Inżynieria białek I Wykład 1 (2014/20155) Magdalena Tworzydło Zakład Biochemii Fizycznej, WBBiB UJ

Transkrypt

1 Inżynieria białek I Wykład 1 (2014/20155) Magdalena Tworzydło Zakład Biochemii Fizycznej, WBBiB UJ

2 Kurs Inżynieria białek I Twórca kursu prof. dr hab. Zygmunt Wasylewski ( ) Cel przeprowadzić studentów biotechnologii/biologii przez całą trasę, od zaprojektowania genu, poprzez produkcję białka rekombinowanego w wybranym systemie ekspresyjnym, jego oczyszczanie, aż do badań strukturalnych Koordynator kursu dr Magdalena Tworzydło 13 wykładów dr Magdalena Tworzydło (10) i dr Andrzej Górecki (3) 12 ćwiczeń dr Ewelina Fic, dr Sylwia Łukasiewicz dr Magdalena Tworzydło

3 Strona:

4 Tematy wykładów Tworzenie konstruktów do produkcji białek rekombinowanych: PCR, termostabilne polimerazy modyfikacje genów: mutageneza punktowa, delecje, insercje, wprowadzanie miejsc cięcia dla enzymów restrykcyjnych, tworzenie genów fuzyjnych enzymy restrykcyjne, klonowanie, wektory plazmidowe Oczyszczanie i renaturacja białek rekombinowanych: Produkcja białek rekombinowanych: regulacja ekspresji genów wektory i szczepy ekspresyjne warunki hodowli izolacja białek z komórek gospodarza etykietki wykorzystywane w procesie oczyszczania czynniki denaturujące i renaturujące wykorzystywane przy refałdowaniu białek Synteza i sekwencjonowanie DNA: synteza DNA metodą triestrów fosforynu sekwencjonowanie DNA metodą Sangera Najczęściej wykorzystywane systemy ekspresyjne: bakteryjne, drożdżowe, owadzie, ssacze, bezkomórkowe (cell-free systems)

5 Definicje Białka rekombinowane (ang. recombinant proteins, r-proteins) Białka, które powstały w żywych organizmach (lub liniach komórkowych) w wyniku ekspresji rekombinowanego DNA. Rekombinowany DNA jest efektem złożenia za pomocą wybranych technik laboratoryjnych fragmentów materiału genetycznego pochodzących z różnych źródeł/organizmów. Utworzone w ten sposób sekwencje DNA nie występują naturalnie w przyrodzie. Jednak dzięki obecności odpowiednich elementów regulatorowych mogą być powielane oraz mogą ulegać ekspresji po wprowadzeniu do komórek gospodarza. Ukierunkowana mutageneza (ang. site-directed/site-specific mutagenesis) Technika, umożliwiająca wprowadzenie mutacji w ściśle określonym miejscu łańcucha DNA. Aby można ją było zastosować, konieczna jest znajomość wyjściowej sekwencji nukleotydów w genie. Obecnie, ukierunkowaną mutagenezę przeprowadza się standardowo w oparciu o łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) i odpowiednio zmodyfikowane oligonukleotydy (startery).

6 PCR Cykl 1 Cykl Denaturacja (95 C) Powielany fragment DNA powielany odcinek DNA przyłączenie starterów (45-65 C) i wydłużanie nici DNA (72 C) Cykl matrycowy DNA produkt reakcji z cyklu 1 produkt reakcji z cyklu 2 produkt reakcji z cyklu

7 PCR, w praktyce wygląda to tak Powielany fragment DNA sekwencja startera 1 (forward, left) pokrywa się z sekwencją nici sensownej (kodującej) Sekwencja startera 2 (reverse, right) pokrywa się z sekwencją nici antysensownej (matrycowej)

8 Mutageneza ukierunkowana, Overlap extension PCR OE PCR, metoda wydłużania nakładających się odcinków PCR 1 A C PCR 2 D B PCR 3 A B

9 Mutageneza ukierunkowana, Overlap extension PCR PCR 1 PCR 2 PCR 3 OE PCR, metoda wydłużania nakładających się odcinków A reakcja 1 reakcja 2 starter C starter B starter A starter D C produkt reakcji 1 produkt reakcji 2 A zmieszanie denaturacja rehybrydyzacja nie ulega wydłużeniu D dntp, polimeraza, startery B i A ulega wydłużeniu B produkt reakcji 3

10 Mutageneza ukierunkowana, Megaprimer PCR PCR1 Megaprimer = produkt PCR1 PCR2 Produkt PCR2

11 Wprowadzanie modyfikacji na końcach genów Wykorzystanie zmodyfikowanych starterów do wprowadzania mutacji na i końcu genu Wprowadzenie/usuwanie sekwencji Shine-Dalgarno/Kozak, kodonu STOP, kodonu START, miejsc cięcia dla enzymów restrykcyjnych

12 Modyfikacje DNA, wprowadzanie delecji przy pomocy PCR Na początku lub na końcu genu PCR 1 startery A i C A W środku genu C D PCR 3 startery A i B PCR 2 startery D i B B

13 Mutageneza ukierunkowana c.d., metoda Quik Change Stratagene 1. Wektor z genem wyizolowany z bakterii dam +, docelowe miejsce wprowadzenia mutacji 2. Startery wprowadzające mutację są do siebie komplementarne 3. Powielanie dwóch nici wektora, wprowadzenie mutacji 4. Trawienie bakteryjnego DNA, usunięcie nici nie zawierających mutacji Większość szczepów E. coli prowadzi metylację dam +. Endonukleaza DpnI rozpoznaje i trawi jedynie metylowaną sekwencję 5 -G m6 ATC-3.

14 Quik Change warunki reakcji Etap Cykl Temperatura Czas QC PCR C 30 sek C 55 C 68 C 30 sek. 1 min 1 min/1kz DNA Etap Cykl Temperatura Czas C 3 min Normalny PCR A B C 55 C 72 C 30 sek. 1 min 1 min/1kz DNA 1A denat. 94 C/60 sek. 2A denat. 94 C/30min/bez DNA matrycowego/test. aktywności polimerazy 3A denat. 94 C/10 sek./z DNA matrycowym W wysokiej temperaturze DNA może ulegać depurynacji. Proporcjonalnie, dłuższe matryce będą bardziej uszkodzone niż krótkie. Przy powielaniu długich fragmentów DNA istotne jest skrócenie czasu denaturacji oraz obniżenie temperatury wydłużania.

15 Klonowanie klasyczne fragment DNA zawierający interesujący nas gen wektor fragment DNA (wstawka) po trawieniu enzymami restrykcyjnymi BamHI i EcoRI ligacja (ligaza DNA) wektor pocięty enzymami restrykcyjnymi BamHI i EcoRI wektor po wklonowaniu wstawki rekombinowanego DNA

16 Metoda OE PCR cloning klonowanie przy pomocy PCR Wektor, do którego chcemy wprowadzić gen Gen, który chcemy wprowadzić do wektora Projektujemy startery, częściowo komplementarne do genu a częściowo komplementarne do wektora W wyniku reakcji PCR otrzymujemy gen, na którego końcach znajdują się sekwencje komplementarne do wektora Tak zmodyfikowany gen wykorzystywany jest w kolejnej reakcji PCR, gdzie służy za starter Po zakończeniu reakcji zmetylowany wektor, który służył jako matryca zostaje pocięty za pomocą enzymu DpnI Namnożony,niezmetylowany wektor z wklonowanym genem zostaje wprowadzony do komórek gospodarza, gdzie gen może ulec ekspresji

17 Enzymy restrykcyjne a metylacja DNA Enzymy restrykcyjne (endonukleazy) występują naturalnie u sinic i bakterii. Razem z komplementarnymi metylazami tworzą system restrykcji-modyfikacji, dzięki któremu mikroorganizmy bronią się przed wnikaniem obcego DNA, np. bakteriofagów. Specyficzna metylacja własnego DNA służy ochronie przed restryktazami syntetyzowanymi przez organizm obcy DNA, niemetylowany według określonego wzoru, ulega degradacji.

18 Enzymy restrykcyjne klasyfikacja uproszczona WŁAŚCIWOŚĆ TYP I TYP II TYP III RESTRYKCJA i MODYFIKACJA STRUKTURA NUKLEAZY Jedno białko posiada obie aktywności Metylaza i endonukleaza występują osobno Heterotrimer Homodimer Heterodimer Osobne enzymy wymieniające się wspólną podjednostką KOFAKTORY ATP, Mg 2+, SAM (S-adenozylometionina) Mg 2+ Mg 2+, SAM SEKWENCJA/E ROZPOZNAWANE PRZEZ NUKLEAZĘ Dwie sekwencje w dowolnej orientacji MIEJSCE CIĘCIA DNA Przypadkowe, około 1000 zasad od miejsca rozpoznawanego przez nukleazę Pojedyncza sekwencja palindromowa (4 8 nukl.) W obrębie (lub blisko miejsca) rozpoznawanego przez nukleazę Dwie sekwencje obok siebie, w przeciwnej orientacji nukleotydów od miejsca rozpoznawanego przez nukleazę, po stronie MIEJCE METYLACJI DNA W obrębie sekwencji rozpoznawanej przez nukleazę W obrębie sekwencji rozpoznawanej przez nukleazę W obrębie sekwencji rozpoznawanej przez nukleazę Ze względu na swoją charakterystykę w biotechnologii wykorzystywane są jedynie enzymy typu II.

19 Enzymy restrykcyjne EcoRI EcoRV PstI Izoschizomery enzymy pochodzące z różnych organizmów, rozpoznające te same sekwencje i tnące je w ten sam sposób, np. MspI i HpaII 5'...C^C G G...3' 3'...G G C^C...5' Neoizoschizomery enzymy pochodzące z różnych organizmów, rozpoznające te same sekwencje, ale tnące je w różny sposób, np. SmaI 5'...C C C^G G G...3 i XmaI 5'...C^C C G G G...3 3'...G G G^C C C...5 3'...G G G C C^C...5

20 Metylacja Dam i Dcm u E. coli Metylazy przenoszą grupę metylową z S-adenozylo-metioniny (SAM) na określony nukleotyd w rozpoznawanej przez siebie sekwencji. Metylaza Dam rozpoznaje sekwencję -GATC- i metyluje adeninę w pozycji N6. Metylaza Dcm rozpoznaje sekwencje -CCAGG- i -CCTGG- i metyluje drugą cytozynę w pozycji C5. Niektóre enzymy restrykcyjne rozpoznają wyłącznie sekwencje metylowane (np. DpnI), inne oba rodzaje sekwencji (np. BamHI), jeszcze inne wyłącznie sekwencje niemetylowane (np. XbaI, MboI itd.). W tym ostatnim przypadku, pojawienie się metylacji Dam i Dcm w obrębie miejsc restrykcyjnych rozpoznawanych przez taki enzym, zaburzy jego działanie. Przykładem szczepu nie przeprowadzającego opisanych powyżej metylacji jest E. coli GM2163 (dam, dcm ).

21 Termostabilne polimerazy DNA Polimeraza Pochodzenie Aktyw. egzonukl. Aktyw. egzonukl. Częstość Wydłubłędów żanie [1x10-6 ] a -końca Termostabilność Procesywność b Taq 1976 Thermus aquaticus tak nie 22 tak 9 w 97,5 C 50 Pwo Pyrococcus woesei nie tak 3,2 nie >2h w 100 C Pfu 1991 Pyrococcus furiosus nie tak 2,6 nie 4h w 95 C DeepVent Pyrococcus szczep GB-D nie tak 5 nie 8h w 100 C Phusion nie tak 0,44 nie a częstość błędów: ilość błędów/pz/cykl b ilość nukleotydów przyłączonych zanim polimeraza odłączy się od matrycy

22 PCR ogólne zasady projektowanie starterów Długość starterów od 18 do 30 zasad, krótsze startery mogą się niespecyficznie wiązać z matrycą koniec startera nie powinien zawierać więcej niż 3 zasady G i/lub C, gdyż mogą one stabilizować niespecyficzne oddziaływania starter matryca koniec startera jest mniej krytyczny dla specyficznego przyłączania startera do matrycy dlatego może być modyfikowany Zawartość GC zasady GC powinny stanowić od 40 do 60 % sekwencji Hybrydyzacja koniec starterów nie powinien tworzyć struktury spinki do włosów, startery używane w reakcji nie powinny tworzyć homo- i/lub heterodupleksów hybrydyzacja starterów na końcu Temperatura topnienia startery używane w reakcji powinny mieć zbliżoną temperaturę topnienia (różnica 2 5 C), optymalnie nieco powyżej 60 C

23 Optymalizacja warunków PCR Stężenie starterów: końcowe stężenie każdego ze starterów powinno się zawierać w przedziale między 0,1 a 0,5 µm ( cząsteczek). Wyższe zwiększa prawdopodobieństwo powstania niespecyficznych produktów Stężenie matrycy DNA: ilość używanego matrycowego DNA zależy od jego pochodzenia. Zwykle stosuje się ng genomowego i ng plazmidowego DNA na 50 µl reakcji Stężenie nukleotydów: końcowe stężenie poszczególnych nukleotydów powinno wynosić ok. 0,2 mm (ilość, która pozwala uzyskać ok. 6 6,5 µg DNA) Ilość cykli od 25 do 35, w zależności od pochodzenia DNA i ilości matrycy Czas wydłużania starterów zwykle przyjmuje się regułę 60 sek/1000 zasad

24 Optymalizacja warunków PCR Bufor standardowy bufor zawiera 50 mm KCl i 10 mm Tris-HCl, ph 8,3. Podniesienie stężenia KCl do mm może zwiększyć wydajność syntezy fragmentów o długości <500 pz. Niektóre bufory obok jednowartościowych jonów K + zawierają jony NH 4 + (obecność jonów NH 4 + minimalizuje potrzebę optymalizacji stężenia jonów Mg 2+ oraz temperatury przyłączania starterów. temp C produkt PCR niespecyficzne produkty PCR Critical Factors, for Successful PCR, Users Manual, Qiagen Stężenie jonów magnezu im wyższe, tym większa wydajność reakcji ale także ilość produktów niespecyficznych Temperatura przyłączania starterów (annealing temperature) im wyższa, tym bardziej specyficzny produkt reakcji

25 Obliczanie temperatury topnienia starterów Dla starterów liczących nie więcej niż 20 nukleotydów temperaturę topnienia (melting temperature) można wyliczyć wg empirycznej zasady Wallacea: T m = 2 C (A + T) + 4 C (G + C) Dla dłuższych oligonukleotydów (do 70 zasad), gdy stężenie kationów jest 0,4 M można zastosować równanie: T m = 81 C + 16,6 (log 10 [K + ]) + 0,41(%[G + C]) Absorbancja przy 260 nm Częściowo rozwinięty DNA Dwuniciowy DNA Jednoniciowy DNA Tm=69 C Temperatura [ C] Temperatura hybrydyzacji (annealing temperature) jest na ogół o 5 10 C niższa od Tm, należy ją ustalić empirycznie.

26 Czynniki wpływające negatywnie na PCR Wysoka zawartość zasad GC jest odpowiedzialna za powstawanie struktur drugorzędowych w obrębie DNA, co prowadzić może do zahamowania aktywności polimerazy. Glicerol, DMSO (2 10%), chlorek tetrametyloamonu (0,01 10 mm), formamid (5 20%) poprawiają wydajność tego typu reakcji PCR. Zanieczyszczenia związkami używanymi przy oczyszczaniu matrycowego DNA Do związków hamujących aktywność polimerazy należą: SDS (>0,005% w/v), fenol (>0,2% v/v), etanol (> 1% v/v), izopropanol (>1% v/v), octan sodu (>5 mm), EDTA (> 0,5 mm). Czystość starterów zależy od sposobu ich oczyszczenia po syntezie. Standardowo startery oczyszcza się stosując sączenie molekularne. Startery o długości powyżej 70 zasad powinny być oczyszczane za pomocą HPLC.

27 Kilka dat z historii 1953 W Nature ukazuje się praca Jamesa Watsona i Francisa Cricka opisująca dwuniciową, helikalną strukturę DNA 1956 Arthur Kornberg odkrywa i izoluje polimerazę DNA 1959 Francois Jacob i Jacques Monod odkrywają w obrębie chromosomu bakteryjnego istnienie sekwencji regulujących ekspresję genów: nazywają je represorem i operonem 1961 Marshall Nirenberg i Heinrich Matthaei łamią kod genetyczny 1961 Naukowcy stwierdzają, że geny oporności na antybiotyki są u bakterii często przenoszone w małych wielokopijnych chromosomach. Nazwa plazmid zostaje zaproponowana już w roku 1952 przez J. Joshuę Laderberga na określenie wszystkich pozachromosomalnych elementów dziedziczności.

28 Kilka dat z historii c.d. Otrzymywanie białek rekombinowanych stało się możliwe dzięki przełomowym osiągnięciom w dziedzinie inżynierii genetycznej do jakich doszło w ostatnich 25 latach XX wieku opisanie i izolacja pierwszego enzymu restrykcyjnego (dokładniej, pierwszego enzymu typu II) HindII (Hamilton Smith) 1974 w Proceedings of the National Academy of Sciences ukazuje się praca Stanleya Cohena (Stanford University) i Herberta Boyera (UCSF), w której uczeni pokazują ekspresję obcego DNA wprowadzonego do bakterii Escherichia coli za pomocą technik rekombinacji DNA (fragmenty kodujące RNA 18S i 28S z Xenopus laevis) 1976 Herbert Boyer i Robert Swanson zakładają Genentech Inc., firmę biotechnologiczną, której celem jest tworzenie i sprzedaż produktów opartych o technologię rekombinacji DNA

29 Kilka dat z historii c.d Geny kodujące 2 łańcuchy insuliny zostały po raz pierwszy sklonowane i wprowadzone do komórek Escherichia coli przez zespół Arthura Riggsa i Keichiego Itakury z Genentech Inc Sąd Najwyższy USA postanowia, że organizmy zmodyfikowane genetycznie mogą podlegać prawu patentowemu 1982 Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (Food and Drug Administration) dopuszcza do obrotu ludzką insulinę produkowaną w bakteriach 1983 Kary Mullis pracujący w Cetus Corporaration wpada na pomysł powielania DNA in vitro (PCR). Trzy lata później udoskonala reakcję wprowadzając termostabilną polimerazę. Cetus opatentowuje reakcję i w 1991 roku sprzedaje ją firmie Hoffman LaRoche za 300 mln dolarów

30 Wykorzystanie białek rekombinowanych w przemyśle farmaceutycznym w przemyśle spożywczym w procesach technologicznych w biotechnologii w badaniach naukowych

31 Wykorzystanie białek rekombinowanych CEL badanie funkcji białka wytworzenie przeciwciał badanie struktury białka diagnostyka i terapia przemysł WYMAGANA ILOŚĆ BIAŁKA mg mg mg mg-kg kg-t Parametry poddawane zmianom FIZYKOCHEMICZNE termostabilność rozpuszczalność kinetyka fałdowania zdolność wiązania ligandów specyficzność wiązania ligandów własności fluorescencyjne BIOLOGICZNE I FARMAKOLOGICZNE okres półtrwania w surowicy aktywność immunogenność toksyczność podatność na działanie proteaz specyficzność oddziaływania z chorymi tkankami

32 Inżynieria białek I Wykład 2 (2014/2015) Magdalena Tworzydło Zakład Biochemii Fizycznej, WBBiB UJ

33 E. coli: idealny system... czasami Pomimo ciągłych prac nad rozwojem nowych systemów ekspresyjnych E. coli pozostaje nadal najczęściej używanym organizmem. Wykorzystywana jest z powodzeniem do produkcji enzymów stosowanych w diagnostyce, analityce i w celach przemysłowych, a także do produkcji leków, o ile tylko nie posiadają one budowy podjednostkowej i nie wymagają pełnej obróbki potranslacyjnej. Dla potrzeb laboratoriów i przemysłu stworzonych zostało szereg szczepów oraz kilkaset wektorów umożliwiających ścisłą kontrolę regulacji ekspresji białek, oraz ułatwiających prawidłowe fałdowanie i oczyszczanie syntetyzowanych protein. Theodor Escherich ( ) lekarz-pediatra odkrywca E. coli (1885 r.) Nadal jednak optymalizacja procesu ekspresji genów a następnie otrzymywania poszczególnych białek rekombinowanych bywa czasochłonna i kosztowna nie zależy bowiem jedynie od właściwości samego systemu, ale przede wszystkim od indywidualnych właściwości białka.

34 Zalety i wady bakteryjnego systemu ekspresyjn System ekspresyjny Klasyfikacja Tworzenie wiązań S-S Glikozylacja Wydzielanie Koszt hodowli Antybiotyki Koszty bezpieczeństwa Produkty na rynku Escherichia coli bakteria gram-ujemna tak (w peryplazmie) nie do peryplazmy niski/średni 1 raczej tak niskie tak 1 zależny od promotora 2 brak końcowej α1,3 mannozy 3 brak dokładnej charakterystyki, 4 końcowa fukoza (6-dezoksygalaktoza) Na podstawie Production of recombinant proteins, Gerd Gellisen 2005 Wiley-Vch Verlag GmbH & Co. Weinheim

35 Wektory plazmidowe Plazmidy naturalnie występujące u bakterii pozachromosomalne, koliste, dwuniciowe cząsteczki DNA, kpz. ich replikacja przebiega niezależnie od chromosomalnego DNA posiadają mechanizmy umożliwiające zachowanie stałej liczby cząsteczek w komórce gospodarza oraz odpowiednią segregację do komórek potomnych replikacja i transkrypcja genów plazmidowych przebiega zwykle w oparciu o enzymy gospodarza w plazmidach naturalnych zawarta jest informacja decydująca o: oporności/produkcji antybiotyków, syntezie bakteriocyn, enterotoksyn, wytwarzaniu enzymów restrykcyjnych, rozkładzie złożonych związków organicznych, oporności na jony metali ciężkich, zdolności do koniugacji, itp. Wektory plazmidowe stworzone na potrzeby klonowania i/lub ekspresji genów posiadają m. in: polilinker, MCS (multi cloning site) ori (origin) miejsce startu replikacji marker selekcyjny: np. gen oporności na antybiotyk promotor

36 Plazmidy nisko- i wysokopijne Replikon liczący kilkaset par zasad obszar DNA, w skład którego wchodzi ori oraz elementy regulujące start replikacji. W wektorach plazmidowych najczęściej spotykane są replikony z plazmidów pmb1 lub ColE1. Niezmodyfikowane, utrzymują ilość kopii plazmidu na poziomie 20 szt./kom. pre RNA II jest trawiony przez RNA-zę H do postaci RNA II RNA II, pozytywny regulator replikacji DNA, (oddziałuje z DNA i inicjuje replikację) RNA II pre RNA II ori RNA I RNA I, negatywny regulator replikacji DNA, (blokuje oddziaływanie RNA II z DNA) kierunek replikacji DNA rop białko ROP, homodimer, 68 aa, negatywny regulator replikacji DNA (stabilizuje oddziaływanie RNA I z RNA II

37 Plazmidy nisko- i wysokokopijne PLAZMID/ WEKTOR REPLIKON ILOŚĆ KOPII CZYNNIK NEGATYWNEJ KONTROLI ILOŚCI KOPII PLAZMIDU/WEKTORA pbr322 pmb RNA I, białko Rop puc zmodyfikowany pmb RNA I pacyc p15a psc101 psc101 ~5 cole1 cole RNA I powtórzone sekwencje DNA (iterony), białko RepA powtórzone sekwencje DNA (iterony), białko Rep A Plazmidy posiadające taki sam replikon są niekompatybilne nie mogą wspólnie występować w jednej komórce bakteryjnej pod nieobecność czynników selekcyjnych. Współzawodnictwo o te same elementy zwiększające ilość kopii danego plazmidu, prowadzi z czasem do eliminacji jednego z nich. Replikony należące do tej samej grupy kompatybilności co pmb1/cole1, to p15a, R6K oraz F.

38 Pierwsze wektory pbr322 wektor plazmidowy 1-szej generacji (Bolivar at al., Gene 1977) Przykładowe nazewnictwo wektorów p plazmid BR inicjały konstruktorów (Bolivar, Rodriguez) 322 numer plazmidu w kolekcji UC msce powstania (University of California) pierwsze wektory posiadające MCS (Vieira i Messing, Gene 1982) seria puc

39 Test α-komplementacji (blue-white screening) gen laczδm15 (chromosom) aminokwasy białko ω nieaktywny dimer (wektor) aminokwasy 1 62 peptyd α aktywny tetramer β-galaktozydazy + = galaktoza DIMERYZACJA OKSYDACJA Barwny precypitat X-gal (5-bromo-4-chloro-3- indol-beta-d-galaktozyd) 5-bromo-4-chloro-indoksyl

40 Promotory inicjacja transkrypcji Promotory E. coli rozpoznawane są przed podjednostkę sigma polimerazy RNA. Istnieje 7 typów podjednostek σ, a co za tym idzie 7 typów promotorów. Najczęściej spotykane promotory oddziałują z czynnikiem σ 70. Inicjacja procesu transkrypcji przebiega w 4 etapach: i) rozpoznanie sekwencji promotorowej przez holoenzym RNA (α 2, β, β, ω, σ 70 ) ii) przejście kompleksu zamkniętego w otwarty, rozpoczęcie syntezy mrna (tworzenie transkryptów poronnych) iii) uwolnienie podjednostki σ, izomeryzacja do kompleksu elongacyjnego iv) uwolnienie promotora. Każdy z etapów wpływa na szybkość całego procesu co oznacza, że promotory o podobnej sile mogą mieć różne sekwencje, w zależności od tego, który z czterech etapów jest w nich zoptymalizowany. W silnych promotorach obszary -35 i -10 są najbardziej zbliżone do sekwencji konsensusowych pz TTGACA TATAAT Silny promotor = częsta inicjacja transkrypcji

41 Promotory pz TTGACA TATAAT Najczęściej spotykanym mechanizmem regulacji ekspresji genów jest wiązanie się białek regulatorowych w obrębie operonu: w systemach regulowanych pozytywnie albo sekwencja -35 (-10) odbiega znacznie od sekwencji konsensusowej, albo odległość pomiędzy obszarami -10 i -35 nie jest optymalna, w związku z czym białko aktywatorowe ułatwia polimerazie RNA rozpoznanie promotora i związanie się z nim, w systemach regulowanych negatywnie białko represorowe wiąże się poniżej lub bezpośrednio w obrębie promotora uniemożliwiając polimerazie RNA wiązanie do DNA lub wydłużanie mrna. Oba rodzaje promotorów mogą być kontrolowane na dwa sposoby: przez indukcję efektor łączy się z represorem i hamuje jego wiązanie do operatora, aktywator łączy się z miejscem docelowym tylko w obecności efektora, przez represję nieaktywny represor ulega aktywacji dopiero w obecności cząsteczki efektorowej, aktywator jest inaktywowany pod wpływem przyłączenia liganda.

42 Promotor lac z operonu laktozowego msce wiązania CRP msce wiązania represora i z y a represor galaktozydaza permeaza acetylaza i promotor lac promotor TTTACA pz-----TATGTT Represja kataboliczna Komórki E. coli rosnące w obecności glukozy charakteryzują się niskim stężeniem enzymów katabolicznych, m. in. β-galaktozydazy. W przypadku operonu lac 1) Glukoza blokuje napływ laktozy przez kanały permeazy do wnętrza komórki i uniemożliwia galaktozydazie przekształcenie laktozy w allolaktozę. 2) glukoza hamuje powstawanie camp potrzebnego do aktywacji CRP. Przykład regulacji negatywnej sterowanej przez indukcję Pod nieobecność laktozy represor (homotetramer) jest związany z operatorem i uniemożliwia transkrypcję genów z, y, a. Po związaniu induktora (allolaktoza, IPTG izopropylotiogalaktozyd) represor traci powinowactwo do miejsca operatorowego. Przykład regulacji pozytywnej Białko CRP (homodimer) związane z camp przyłącza się do DNA powyżej promotora i ułatwia polimerazie RNA oddziaływanie z kwasem nukleinowym.

43 Przeciekanie promotora lac ~10 cząsteczek represora msce wiązania CRP msce wiązania represora lac promotor kopii plazmidu W popularnych, niezmodyfikowanych szczepach E. coli dochodzi do minimalnej ekspresji genu laci kodującego represor: ilość białka w komórce nie przekracza 10 cząsteczek. Po transformacji wysokokopijnym wektorem z promotorem laktozowym, większość miejsc operatorowych nie zostaje obsadzona, w związku z czym ma miejsce konstytutywna ekspresja rekombinowanego genu. Jednym ze sposobów rozwiązania tego problemu jest wprowadzenie do bakterii genu laci q ze zmienionym promotorem. Pojedyncza mutacja w obrębie promotora laci pozwala 10-krotnie zwiększyć ilość cząsteczek represora w komórce.

44 System pet polimeraza RNA i promotor ø10 faga T7 System pet jest chroniony patentami nr: 4,952,496; 5,693,489 i 5,869,320. Indukcja IPTG Indukcja IPTG Polimeraza RNA E. coli Gen T7 T7 RNA po limeraza Polimeraza RNA faga T7 represor lac gen lac I operator lac operator lac promotor lac promotor T7 NIE KTYWNA DE3 lyzozym T7 represor lac gen lac I pet TAATACGACTCACTATAGGGAGA DNA chromosomalne gen lyzozymu T7 plyss lub E KOMÓRKA GOSPODARZA Polimeraza RNA faga T7, monomer o masie 99 kda. Odporna na działanie rifampicyny (w przypadku bakterii antybiotyk oddziałuje z podjednostką β polimerazy i hamuje syntezę 1-szego wiązania fosfodiestrowego w mrna), rozpoznaje jedynie swoje własne promotory, jest wysoce procesywna 230 nt/s (polimeraza RNA z E. coli 50 nt/s).

45 Operon arabinozowy przykład regulacji pozytywnej miejsce wiązania CAP arao 2 arac arao 1 arai 1 arai 2 arab araa arac arad CTGACG pz-----TACTGT promotor p BAD Białko arac jest negatywnym regulatorem swojej własnej transkrypcji, łącząc się z operatorem arao 1 blokuje promotor p C. Promotor p BAD podlega represji katabolicznej. Pod nieobecność L-arabinozy produkt genu arac cząsteczki białka arac łączą się z miejscami operatorowymi arao 2 i arai 1, w wyniku czego powstaje pętla DNA, która uniemożliwia polimerazie RNA transkrypcję genów BAD spod promotora p BAD. W obecności arabinozy cząsteczki białka arac zmieniają konformację, jedna z nich opuszcza operator arao 2 i łączy się z miejscem operatorowym arai 2. Do pełnej aktywacji promotora p BAD konieczna jest obecność białka CRP związanego z camp. CRP oraz 2 cząsteczki białka ara C (z arabinozą) w pozycjach arai 1 i arai 2 ułatwiają polimerazie rozpoznanie promotora p BAD i związanie się z nim.

46 Promotor trp z operonu tryptofanowego msce wiązania represora trp represor L E D C B A trp promotor TTGACA pz-----TTAACT Promotory hybrydowe Promotory tac i trc zawierają sekwencje 35 z promotora trp i 10 z promotora lacuv5 oddzielone fragmentami liczącymi odpowiednio 16 i 17 pz. Promotory te nie wymagają do pełnej aktywacji białka CRP. Promotor tac jest 5 razy silniejszy od p lac Przykład negatywnej regulacji sterowanej przez represję W obecności tryptofanu represor (dimer) jest związany z operatorem i uniemożliwia transkrypcję sekwencji liderowej L oraz genów E, D, C, B i A. Brak aminokwasu uruchamia ekspresję enzymów potrzebnych do jego syntezy. Zalety Silny, indukowalny promotor. i wady Podobnie jak promotor laktozowy ma tendencje do przeciekania. Niewielka ilość pożywek nadających się do hodowli. Konieczność usunięcia tryptofanu w momencie wzmożonej syntezy białka.

47 Promotory faga λ białka główki ogonka regulacja replikacja DNA liza N P L ci P R cro Q W fazie lizogenicznej wyróżnia się etap integracji, trwania i uwalniania. Na etapie profaga ekspresji ulega jedynie gen ci kodujący represor l, który po przyłączeniu do promotorów L i R zabiega ekspresji białek wczesnej fazy, a tym samym ekspresji wszystkich białek faga. Faza lityczna przebiega w trzech etapach: wczesnym, opóźnionym i późnym. Sekwencyjnie dochodzi do ekspresji enzymów niezbędnych do replikacji i rekombinacji DNA, syntezy białek główki oraz ogonka wirusa, a na końcu białek koniecznych do wywołania lizy komórki.

48 Promotory faga λ białka główki ogonka regulacja replikacja DNA liza N P L ci P R cro Q W systemach ekspresyjnych wykorzystywana jest najczęściej zmutowana, termolabilna wersja represora I, blokująca promotory p L i p R tylko w obniżonej temperaturze (28 30 C). Wykorzystując wektory z promotorem p L (jest silniejszy od p R ) należy dodatkowo używać bakterii posiadających gen ci ts857 dla zmutowanej wersji represora. Problemy związane ze stosowaniem termicznie indukowanych promotorów mogą wynikać z faktu, że podwyższona temperatura aktywuje także geny szoku cieplnego, z których część koduje proteazy. Dodatkowo, niektóre z syntetyzowane białek rekombinowanych mogą ulegać termicznej denaturacji i wytrącać się w postaci agregatów. Aby wyeliminować problem powstawania białek szoku cieplnego można wykorzystać szczep bakterii ze zmodyfikowanym genem rpoh kodującym podjednostkę σ 32 polimerazy RNA. Innym sposobem indukcji promotora λpl jest użycie szczepu bakterii, w którym gen ci jest umieszczony pod kontrolą promotora trp. Po dodaniu do pożywki tryptofanu, dochodzi do zahamowania transkrypcji genu ci i, w konsekwencji, do aktywacji indukcji λpl.

49 Terminacja transkrypcji, stabilność mrna Ekspresja genów białek heterogenicznych w komórkach E. coli zależy nie tylko od siły promotora, lecz także od wydajności procesów transkrypcji i translacji. Sygnał terminacji transkrypcji, palindromowy rejon RNA bogaty w pary G C, tworzy strukturę spinki do włosów i poprzedza sekwencję oligo-u. Działa niezależnie od obecności białka Rho. Destabilizuje oddziaływanie pomiędzy DNA a matrycowym mrna. G C A U C G G C C G C G C G U U U U Pętla na końcu mrna najprawdopodobniej chroni je przed działaniem egzonukleaz. Stabilność mrna zależy także od wydajności procesu translacji, jaki zachodzi przy jego udziale. Rybosomy chronią mrna przed degradacyjnym działaniem RNA-zy E (endonuklaza).

50 Stabilność mrna Okres półtrwania mrna komórkach E. coli wynosi od kilku sekund do 20 minut. Degradacja mrna jest inicjowana między innymi przez endonukleazę RNazę E. RNaza E jest homodimerem zaangażowanym w proces dojrzewania rybosomowego RNA. Aktywność katalityczna enzymu związana jest z jego domeną N-końcową. Domena C-końcowa stanowi rusztowanie dla degradosomu złożonego z RNazy II, enolazy, helikazy RhlB i fosforylazy polinukleotydowej (PnPase). Degradosom łączy się z jednoniciowym ufosforylowanym końcem mrna. Jednym ze sposobów ochrony -końca jest dołączenie do niego sekwencji genu ompa tworzącego strukturę spinki.

51 Inicjacja translacji sekwencja Shine-Dalgarno (SD box, rbs ribosome binding site), sekwencja komplementarna do końca rybosomowego RNA 16S, 4 9 nukleotydów AGGAGGT ATG promotor +1 rbs (konsensus) 11(8) pz START kodony START: AUG (fmet) wykorzystywany w 83% genów (pozostałe: GUG (Val) 14% oraz UUG (Leu) 3%) Restryktazy użyteczne przy klonowaniu: NdeI (CA*TATG), SphI (GCATG*C), NcoI (C*CATGG) powstawanie struktur drugorzędowych w obrębie sekwencji SD, kodonu START i ok. 20 nukleotydów poniżej kodonu START wpływa negatywnie na inicjację translacji

52 Dialekty w kodzie genetycznym Rzadkie kodony Kod genetyczny jest zdegenerowany kilka różnych kodonów koduje jeden aminokwas. Pomiędzy organizmami istnieją różnice w częstości występowaniu kodonów dla poszczególnych aminokwasów. Częstość wykorzystania danego kodonu znajduje odzwierciedlenie w ilości odpowiadającego mu trna. Konsekwencją istnienia dialektów może być: obniżona stabilność mrna przedwczesna terminacja translacji przesunięcia w ramce odczytu, wystąpienie delecji, wprowadzenie błędnych aminokwasów (np. Lys w miejsce Arg) zahamowanie syntezy białka Rzadkie kodony u E. coli to: AGG/AGA (Arg), AUA (Ile), CUA (Leu) i CCC (Pro).

53 Osiem najrzadziej używanych kodonów u E. coli, drożdży, Drosophila melanogaster i naczelnych E. coli Drożdże Drosophila Naczelne Aminokwas AGG AGG ARGININA AGA AGA ARGININA AUA AUA IZOLEUCYNA CUA LEUCYNA CGA CGA CGA CGA ARGININA CGG CGG CGG CGG ARGININA CCC PROLINA UCG UCG SERYNA CGC CGC ARGININA CCG CCG PROLINA CUC LEUCYNA GCG GCG ALANINA ACG ACG TREONINA UUA GGG AGU UGU CGU LEUCYNA GLICYNA SERYNA CYSTEINA ARGININA

54 Dwójki kodonów (codon pairs) Również częstość występowania określonych par kodonów odbiega od wartości przewidywanych dla rozkładu losowego. Pojawienie się nadreprezentowanej pary kodonów w sekwencji mrna działa jak przecinek w zdaniu obniża szybkość syntezy łańcucha polipeptydowego. Najprawdopodobniej jest to mechanizm ułatwiający właściwe fałdowanie białek. Sygnały opóźnienia translacji są różne dla poszczególnych organizmów.

55 Terminacja translacji Sygnałem zakończenia translacji jest pojawienie się jednego z 3 kodonów: UAA (ochre, 63%), UAG (opal, 29%) UGA (amber, 8%) Wydajność terminacji translacji zależy także od nukleotydu występującego bezpośrednio za kodonem STOP i jest najwyższa w przypadku sekwencji UAAU a najniższa dla sekwencji UAGC.

56 Rola mutacji cichych (silent mutations)

57 Inżynieria translacyjna Inżynieria translacyjna wykorzystuje programy komputerowe w celu optymalizacji sekwencji nukleotydowej genu heterologicznego białka i dopasowaniu jej do dialektu używanego przez gospodarza.

58 Synteza genów de novo Cennik od 0,23 $ do 0,35 $ za zasadę 299 $ wklonowanie do wektora komercyjnego Czas realizacji Od 0 do 1000 pz od 5 dni roboczych Od 1001 do 2000 pz od 7 dni roboczych gen (1300 pz) + wklonowanie do wektora = 2000 PLN