowe jest, dodatkowo, zastosowanie przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie oraz, oprócz detektora refraktometrycznego, wykorzystanie takŝe detektora UV- DAD. UmoŜliwia to wykorzystanie widm w zakresie UV do identyfikacji substancji powstałych podczas rozkładu PEG i oznaczenie produktów rozkładu poliglikoli w przypadku posiadania wzorców odpowiednich substancji. Jak widać z rysunku 32 ewentualna potrzeba oznaczania wszystkich produktów degradacji PEG wymagałaby jednocześnie stosowania składników eluentu nie wykazujących absorpcji światła w zakresie do ok. 207nm, albo zastosowania innego typu detektora. W przypadku braku wzorców moŝna by dokonać oszacowania ich zawartości takŝe z wykorzystaniem 142

145 koncepcji Synoviec a, która jednak w zakresach niskich stęŝeń nie prowadzi do dokładnych wyników. Ogranicza to, jednocześnie, moŝliwe do stosowania składniki eluentu, do takich, które nie wykazują absorpcji światła w zakresie powyŝej 220nm. Rozdzielanie moŝna by wówczas wykonać z zastosowaniem tetrahydrofuranu i dichlorometanu jako dwóch alternatywnych eluentów. W przypadku chromatografii wykluczania, gdzie wyklucza się jakiekolwiek oddziaływania pomiędzy fazą stacjonarną, fazą ruchomą i substancjami rozdzielanymi, zastosowanie tej koncepcji jest prostsze niŝ w innych układach. Substancje o tych samych masach molekularnych wykazują zawsze tę samą retencję, a w/w rozpuszczalniki które moŝna zastosować jako eluenty róŝnią się znacznie współczynnikiem załamania światła. DuŜa róŝnica wartości współczynników załamania światła eluentów uŝywanych do rozdzielania zgodnie z koncepcją Synoviec a powinna zwiększyć dokładność oznaczenia. W tabeli 24 zestawiono wyniki oznaczania zawartości PEG, uzyskane dla tej samej próbki mieszaniny PEG obliczone na podstawie krzywej wzorcowej i koncepcji Synoviec a. Tabela 24 Zestawienie wyników wartości zawartości PEG 400 i 4000 w próbce ekstraktów z drewna z zastosowaniem krzywej kalibracyjnej i koncepcji Synoviec a. Zawartość PEG oznaczona wg krzywej kalibracyjnej Sr zawartość PEG oznaczona wg koncepcji Synoviec a Sr PEG ,82 0,24 24,34 1,58 PEG ,65 0,15 46, S r - odchylenia standardowe dla trzech równoległych oznaczeń Rozrzut wyników obliczonych na podstawie koncepcji Synoviec a (wzór ) wynosi około 5%, jednak odchylenie standardowe otrzymanych wyników wynosi 1,58, co stanowi od 4 (w przypadku PEG 4000) do 6% błędu oznaczenia (w przypadku PEG 400). W związku z tym koncepcję Synoviec a moŝna traktować jako oznaczenie orientacyjne. Jest, jednak, bardzo korzystna w przypadku nie posiadania wzorców substancji, np. w oznaczaniu polimerów dla, których wzorce są niedostępne lub ich otrzymanie we własnym zakresie jest bardzo czasochłonne. 143

146 7.4.5 Ścieki po oksydacji asfaltów Analiza ścieków powstających podczas procesu oksydacji asfaltów obejmuje zarówno analizę fazy ciekłej, jak i fazy gazowej. Fazę ciekłą stanowi faza wodna i olejowa. W badaniach przyjęto za cel cząstkowy oznaczanie składu fazy wodnej. Natomiast fazę olejowa powinna zostać efektywnie usunięta ze ścieków dzięki zastosowaniu odpowiednio dobranego koagulanta. Drugi aspekt badań to analiza fazy gazowej ścieku- opartej na analizie fazy nadpowierzchniowej ścieku, oddzielnie dla fazy wodnej i olejowej. Analiza fazy nadpowierzchniowej techniką chromatografii gazowej sprzęŝonej ze spektrometrią mas (GC- MS) pozwoliła na identyfikację części składników emitowanych do fazy gazowej. Na rysunku 34 zestawiono cztery chromatogramy otrzymane dla faz wodnych dwóch róŝnych rodzajów ścieków podestylacyjnych (rysunki 34 A i B) oraz ich faz olejowych (rysunki 34 C i D). W przypadku silnie zemulgowanego ścieku pochodzącego z instalacji 1020, pomiędzy piątą, a dwudziestą minutą rozdzielania, otrzymano bardzo podobny przebieg chromatogramu otrzymanego dla fazy olejowej zebranej z powierzchni tego ścieku. Natomiast klarowne i nie zemulgowane ścieki z instalacji 1000 mają diametralnie inny skład niŝ faza olejowa zebrana z ich powierzchni. W związku z tym naleŝy zaznaczyć, iŝ skład związków chemicznych emitowanych przez fazę organiczną jest inny niŝ skład fazy gazowej emitowany przez zdemulgowaną fazę wodną. Skuteczne usunięcie fazy olejowej ma kluczowe znaczenie dla odwaniania (usunięcia uciąŝliwych zapachów) ścieków. W tabeli 25 przedstawiono wyniki analizy jakościowej dla największych pików. 144

147 A B C D Rysunek 34 Zestawienie chromatogramów otrzymanych dla fazy nad-powierzchniowej (HS- GC- MS) dla ścieków: A- ściek z instalacji 1020 (w pewnym stopniu zemulgowany, mimo zastosowania operacji deemulgowania), B- ściek z instalacji 1000 oraz dla tych ścieków olejowych, C- faza olejowa ścieku 1020, D- faza olejowa ścieku Ścieki pochodzące z mycia gazów wylotowych z odpowiednich instalacji oksydacji asfaltów. 145

148 Tabela 25 Zestawienie wyników analizy techniką HS- GC- MS składników występujących w najwyŝszych stęŝeniach w fazie wodnej i olejowej ścieków pooksydacyjnych. ścieki 1020 ph 10 - faza wodna nie całkowicie zdemulgowana ścieki 1000 ph 1 - faza wodna czas retencji [min.] nazwa czas retencji [min.] nazwa 1,98 acetaldehyd 2,47 aceton 2,47 aceton 3,07 1-propanol 3,07 1-propanol 3,44 metylopropanal 3,41 butanal 4,19 2-butenal 5,07 pentanal 4,90 3-metylo-2-butanon 5,55 heptan 5,07 pentanal 7,04 2-metyloheptan 5,25 formamid 7,31 heksanal 7,09 2-heksanon 7,83 oktan 8,37 kwas butenowy 9,82 heptanal 10,30 nonan 11,19 kwas mewalonowy 12,49 1-decen 12,77 dekan 13,36 2,6-dimetylononan 14,87 1,2-dibutylocyklopropan 15,13 undekan 16,27 tetrametylobenzen 17,13 4- pentenal 17,37 dodekan 17,71 trimetylododekan faza olejowa 1020 faza olejowa ,79 nonanal 15,13 undekan 16,25 tetrametylobenzen 17,36 dodekan 17,09 dimetylocyklooktan 21,43 nonadekan 17,35 dodekan 26,68 heptadekan 17,69 dimetyloundekan 19,23 tridecen 19,44 tridekan 23,26 pentadekan 21,41 tetradekan 25,02 heksadekan 26,68 heptadekan Analiza GC- MS dostarcza wielu informacji na temat charakteru odoru emitowanego przez ścieki, jednak, wykonywana bez Ŝmudnego analizowania widm poszczególnych pików, nie dostarcza informacji o występowaniu związków siarkoorganicznych uznawanych za najbardziej złowonne substancje. W związku z tym do oznaczania związków chemicznych zawierających w swojej budowie siarkę wykorzystano technikę chromatografii gazowej sprzęŝonej z pulsacyjnym detektorem płomieniowofotometrycznym (GC- PFPD). Detektor PFPD jest detektorem niezwykle czułym na organiczne związki siarki (ok. 1 pg S) oraz jednocześnie, niezwykle selektywnym 146

149 (SEL>105). Na rysunku 35 przedstawiono przykładowy chromatogram otrzymany podczas analizy fazy nadpowierzchniowej ścieków pochodzących z instalacji 1020 (ph ok. 10). Analiza wykazała zawartość w oparach ścieków szerokiego spektrum związków siarki. Zestawienie nazw zidentyfikowanych substancji przedstawiono w tabeli 26. Substancje te zostały zidentyfikowane na podstawie porównania wartości czasu retencji z wartością czasu retencji poszczególnych wzorców lotnych związków siarki. Rysunek 35 Chromatogram otrzymany dla fazy nad-powierzchniowej dla ścieku z instalacji 1020, kolumna kapilarna 60m x 0,32mm x 1,0μm HP1, detektor PFPD. Tabela 26 Lista substancji wykrytych technika HS- GC- PFPD, w ściekach. substancje chemiczna siarkowodór 1-heksanotiol etanotiol 1,3-propanoditiol dwusiarczek węgla p-tiokrezol 2-propanotiol 1,4-butanoditiol 1-Propanotiol 1-heptanotiol tiofen sulfon dietylowy Dimetylo disiarczek benzylotiol 2-metylo tiofen siarczek dibutylu 3-metylo-1-butanotiol disiarczek dipropylu dimetylosulfotlenek disiarczek ditertbutylu 1-pentanotiol tiofenol 2-etylotiofen 2-izopropylobenzenotiol siarczek dipropylu 1-dekanotiol PowyŜsze wyniki świadczą o złoŝoności problemu powstawania złowonności i ukazują złoŝoność mieszaniny związków chemicznych w ściekach. Pełna identyfikacja związków chemicznych zawartych w fazie nad- powierzchniowej ścieków jest moŝliwa, ale wymagałaby niezwykle pracochłonnych i Ŝmudnych badań. Identyfikacja substancji niskolotnych moŝliwa jest tylko w części dzięki wykorzystaniu techniki chromatografii cieczowej z detekcją UV- VIS/DAD i RI. Pełna identyfikacja wymagałaby 147

150 zastosowania techniki LC- MS lub być moŝe dopiero LC- MS- MS. Monitorując stęŝenie substancji niskolotnych moŝemy kontrolować proces oczyszczania ścieków, lecz naleŝy, przede wszystkim, śledzić wartości parametrów sumarycznych lub wybranych markerów takich zjawisk jak złowonność czy toksyczność względem osadu czynnego. Istnieje teŝ duŝa szansa, Ŝe jednoczesne monitorowanie stęŝenia substancji organicznych w fazie nadpowierzchniowej dla określonej wartości ph i temperatury ścieku oraz oznaczanie ChZT wystarczy do monitorowania efektywności oczyszczania ścieków. Postanowiono dobrać grupę przedstawicieli substancji, występujących w ściekach, według, których przeprowadzona by była kalibracja dla zawartości grup substancji chemicznych występujących w ściekach pooksydacyjnych w róŝnych fazach ich podczyszczania.. W tym celu sporządzono ściek modelowy w skład, którego wchodziły substancje chemiczne zestawione w tabeli 26. Na podstawie wartości czasu retencji w warunkach układu faz normalnych podzielono składniki ścieku modelowego na 3 grupy substancji, tabela 26 i rysunek 36. Tabela 26 Lista substancji wchodzących w skład ścieku modelowego grupa GRUPA 1- G1 GRUPA 2- G2 GRUPA 3- G3 substancja chemiczna kwas mlekowy kwas octowy alkohol etylowy 2-butanon cykloheksanon fenol cycloheksanol aldehyd benzylowy eter metylowo- tert- butylowy etyloparaben β-naftol propyloparaben dibenzotiofen 148

151 Rysunek 36 Chromatogram UV- VIS 220 nm, otrzymany z zastosowaniem chromatografii cieczowej, kolumna RP 18e, 3 mm, 125 x 4 mm, faza ruchoma: metanol: woda 60:40 (v/v) ph= 3 (H 2 SO 4 ), 1 ml/min, objętość dozowana: 20 µl, EBF- 4,5 min. W badaniach wykorzystano dwa typy kolumn chromatograficznych, kolumny na bazie Ŝelu krzemionkowego: modyfikowane grupami oktadecylowymi oraz cyjanopropylowymi. Korzystne, dla rozdzielania składników ścieków jest zastosowanie pierwszego typu kolumny, której powierzchnia sorpcyjna jest bardziej hydrofobowa. Konieczne jest równieŝ utrzymanie fazy ruchomej o ph w zakresie 3. Najlepszy, jako dodatek kwasowy, okazał się kwas siarkowy (spośród kwasu fosforowego, trifluorooctowego i siarkowego). Eluent z dodatkiem kwasu siarkowego nie absorbuje promieniowania UV. Dodatkowo, w przypadku stosowania detektora RI, kwas siarkowy obniŝa współczynnik załamania światła fazy ruchomej. Pozostałe kwasy wykazują absorpcję światła w zakresie najwyŝszej absorpcji światła składników ścieków (około nm), co uniemoŝliwia analizę chromatogramów przy niskich długościach fali. W zaleŝności od typu ścieku otrzymujemy charakterystyczne chromatogramy UV- DAD- rysunek 37, na podstawie których moŝna określić rodzaj ścieku. Widać, Ŝe ściek 1000 zawiera znaczny udział substancji o średniej hydrofobowości, a 1020 szczególnie duŝo substancji o niskiej a takŝe względnie wysokiej hydrofobowości. 149

152 Rysunek 37 Chromatogramy UV- DAD dla faz wodnych surowych ścieków pooksydacyjnych nie zawierających siarczków, wodorotlenków i węglanów.a- ściek z instalacji 1000, B- ściek z instalacji 1020, C- slopy ciemne. Wysokosprawna chromatografia cieczowa, kolumna RP 18e, 3 mm, 125 x 4 mm, faza ruchoma: metanol: woda 60:40 (v/v) ph= 3 (H 2 SO 4 ), 1 ml/min, objętość dozowana: 20 µl. Opracowane procedury wykorzystano do oceny stopnia oczyszczenia ścieków. Rysunek 38 przedstawia wyniki badania utleniania ścieków 1020 w warunkach procesu Fentona. Zastosowanie ok. 15% utleniacza względem chemicznego zapotrzebowania tlenu (ChZT) oraz naświetlania promieniowaniem UV, pozwoliło na zredukowanie ChZT o ok. 94%, juŝ w ciągu pierwszych piętnastu minut. RównieŜ analiza HPLC- RP wykazała, Ŝe największe zmiany stęŝeń zachodzą w ciągu pierwszych 15 minut. Natomiast analiza fazy nadpowierzchniowej wykazała, Ŝe ścieki zmniejszają emisję związków organicznych niemal liniowo, osiągając po 120 minutach oczyszczania poziom ok. 99% redukcji. 150