ĆWICZENIE NR 3 IDENTYFIKACJA CUKRÓW PROSTYCH I ZŁOŻONYCH REAKCJAMI BARWNYMI. HYDROLIZA SACHAROZY

Transkrypt

1 ĆWICZENIE N 3 IDENTYFIKACJA CUKÓW PSTYC I ZŁŻNYC EAKCJAMI BAWNYMI. YDLIZA SACAZY Ćwiczenie składa się z dwóch części. Pierwsza część ma na celu zapoznanie się z charakterystycznymi barwnymi reakcjami węglowodanów oraz ich identyfikacje w otrzymanych zestawach roztworów węglowodanów jedno- i dwuskładnikowych. gólny tok analizy i wnioskowania został przedstawiony na Schemacie 1. Druga część ćwiczenia dotyczy hydrolizy sacharozy (kwasowej i enzymatycznej) oraz wykryciu produktów hydrolizy za pomocą prób Fehlinga i Benedicta (próby na cukry redukujące). 1. Analiza jakościowa węglowodanów Schemat 1. Analiza roztworu nieznanego cukru 1

2 Materiał badany: dczynniki: Zestaw sześciu jednoskładnikowych wodnych roztworów węglowodanów (ksyloza, glukoza, fruktoza, sacharoza, laktoza lub skrobia) Dwa dwuskładnikowe wodne roztwory zawierające wybrane węglowodany 1% roztwory węglowodanów: ksylozy, glukozy, fruktozy, sacharozy, laktozy, skrobii 10% etanolowy roztwór α-naftolu 98% 2S4 (stężony) dczynnik Biala (0,2% roztwór orcyny w 20% wodnym roztworze Cl) 1% roztwór FeCl3 62 Płyn Lugola - roztwór I2 w KI: (2 g KI rozpuszczone w 5 ml 2, w tym roztworze rozpuszczono 1 g jodu i uzupełniono wodą do 300 ml. Przed użyciem rozcieńczono 150 razy) dczynnik Seliwanowa (2% roztwór rezorcyny w 99,8% etanolu) 12% wodny roztwór Cl 28,0-30,0% wodny roztwór amoniaku (stężony) 3% wodny roztwór K odczynnik Barfoeda (24 g octanu miedzi(ii) rozpuszczono w 450 ml gorącej wody. Dodano 25 ml 8,5% roztworu kwasu mlekowego. Po rozpuszczeniu soli odczynnik oziębiono i uzupełniono w kolbie miarowej do objętości 500 ml) 5% roztwór azotanu(v) srebra 10% wodny roztwór amoniaku Szkło i sprzęt laboratoryjny: Zestaw probówek szklanych w statywie Korki dopasowane do probówek szklanych Pipety automatyczne 2-10 µl, µl Pipety szklane o pojemności 5 ml Gruszki do pipet szklanych Termostatowana łaźnia wodna 2

3 1.1. Próba Molischa - ogólna reakcja na cukry Cukry w obecności stężonych kwasów nieorganicznych takich jak kwas siarkowy(vi) lub kwas solny w temperaturze pokojowej ulegają odwodnieniu i cyklizacji tworząc aldehydy cykliczne, pochodne furanu (Schemat 2). dwodnienie pentoz prowadzi do przekształcenia ich w furfural (Schemat 2.A), natomiast heksoz w 5-hydroksymetylofurfural (Schemat 2.B). Schemat 2. eakcja odwodnienia węglowodanów w środowisku kwaśnym dla (A) pentoz oraz (B) heksoz dwodnieniu najłatwiej ulegają pentozy, wśród heksoz natomiast ketozy. Disacharydy reagują znacznie wolniej niż monosacharydy aczkolwiek znacznie szybciej niż polisacharydy. W przypadku oligo- i polisacharydów, proces ten poprzedzony hydrolizą cukru, przebiega wolniej wraz ze wzrostem długości łańcucha sacharydowego. Powstałe pochodne furanu kondensują z różnymi fenolami, chinonami lub aminami aromatycznymi (naftolem, tymolem, rezorcyną) tworząc barwne produkty wykorzystywane do wykrywania cukrów. Próba Molischa jest najbardziej ogólną reakcją na węglowodany zarówno wolne jak i związane. Ujemny jej wynik pozwala jedynie wykluczyć obecność cukrowca, dodatni zaś nie jest wystarczający do stwierdzenia jego obecności, ze względu na małą specyficzność tej reakcji, gdyż w jej wyniku barwny produkt dają również aldehydy, aceton, kwas szczawiowy, mrówkowy lub cytrynowy. W przypadku reakcji Molischa z -naftolem wynikiem kondensacji jest produkt o barwie fioletowej (Schemat 3). 3

4 C 2 -naftol :, C 2 pochodna furfuralu czerwono-fioletowy produkt kondensacji Schemat 3. eakcja kondensacji α-naftolu z pochodnymi furanu Wykonanie próby Molischa: Do 1 ml badanego roztworu cukru dodać 2 krople (lub 60 µl) 10% etanolowego roztworu - naftolu i dokładnie wymieszać. Następnie lekko przechylić probówkę, powoli i bardzo ostrożnie po ściankach wprowadzić około 1 ml stężonego 98% 2S4, tak aby widoczna była granica między cieczami. Powstający na granicy roztworów czerwono-fioletowy pierścień świadczy o dodatnim wyniku próby Próba Tollensa wykrywanie cukrów redukujących Cukrami redukującymi nazywamy węglowodany, które redukują odczynniki utleniające takie jak odczynnik Fehlinga (Cu 2+ w wodnym roztworze winianu sodu), Benedicta (Cu 2+ w wodnym roztworze cytrynianu sodu) lub Tollensa (Ag + w wodnym roztworze N3). W roztworach obojętnych i słabo kwaśnych w temperaturze pokojowej cukry występują głownie w formie pierścieniowej, która pozbawiona jest wolnej grupy redukującej (aldehydowej lub ketonowej), gdyż uczestniczy ona w tworzeniu wewnątrzcząsteczkowego hemiacetalu. W środowisku zasadowym lub silnie kwaśnym cukry tworzą przede wszystkim formy łańcuchowe z wolnymi grupami karbonylowymi. Do cukrów redukujących należą wszystkie monosacharydy, zarówno aldozy zawierające aldehydową grupę karbonylową, (niezwykle łatwo redukują słabe utleniacze) jak również ketozy, zawierające ketonową grupę karbonylową, które mimo iż nie reagują ze słabymi utleniaczami to w warunkach zasadowych w wyniku występowania równowag keto-enolowych łatwo izomeryzują do aldozy. Cukrami redukującymi są również dwucukry takie jak maltoza, laktoza i celobioza. Szczególny wyjątek stanowi sacharoza która podobnie jak polisacharydy nie należy do cukrów redukujących. dczynnik Tollensa otrzymuje się dodając wody amoniakalnej do roztworu azotanu(v) srebra (Schemat 4.A). Powstający brunatny osad tlenku srebra(i) rozpuszcza się w nadmiarze amoniaku. Powstaje jon kompleksowy diaminasrebra(i) [Ag(N3)2] + (Schemat 5.B). Wprowadzenie do odczynnika Tollensa cukru o właściwościach redukujących (z aktywną grupą aldehydową) powoduje redukcję jonów srebra(i) do metalicznego srebra tworzącego lustro srebrowe (Schemat 5.C). Mimo, iż próba Tollensa jest ogólną reakcją na aldehydy nie można za jej pomocą odróżnić ketoz od aldoz, gdyż pozytywny wynik uzyskuje się również w przypadku α-hydroksyketonów (np. fruktoza z grupą ketonową). 4

5 A 2AgN3 + 2N3 + 2 Ag2 + 2 N4N3 B Ag2 + 4N [Ag(N3)2] C + 2 [Ag(N3)2] Ag + 4 N3 + 2 Schemat 5. eakcje powstawania lustra srebrowego w obecności cukru (Próba Tollensa) Wykonanie próby Tollensa: Do probówki odmierzyć 1 ml 5% roztworu azotanu(v) srebra AgN3, następnie dodawać po kropli 10% roztworu amoniaku do momentu, aż powstały brunatny osad Ag2 rozpuści się w nadmiarze amoniaku. Dodać 1 ml badanego roztworu cukru i dokładnie wymieszać po czym wstawić do łaźni wodnej i obserwować wynik reakcji. NIE DPUSCIC D WYSCNIECIA TEG UKLADU! 1.3. Próba Lugola wykrywanie polisacharydów Polisacharydy w odróżnieniu od oligo- i monosacharydów tworzą z jodem barwne kompleksy, co pozwala na ich jednoznaczne odróżnienie, gdyż kompleksy z jodem mogą tworzyć tylko cząsteczki odpowiednio duże i o uporządkowanej strukturze. Jednym z najpopularniejszych polisacharydów roślinnych jest skrobia, która występuje w dwóch formach: α-amylozy (10-30%) i amylopektyny (70-90%). Liniową strukturę łańcucha α-amylozy tworzą mery D-glukozy połączone wiązaniami α-1,4-glikozydowymi (ysunek 1.A). Pomimo słabej rozpuszczalności w wodzie α-amyloza tworzy micele, w których łańcuch polisacharydowy przyjmuje konformację helikalną (ysunek 1.B). oztwory skrobii oraz innych polisacharydów pod wpływem wodnego roztworu jodu przyjmują intensywnie niebieskie barwy. W wyniku tej reakcji następuje adsorpcja kanałowa jodu przez polisacharydy, który wnikając do kanału utworzonego przez helikalnie skręcone łańcuchy węglowodanów, jest przetrzymywany przez tlen przy pierwszym i czwartym atomie węgla każdej cząsteczki glukozy (ysunek 2). Jedna cząsteczka jodu przypada na sześć reszt glukozylowych, czyli na jeden skręt helisy. ddziaływanie jednostek polisacharydu z cząsteczkami jodu ma charakter niekowalencyjny, opierający się głównie na siłach Van der Waalsa i wiązaniach typu przeniesienia ładunku (charge transfer). Wzdłuż wytworzonego w ten sposób łańcucha drobin jodu przemieszczają się elektrony, efektem tej delokalizacji elektronowej jest silne pochłanianie światła przez układ. bserwowana barwa zależy od budowy i stopnia rozgałęzienia łańcucha polisacharydu. Amyloza z jodem daje zabarwienie intensywnie niebieskie. Barwa kompleksów jodu z polisacharydami o krótszych łańcuchach zmienia się na fioletowoczerwoną (amyloza) i czerwoną (dekstryny). Glikogen daje kompleks o barwie czerwonej. grzewanie powoduje rozkręcenie się helisy, jod zostaje uwolniony co jest przyczyną zaniku zabarwienia. 5

6 ysunek 1. Struktura i konformacja dwóch form w jakich występuje skrobia: liniowej α-amylozy oraz rozgałęzionej amylopektyny (J.Koolman, K.. öhm, Color Atlas of Biochemistry 2 nd edition, Thieme 2005,..Garrett i C.M.Grischam, Biochemistry 5th edition, Brooks/Cole Cengage Learning 2013) Wykonanie próby Lugola: Do 1 ml badanego roztworu dodać trzy krople (lub 90 µl) roztworu jodu (I2) w jodku potasu (KI). W obecności skrobii powstaje ciemnoniebieskie zabarwienie. Następnie próbkę, w której zaobserwowano niebieską barwę, ogrzać do wrzenia na łaźni wodnej, zaobserwować czy zabarwienie znika, po czym próbkę schłodzić pod bieżącą wodą i zaobserwować czy zabarwienie powraca. ysunek 2. Konformacja helikalna zawiesiny amylozy w wodzie. Cząsteczki jodu umiejscowione są w środku spirali amylozy tworząc charakterystyczny kompleks o barwie niebieskiej (..Garrett i C.M.Grischam, Biochemistry 5th edition, Brooks/Cole Cengage Learning 2013) 6

7 1.4. Próba Biala odróżnienie pentoz od heksoz Pentozy podczas ogrzewania ze stężonymi kwasami nieorganicznymi ulegają odwodnieniu przekształcając się w furfural, który w reakcji z orcyną i w obecności jonów żelaza(iii) tworzy kompleks o barwie szaro-niebieskiej. eksozy natomiast przekształcając się w hydroksymetylofurfural w tych samych warunkach reaguję znacznie słabiej dając kompleksy o barwie zielonej, czerwonej lub brązowej (Schemat 6). C 2 + +, 0.5 eq C 3 C 3 C 3 :, C 2 orcyna pochodna furfuralu Schemat 6. eakcja kondensacji orcyny z pochodnymi furanu zielononiebieski produkt kondensacji Wykonanie próby Biala: Do probówki wprowadzić 2 ml odczynnika Biala (0,2% roztworu orcyny w 20% roztworze Cl) a następnie dodać kroplę (lub 30 µl) 1% FeCl3 62 i 0,5 ml badanej próbki. Całość wymieszać i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 5 min eakcja Seliwanowa odróżnienie ketoz od aldoz eakcja Seliwanowa jest wykorzystywana do odróżnienia ketoz od aldoz na zasadzie różnicy w szybkości odwadniania tych cukrów. Ketozy ogrzewane w 12% Cl w temperaturze 100 o C w ciągu 30 sekund ulegają odwodnieniu do 5-hydroksymetylofuranu. W tych warunkach aldozy nie ulegają odwodnieniu co pozwala na ich zróżnicowanie od heksoz. Powstały 5- hydroksymetylenofurfural kondensuje z rezorcyną tworząc kompleks o barwie czerwonofioletowej (Schemat 7). C 2 + +, 0.5 eq rezorcyna pochodna furfuralu :, C 2 Schemat 7. eakcja kondensacji rezorcyny z pochodnymi furanu 7 czerwono-fioletowy produkt kondensacji! Użycie kwasu bardziej stężonego jak również wydłużenie czasu ogrzewania lub podwyższenie temperatury może sprawić iż reakcji tej ulegną również aldozy.! Próba ta daje również wynik pozytywny w przypadku wielocukrów zawierających jednostki ketozowe.

8 Wykonanie reakcji Seliwanowa: Do 0,5 ml badanego roztworu cukru dodać 1 ml 12% roztworu Cl oraz kroplę (lub 30 µl) 2% roztworu rezorcyny w etanolu. Po wymieszaniu zawartości probówki wstawić do wrzącej łaźni wodnej na około 30 sekund, a następnie szybko oziębić w strumieniu zimnej wody eakcja Wöhlkego odróżnienie dwucukrów redukujących od cukrów prostych Podczas ogrzewania roztworów dwucukrów redukujących (laktoza, maltoza) z amoniakiem w obecności K powstaje produkt o czerwonym zabarwieniu. Cukry proste natomiast w tych samych warunkach tworzą żółto-brązowy produkt. eakcja ta wykorzystywana jest do odróżniania dwucukrów redukujących od cukrów prostych. Wykonanie: Do 1 ml badanej próbki dodać 1 ml stężonego roztworu amoniaku i 3 krople (lub 90 µl) 3% wodnego roztworu K. Wstawić do łaźni wodnej na kilka minut i obserwować powstałe zabarwienie. 2. ydroliza sacharozy Sacharoza jest disacharydem złożonym z dwóch reszt monosacharydów połączonych ze sobą wiązaniem -1,2-glikozydowym. Sacharoza zbudowana jest z reszty glukozy (-Dglukopiranozy) oraz fruktozy (-D-fruktofuranozy) (ysunek 3). C 2 2 C 1 2 C 2 ysunek 3 Struktura sacharozy sacharoza α-d-glukopiranozylo-(1 2)-β-D-fruktofuranoza W środowisku kwaśnym jak również pod wpływem enzymu zwanego inwertazą sacharoza bardzo łatwo ulega hydrolizie do β-d-fruktozy i do α-d-glukozy (Schemat 8). C lub enzymy 2 C C sacharoza -D-glukoza -D-fruktoza Schemat 8. ydroliza sacharozy 8

9 Materiał badany: dczynniki: 1% wodny roztwór sacharozy 2M wodny roztwór Cl 10% wodny roztwór Na dczynnik Fehlinga I (7% CuS4 52) dczynnik Fehlinga II (35% roztwór winianu sodowo-potasowego w 10% wodnym roztworze Na) Zawiesina drożdży w wodzie dczynnik Benedicta (w 700 ml wrzącej wody rozpuszczono 173 g cytrynianu sodu i 100g Na2C3. Po ochłodzeniu dodano powoli 100 ml 17,3% CuS4 52, stale mieszając. Uzupełniono wodą do 1000 ml) Szkło i sprzęt laboratoryjny: Probówki szklane Statyw na probówki Łaźnia wodna o temperaturze 100 o C 2.1. ydroliza kwasowa sacharozy W środowisku alkalicznym formy pierścieniowe cukrów przechodzą w formy łańcuchowe, co powoduje pojawienie się wolnej grupy aldehydowej lub ketonowej. Grupy te charakteryzują się właściwościami redukcyjnymi. Wszystkie cukry proste oraz niektóre dwucukry (maltoza, laktoza, celobioza) wykazują właściwości redukujące. Sacharoza nie posiada właściwości redukujących ze względu na zaangażowanie obu hydroksyli półacetalowych w wiązaniu glikozydowym (jednostki glukozowej i fruktozowej). Pod wpływem hydrolizy kwasowej (już w obecności słabych kwasów) następuje rozerwanie wiązania glikozydowego i uwolnienie grupy aldehydowej glukozy i ketonowej fruktozy. Wykonanie: Do 0,5 ml roztworu sacharozy dodać 1 kroplę (lub 30 µl) 2M wodnego roztworu Cl i wymieszać. Mieszaninę ogrzewać w łaźni wodnej o temperaturze 100 o C przez ok. 2 min. Po schłodzeniu, próbę zalkalizować dodając 0,5 ml 10% wodnego roztworu Na. Wykonać próbę Fehlinga zgodnie z procedurą opisaną w punkcie Próba Fehlinga Cukry redukujące, jak już wspomniano w punkcie 1.2. można wykryć między innymi za pomocą próby Fehlinga, którą przeprowadza się z wykorzystaniem wodnego roztworu CuS4 (Fehling I) oraz alkalicznego roztworu winianu sodowo-potasowego (Fehling II). W obecności związku zawierającego grupę karbonylową następuje redukcja jonów Cu 2+ do jonów Cu + z utworzeniem ceglastoczerwonego osadu tlenku miedzi(i). Winian sodowo potasowy tworząc związki kompleksowe z jonami Cu 2+ zapobiega powstawaniu niebiesko-zielonego osadu 9

10 wodorotlenku miedzi(ii). Dodatnią próbę Fehlinga, poza cukrami redukującymi, dają również chloroform, kreatyna i kwas moczowy. Na K Cu 10 Na Cu() K Na + 2 Cu K Schemat 9. Schemat redukcji odczynnika Fehlinga Wykonanie próby Fehlinga: Na + + Cu 2 Do probówki wprowadzić 0,5 ml odczynnika Fehlinga I (wodny roztwór CuS4) oraz 0,5 ml odczynnika Fehlinga II (alkaliczny roztwór winianu sodowo-potasowego). Następnie dodać dwie krople (lub 60 µl) badanego hydrolizatu sacharozy i dokładnie wymieszać. Mieszaninę ogrzewać do wrzenia w łaźni wodnej obserwując zmiany. W obecności cukrów redukujących wytrąca się ceglastoczerwony osad Cu Enzymatyczna hydroliza sacharozy Drożdże piekarskie zawierają enzym zwany -inwertazą, który katalizuje hydrolizę wiązania -glikozydowego, hydrolizując sacharozę do β-d-fruktozy i α-d-glukozy Wykonanie: Do trzech probówek wprowadzić po 0,5 ml zawiesiny drożdży w wodzie (Tabela 1). Do pierwszej (próba kontrolna) dodać 0,5 ml 2. Drugą wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 100 o C na 10 min. Po upływie tego czasu do probówki drugiej i trzeciej dodać po 0,5 ml roztworu sacharozy i wymieszać. Następnie z każdej probówki pobrać po 0,5 ml roztworu i przenieść do oddzielnych probówek, po czym wykonać próbę Benedicta zgodnie z procedurą opisaną w punkcie Tabela 1 Nr probówki Zawiesina drożdży [ml] 0,5 0,5 0,5 2 [ml] 0,5 - - Temperatura/czas r.t./10 min. 100 o C/10 min. r.t./10 min. Sacharoza [ml] - 0,5 0,5 r.t. temperatura pokojowa, 25 o C K

11 Próba Benedicta Próba Benedicta należy do najbardziej specyficznych i czułych prób redukcyjnych na cukry, jest charakterystyczna wyłącznie dla aldehydów alifatycznych. Wolne grupy aldehydowe węglowodanów jak już wspomniano w punkcie 1.2. w środowisku zasadowym wykazują właściwości redukujące. Aktywna w tych warunkach forma aldehydowa redukuje jony miedzi(ii) z odczynnika Benedicta do jonów miedzi(i). Powstający w tej reakcji osad tlenku miedzi(i) Cu2 w zależności od stężenia roztworu cukru redukującego ma różne zabarwienie (Tabela 2). Już 0,1% stężenie cukru redukującego powoduje zmianę barwy z niebieskiej na zieloną. Zielone zabarwienie jest wynikiem zmieszania pomarańczowej zawiesiny Cu2 z niebieskim odczynnikiem Wykonanie: Do każdej probówki dodać po 2,5 ml odczynnika Benedicta, następnie wszystkie probówki wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 3 min. Zaobserwować, w której probówce pojawia się zielone zabarwienie albo żółty, pomarańczowy lub czerwony osad (barwa powstającego osadu zależy od ilości cukru redukującego w roztworze). Zaznaczyć w których probówkach próba wypada ujemnie i wyjaśnić dlaczego. Tabela 2. cena ilości cukru w badanej mieszaninie na podstawie próby Benedicta Barwa sad Stężenie cukru [%] niebieska - 0 zielona - 0,1 0,3 zielona + 0,5 żółto-zielona + 1,0 pomarańczowa + 1,5 czerwona + >2,0 11