ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH

Transkrypt

1 ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH Zeszyt 587 Wydział Nauk o Żywności Szkoły Głównej Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie 2016

2

3 Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych nr 587, 2016, 3 11 ZAWARTOŚĆ OGÓLNYCH I ŁATWOEKSTAHOWALNYCH GLOMALIN ORAZ BIAŁEK GLEBOWYCH SPOKREWNIONYCH Z GLOMALINAMI W RÓŻNYCH TYPACH GLEB POLSKI SPOD UPRAW ŻYTA I PSZENICY Anna Gałązka Instytut Uprawy Nawożenia i Gleboznawstwa w Puławach Państwowy Instytut Badawczy Streszczenie. Grzyby endomykoryzowe są obligatoryjnie związane z roślinami, a poprzez wytwarzanie glomalin wpływają na poprawę środowiska wzrostu dla swoich gospodarzy. Właściwości glomalin, takie jak nierozpuszczalność, kleistość i hydrofobowość, mogą inicjować i chronić powstające agregaty glebowe. Białka te występują powszechnie w glebach różnych stref klimatycznych i stanowią magazyn węgla, którego źródłem jest atmosferyczny CO 2. Celem pracy było określenie zawartości glikoprotein (glomalin ogólnych TG, łatwoekstrahowalnych EEG oraz białek glebowych spokrewnionych z glomalinami GRSP) w próbkach różnych gleb Polski pobranych spod upraw roślin zbożowych. Próbki gleb przechowywano w stanie powietrzno-suchym, a następnie oznaczono w nich skład granulometryczny, zawartość węgla i azotu ogólnego oraz pojemność wodną. Równolegle w próbkach glebowych określono zawartość glomalin (TG, EEG, GRSP). Wyekstrahowane białka oznaczono metodą Bradford. W badanym materiale glebowym stwierdzono obecność zarówno glomalin ogólnych, łatwoekstrahowalnych, jak i białek glebowych spokrewnionych z glomalinami. Obecność glomalin zależna była zarówno od rodzaju gleb oraz rodzaju uprawianej rośliny zbożowej. Słowa kluczowe: mykoryza, glomalina ogólna, glomalina łatwoekstrahowalna, białko glebowe spokrewnione z glomalinami, gleba, żyto, pszenica ozima, pszenica jara agalazka@iung.pulawy.pl Copyright by Wydawnictwo SGGW

4 4 A. Gałązka WSTĘP Stabilność struktury gleby istotnie wpływa na charakter i zawartość materii organicznej w glebie [Cucci i in. 2015]. Zarówno użytkowanie gruntów, jak i rodzaj uprawianej rośliny ma wpływ na ilość i jakość materii organicznej gleby, a tym samym na jej agregację [Bowles i in. 2014, Brevik i in. 2015]. Grzyby mykoryzowe (AMF ang. arbuscular mycorrhizal fungi) są jednym z najważniejszych czynników biotycznych warunkujących jakość środowiska glebowego [Wu i in. 2015]. Odgrywają bardzo ważną rolę w ekosystemach agrarnych, a poprzez produkcję glomalin mogą stanowić istotny czynnik pozytywnego oddziaływania na wzrost i zdrowotność roślin w zależności m.in. od typu gleby oraz systemu jej uprawy [Wright i Anderson 2000, Gałązka i Gawryjołek 2015]. Symbioza grzybów AMF jest tworzona m.in. z wieloma trawami, większością roślin użytkowanych rolniczo oraz między niektórymi drzewami i krzewami. Występuje najczęściej w glebach o ph zbliżonym do naturalnego, zawierających przyswajalny azot mineralny [Rillig 2004, Purin i Rilling 2007]. Zdolność produkcji i magazynowania glomalin (glikoprotein) w strzępkach grzybowych jest charakterystyczna wyłącznie dla arbuskularnych grzybów mykoryzowych należących do rzędu Glomerales skupiającego rodzinę Glomeraceae z rodzajem Glomus [Wright i in. 1996, Gałązka i Gawryjołek 2015]. Żadne inne grzyby oprócz Glomeromycota nie produkują glomalin w znaczących ilościach [Driver i in. 2005]. Pod względem budowy cząsteczkowej glomalina to glikoproteina z N-końcowym łańcuchem oligosacharydowym, silnie hydrofobowa [Nichols 2004]. To właśnie hydrofobowe domeny molekuły są odpowiedzialne za trudności w ekstrakcji oraz słabą rozpuszczalność tegoż białka. Glomaliny stanowią blisko 30% zawartości węgla w glebie oraz około 2% ogólnej wagi agregatów glebowych [Rillig i Steinberg 2002, Schindler i in. 2007]. Funkcjonalnie są to białka związane z glebową materią organiczną należące do tzw. białek glebowych spokrewnionych z glomalinami z ang. glomalin-related soil protein [Gillespie i in. 2011, Fokom i in. 2012]. W przypadku oznaczeń glomalin stosuje się oddzielną terminologię w zależności od metody ekstrakcji i metody detekcji białka (tab. 1) [Rillig 2004, Gillespie i in. 2011]. Tabela 1. Terminologia glomalin w zależności od metody ekstrakcji białka [Rillig 2004] Table 1. Glomalin terminology depending on the method of protein extraction [Rillig 2004] Skrót Abbreviation TG EEG GRSP Nazwa Name glomaliny ogólne total glomalin glomaliny łatwoekstrahowalne easily extractable glomalin białko glebowe spokrewnione z glomalinami glomalin-related soil protein Opis Description frakcja glomalin gleby kilkukrotnie ekstrahowana przy użyciu 50 mm buforu cytrynianowego (ph 8,0), w autoklawie w temperaturze 121 C przez 60 minut frakcja glomalin gleb ekstrahowana jednorazowo przy użyciu 20 mm buforu cytrynianowego (ph 7,0) w autoklawie w temperaturze 121 C przez 30 minut stanowi łączny udział glomaliny w glebie, ewentualnie zawiera inne białko gleby; jest to frakcja glomalin gleby kilkukrotnie ekstrahowana przy użyciu 20 i 50 mm buforu cytrynianowego Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

5 Zawartość ogólnych i łatwoekstahowalnych glomalin oraz białek glebowych... 5 Celem pracy było określenie zawartości ogólnych i łatwoekstrahowalnych glomalin oraz białek glebowych spokrewnionych z glomalinami w próbkach różnych gleb Polski spod upraw roślin zbożowych (żyta, pszenicy ozimej i pszenicy jarej). MATERIAŁY I METODY Materiał badawczy stanowiło 18 próbek glebowych spod upraw roślin zbożowych z reprezentatywnych doświadczeń polowych z różnych miejsc geograficznych w Polsce z Rolniczych Zakładów Doświadczalnych IUNG-PIB w Puławach. Próbki glebowe pobierano na głębokości 0 15 cm, a następnie przesiewano na sicie o 2-milimetrowej średnicy oczek. Próbki gleb przechowywano w stanie powietrzno-suchym, a następnie oznaczono w nich skład granulometryczny, zawartość węgla i azotu ogólnego oraz pojemność wodną. Całkowitą zawartość węgla w glebie oznaczono według metody Tiurina, z kolei zawartość azotu ogólnego metodą spektrometrii przepływowej, z użyciem mineralizacji prób na drodze mokrej. Równolegle w próbkach glebowych określono zawartość ogólnych (TG) i łatwoekstrahowalnych glomalin (EEG) oraz białek spokrewnionych z glomalinami (GRSP). Łatwoekstrahowalne frakcje glomalin ekstrahowano jednokrotnie z gleby 20 mm buforem cytrynianowym ph 7,0 przez 30 minut przy temperaturze 121 C, natomiast ogólną ilość glomalin ekstrahowano kilkukrotnie 50 mm buforem cytrynianowym ph 8,0 przez 60 minut przy temperaturze 121 C, według metody opisanej przez Wright i Upadhyaya [1996]. Otrzymane supernatanty po ekstrakcji przechowywano do dalszych analiz w temperaturze +4 C. W otrzymanych ekstraktach oznaczono stężenie białka metodą Bradford [1976], polegającą na kolorymetrycznym oznaczaniu ogólnego stężenia białka przy użyciu albuminy wołowej jako standardu, z uwzględnieniem modyfikacji metody według Wright i Upadhyaya [1999]. Pomiar absorbancji wykonano przy długości fali 590 nm. W celu oszacowania istotnych różnic pomiędzy średnimi zastosowano test t-studenta dla rozkładów normalnych, przyjęto poziom ufności 0,95. Wyliczono także wartości współczynnika korelacji prostej Pearsona dla p <0,05 dla układów liniowych. Równania regresji przedstawiono na wykresach rozrzutu przy zastosowaniu testu R-kwadrat. Do analizy wyników zastosowano także jednoczynnikową i dwuczynnikową analizę wariancji ANOVA. Do statystycznej oceny wyników wykorzystano pakiet programów Statistica.pl (7), (Stat. Soft. Inc.). WYNIKI I DYSKUSJA Glomaliny to bardzo charakterystyczne pod względem budowy i właściwości białka nierozpuszczalną w wodzie i odporną na degradację cieplną [Fakom i in. 2012]. Węgiel obecny w białku GRSP stanowi duża pulę w strukturze węgla organicznego [Nichols 2004]. Według Rilliga [2004] produkcja i rozkład glomaliny w środowisku glebowym wiąże się z wieloma czynnikami zarówno odnoszącymi się do fizykochemicznych w łaściwości gleby, jak i rośliny oraz gatunku grzyba. Struktura gleby i jej właściwości chemiczne mają istotny wpływ na wzrost grzybni, a tym samym na zawartość glomaliny. nr 587, 2016

6 6 A. Gałązka Zawartości glomalin w próbkach glebowych przedstawiono w tabeli 2. Z kolei korelacje pomiędzy zawartością białek TG, EEG i GRSP a zawartością węgla i azotu w próbce glebowej przedstawiono w tabeli 3. Tabela 2. Zawartość glomalin ogólnych (TG), łatwoekstrahowalnych (EEG) i białek glebowych związanych z glomalinami (GRSP) w różnych glebach Polski spod upraw zbożowych Table 2. The content of total glomalin (TG), easily extractable glomalin (EEG) and glomalin-related soil protein (GRSP) in different soils from Polish cereal crops C N TG EEG GRSP Miejscowość Roślina Locality g kg 1 Plant mg g 1 s.m. gleby mg g 1 d.m. of soil Jelcz-Laskowice 7,2 0,64 żyto rye 0,78 a 0,05 a 0,82 a Jelcz-Laskowice 6,5 0,52 Jelcz-Laskowice 8,0 0,65 pszenica ozima winter wheat pszenica jara spring wheat 0,47 a 0,14 a 0,61 a 0,46 a 0,16 a 0,62 a Żelisławki 8,4 0,83 żyto rye 1,57 b 0,75 b 2,32 b Żelisławki 5,8 0,54 pszenica jara spring wheat 0,57 a 0,18 a 0,76 a Błonie-Topola 10,4 0,92 żyto rye 2,03 c 0,87 b 2,90 c Błonie-Topola 9,7 0,91 Błonie-Topola 6,7 0,66 pszenica ozima winter wheat pszenica jara spring wheat 1,63 b 0,86 b 2,49 b 1,42 b 0,64 b 2,04 ab Wierzchno 7,6 0,72 żyto rye 1,93 b 0,76 b 2,69 b Wierzchno 5,5 0,42 Baborówko 6,3 0,58 Baborówko 6,2 0,55 pszenica ozima winter wheat pszenica ozima winter wheat pszenica jara spring wheat 1,68 b 0,22 a 1,89 ab 1,93 b 0,09 a 2,02 ab 1,64 b 0,06 a 1,70 ab Borusowa 16,6 1,20 żyto rye 3,17 c 0,89 b 4,06 c Borusowa 15,5 1,40 Borusowa 9,9 1,05 pszenica ozima winter wheat pszenica jara spring wheat 1,99 b 0,74 b 2,73 c 1,55 b 0,64 b 2,19 b Wielichowa 11,0 0,95 żyto rye 2,37 c 0,87 b 3,24 c Wielichowa 6,1 0,54 Wielichowa 6,3 0,45 pszenica ozima winter wheat pszenica jara spring wheat 1,86 b 0,45 ab 2,31 b 1,55 b 0,22 a 1,77 ab TG glomaliny ogólne total glomalin. EEG łatwoekstrahowalne glomaliny easily extractable glomalin. GRSP białka glebowe spokrewnione z glomalinami glomalin related soil protein. Wartości średnie dla n = 5 Mean values for n = 5. Wartości oznaczone literami a, b, c różnią się między sobą istotnie statystycznie w grupie (p <0,05) Values signed with different letters are significantly differ (p <0.05). Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

7 Zawartość ogólnych i łatwoekstahowalnych glomalin oraz białek glebowych... 7 Tabela 3. Wartości współczynnika korelacji prostej Pearsona dla p <0,05 dla układów liniowych Table 3. The values of the coefficient of Pearson linear correlation p <0.05 TG EEG GRSP %C %N TG 1,000 0,633* 0,860* 0,433 0,494 EEG 0,633* 1,000 0,902* 0,716* 0,714* GRSP 0,860* 0,902* 1,000 0,701* 0,760* %C 0,433 0,716* 0,701* 1,000 0,936* %N 0,494 0,714* 0,760* 0,936* 1,000 Wartości oznaczone (*) różnią się istotnie statystycznie (p <0,05) Values signed with (*) are significantly differ. Oznaczenia patrz tab. 2 numer of soil samples see Table 2. Glomaliny występują powszechnie w różnych typach gleb [Wright i Anderson 2000]. Ich zawartość stwierdzono w glebach uprawianych rolniczo, glebach leśnych i łąkowych oraz nieużytkach rolnych [Nichols 2004, Gałązka 2013]. Zawartość glomalin w badanych glebach zależała zarówno od typu gleby, jak i uprawianej rośliny. Największe zawartości glomalin ogólnych i łatwoekstrahowalnych stwierdzono w glebach pod uprawą żyta a następnie pszenicy ozimej i jarej (tab. 2). Zależności te potwierdzono, stosując test LSD (tab. 4), gdzie wykazano statystycznie istotne różnice zawartości białka GRSP w zależności od uprawianej rośliny. Tabela 4. Test LSD dla porównania różnic pomiędzy zawartością białek GRSP a uprawiana rośliną, p <0,05 Table 4. The LSD test to compare differences between the protein content GRSP a cultivated plant, p <0.05 Roślina Plant Żyto Rye Pszenica ozima Winter wheat Pszenica jara Spring wheat Żyto rye 0,197 0,032* Pszenica ozima 0,197 0,331 Winter wheat Pszenica jara 0,032* 0,331 Spring wheat Wartości oznaczone (*) różnią się istotnie statystycznie (p <0,05) Values signed with (*) are significantly differ (p <0.05). Grzyby mykoryzowe znacznie częściej wchodzą w symbiozę z roślinami, które wydzielają poprzez system korzeniowy do środowiska znaczne ilości substancji wzrostowych i hormonów [Schindler i in. 2007]. Stąd też uprawa żyta może wiązać się z efektywniejszym nawiązywaniem symbiozy w porównaniu do pszenicy jarej i ozimej. Zarówno czynniki biotyczne jak i abiotyczne mają decydujący wpływ na ilość wyprodukowanej przez grzyby AMF glomaliny. Podstawowym czynnikiem wpływającym na znaczną produkcję glomaliny są optymalne warunki do rozwoju grzybów AMF, wynikiem czego jest aktywna symbioza pomiędzy rośliną a grzybem [Rillig 2004]. Stopień zasiedlenia korzeni roślin przez grzyby AMF może być regulowany dodatkowo przez podatność (mykotroficzność) rośliny na infekcję, jak i poprzez aktywność nr 587, 2016

8 8 A. Gałązka infekcyjną spor tych grzybów występujących w glebie, na której uprawiana jest dana roślina [Koide i Peoples 2013]. Liczebność i aktywność symbiotyczna grzybów AMF, a tym samym wzrost produkcji glomaliny, może być zwiększona zarówno poprzez modyfikację warunków glebowych sprzyjających namnażaniu i aktywności spor, jak i przez wprowadzanie do ryzosfery wyselekcjonowanych drobnoustrojów wspomagających proces mykoryzy (MHB ang. mycorrhiza helper bacteria) [Guo i in. 2012]. Głównymi wyznacznikami produkcji glomalin są zarówno gatunek grzyba tworzącego symbiozę, jak i rodzaj rośliny. Większość zasymilowanego węgla jest dostarczana do rośliny (ok. 85% węgla), pozostała część jest wykorzystywana m.in. na produkcję glomaliny [Wright i in. 1996, Driver i in. 2005]. Analiza regresji prostej potwierdziła zależność zawartości węgla ogólnego (%C) od zawartości białka GRSP na poziomie współczynnika determinacji 49% (rys). 4,5 GRSP [mg g 1 s.m. gleby] total carbon [mg g 1 d.m. of soil] 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 węgiel: GRSP: y = 0, ,051*x; r = 0,7008; p = 0,0012; r 2 = 0,4922 0,0 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 zawartość węgla ogólnego [μg g 1 s.m. gleby] total carbon [μg g 1 d.m. of soil] Rys. Fig. Analiza regresji p <0,05. GRSP białka glebowe spokrewnione z glomalinami -glomalin related soil protein [mg g 1 s.m. gleby], C węgiel ogólny [μg g 1 s.m. gleby] Analysis of regresion p <0.05. GRSP glomalin related soil protein [mg g 1 d.m. of soil], C total carbon [μg g 1 d.m. of soil] Do czynników ograniczających prawidłowe funkcjonowanie mykoryzy arbuskularnej należą m.in.: uprawa mechaniczna, stosowanie środków ochrony roślin, intensywne nawożenie oraz niektóre rotacje (np. wprowadzanie roślin nie tworzących mykoryz) [Wright i Upadhyaya 1996]. Właściwości fizykochemiczne gleb oraz stosowany system uprawy ma istotny wpływ na zawartość glomaliny w glebie [Gałązka 2013, Wang i in. 2015]. Stąd też wysokie stężenie glomalin zaznacza się głównie w niezakłóconym, bez uprawowym systemie, co jest wynikiem formowania oraz utrzymywania trwałości agregatów glebowych, w porównaniu do konwencjonalnego systemu uprawy gleby, gdzie następuje rozbicie agregatów glebowych oraz inwazyjne rozerwanie filamentów grzybowych, czego konsekwencją jest mała zawartość glomalin w glebie [Wright i Anderson 2000]. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

9 Zawartość ogólnych i łatwoekstahowalnych glomalin oraz białek glebowych... 9 WNIOSKI 1. W badanych próbkach glebowych stwierdzono zawartość zarówno ogólnych, jak i łatwoekstrahowalnych glomalin oraz białek glebowych spokrewnionych z glomalinami. 2. Obecność glomalin zależna była zarówno od rodzaju gleb oraz rodzaju uprawianej rośliny zbożowej. 3. Największe zawartości glomalin stwierdzono w glebie spod uprawy żyta. Podziękowania Badania wykonano w ramach realizacji tematu z działalności statutowej IUNG-PIB nr 1.16 oraz zadania 1.4. Ocena i kształtowanie bioróżnorodności środowiska glebowego oraz aktywności mikrobiologicznej gleb z uwzględnieniem różnych warunków siedliskowych i systemów gospodarowania. Program Wieloletni IUNG-PIB na lata LITERATURA Bowles T.M., Acosta-Martínez V., Calderón F., Jackson L.E., Soil enzyme activities, microbial communities, and carbon and nitrogen availability in organic agroecosystems across an intensively-managed agricultural landscape. Soil Biol. Biochem. 68, Bradford M.M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, Brevik E.C., Cerdà A., Mataix-Solera J., Pereg L., Quinton J.N., Six J., Van Oost K., The interdisciplinary nature of SOIL. SOIL 1, doi: /soil Cucci G., Lacolla G., Pagliai M., Vignozzi N., Effect of reclamation on the structure of silty- -clay soils irrigated with saline-sodic waters. Int. Agrophys. 29, Driver J.D., Holben W.E., Rillig M.C., Characterization of glomalin as a hyphal wall component of arbuscular mycorrhizal fungi. Soil Biol. Biochem. 37, Fokom R., Adamou S., Teugwa M.C., Begoude Boyogueno A.D., Nana W.L., Ngonkeu M.E.L., Tchameni N.S., Nwaga D., Tsala Ndzomo G., Amvam Zollo P.H., Glomalin related soil protein, carbon, nitrogen and soil aggregate stability as affected by land use variation in the humid forest zone of south Cameroon. Soil Till. Res. 120, Gałązka A., Charakterystyka glomalin i oddziaływania różnych systemów uprawy na ich zawartość w glebie. Polish J. Agron. 15, Gałązka A., Gawryjołek K., Glomalina glikoproteina produkowana przez grzyby mykoryzy arbuskularnej. Postep Mikrobiol. 54 (3), Gillespie A.W., Farrell R.E., Walley F.L., Ross A.R.S., Leinweber P., Eckhardt K.U., Regier T.Z., Blyth R.I.R., Glomalin-related soil protein contains non-mycorrhizal-related heat- -stable proteins, lipids and humic materials. Soil Biol. Biochem., 43, Guo H., He X.L., Li Y.P., Spatial distribution of arbuscular mycorrhiza and glomalin in the rhizosphere of Caragana korshinskii Kom. in the Otindag sandy land, China. Afr. J. Microbio. Res. 6, Koide R.T., Peoples M.S., Behavior of Bradford-reactive substances is consistent with predictions for glomalin. Appl. Soil Ecol. 63, Nichols K.A., Characterization of glomalin a glycoprotein produced by arbuscular mycorrhizal fungi. Agriculture, Soil Sci. 81, nr 587, 2016

10 10 A. Gałązka Purin S., Rillig M.C., The arbuscular mycorrhizal fungal protein glomalin: Limitations, progress, and a new hypothesis for its function. Pedobiologia 51, Rillig M.C., Arbuscular mycorrhizae and terrestrial ecosystem processes. Ecol. Lett. 7, Rillig M.C., Steinberg P.D., Glomalin production by an arbuscular mycorrhizal fungus: a mechanism of habitat modification? Soil Biol. Biochem. 34, Schindler F.V., Mercer E.J., Rice J.A., Chemical characteristics of glomalin-related soil protein (GRSP) extracted from soils of varying organic matter content. Soil Biol. Biochem. 39, Wang S., Wu Q.-S., He X.-H., Exogenous easily extractable glomalin-related soil protein promotes soil aggregation, relevant soil enzyme activities and plant growth in trifoliate orange. Plant Soil Environ. 61, 2, Wright S.F., Anderson R.L., Aggregate stability and glomalin in alternative crop rotations for the central Great Plains. Biol. Fert. Soils 31, Wright S.F., Franke-Synder M., Morton J.B., Upadhyaya A., Time course study and partial characterization of a protein on hyphae of arbuscular mycorrhizal fungi during active colonization of roots. Plant Soil 181, Wright S.F., Upadhyaya A., Extraction of an abundant and unusual protein from soil and comparison with hyphal protein from arbuscular mycorrhizal fungi. Soil Sci. 161, Wu Q.S., Li Y., Zou Y.N., He X.H., Arbuscular mycorrhiza mediates glomalin-related soil protein production and soil enzyme activities in the rhizosphere of trifoliate orange grown under different P levels. Mycorrhiza 25, THE CONTENTS OF TOTAL AND EASILY EXTRACTABLE GLOMALIN-RELATED SOIL PROTEIN IN DIFFERENT TYPES OF SOIL FROM THE POLISH CROP OF RYE AND WHEAT Summary. It is now established that universal and ubiquitous symbiotic arbuscular mycorrhizal fungi (AMF), belonging to Glomales, form symbiotic relationships with roots of 80 90% land plants in natural and agricultural ecosystems. Glomalin is thermostable, water-insoluble glycoprotein abundantly produced by AMF fungi and tends to accumulate in the soil. These are proteins with a very unique physicochemical properties performing a fundamental role in making soil structure. Glomalin glues soil aggregates and thus stabilizes the soil structure. The content of glomalin in soil particles is significantly correlated with their stability (water resistance). There is a hypothesis that mycorrhizal fungi produce large quantities of glomalin to improve the environment for growth of plants. It is possible that glomalin is involved in the formation of hydrophobic properties of soil, improving water and air relations in soil. The properties of glomalin such as insolubility, viscosity and hydrophobicity can initiate formation of aggregates and protect the already existing soil aggregates. The mycelium of AMF, in addition to its crucial role in enhancing nutrition of host plant, also plays a role in soil particle aggregation and soil stability. Studies show that glomalin are commonly found in soil and provide a depot for carbon which is a source of atmospheric CO 2. Glomalin are recently included to soil organic matter. They are common in soil, also in Polish agricultural soils. The aim of the study was to determine the content of total glomalin TG and easily extractable glomalin EEG and glomalin-related soil protein GRSP in samples of different soils from the Polish cereal crops (rye, winter and spring wheats). Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

11 Zawartość ogólnych i łatwoekstahowalnych glomalin oraz białek glebowych The 18 soil samples from the cultivation of cereal with representative field trials in different geographic locations in Poland were studied. Soil samples collected at a depth of 0 15 cm, and then sieved on a sieve with a mesh diameter of 2 mm. Soil samples were stored in air-dry state, and then the carbon and nitrogen content and water capacity were studied. Simultaneously in soil samples were determined contents of total glomalin TG and easily extractable glomalin EEG and glomalin-related soil protein GRSP. The protein concentration was measured according to Bradford method. The highest content of total and easily extractable glomalin were found in the soils under cultivation of rye. Glomalines content in soils depends both on the type of soil and cultivated plants. Mycorrhizal fungi more often enter into symbiosis with plants, which emit through the root system into the environment a significant amount of growth substances and hormones. The cultivation of rye may be associated with more efficient in establishing the symbiosis compared to the winter and spring wheat. Key words: mycorrhiza, total glomalin, easily extractable glomalin, glomalin-related soil protein, soil, rye, winter and spring wheat nr 587, 2016

12

13 Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych nr 587, 2016, CZY BIAŁKO MOŻE BYĆ OBECNE W GLEBIE NAWET 20 LAT? OCENA ZAWARTOŚCI OGÓLNYCH I ŁATWOEKSTRAHOWALNYCH GLOMALIN W ARCHIWALNYCH PRÓBACH GLEBOWYCH Anna Gałązka, Karolina Gawryjołek Instytut Uprawy Nawożenia i Gleboznawstwa w Puławach Państwowy Instytut Badawczy Streszczenie. Glomaliny to glikorpoteiny grzybowe, które są wyjątkowo odporne na degradację (obecne w glebie nawet od 10 do 30 lat) oraz trudno rozpuszczalne w wodzie. Celem niniejszej pracy była ocena zawartości ogólnych i łatwoekstrahowalnych glomalin w archiwalnych próbkach glebowych. Do badań wybrano 15 próbek glebowych z doświadczeń polowych z 1994 roku dotyczących uprawy jęczmienia jarego. Badane gleby pochodziły z różnych regionów Polski oraz reprezentowały różne typy gleb. Gleby charakteryzowały się także dużym zróżnicowaniem właściwości fizykochemicznych i biologicznych. Przeprowadzone w niniejszej pracy badania wykazały obecność glomalin we wszystkich próbkach glebowych. Stężenie ogólnych i łatwoekstrahowalnych glomalin zależało głównie od typu gleby. Obecność glomalin w badanych glebach potwierdza hipotezę, iż białka te są szczególnie odporne na degradację i mogą pozostać w niezmienionej formie w glebie przez wiele lat. Słowa kluczowe: glomalina, glomalina ogólna, glomalina łatwoekstrahowalna, białko glebowe spokrewnione z glomalinami, gleba, mykoryza WSTĘP Glomalina jest glikoproteiną glebową produkowana przez grzyby mykoryzy arbuskularnej (AMF). Białko to zostało po raz pierwszy opisane w 1996 roku przez Sarę Wright [Wright i Upadhyaya 1996]. Grzyby endomykoryzowe są obligatoryjnie związane agalazka@iung.pulawy.pl Copyright by Wydawnictwo SGGW

14 14 A. Gałązka, K. Gawryjołek z większością roślin, a poprzez m.in. produkcję glomalin są zdolne do poprawy środowiska wzrostu roślin swoich gospodarzy. Właściwości fizykochemiczne glomaliny takie jak nierozpuszczalność, kleistość i hydrofobowość mogą inicjować i chronić powstające agregaty glebowe oraz poprawiać właściwości hydrofobowe cząstek gleby pozwalających na przenikanie powietrza i przepływ wody [Wright i Anderson 2000]. Glomaliny wytwarzane przez grzyby AMF okrywają strzępki grzybni, utrzymując wodę i składniki odżywcze przed ich utratą w drodze do i z rośliny [Fakom i in. 2012]. Funkcjonalnie są to białka związane z glebową materią organiczną należące do tzw. białek glebowych spokrewnionych z glomalinami z ang. glomalin-related soil protein (GRSP) [Schindler i in. 2007]. Glomalina zlokalizowana jest głównie na powierzchni strzępek i spor grzybów AMF. Głównym zadaniem tej hydrofobowej cząsteczki okrywającej grzybnie jest jej ochrona przed degradacją przez inne mikroorganizmy, a także zwiększenie sztywność i trwałość struktur ścian komórkowych tych grzybów, co ułatwia ich rozprzestrzenianie się w glebie. Według Rilliga i Steinberga [2002] produkcja i rozkład glomaliny w środowisku glebowym wiąże się z wieloma czynnikami zarówno odnoszącymi się do fizykochemicznych właściwości gleby, jak i rośliny oraz gatunku grzyba. Struktura gleby i jej właściwości chemiczne mają istotny wpływ na wzrost grzybni, a tym samym na zawartość glomaliny [Nichols 2004]. Glomalina jest bardzo odporna na rozkład. W miarę starzenia się strzępek pozakorzeniowych oraz korzeni roślin, biomasa grzybni ulega degradacji ale nie glomalina [Driver i in. 2005]. Białko to w niezmienionej formie jest w stanie przetrwać w glebie nawet kilkadziesiąt lat. Glomaliny występują powszechnie w różnych typach gleb. Ich obecność potwierdzono także w glebach uprawnych naszego kraju [Gałązka 2013]. Węgiel obecny w białku GRSP stanowi dużą pulę w strukturze węgla organicznego [Wright i Anderson 2000, Nichols 2004]. Udowodniono, iż glomaliny są produkowane i magazynowane nie tylko podczas intensywnego wzrostu strzępki, ale również są przekazywane do gleby po obumarciu grzyba na skutek rozkładu grzybni [Driver i in. 2005]. Glomaliny są glikoproteinami wyjątkowo odpornymi na degradację. Trudno rozpuszczają się w wodzie, z kolei bardzo dobrze rozpuszczają się w wysokiej temperaturze (121 C) w buforze cytrynianowym o odczynie neutralnym lub alkalicznym [Wright i Upadhyaya 1996]. Celem pracy było określenie zawartości ogólnych i łatwoekstrahowalnych glomalin w archiwalnych próbkach glebowych pochodzących z kolekcji gleb Zakładu Mikrobiologii Rolniczej IUNG-PIB pobranych w 1994 roku spod uprawy jęczmienia jarego. MATERIAŁY I METODY Do badań wykorzystano 15 archiwalnych próbek glebowych pochodzących z doświadczeń polowych dotyczących uprawy jęczmienia. Próbki glebowe pobrano do badań na głębokości 0 15 cm w 1994 roku a po przesianiu na sicie o średnicy oczek 2 mm i wysuszeniu zarchiwizowano i przechowywano w temperaturze pokojowej. Próbki gleb przechowywano w stanie powietrzno-suchym. Charakterystykę gleb z uwzględnieniem składu granulometrycznego oraz miejsca poboru prób przedstawiono w tabeli 1 na podstawie archiwalnych danych źródłowych dane z 1994 roku [Król Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

15 Czy białko może być obecne w glebie nawet 20 lat? ]. W tabeli 2 podano podstawowe właściwości fizykochemiczne badanych gleb: węgiel ogólny oznaczony metodą Tiurina, azot ogólny oznaczony metoda spektrometrii przepływowej, mineralizacja prób na drodze mokrej, odczyn gleby (ph H2 O) metoda potencjometryczna oraz kwasowość hydrolityczna metoda alkacymetryczna, fosfor przyswajalny (P 2 O 5 ) znaczony metodą kolorymetryczną wg Egnera-Riehma, potas przyswajalny (K 2 O) oznaczony metodą spektrometrii emisji płomieniowej wg Egnera- -Riehma. W powietrznie-suchych próbkach glebowych oznaczono aktualnie zawartość ogólnych (TG) i łatwoekstrahowalnych glomalin (EEG) oraz białek spokrewnionych z glomalinami (GRSP). Otrzymane wyniki skorelowano z fizykochemicznymi właściwościami tych gleb. Łatwoekstrahowalne frakcje glomalin ekstrahowano jednokrotnie z gleby 20 mm buforem cytrynianowym ph 7,0 przez 30 minut przy temperaturze 121 C, z kolei ogólną ilość glomalin ekstrahowano kilkukrotnie 50 mm buforem cytrynianowym ph 8,0 przez 60 minut przy temperaturze 121 C, według metody opisanej przez Wright i Upadhyaya [1996]. Otrzymane supernatanty po ekstrakcji przechowywano w temperaturze +4 C do dalszych analiz. W otrzymanych ekstraktach oznaczono stężenie białka z uwzględnieniem modyfikacji metody Wright i innych [1996] oraz Bradford [1976]. Pomiar absorbancji wykonano przy długości fali 590 nm. Tabela 1. Charakterystyka gleb pobranych w 1994 roku spod uprawy jęczmienia [Król 1997] Table 1. The characteristic of soil collected in 1994 from barley [Król 1997] Procentowa zawartość frakcji mechanicznych* Textural classification Miejscowość Place [mm] 1,0 0,1 0,1 0,02 0,02 0,002 <0,002 Gnojno/Chmielnik Kłoda/Połaniec Kazimierza Wielka Osiny/Iłża Kiełczany/Bogucin Rudniki/Połaniec Busko Zdrój Nowy Dwór Gdański Las Stocki/Wąwolnica Stara Wieś/Frampol Ostaszewo/Toruń Hrubieszów Młynary/Braniewo Nakło/Noteć n.b. n.b. n.b. n.b. Kończyce/Chełmża n.b. brak danych. *Skład granulometryczny, procentowa zawartość frakcji mechanicznych skład granulometryczny metoda Casagrande a w modyfikacji Prószyńskiego według normy [PN-R-04032:1998] Textural classification Casagrande method modified by Prószyński [PN-R-04032:1998]. nr 587, 2016

16 16 A. Gałązka, K. Gawryjołek W celu oszacowania istotnych różnic pomiędzy średnimi zastosowano test t-studenta, przyjęto poziom ufności 0,95. Wyliczono także wartości współczynnika korelacji prostej Pearsona dla p <0,05. Równania regresji przedstawiono na wykresach rozrzutu przy zastosowaniu testu R-kwadrat. Do analizy wyników zastosowano także jednoczynnikową i dwuczynnikową analizę wariancji ANOVA. Do statystycznej oceny wyników wykorzystano pakiet programów Statistica.pl (7), (Stat. Soft. Inc.). WYNIKI I DYSKUSJA Glomaliny występują powszechnie w różnych typach gleb [Guo i in. 2012, Gałązka i Gawryjołek 2015]. Ich zawartość stwierdzono zarówno w glebach uprawianych rolniczo, glebach leśnych, łąkowych oraz nieużytkach rolnych [Rillig 2004, Purin i Rillig 2007]. Najwyższe stężenie tego białka odnotowano w tropikalnych glebach leśnych na Hawajach (ponad 100 mg g 1 gleby), z kolei najniższe stężenie glomaliny (poniżej 1 mg g 1 gleby) stwierdzono w glebach pustynnych [Wright i Upadhyaya 1996, Wang i in. 2015]. Gleby lasów tropikalnych, ze względu na wysoką temperaturę i dużą wilgotność, charakteryzują się niskim stężeniem glomaliny 0,7 1,5 mg g 1 w przeciwieństwie do gleb z klimatu umiarkowanego i podzwrotnikowego, gdzie zaznacza się wysokie stężenie glomaliny nawet do 100 mg g 1 gleby, co tłumaczy się szybkimi zmianami klimatu, wysokim stężeniem żelaza w glebie oraz wysokim poziomem dwutlenku węgla w atmosferze stymulującym wzrost grzybów AMF [Wang i in. 2015]. Na rysunku przedstawiono zawartość glomalin ogólnych i łatwoekstarhowalnych oraz białek glebowych spokrewnionych z glomalinami. Największe zawartości glomalin stwierdzono w glebie murszowej (próbka nr 14). Otrzymane wyniki zawartości glomalin w próbkach archiwalnych porównano z podstawowymi właściwościami chemicznymi gleb (tab. 2). Zawartość glomalin ogólnych i łatwoekstrahowalnych oraz białek glebowych spokrewnionych z glomalinami nie korelowała z odczynem gleby oraz zawartością węgla ogólnego (tab. 3). Brak istotnych korelacji pomiędzy stężeniem glomalin a zawarto ścią węgla ogólnego potwierdza hipotezę, iż glomaliny stanowią odmienną pulę węgla organicznego w glebie. Podobne rezultaty uzyskano w badaniach obecności glomalin w świeżych glebach uprawnych w różnych systemach uprawy zbóż [Gałązka 2013, Koide i Peoples 2013]. Statystycznie istotną korelację dodatnią uzyskano pomiędzy stężeniem glomalin ogólnych i łatwoekstrahowalnych. Na produkcję glomalin może mieć wpływ wiele czynników zarówno środowiskowych, glebowych, jak i klimatycznych. Podstawowy czynnikiem ograniczającym produkcję glomaliny są niekorzystne warunki do rozwoju grzybów AMF, wynikiem czego jest nieaktywna symbioza pomiędzy rośliną a grzybem [Wright i Anderson 2000]. Stopień zasiedlenia korzeni roślin przez grzyby AMF może być regulowany dodatkowo przez podatność (mykotroficzność) rośliny na infekcję i poprzez aktywność infekcyjną spor tych grzybów występujących w glebie, na której uprawiana jest dana roślina [Gillespie i in. 2011, Gałązka i Gawryjołek 2015]. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

17 Zawartość glomalin [mg g 1 s.m. gleby] Concentration of glomalin [mg g 1 d.m. of soil] Rys. Fig numer próbki glebowej number of soil samples TG EEG GRSP Liniowy (GRSP) Zawartość glomalin w archiwalnych próbkach glebowych The content of glomalins in the archives of soil samples Tabela 2. Zawartość glomalin ogólnych (TG), łatwoekstrahowalnych (EEG) i białek glebowych związanych z glomalinami (GRSP) oraz podstawowe właściwości chemiczne w różnych glebach Polski spod uprawy jęczmienia Table 2. The content of total glomalin (TG), easily extractable glomalin (EEG) and glomalin- -related soil protein (GRSP) and basic phisico-chemical properties in different soils from Polish barley s crops TG EEG GRSP mg g 1 s.m. gleby mg g 1 d.m. of soil C og [%] ph Hh [cmol (+) kg 1 ] P 2 O 5 K 2 O Mg mg 100 g 1 gleby mg 100 g 1 of soil 2,49 b 2,07 b 4,57 b 1,64 7,6 1,05 18,9 12,7 2,8 2,98 b 2,21 b 5,19 b 2,43 5,4 3,53 2,5 4,6 6 4,08 b 2,04 b 6,12 b 3,8 7,3 0,9 5,8 8,6 20 1,06 c 0,92 c 1,99 c 1,1 6,8 1,35 4,6 13,3 1,8 2,55 b 2,44 b 5,00 b 1,84 5,5 4,05 5,6 3,1 6,6 3,80 b 3,01 b 6,81 b 2,85 4,6 4, ,7 4,4 1,82 c 1,35 c 3,17 c 2 7 0,68 46,8 18,2 4,2 9,13 a 5,01 a 14,15 a 3,65 5,9 4,35 6,5 7,7 22 1,77 c 1,24 c 3,02 c 0,89 6,2 1,88 7 8,6 3,2 2,44 b 1,57 c 4,01 b 1,05 5,8 2,7 8 11,1 4,8 4,24 b 3,06 b 7,30 a 1,95 5 4,05 7,2 13,3 6,2 2,96 b 2,62 b 5,59 b 2,9 6,8 0,98 14,5 5,2 17,4 6,28 a 3,47 b 9,76 a 2,59 6,8 1,58 15,4 13,3 22,8 16,65 a 4,45 a 21,11 a 6,8 1,73 15,9 3,4 17,4 1,86 c 1,36 c 3,22 b 1,48 7,4 0, ,5 4,8 TG glomaliny ogólne total glomalin. EEG łatwoekstrahowalne glomaliny easily extractable glomalin. GRSP białka glebowe spokrewnione z glomalinami glomalin related soil protein. Wartości średnie dla n = 5 Mean values for n = 5. Wartości oznaczone innymi literami różnią się między sobą istotnie statystycznie w grupie (p <0,05) Values signed with different letters are significantly differ (p <0.05).

18 18 A. Gałązka, K. Gawryjołek Tabela 3. Wartości współczynnika korelacji prostej Pearsona dla p <0,05 dla układów liniowych Table 3. The values of the coefficient of Pearson linear correlation p <0.05 TG EEG GRSP P 2 O 5 K 2 O Mg ph C og Hh TG 1,000 0,932* 0,992* 0,053 0,378 0,815* 0,257 0,442 0,405 EEG 0,932* 1,000 0,951* 0,010 0,391 0,742* 0,360 0,392 0,522* GRSP 0,992* 0,957* 1,000 0,028 0,365 0,799* 0,277 0,442 0,423 P 2 O 5 0,05 0,010 0,028 1,000 0,430 0,001 0,636* 0,242 0,604* K 2 O 0,378 0,391 0,365 0,430 1,000 0,404 0,358 0,069 0,429 Mg 0,815* 0,742* 0,799* 0,001 0,404 1,000 0,097 0,533* 0,155 ph 0,257 0,360 0,277 0,636* 0,358 0,097 1,000 0,081 0,896* C og 0,442 0,392 0,442 0,242 0,069 0,533* 0,081 1,000 0,058 Hh 0,405 0,523* 0,423 0,604* 0,429 0,155 0,896* 0,058 1,000 Wartości oznaczone (*) różnią się istotnie statystycznie (p <0,05) Values signed with (*) are significantly differ (p <0.05). Oznaczenia patrz tabela 1 numer of soil samples see Table 1. Analiza regresji prostej potwierdziła zależność stężenia glomalin ogólnych (TG) od stężenia glomalin łatwoekstrahowalnych (EEG) na poziomie współczynnika determinacji 68% oraz białek EEG od białek glebowych spokrewnionych z glomalinami (GRSP) na poziomie 80% (rys. 2). Liczebność i aktywność symbiotyczna grzybów AMF a tym samym wzrost produkcji glomaliny może być zwiększona zarówno poprzez modyfikację warunków glebowych sprzyjających namnażaniu i aktywności spor, jak i przez wprowadzanie do ryzosfery wyselekcjonowanych drobnoustrojów wspomagających proces mykoryzy. Głównymi wyznacznikami produkcji glomalin są zarówno gatunek grzyba tworzącego symbiozę, jak i rodzaj rośliny oraz właściwości biologiczne i fizyczne gleby [Cucci i in. 2015, Wu i in. 2015]. Większość zasymilowanego przez grzyby węgla jest dostarczana do rośliny (ok. 85%), pozostała część jest wykorzystywana m.in. na produkcję glomaliny. WNIOSKI 1. W archiwalnych próbkach glebowych stwierdzono obecność glomalin ogólnych, łatwoekstrahowalnych oraz białek glebowych spokrewnionych z glomalinami. 2. Wysokie stężenia glomalin w badanych glebach potwierdzają przyjęta hipotezę, iż białka te nie ulegają całkowitej degradacji i pozostają w glebie nawet przez kilkanaście lat. 3. Stwierdzono zależność stężenia glomalin ogólnych (TG) od stężenia glomalin łatwoekstrahowalnych (EEG) na poziomie współczynnika determinacji 68% oraz białek EEG od białek glebowych spokrewnionych z glomalinami (GRSP) na poziomie 80%. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

19 Czy białko może być obecne w glebie nawet 20 lat? a TG [mg g 1 s.m. gleby] TG [mg g 1 d.m. of soil] EEG:TG: y = 2, ,7857*x; r = 0,8275; p = 0,0001; r 2 = 0, ,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 EEG [mg g 1 s.m. gleby] EEG [mg g 1 d.m. of soil] b GRSP [mg g 1 s.m. gleby] GRSP [mg g 1 d.m. of soil] EEG:GRSP: y = 2, ,7857*x; 14 r = 0,8947; p = 0,00001; r 2 = 0, ,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 EEG [mg g 1 s.m. gleby] EEG [mg g 1 d.m. of soil] Rys. 2. Fig. 2. Analiza regresji p <0,05. TG glomaliny ogólne, EEG łatwoekstrahowalne glomaliny, GRSP białka glebowe spokrewnione z glomalinami [mg g 1 s.m. gleby] Analysis of regresion p <0.05. TG total glomalin, EEG easily extractable glomalin, GRSP glomalin related soil protein [mg g 1 d.m. of soil] nr 587, 2016

20 20 A. Gałązka, K. Gawryjołek Podziękowania Badania wykonano w ramach realizacji tematu z działalności statutowej IUNG-PIB 1.16 oraz zadania 1.4. Ocena i kształtowanie bioróżnorodności środowiska glebowego oraz aktywności mikrobiologicznej gleb z uwzględnieniem różnych warunków siedliskowych i systemów gospodarowania. Program Wieloletni IUNG-PIB na lata LITERATURA Bradford M.M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, Cucci G., Lacolla G., Pagliai M., Vignozzi N., Effect of reclamation on the structure of silty- -clay soils irrigated with saline-sodic waters. Int. Agrophys. 29, Driver J.D., Holben W.E., Rillig M.C., Characterization of glomalin as a hyphal wall component of arbuscular mycorrhizal fungi. Soil Biol. Biochem. 37, Fakom R., Adamou S., Teugwa M.C., Begoude Boyogueno A.D., Nana W.L., Ngonkeu M.E.L., Tchameni N.S., Nwaga D., Tsala Ndzomo G., Amvam Zollo P.H., Glomalin related soil protein, carbon, nitrogen and soil aggregate stability as affected by land use variation in the humid forest zone of south Cameroon. Soil Till. Res. 120, Gałązka A., Charakterystyka glomalin i oddziaływania różnych systemów uprawy na ich zawartość w glebie. Polish J. Agronom. 15, Gałązka A., Gawryjołek K., Glomalina glikoproteina produkowana przez grzyby mykoryzy arbuskularnej. Postep Mikrobiol. 54 (3), Gillespie A.W., Farrell R.E., Walley F.L., Ross A.R.S., Leinweber P., Eckhardt K.U., Regier T.Z., Blyth R.I.R., Glomalin-related soil protein contains non-mycorrhizal-related heat- -stable proteins, lipids and humic materials. Soil Biol. Biochem. 43, Guo H., He X.L., Li Y.P., Spatial distribution of arbuscular mycorrhiza and glomalin in the rhizosphere of Caragana korshinskii Kom. in the Otindag sandy land, China. Afr. J. Microbiol. Res. 6, Koide R.T., Peoples M.S., Behavior of Bradford-reactive substances is consistent with predictions for glomalin. Appl. Soil Ecol. 63, Król M., Drobnoustroje ryzosfery jęczmienia jarego. ISBN , H(13). Rozprawa habilitacyjna. Nichols K.A., Characterization of glomalin a glycoprotein produced by arbuscular mycorrhizal fungi. Agriculture, Soil Sci. 81, Purin S., Rillig M.C., The arbuscular mycorrhizal fungal protein glomalin: Limitations, progress, and a new hypothesis for its function. Pedobiologia 51, Rillig M.C., Arbuscular mycorrhizae and terrestrial ecosystem processes. Ecol. Lett. 7, Rillig M.C., Steinberg P.D., Glomalin production by an arbuscular mycorrhizal fungus: a mechanism of habitat modification? Soil Biol. Biochem. 34, Schindler F.V., Mercer E.J., Rice J.A., Chemical characteristics of glomalin-related soil protein (GRSP) extracted from soils of varying organic matter content. Soil Biol. Biochem. 39, Wang S., Wu Q.-S., He X.-H., Exogenous easily extractable glomalin-related soil protein promotes soil aggregation, relevant soil enzyme activities and plant growth in trifoliate orange. Plant Soil Environ. 61 (2), Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

21 Czy białko może być obecne w glebie nawet 20 lat? Wright S.F., Anderson R.L., Aggregate stability and glomalin in alternative crop rotations for the central Great Plains. Biol. Fert. Soils 31, Wright S.F., Franke-Synder M., Morton J.B., Upadhyaya A., Time course study and partial characterization of a protein on hyphae of arbuscular mycorrhizal fungi during active colonization of roots. Plant Soil 181, Wright S.F., Upadhyaya A., Extraction of an abundant and unusual protein from soil and comparison with hyphal protein from arbuscular mycorrhizal fungi. Soil Sci. 161, Wu Q.S., Li Y., Zou Y.N., He X.H., Arbuscular mycorrhiza mediates glomalin-related soil protein production and soil enzyme activities in the rhizosphere of trifoliate orange grown under different P levels. Mycorrhiza 25, CAN SOIL PROTEINS BE PRESENT IN THE SOIL EVEN 20 YEARS? ASSESSMENT OF TOTAL AND EASY EXTRACTABLE GLOMALIN CONTENTS IN ARCHIVAL SAMPLES OF SOIL Summary. Glomalines are thermostable, water-insoluble glycoproteins abundantly produced by Glomus fungi and tends to accumulate in the soil, that surrounds soil aggregates and protects them from destroying. Glomalines are especially resistant to destruction, hard to dissolve in water, while very easy dissolve in high temperature (121 C) in citrate buffer with neutral or alkali ph. These proteins have very unique physico-chemical properties performing a fundamental role in making soil structure. The content of glomalin in soil particles is significantly correlated with their stability (water resistance). It is possible that glomalin is involved in the formation of hydrophobic properties of soil, improving water and air relations in soil. Glomalines are mainly located on the surface of hyphae and spores of AM (arbuscular mycorrhizal) fungi and a hydrophobic substances covers and protects it from the degradation by other microorganisms. It also increases the stiffness and the durability of the cell of fungi facilitating their distribution in the soil. Production and distribution of glomalin in soil involves many factors, both related to the physico-chemical properties of soil and plant and fungal species. The structure of soil and its chemical properties have a significant effect on the growth of mycelium, and therefore the glomalin content. Glomalins are very resistant to degradation. As aging hyphae outside the root and the roots of plants, biomass mycelium of AMF fungi is degraded but not glomalin. This protein is unchanged is able to survive in the soil even decades. Glomalins commonly occur in different types of soils. The aim of the study was to demonstrate the presence of total and easy extractable glomalins in archival samples of soil from the collection of soil Department of Microbiology IUNG-PIB in Puławy. The study selected 20 soil samples from field trials in 1994 with the cultivation of barley. The soil samples survey from various Polish regions and represented different types of soils. Soils were characterized by different physical, chemical and biological properties. The studies carried out in this paper have shown the contents of glomalin in all soil samples. The concentration of total and easily extracted glomalin depend mainly on the type of soil. The presence of glomalin in soils confirms the hypothesis that these proteins are particularly resistant to degradation and can remain unchanged in the soil even decades. Key words: glomalin, total glomalin, easily extractable glomalin, glomalin-related soil protein, soil, mycorrhiza nr 587, 2016

22

23 Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych nr 587, 2016, PORÓWNANIE EKOTOKSYCZNOŚCI 1-BUTYLO-2,3-DIMETYLOIMIDAZOLIOWYCH CIECZY JONOWYCH Z ANIONEM TETRAFLUOROBORANOWYM I HEKSAFLUOROFOSFORANOWYM W STOSUNKU DO WYBRANYCH ENZYMÓW GLEBOWYCH Arkadiusz Telesiński 1, Robert Biczak 2, Barbara Pawłowska 2, Michał Stręk 1, Maciej Płatkowski 1 1 Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie 2 Akademia im. Jana Długosza w Częstochowie Streszczenie. Celem podjętych badań było określenie oddziaływania dwóch 1-butylo- -2,3-dimetyloimidazoliowych cieczy jonowych z różnymi anionami: tetrafluoroboranowym [BMMIM][BF4] i heksafluorofosforanowym [BMMIM][PF6] na aktywność wybranych enzymów glebowych: dehydrogenaz, fosfatazy kwaśnej, fosfatazy zasadowej oraz ureazy. Badania przeprowadzono na piasku gliniastym o zawartości węgla organicznego 9,50 g kg 1. Do gleby wprowadzono wodne roztwory [BMMIM][BF4] lub [BMMIM][PF6] w ilościach: 0, 1, 10, 50, 100, 400, 700 i 1000 mg kg 1 s.m. Tak przygotowaną glebą napełniano wazony, do których następnie wysiano po 15 nasion jęczmienia jarego lub rzodkiewki. Przez cały okres badań utrzymywano stałą temperaturę 20 ±2 C oraz wilgotność na poziomie 70%. W 14. dniu doświadczenia oznaczono spektrofotometrycznie aktywność wymienionych enzymów. Wprowadzenie do gleby [BMMIM][BF4] i [BMMIM][PF6] spowodowało inhibicję aktywności wszystkich enzymów glebowych, pogłębiającą się wraz ze wzrostem dawki analizowanych substancji. Spośród oznaczanych enzymów najbardziej wrażliwa na obecność obu cieczy jonowych okazała się fosfataza kwaśna. Jedynie po aplikacji analizowanych związków, w dawce 1000 mg kg 1, największa inhibicja aktywności wystąpiła w przypadku ureazy. Słowa kluczowe: ciecze jonowe, gleba, dehydrogenazy, ureaza, fosfatazy, wskaźnik oporności arkadiusz.telesinski@zut.edu.pl Copyright by Wydawnictwo SGGW

24 24 A. Telesiński i inni WSTĘP Aktualnie na całym świecie prowadzi się coraz więcej badań nad syntezą i właściwościami cieczy jonowych, które wskazują na możliwość praktycznego ich zastosowania [Pham i in. 2010]. Pierwszym opisanym przez Waldena w 1914 roku związkiem tego typu był azotan etyloamoniowy [C 2 H 5 NH 3 ] + [NO 3 ]ˉ, ale szersze zainteresowanie cieczami jonowymi datuje się na 1990 rok, kiedy to odkryto możliwości ich wykorzystania jako środowiska reakcji [Majewska i Białecka-Florjańczyk 2010]. Ze względu na swoje właściwości stały się one głównymi rozpuszczalnikami w tzw. zielonej chemii, znajdując szerokie zastosowanie w takich dziedzinach nauki, jak: synteza organiczna, biokataliza, elektrochemia, chemia analityczna i wiele innych [Liu i in. 2006, Matzke i in. 2009]. W odróżnieniu od rozpuszczalników organicznych ciecze jonowe są płynnymi solami całkowicie zbudowanymi z jonów. Składają się one zazwyczaj z dużego organicznego kationu oraz o wiele mniejszego nieorganicznego lub organicznego anionu [Stepnowski 2005]. Ładunek dodatni w tych solach zlokalizowany jest na atomie azotu, fosforu lub siarki [Pernak i in. 2005]. Wśród cieczy jonowych poszukuje się związków chemicznych o właściwościach biobójczych, które mogłyby zastąpić komercyjnie stosowane, niebezpieczne dla zdrowia i życia człowieka biocydy [Janiszewska i in. 2010]. W praktyce najczęściej stosowane są ciecze jonowe imidazoliowe i pirydyniowe. Najbardziej popularne i najdokładniej przebadane są z kolei pochodne 1-alkilo-3-metyloimidazoliowe [Docherty i in. 2007]. Słaba prężność par cieczy jonowych bywa często utożsamiana z brakiem ich szkodliwego oddziaływania na środowisko. Nie można jednak wykluczyć, że w wyniku dobrej rozpuszczalności w wodzie cieczy jonowych, ich resztkowe pozostałości znajdują się w ściekach i środowisku. Źródłem zanieczyszczenia środowiska mogą być również produkty i odpady zawierające ciecze jonowe. Pod uwagę należy brać także zanieczyszczenia wprowadzane bezpośrednio do środowiska wodno-glebowego, w wyniku różnorakich zdarzeń incydentalnych takich jak awarie urządzeń technologicznych oraz pojazdów transportowych [Amde i in. 2015]. Rozpuszczalność w wodzie, a także zdolność do tworzenia wiązań wodorowych wpływają w znaczący sposób na szybkość dystrybucji, biodostępność, potencjał biodegradacyjny oraz bioakumulację cieczy jonowych w środowisku. Związki rozpuszczalne w wodzie rozprzestrzeniają się najszybciej zarówno w środowisku glebowym, jak i wodnym, będąc łatwiej dostępnymi dla mikroorganizmów oraz organizmów wyższych [Zhao i in. 2007]. Wiele cieczy jonowych zawiera w anionie atomy fluoru. Aniony takie mogą w środowisku ulegać hydrolizie, czego efektem może być powstawanie toksycznego fluorowodoru [Swatlowski i in. 2003]. Precyzyjną miarą stanu ekochemicznego gleb, uwzględniającą zarówno pojemność homeostatyczną danego ekosystemu ekologicznego, jak i poziom zanieczyszczenia środowiska, który zagraża organizmom żywym, jest aktywność enzymów glebowych [Bielińska i Mocek 2010]. Celem podjętych badań było więc określenie oddziaływania dwóch cieczy jonowych: tetrafluoroboranu 1-butylo-2,3-dimetyloimidazoliowego [BMMIM][BF4] i heksafluorofosforanu 1-butylo-2,3-dimetyloimidazoliowego [BMMIM][PF6] na aktywność dehydrogenaz, fosfataz i ureazy. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

25 Porównanie ekotoksyczności 1-butylo-2,3-dimetyloimidazoliowych cieczy jonowych MATERIAŁ I METODY Doświadczenie wazonowe przeprowadzono w hali wegetacyjnej Zakładu Biochemii i Ekotoksykologii Akademii im. Jana Długosza w Częstochowie. W badaniach użyto glebę o składzie granulometrycznym piasku gliniastego, z zawartością węgla organicznego 9,50 g kg 1, ilością frakcji <0,02 mm 10,01% oraz ph 6,0. Do gleby wprowadzono wodne roztwory [BMMIM][BF4] lub [BMMIM][PF6] w ilościach: 0, 1, 10, 50, 100, 400, 700 i 1000 mg kg 1 s.m. Po aplikacji cieczy jonowych wilgotność gleby doprowadzono do 70% maksymalnej pojemności wodnej i na tym poziomie utrzymywano ją w trakcie trwania doświadczenia. Tak przygotowaną glebą napełniono po trzy wazony dla każdego wariantu, a następnie wysiano do nich po 15 nasion jęczmienia jarego (Hordeum vulgare L.) lub rzodkiewki (Raphanus sativus L. subvar. radicula Pers.). Przez cały okres badań utrzymywano stałą temperaturę 20 ±2 C i natężenie oświetlenia równe 7000 luxów, w systemie 16 godzin na dzień i 8 godzin na noc. W 14. dniu doświadczenia pobrano próbki gleb i oznaczono w nich spektrofotometrycznie aktywność dehydrogenaz, EC x [Thalmann 1968], fosfatazy kwaśnej, EC i zasadowej, EC [Tabatabai i Bremner 1969] oraz ureazy, EC [Kandeler i Gerber 1988]. Do oznaczeń użyto spektrofotometru UV-1800 firmy Shimadzu. Na podstawie otrzymanych wyników obliczono indeksy oporności enzymów (RS), zgodnie ze wzorem podanym przez Orwin i Wardle a [2004]. Wszystkie analizy wykonano w trzech powtórzeniach. Uzyskane wyniki opracowano statystycznie za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji ANOVA oraz komplementarnie porównano testem post-hoc Tukeya HSD, wykorzystując oprogramowanie Statistica 12.5 Statsoft. Przyjęty poziom istotności wynosił p <0,05. WYNIKI I DYSKUSJA Wprowadzenie do gleby obu cieczy jonowych: [BMMIM][BF4] oraz [BMMIM] [PF6] spowodowało w większości przypadków istotne zmiany aktywności oznaczanych enzymów. W doświadczeniu wazonowym z jęczmieniem jarym aplikacja [BMMIM][BF4] w dawce 1 mg kg 1, w porównaniu do gleby kontrolnej, spowodowała istotny statystycznie spadek aktywności dehydrogenaz (o 5,25%), fosfatazy zasadowej (o 4,18%) oraz wzrost aktywności ureazy (o 2,58%). Po wprowadzeniu [BMMIM][PF6] w tej dawce odnotowano istotną statystycznie inhibicję aktywności fosfatazy kwaśnej (o 3,33%) i fosfatazy zasadowej (o 6,00%). Pozostałe dawki badanych cieczy jonowych obniżały aktywność wszystkich oznaczanych enzymów, a zaobserwowana inhibicja pogłębiała się wraz z ich zwiększaniem i przy dawce 1000 mg kg 1 wynosiła dla dehydrogenaz, fosfatazy kwaśnej, fosfatazy zasadowej oraz ureazy, dla [BMMIM][BF4], odpowiednio: 63,21, 56,05, 46,82 i 86,70%, a dla [BMMIM][PF6], odpowiednio: 45,37, 62,11, 53,02 i 85,24% (tab. 1). W doświadczeniu z rzodkiewką po zastosowaniu [BMMIM][BF4] w dawce 1 mg kg 1 stwierdzono istotnie statystycznie wzrost aktywności dehydrogenaz (o 5,72%) oraz spadek aktywności fosfatazy kwaśnej (o 3,12%) i fosfatazy zasadowej (o 10,14%). Wprowadzenie [BMMIM][PF6] w tej dawce wywołało zaś inhibicję aktywności fosfatazy kwaśnej nr 587, 2016

26 26 A. Telesiński i inni (o 4,82%) i fosfatazy zasadowej (o 9,72%). Podobnie jak w doświadczeniu z jęczmieniem jarym aplikacja większych dawek obu soli 1-butylo-2,3-dimetyloimidazoliowych hamowała aktywność wszystkich oznaczanych enzymów (tab. 2). Analogicznie do doświadczenia z jęczmieniem jarym zaobserwowana inhibicja pogłębiała się wraz ze zwiększeniem dawki cieczy jonowych i przy 1000 mg kg 1 wynosiła dla dehydrogenaz, fosfatazy kwaśnej, fosfatazy zasadowej oraz ureazy, dla [BMMIM][BF4], odpowiednio: 35,74, 48,02, 47,19 i 85,36%, a dla [BMMIM][PF6], odpowiednio: 39,97, 58,39, 53,69, 85,52%. Prowadzone wcześniej badania nad oddziaływaniem 1-alkilo-3-metyloimidazoliowych cieczy jonowych na aktywność enzymatyczną gleby wykazały zwiększającą się inhibicję aktywności enzymów glebowych: dehydrogenaz, katalazy, fosfatazy zasadowej, proteaz oraz amylazy wraz ze zwiększeniem dawki, jak i długością podstawnika alkilowego [Telesiński 2010]. Spadek aktywności dehydrogenaz glebowych pod wpływem siedmiu różnych imidazoliowych cieczy jonowych odnotowali również Liwarska-Bizukojc i inni [2015]. Wielu autorów donosi także o negatywnym wpływie imidazoliowych cieczy jonowych na aktywność drobnoustrojów, które są głównym źródłem enzymów w glebie [Carson i in. 2009, Wang i in. 2011, Yu i Nie 2011, Guo i in. 2015, Mester i in. 2015]. Tabela 1. Zmiany aktywności enzymów glebowych po aplikacji [BMMIM][BF4] i [BMMIM][PF6] w doświadczeniu wazonowym z jęczmieniem jarym Table 1. Changes of soil enzyme activities after treatment with [BMMIM][BF4] and [BMMIM][PF6] in pot experiment with spring barley Dawka cieczy jonowej Ionic liquids dose DHA Fk Fz URE [BMMIM][BF4] 0 8,18 ±0,04 a 265,10 ±13,06 a 242,24 ±4,35 a 207,78 ±2,53 b 1 7,75 ±0,91 b 260,26 ±7,46 ab 232,12 ±3,73 b 213,15 ±2,55 a 10 6,67 ±0,92 c 233,00 ±11,19 c 231,24 ±4,36 b 188,08 ±7,60 c 50 6,03 ±0,51 e 196,07 ±8,70 e 200,91 ±10,19 d 172,85 ±11,40 d 100 5,17 ±0,46 f 186,84 ±4,35 f 198,71 ±6,22 d 164,79 ±2,35 e 400 5,06 ±0,33 f 146,84 ±7,46 h 149,03 ±6,84 f 162,10 ±1,27 e 700 3,34 ±0,14 g 130,57 ±8,08 i 135,41 ±8,70 g 145,98 ±8,87 f ,01 ±0,08 g 116,50 ±5,61 i 128,81 ±10,57 h 27,64 ±2,78 i [BMMIM][PF6] 0 8,12 ±0,13 a 267,25 ±10,54 a 244,05 ±8,46 a 206,89 ±2,78 b 1 8,03 ±0,26 a 258,36 ±3,58 b 229,41 ±5,64 b 205,99 ±3,24 b 10 7,42 ±0,45 cd 224,68 ±8,54 d 224,64 ±3,89 c 182,36 ±5,04 c 50 6,98 ±0,33 d 200,27 ±4,36 e 221,35 ±7,05 c 170,33 ±2,39 d 100 5,89 ±0,42 e 172,28 ±6,24 g 200,36 ±5,62 d 160,91 ±3,57 e 400 5,76 ±0,43 e 121,04 ±2,28 j 175,36 ±4,58 e 125,60 ±4,58 g 700 5,01 ±0,38 f 118,64 ±3,89 j 123,25 ±6,54 h 98,26 ±6,58 h ,46 ±0,14 h 101,26 ±5,55 k 114,65 ±4,73 i 30,54 ±1,57 i DHA dehydrogenazy [mg TPF kg 1 s.m. 16 h 1 ] dehydrogenases [mg TPF kg 1 d.w. 16 h 1 ]. Fk fosfataza kwaśna [mg p-np kg 1 s.m. h 1 ] acid phosphatase [mg p-np kg 1 d.w. h 1 ]. Fz fosfataza zasadowa [mg p-np kg 1 s.m. h 1 ] alkaline phosphatase [mg p-np kg 1 d.w. h 1 ]. URE ureaza [mg N-NH 4 kg 1 s.m. 2 h 1 ] urease [mg N-NH 4 kg 1 d.w. 2 h 1 ]. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

27 Porównanie ekotoksyczności 1-butylo-2,3-dimetyloimidazoliowych cieczy jonowych Obliczone wskaźniki oporności wykazały, że wprowadzenie obu cieczy jonowych w dawce 1 mg kg 1 w niewielkim stopniu wpłynęło na aktywność oznaczanych enzymów, zwłaszcza fosfatazy kwaśnej i ureazy w przypadku [BMMIM][BF4] oraz dehydrogenaz i ureazy w przypadku [BMMIM][PF6]. Analiza wpływu większych dawek cieczy jonowych na wskaźniki oporności wykazała, że po aplikacji [BMMIM][BF4] w dawkach od 10 do 700 mg kg 1 najbardziej wrażliwe na obecność tej cieczy jonowej w glebie okazały się dehydrogenazy oraz fosfataza kwaśna (spadek wartości RS od 0,79 do 0,37), z kolei po zastosowaniu [BMMIM][PF6] tylko fosfataza kwaśna (spadek wartości RS od 0,72 do 0,29). W glebie z największą dawką obu cieczy jonowych największy spadek indeksu oporności wystąpił w przypadku aktywności ureazy (dla [BMMIM][BF4] RS = 0,07, a dla [BMMIM][PF6] RS = 0,08) rysunek. Tabela 2. Zmiany aktywności enzymów glebowych po aplikacji [BMMIM][BF4] i [BMMIM][PF6] w doświadczeniu wazonowym z rzodkiewką Table 2. Changes of soil enzyme activities after treatment with [BMMIM][BF4] and [BMMIM][PF6] in pot experiment with common radish Dawka cieczy jonowych Ionic liquids dose DHA Fk Fz URE [BMMIM][BF4] 0 8,03 ±0,55 b 263,67 ±5,17 a 241,06 ±4,69 a 207,11 ±5,68 a 1 8,49 ±0,33 a 255,45 ±6,87 b 216,61 ±5,78 c 201,51 ±3,47 ab 10 7,58 ±0,68 c 235,17 ±7,36 c 231,23 ±2,96 b 200,61 ±6,21 b 50 7,43 ±0,47 cd 226,94 ±9,61 d 230,17 ±3,86 b 185,39 ±2,98 c 100 6,37 ±0,18 de 214,88 ±4,69 e 181,00 ±2,66 e 183,60 ±3,38 c 400 5,76 ±0,51 ef 212,69 ±1,99 e 161,86 ±3,89 g 149,57 ±5,02 e 700 5,31 ±0,38 f 152,39 ±4,98 g 145,12 ±4,83 h 132,55 ±3,87 f ,16 ±0,28 fg 137,04 ±3,87 h 127,31 ±5,01 i 30,32 ±1,89 h [BMMIM][PF6] 0 8,13 ±0,47 b 265,36 ±4,58 a 245,20 ±3,58 a 207,28 ±7,32 a 1 8,20 ±0,73 b 252,56 ±7,21 b 221,36 ±7,01 bc 205,24 ±3,19 a 10 7,76 ±0,14 c 220,36 ±4,58 de 218,36 ±1,88 c 188,36 ±5,43 c 50 7,66 ±0,61 c 193,56 ±2,58 d 215,36 ±4,87 c 168,36 ±4,57 c 100 6,87 ±0,47 d 173,54 ±4,45 f 192,36 ±5,06 d 158,36 ±4,89 d 400 6,00 ±0,27 de 136,35 ±6,02 h 171,86 ±4,47 f 127,63 ±3,38 f 700 5,42 ±0,30 f 120,36 ±2,58 i 124,84 ±5,39 i 101,35 ±4,69 g ,88 ±0,21 g 110,42 ±6,24 j 113,56 ±4,87 j 30,01 ±2,33 h DHA dehydrogenazy [mg TPF kg 1 s.m. 16 h 1 ] dehydrogenases [mg TPF kg 1 d.w. 16 h 1 ]. Fk fosfataza kwaśna [mg p-np kg 1 s.m. h 1 ] acid phosphatase [mg p-np kg 1 d.w. h 1 ]. Fz fosfataza zasadowa [mg p-np kg 1 s.m. h 1 ] alkaline phosphatase [mg p-np kg 1 d.w. h 1 ]. URE ureaza [mg N-NH 4 kg 1 s.m. 2 h 1 ] urease [mg N-NH 4 kg 1 d.w. 2 h 1 ]. Zmiany aktywności oznaczanych enzymów mogą wynikać z bezpośredniego oddziaływania kationu imidazoliowego, jak również z hydrolizy anionów i uwalniania do środowiska glebowego jonów fluorkowych [Freire i in. 2010]. Wcześniejsze badania nr 587, 2016

28 28 A. Telesiński i inni wykazały, że wprowadzenie do gleby 1-alkilo-3-metyloimidazoliowych cieczy jonowych z anionem tetrafluoroboranowym spowodowało podwyższenie w glebie zawartości fluoru rozpuszczalnego i potencjalnie dostępnego dla roślin. Ponadto stwierdzono istotną statystycznie ujemną korelację między zawartością fluoru a aktywnością enzymatyczną gleby [Telesiński 2012]. Negatywny wpływ fluoru na właściwości mikrobiologiczne i biochemiczne gleb potwierdzają również badania wielu autorów [Telesiński i in. 2010, Monadal i in. 2015, Onyszko i Telesiński 2015, Szostek i in. 2015]. 1 DHA Fk Fz URE 0,8 0,6 RS 0,4 0,2 Rys. Fig [BMMIM][BF4] [BMMIM][PF6] Średnie wskaźniki oporności (RS) enzymów glebowych po zastosowaniu [BMMIM][BF4] i [BMMIM][PF6]: DHA dehydrogenazy, Fk fosfataza kwaśna, Fz fosfataza zasadowa, URE ureaza Mean resistance indices (RS) of soil enzymes after treatments with [BMMIM][BF4] and [BMMIM][PF6]: DHA dehydrogenases, Fk acid phosphatase, Fz alkaline phosphatase, URE urease WNIOSKI 1. Wprowadzenie do gleby dwóch 1-butylo-2,3-dimetyloimidazoliowych cieczy jonowych z anionami: tetrafluoroboranowym [BMMIM][BF4] i heksafluorofosforanowym [BMMIM][PF6] spowodowało inhibicję aktywności enzymów glebowych: dehydrogenaz, fosfatazy kwaśnej, fosfatazy zasadowej i ureazy pogłębiającą się wraz ze wzrostem dawki analizowanych substancji. 2. Spośród oznaczanych enzymów najbardziej wrażliwa na obecność [BMMIM][BF4] i [BMMIM][PF6] okazała się fosfataza kwaśna. Jedynie po aplikacji analizowanych związków w dawce 1000 mg kg 1 największa inhibicja aktywności wystąpiła w przypadku ureazy. 3. Pomimo wykazanej ekotoksyczności [BMMIM][BF4] i [BMMIM][PF6] w stosunku do aktywności enzymatycznej gleby, trudno jednoznacznie wskazać, która z analizowanych soli wywarła większy wpływ na oznaczane parametry biochemiczne. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

29 Porównanie ekotoksyczności 1-butylo-2,3-dimetyloimidazoliowych cieczy jonowych LITERATURA Amde M., Liu J.-F., Pang L., Environmental application, fate, effect and concerns of ionic liquids. Environ. Sci. Technol. 49, Bielińska E.J., Mocek A., Właściwości sorpcyjne i aktywność sorpcyjna gleb parków miejskich na terenach o zróżnicowanym wpływie antropopresji. J. Res. Appl. Agric. Engin. 55 (3), Carson L., Chau P.K.W., Earle M.J., Gilea M.A., Gilmore B.F., Gorman S.P., McCanna M.T., Seddom K.R., Antibiofilm activities of 1-alkyl-3-methylimidazolium chloride ionic liquids. Green Chem. 11 (4), Docherty K.M., Dixon J.K., Kulpa C.F., Biodegrability of imidazolium and pyridinic ionic liquids by an activated sludge microbial community. Biodegradation 18 (4), Freire M.G., Neves C.M.S.S., Marrucho I.M., Coutinho J.A.P., Fernandes A.M., Hydrolysis of tetrafluoroborate and hexafluorophosphate counter ions in imidazolium-based ionic liquids. J. Phys. Chem. A 114 (11), Guo P., Zhu L., Wang J., Wang J., Liu T., Effects of alkyl-imidazolium ionic liquid [Omim]Cl on the functional diversity of soil microbial communities. Environ. Sci. Pollut. Res. 22, Janiszewska D., Syguda A., Pernak J., Ciechowskie ciecze jonowe. Przem. Chem. 89 (11), Kandeler E., Gerber H., Short-term assay of soil urease activity using colorimetric determination of ammonium. Biol. Fertil. Soils 6, Liu X., Zhou F., Liang Y., Liu W., Benzotriazole as additive for ionic liquid lubricant: one pathway towards actual application of ionic liquids. Tribol. Lett. 23 (3), Liwarska-Bizukojc E., Maton C., Stevens C.V., Biodegradation of imidazolium ionic liquids by activated sludge microorganisms. Biodegradation 26, Majewska E., Białecka-Florjańczyk E., Zielona chemia w przemyśle spożywczym. Chem. Dydakt. Ekol. Metrol. 15 (1), Matzke M., Thiele K., Müller A., Filser J., Sorption and desorption of imidazolium based ionic liquids in different soil types. Chemosphere 74 (4), Mester P., Wagner M., Rossmanith P., Antimicrobial effects of short chained imidazolium- -based ionic liquids Influence of anion chaotropicity. Ecotox. Environ. Saf. 111, Mondal N.K., Pal K.C., Dey M., Ghosh S., Das C., Datta J.K., Seasonal variation of soil enzymes in areas of fluoride stress in Birbhum District, West Bengal, India. J. Taib. Univ. Sci. 9 (2), Onyszko M., Telesiński A., Wpływ selenu i fluoru na aktywność fosfataz w glebie lekkiej. Inż. Ekol. 43, Orwin K.H., Wardle D.A., New indices for quantifying the resistance and resilience of soil biota to exogenous disturbances. Soil Biol. Biochem. 36 (11), Pernak A., Iwanik K., Majewski P., Grzymisławski M., Pernak J., Ionic liquids as an alternative to formalin in histopathological diagnosis. Acta Histochem. 107 (2), Pham T.P.T., Cho C.-W., Yun T.-S., Environmental fate and toxicity of ionic liquids: A review. Water Res. 44 (2), Stepnowski S., Preliminary assessment of the sorption of some alkyl imidazolium cations as used in ionic liquids to soil and sediments. Aust. J. Chem. 58 (3), Swatlowski R.P., Holbrey J.D., Rogers R.D., Ionic liquids are not always green: hydrolysis of 1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate. Green Chem. 5 (4), Szostek R., Ciećko Z., Walczak M., Swiontek-Brzezinska M., Microbiological and enzymatic activity of soil after pollution with fluorine. Pol. J. Environ. Sci. 24 (6), nr 587, 2016

30 30 A. Telesiński i inni Tabatabai M.A., Bremner J.M., Use of p-nitrophenyl phosphate for assay soil phosphatase activity. Soil Biol. Biochem. 1 (4), Telesiński A., Smolik B., Grabczyńska E., Formation of adenylate energy charge (AEC) versus the fluorine content in forest soil in the area affected by emission from Police Chemical Plant. Journal of Elementol. 15 (2), Thalmann A., Zur Methodik der Bestimmung der Dehydrogenaseaktivität im Boden mittels Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC). Landwirtsch. Forsch. 21, Wang H., Malhorta S.V., Francis A.J., Toxicity of various anions associated with methoxyethyl methyl imidazolium-based ionic liquids on Clostridium sp. Chemosphere 82 (11), Yu Y., Nie Y., Toxicity and antimicrobial activities of ionic liquids with halogen anion. J. Environ. Protect. 2 (3), Zhao D., Liao Y., Zhang G., Toxicity of ionic liquids. Clean 35 (1), COMPARISON OF ECOTOXICITY OF 1-BUTYL-2,3-DIMETHYLIMIDAZOLIUM IONIC LIQUIDS WITH TETRAFLUOROBORATE AND HEXAFLUOROPHOSPHATE ANION FOR SELECTED SOIL ENZYMES Summary. Ecotoxicity of two 1-butyl-2,3-dimethylimidazolium ionic liquis (ILs) with different anion: tetrafluoroborate [BMMIM][BF4] and hexafluorophosphate [BMMIM][PF6], to soil enzymes was tested in the research. A pot experiment was carried out in the vegetation hall of the Department of Biochemistry and Ecotoxicology at Jan Długosz University in Częstochowa. A monocotyledonous plant, the spring barley (Hordeum vulgare L.) and a dicotyledonous plant, the common radish (Raphanus sativus L. subvar. radicula Pers.) were used in the experiment. The seeds of the plants, originating from the same source, were sown into a 90-mm diameter plastic plant pot that was filled with the reference soil and a soil thoroughly mixed with the studied ILs. The ILs was used at the dosages of 0, 1, 10, 50, 100, 400, 700 and 1,000 mg kg 1 d.m. The soil used in the experiment was loamy sand with a dissolved matter containing of approximately 10%, an organic carbon of 9.0 g kg 1 and ph in 1 M KCl equal to 6.0. Throughout the testing period (14 days), constant substrate moisture content at the level required for the plants (70% field water capacity) and a constant temperature 20 ±2 C. On day 14 the soil samples were collected to analyze activity of dehydrogenase (EC x), acid phosphatase (EC ), alkaline phosphatase (EC ), and urease (EC ) were measured spectrophotometrically. Obtained results showed that the application of [BMMIM][BF4] and [BMMIM][PF6] to soil caused inhibition of all enzymes activities, which increased with increase in ionic liquids dosages. Among all assayed enzymes acid phosphatase was the most vulnerable for treatment with both ionic liquids. However, in soil with the highest dosage (1,000 mg kg 1 ) of both ionic liquids, the resistance indices (RS) of urease activity were the lowest (RS values were 0.07 and 0.08, respectively). Despite proved ecotoxicity of [BMMIM][BF4] and [BMMIM][PF6] to the soil enzyme activity, it is difficult to clearly indicate which analyzed ILs had a stronger impact on determined biochemical parameters. Key words: ionic liquids, soil, dehydrogenases, urease, phosphatases, resistance index Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

31 Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych nr 587, 2016, OCENA ODDZIAŁYWANIA ZWIĄZKÓW SELENU ORAZ BENZYNY NA AKTYWNOŚĆ WYBRANYCH ENZYMÓW PRZEMIAN ZWIĄZKÓW AZOTU W GLEBIE Michał Stręk, Arkadiusz Telesiński Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie Streszczenie. W pracy przedstawiono wyniki oddziaływania benzyny oraz selenu (IV) i (VI), na aktywność wybranych enzymów przemian azotu w glebie. Badania prowadzono w doświadczeniu laboratoryjnym na glebie zakwalifikowanej jako piasek gliniasty o zawartości węgla organicznego 8,7 g kg 1 s.m. Do próbek gleby wprowadzono w różnych kombinacjach kwas selenowy (IV) lub kwas selenowy (VI) (ilość dodanego Se wynosiła 0,05 mmol kg 1 s.m.) oraz benzynę w ilościach 2, 10 i 50 g kg 1 s.m. Wszystkie próbki doprowadzono do 60% maksymalnej pojemności wodnej i inkubowano w stałej temperaturze 20 C. W 1., 7., 14., 28. i 56. dniu doświadczenia oznaczono spektrofotometrycznie aktywność reduktazy azotanowej, ureazy oraz proteaz. Wprowadzenie do gleby benzyny w dawce 2 g kg 1 s.m. wywołało stymulację aktywności ureazy oraz reduktazy, podczas gdy większe dawki benzyny inhibitowały aktywność enzymów przemian azotu w glebie lekkiej. Po dodaniu selenu, zwłaszcza Se (VI) do gleby zanieczyszczonej benzyną w dawkach 10 i 50 g kg 1 s.m. stwierdzono głównie stymulację oznaczanych enzymów, zwłaszcza reduktazy azotanowej. Słowa kluczowe: selen, benzyna, gleba, reduktaza azotanowa, ureaza, proteazy WSTĘP Nadmierna eksploatacja złóż naftowych, awarie podczas wydobycia, magazynowania i transportu surowców, stają się głównymi przyczynami narastającego skażenia środowiska substancjami ropopochodnymi [Gouda i in. 2016]. Kluczowe dla prawidłowego przebiegu procesu biodegradacji związków ropopochodnych jest występowanie odpowiedniej ilości substancji biogennych, w tym także azotu [Xenia i Refugio 2016]. Istotnym czynnikiem determinującym jego dostępność dla michal.strek@zut.edu.pl Copyright by Wydawnictwo SGGW

32 32 M. Stręk, A. Telesiński organizmów żywych jest metabolizm mikroflory glebowej. Mikroorganizmy rozkładając szczątki organiczne sprawiają, że azot staje się dostępny dla roślin. Przemiany związków azotu katalizowane są wiele enzymów, zarówno z klasy oksydoreduktaz, jak i hydrolaz [van Groenigen i in. 2015]. Substancje ropopochodne mogą jednakże negatywnie wpływać na aktywność mikroorganizmów i wydzielane przez nie enzymy [Stręk i Telesiński 2016a]. Dlatego też opracowanie szczegółowych programów zapobiegania degradacji gleb zanieczyszczonych substancjami ropopochodnymi, rekultywacji gleb zdegradowanych i ponownego ich zagospodarowania jest niezwykle ważnym problemem [Gałązka 2015]. Selen jako mikroskładnik dla organizmów żywych budzi kontrowersje. Z jednej strony jest on toksyczny już w niewielkich dawkach, które mogą prowadzić do negatywnych skutków środowiskowych, a z drugiej strony deficyt tego pierwiastka jest globalnym problemem związanym ze zwiększoną podatnością zwierząt i ludzi na wiele chorób [Borowska i in 2015]. Prowadzone wcześniej badania wykazały, że aplikacja selenu do gleb zanieczyszczonych substancjami ropopochodnymi może ograniczyć toksyczne oddziaływanie tych związków na aktywność niektórych enzymów oksydoredukcyjnych w glebie [Stręk i Telesiński 2015a, 2016a]. Celem badań była próba określenia oddziaływania selenu oraz benzyny na aktywność wybranych enzymów przemian związków azotu: reduktazy azotanowej, ureazy i proteaz w glebie lekkiej. MATERIAŁ I METODY Doświadczenia przeprowadzono, na próbkach gleb pobranych z poziomu ornopróchnicznego (0 30 cm) ziem rdzawych typowych znajdujących się na terenie Rolniczej Stacji Doświadczalnej w Lipniku (woj. zachodniopomorskie). Gleba ta charakteryzuje się składem granulometrycznym piasku gliniastego oraz zawartością węgla organicznego 8,7 g kg 1 s.m. Do części ziemistych pobranego materiału glebowego wprowadzono w różnych kombinacjach benzynę bezołowiową (Statoil) oraz selen (w ilości 0,05 mmol Se kg 1 s.m.) na dwóch stopniach utlenienia: (IV) i (VI), w postaci H 2 SeO 3 i H 2 SeO 4 (prod. Fluka). Odniesieniem (kontrolą) była gleba bez selenu i benzyny. W trakcie doświadczenia wilgotność próbek była utrzymywana na poziomie 60% maksymalnej pojemności wodnej. Glebę wymieszano i przechowywano w szczelnie zamkniętych szklanych pojemnikach typu twist w temperaturze 20 C. We wszystkich kombinacjach w trzech powtórzeniach badano spektrofotometrycznie aktywność reduktazy azotanowej EC [Abdelmagid i Tabatabai 1987], ureazy EC [Kandeler i Gerber 1988] oraz proteaz EC x [Ladd i Butler 1972] w 1., 7., 14., 28. i 56. dniu doświadczenia. W oznaczeniach zastosowano spektrofotometr UV-1800 firmy Shimadzu. Na podstawie otrzymanych wyników aktywności enzymów obliczono indeks oddziaływania selenu, zgodnie ze wzorem podanymi przez Kaczyńską i innych [2015]: IF Se = A A Se Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

33 Ocena oddziaływania związków selenu oraz benzyny na aktywność gdzie: IF Se indeks oddziaływania selenu; A aktywność oksydoreduktaz w glebie kontrolnej lub w glebie zawierającej benzynę; A Se aktywność oksydoreduktaz w glebie po aplikacji selenu. Wartości IF Se równe 1 świadczą o braku wpływu selenu na aktywność oznaczanych enzymów, wartości powyżej i poniżej 1 wskazują odpowiednio na inhibicję i stymulację aktywności enzymu. Otrzymane wyniki opracowano statystycznie przy użyciu oprogramowania Statistica 12.5 (Statsoft, Inc.). Grupy jednorodne wyznaczono na podstawie obliczonych testem Tukeya najmniejszych istotnych różnic na poziomie p <0,05. Na podstawie analizy wariancji η 2 wykazano procentowy udział poszczególnych czynników na zmiany aktywności oznaczanych enzymów. WYNIKI I DYSKUSJA W porównaniu do gleby kontrolnej wprowadzenie benzyny w dawce 2 g kg 1 s.m. spowodowało w 1. dniu doświadczenia istotne statystycznie (p <0,05) zmniejszenie aktywności reduktazy azotanowej i proteaz (odpowiednio o 16,21 i 28,76%) oraz zwiększenie aktywności ureazy (o 55,56%). Stymulacja aktywności ureazy utrzymywała się przez cały okres trwania doświadczenia i kształtowała się na poziomie od 7,86% (28. dzień doświadczenia) do 65,44% (7. dzień doświadczenia). Również aktywność reduktazy azotanowej od 7. dnia do końca trwania doświadczenia uległa zwiększeniu w stosunku do kontroli (o 46,57 166,18%). Z kolei aktywność proteaz w 7. dniu doświadczenia była mniejsza niż w glebie kontrolnej (o 13,60%), podczas gdy w dwóch ostatnich terminach także odnotowano aktywację tej grupy enzymów (odpowiednio o 136,05 i 78,12%). Wielu autorów wykazało stymulację aktywności enzymów biorących udział w obiegu związków azotu pod wpływem niskich dawek benzyny lub innych substancji ropopochodnych [Rao i in. 2010, Ziółkowska i Wyszkowski 2010, Stręk i Telesiński 2016a]. Prowadzone wcześniej badania wykazały ponadto, że aplikacja benzyny w niewielkich dawkach stymuluje aktywność innych enzymów, np. dehydrogenaz czy peroksydaz [Stręk i Telesiński 2015a]. Po dodaniu do gleby benzyny, w dawkach 10 i 50 g kg 1 s.m. odnotowano we wszystkich terminach pomiarów istotne statystycznie zmniejszenie (p <0,05) aktywności reduktazy azotanowej. Po aplikacji benzyny w dawce 10 g kg 1 s.m. stwierdzona inhibicja jednakże zmniejszała się (od 93,16 do 30,36%), a w dawce 50 g kg 1 s.m. zwiększała się (od 97,10 do 99,79%) w trakcie trwania doświadczenia. Wprowadzenie benzyny w dawce 10 g kg 1 s.m. spowodowało także obniżenie aktywności ureazy w 28. i 56. dniu doświadczenia (odpowiednio o 35,68 i 46,55%) oraz aktywności proteaz w 7. i 14. dniu doświadczenia (odpowiednio o 47,79 i 21,98%), podczas gdy stymulacja aktywności pod wpływem tej dawki benzyny wystąpiła w przypadku ureazy w 14. dniu doświadczenia (o 15,07%), a w przypadku proteaz w 28. i 56. dniu doświadczenia (odpowiednio o 32,62 i 72,27%). Zanieczyszczenie gleby benzyną w dawce 50 g kg 1 s.m., spowodowało inhibicję aktywności ureazy i proteaz w trakcie trwania nr 587, 2016

34 34 M. Stręk, A. Telesiński całego doświadczenia. To obniżenie aktywności było mniejsze niż w przypadku reduktazy azotanowej i wynosiło 57,37 82,85% dla ureazy oraz 41,18 57,94% dla proteaz (tab. 1). Kucharski i inni [2010] wykazali, że w glebie zanieczyszczonej benzyną, a także olejem napędowym zachodziła silna immobilizacja azotu. Ponadto zanieczyszczenia te silnie hamowały proces nitryfikacji. Według danych literaturowych inhibicja enzymów glebowych jest najczęściej obserwowanym efektem skażenia gleby substancjami ropopochodnymi [Rao i in. 2010, Akubugwo i in. 2015, Stręk i Telesiński 2015a, Stręk i Telesiński 2016a]. Obliczone wartości indeksu oddziaływania selenu wykazały, że w glebie bez dodatku benzyny wprowadzenie Se (IV) od 7. do 28. dnia doświadczenia stymulowało aktywność reduktazy azotanowej (IF Se 1,27 1,49), a Se (VI) od 14. do 56. dnia doświadczenia (IF Se 1,05 2,03). Aktywność ureazy w glebie zawierającej Se (IV) była wyższa niż w glebie kontrolnej jedynie w 1. dniu doświadczenia (IF Se 1,17), podczas gdy aplikacja Se (VI) spowodowała podwyższenie aktywności enzymu w trakcie trwania doświadczenia (IF Se 1,17 1,39). Aktywność proteaz natomiast zwiększyła się pod wpływem Se (IV) tylko w 28. dniu doświadczenia (IF Se 1,41), a pod wpływem Se (VI) w 7., 14. i 56. dniu doświadczenia (IF odpowiednio: 1,11, 1,19 i 1,21). W pozostałych przypadkach aktywność oznaczanych enzymów była mniejsza lub zbliżona do wartości w glebie kontrolnej (rys. 1A). W literaturze istnieją doniesienia zarówno o stymulacji [Nowak i in. 2004, Borowska i Koper 2011], jak i inhibicji aktywności enzymatycznej gleb pod wpływem selenu [Nowak i in. 2002, Onyszko i Telesiński 2015]. Wynika to między innymi z właściwości gleby, stopnia utlenienia selenu, jego dawki, a także rodzaju oznaczanego enzymu. Przeprowadzone wcześnie badania wykazały, że zastosowanie selenu może ograniczyć oddziaływanie różnych substancji ropopochodnych na aktywność enzymów oksydoredukcyjnych [Stręk i Telesiński 2015a, 2016a, b] oraz pojemność antyoksydacyjną gleby [Stręk i Telesiński 2015b]. W przypadku enzymów biorących udział w przemianach związków azotu również niejednokrotnie ujawnia się ten efekt, zwłaszcza w glebie zawierającej dawki benzyny 10 i 50 g kg 1 s.m. W glebie z dodatkiem benzyny w dawce 2 g kg 1 s.m. aktywność reduktazy azotanowej w 1. dniu po aplikacji Se (IV) nie uległa zmianom, a w kolejnych dniach doświadczenia wystąpił stopniowy spadek aktywności tego enzymu do wartości IF Se wynoszące 0,28 w ostatnim terminie pomiaru. Wprowadzenie Se (VI) wywołało zwiększenie aktywności reduktazy azotanowej w 1. dniu doświadczenia (IF Se 1,39), podczas gdy w kolejnych terminach pomiarów aktywność enzymu była zbliżona lub mniejsza w porównaniu do stwierdzonej w glebie z dodatkiem samej benzyny (rys. 1B). W przypadku ureazy wprowadzenie Se (IV) spowodowało w trakcie trwania całego doświadczenia spadek aktywności tego enzymu (IF 0,28 0,81). Po aplikacji Se (VI) wystąpiła przez pierwsze dwa tygodnie doświadczania zbliżona aktywność ureazy w porównaniu do gleby zawierającej benzynę, a w 28. i 56. dniu doświadczenia nastąpiło zwiększenie aktywności enzymu (IF Se odpowiednio 1,65 i 1,29). Aktywność proteaz w glebie z dodatkiem selenu ulegała wahaniom w trakcie trwania doświadczenia i w porównaniu do gleby zawierającej benzynę w dawce 2 g kg 1 s.m. była większa po dodaniu Se (IV) tylko w 7. dniu doświadczenia (IF Se 1,44), a po dodaniu Se (VI) w 7. i 14. dniu doświadczenia (IF Se 1,38 i 1,15). Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

35 Ocena oddziaływania związków selenu oraz benzyny na aktywność Tabela 1. Zmiany aktywności enzymów przemian związków azotu w glebie po aplikacji benzyny Table 1. Changes of activity of enzymes involved in nitrogen transformations in soil treated with gasoline Dawka benzyny Gasoline dose [g kg 1 ] Dzień doświadczenia Day of experiment Reduktaza azotanowa [μg N-NO 2 kg 1 s.m. 24 h 1 ] Nitrate reductase [μg N-NO 2 kg 1 d.m. 24 h 1 ] 0 288,09 a 279,36 b 236,66 b 233,43 b 273,85 b 2 241,40 b 409,47 a 409,36 a 621,35 a 595,72 a 10 19,70 c 15,18 c 21,64 c 52,95 c 168,81 c 50 8,35 d 5,69 d 1,14 d 1,14 d 0,57 d Ureaza [mg N-NH 4 kg 1 s.m. 2 h 1 ] Urease [mg N-NH 4 kg 1 d.m. 2 h 1 ] 0 65,69 b 74,45 b 57,78 c 68,06 b 66,91 b 2 102,19 a 123,17 a 75,33 a 73,41 a 88,80 a 10 66,88 b 70,25 b 66,49 b 43,79 c 35,76 c 50 14,16 c 12,77 c 24,63 d 28,28 a 20,07 d Proteazy [mg Tyr kg 1 s.m. 2 h 1 ] Proteases [mg Tyr kg 1 d.m. 2 h 1 ] 0 3,06 a 2,72 a 1,82 a 2,33 c 2,24 b 2 2,18 b 2,35 b 2,01 a 5,50 a 3,99 a 10 1,97 b 1,42 c 1,42 b 3,09 b 3,87 a 50 1,58 c 1,60 c 0,85 c 0,98 d 1,24 c Wartości średnie oznaczone tymi samymi literami w obrębie kolumn dla enzymu nie różnią się statystycznie p <0,05). Mean values denoted with the same letters within a column for enzyme do not differ statistically (p <0.05). Wprowadzenie selenu do gleby zawierającej benzynę w dawce 10 g kg 1 s.m. również spowodowało liczne wahania aktywności oznaczanych enzymów. Po aplikacji Se (IV) stwierdzono stymulację aktywności reduktazy azotanowej w 28. dniu doświadczenia (IF Se 2,69), ureazy od 7. dnia do końca trwania doświadczenia (IF Se 1,12 1,73) oraz proteaz w 7. dniu doświadczenia (IF Se 1,13). Z kolei dodatek Se (VI) zwiększał w trakcie trwania całego doświadczenia aktywność reduktazy azotanowej (IF Se 1,03 3,01) oraz aktywność proteaz (IF Se 1,05 1,52). Aktywność ureazy uległa stymulacji jedynie w 56. dniu doświadczenia (IF Se 1,53) (rys. 1C). Dodatek selenu do gleby zawierającej benzynę w dawce 50 g kg 1 s.m. spowodował zwiększenie aktywności oznaczanych enzymów. Wprowadzenie Se (IV) stymulowało aktywność reduktazy azotanowej prawie przez cały czas trwania doświadczenia (IF Se odpowiednio: 1,25 2,73) z wyjątkiem 7. dnia, aktywność ureazy w 1. i 14. dniu doświadczenia (IF Se odpowiednio: 2,00 i 1,18) oraz aktywność proteaz we wszystkich terminach pomiarów (IF Se 1,03 1,48). Po aplikacji Se (VI) z kolei odnotowano podwyższenie aktywności reduktazy azotanowej we wszystkich terminach pomiarów (IF Se 1,07 2,86), a także aktywności ureazy i proteaz od 7. dnia do końca trwania doświadczenia (IF Se odpowiednio: 1,16 1,66 i 1,11 1,41) (rys. 1D). nr 587, 2016

36 IF Se IF Se IF Se IF Se 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 A Se (IV) Se (VI) NR Ure Prot Dzień doświadczenia Day of experiment B Se (IV) Se (VI) NR Ure Prot Dzień doświadczenia Day of experiment C Se (IV) Se (VI) NR Ure Prot Dzień doświadczenia Day of experiment D Se (IV) Se (VI) NR Ure Prot Dzień doświadczenia Day of experiment Rys. 1. Fig. 1. Indeksy oddziaływania selenu (IF Se ) na aktywność reduktazy azotanowej (NR), ureazy (Ure) oraz proteaz (Prot) w glebie bez dodatku benzyny (A) oraz zawierającej benzynę w dawkach 2 (B), 10 (C) i 50 (D) g kg 1 s.m. Indices of selenium effect (IF Se ) on activity of nitrate reductase (NR), urease (Ure) and proteases (Prot) in soil without gasoline (A) and in soil treated with gasoline at dosages 2 (B), 10 (C) i 50 (D) g kg 1 d.m.

37 Ocena oddziaływania związków selenu oraz benzyny na aktywność Wyniki analizy η 2 wykazały, że na aktywność oznaczanych enzymów największy wpływ miała dawka benzyny, a procentowy udział tego czynnika na zmiany aktywności reduktazy azotanowej, ureazy i proteaz wynosił odpowiednio: 88,66, 81,07 i 51,16%. Jest to potwierdzeniem prowadzonych wcześniej badań nad oddziaływaniem selenu i innych dodatków modyfikujących na aktywność enzymatyczną gleby zanieczyszczonej substancjami ropopochodnymi [Kaczyńska i in. 2015, Stręk i Telesiński 2016a, c]. Procentowy udział aplikacji selenu w kształtowaniu aktywności oznaczanych enzymów był zdecydowanie mniejszy niż benzyny. Jednakże w przypadku reduktazy azotanowej i ureazy udział tego czynnika był większy niż wpływ terminu analiz (tab. 2). Tabela 2. Procentowy udział czynników doświadczalnych w kształtowaniu aktywności enzymów przemian związków azotu w glebie Table 2. Percentage participation of variable factors in the formation of enzymes involved in nitrogen transformations in soil Czynnik Factor Reduktaza azotanowa Nitrate reductase Ureaza Urease Proteazy Proteases B 88,66 81,07 51,16 Se 3,21 4,32 2,73 D 2,55 1,94 26,74 B Se 2,73 7,69 3,93 B D 1,13 1,94 11,37 Se D 0,84 1,66 1,41 B Se D 0,80 1,15 2,45 Błąd Error 0,08 0,25 0,20 WNIOSKI 1. Wprowadzenie do gleby benzyny w dawce 2 g kg 1 s.m. wywołało stymulację aktywności ureazy oraz reduktazy. Z kolei zanieczyszczenie gleby większymi dawkami benzyny inhibitowało aktywność enzymów przemian azotu w glebie lekkiej. 2. Aplikacja Se (VI), spowodowała stymulację aktywności enzymów przemian związków azotu, zwłaszcza w glebie zanieczyszczonej benzyną. 3. Zarówno dodatek Se (IV), jak i Se (VI) w największym stopniu oddziaływał na aktywność reduktazy azotanowej. LITERATURA Abdelmagid H.M., Tabatabai M.A., Nitrate reductase activity of soils. Soil Biol. Biochem. 19, Akubugwo E.I., Elebe E.U., Osuocha K.U., Studies on the impact of crude oil exploration on soil quality and crops grown in Kpean community in Khana local government area of Rivers State, Nigeria. Int. Res. J. Biochem. Biotechnol. 3 (1), nr 587, 2016

38 38 M. Stręk, A. Telesiński Borowska K., Koper J., Dynamics of changes of selenium content in soil and red clover (Trifolium pretense L.) affected by long-term organic fertilization on the background of selected soil oxidoreductases. Pol. J. Environ. Stud. 20 (6), Borowska K., Lemanowicz J., Koper J., Siwik-Ziomek A., Piotrowska-Długosz A., Polkowska M., Zależności między zawartością fitodostępnych form selenu, siarki i fosforu w glebie oraz ich wpływ na pobieranie selenu przez rośliny pszenicy ozimej w warunkach zróżnicowanego nawożenia. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 580, Gałązka A., Zanieczyszczenia gleb substancjami ropopochodnymi z uwzględnieniem biologicznych metod ich oczyszczenia. Kosmos 64 (1), Gouda A.H., El-Gendy A.S., El-Razek T.M.A., El-Kassas H.I., Evaluation of phytoremediation and bioremediation for sandy soil contaminated with petroleum hydrocarbons. Int. J. Environ. Sci. Develop. 7 (7), Kaczyńska G., Borowik A., Wyszkowska J., Soil dehydrogenases as an indicator of contamination of the environment with petroleum products. Water Air Soil Pollut. 226 (11), 372. Kandeler E., Gerber H., Short-term assay of soil urease activity using colorimetric determination of ammonium. Biol. Fertil. Soils 6, Kucharski J., Tomkiel M., Boros A., Wyszkowska J., The effect of soil contamination with diesel oil and petrol on the nitrification process. J. Elem. 15 (1), Ladd I.N., Butler J.H.A., Short-term assay of soil proteolytic enzyme activities using proteins and dipeptide derivates as substrates. Soil Biol. Biochem. 4, Nowak J., Kłódka D., Kąklewski K., Influence of various concentrations of selenic acid (IV) on the activity of soil enzymes. Sci. Total Environ. 291 (1 3), Onyszko M., Telesiński A., Wpływ selenu i fluoru na aktywność fosfataz w glebie lekkiej. Inż. Ekolog. 43, Nowak J., Kąklewski K., Ligocki M., Influence of selenium on oxidoreductive enzymes activity in soil and in plants. Soil Biol. Biochem. 36 (10), Rao M.A., Scelza R., Scotti R., Gianfreda L., Role of enzymes in the remediation of polluted environments. J. Soil Sci. Plant Nutr. 10 (3), Stręk M., Telesiński A., 2015a. Zmiana aktywności wybranych enzymów oksydoredukcyjnych wytwarzanych przez mikroorganizmy w glebie lekkiej zanieczyszczonej benzyną w obecności jonów selenu. Ochr. Środ. 37 (1), Stręk M., Telesiński A., 2015b. Assessment of selenium compounds use in limitation of petroleum impact on antioxidant capacity in sandy soil. Environ. Protect. Nat. Res. 26 (3), Stręk M., Telesiński A., 2016a. Comparison of selenite (IV) and selenate (VI) effect on some oxidoreductive enzymes in soil contaminated with spent engine oil. Plant Soil Environ. 62 (4), Stręk M., Telesiński A., 2016b. Porównanie oddziaływania selenu na aktywność peroksydazową gleby skażonej olejem napędowym lub przepracowanym olejem silnikowym. Acta Agroph. 23 (3), Stręk M., Telesiński A., 2016c. Oddziaływanie nadtlenku wapnia na aktywność wybranych oksydoreduktaz w glebie zanieczyszczonej olejem kreozotowym. Chem. Environ. Biotechnol. 19, Van Groenigen J.W., Huygens D., Boeckx P., Kuyper T.W., Lubbers I.M., Rütting T., Groff - man P.M., The soil N cycle: new insights and key challenges. Soil 1, Xenia M.E., Refugio M.V., Microorganisms metabolism during bioremediation of oil contaminated soils. J. Bioremed. Biodeg. 7, 340. Ziółkowska A., Wyszkowski M., Toxicity of petroleum substances to microorganisms and plants. Ecol. Chem. Engin. S 17 (1), Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

39 Ocena oddziaływania związków selenu oraz benzyny na aktywność ASSESSMENT OF SELENIUM AND GASOLINE EFFECT ON ACTIVITY OF SOME ENZYMES INVOLVED IN NITROGEN TRANSFORMATION IN SOIL Summary. This paper describes the impact of selenium in two oxidation states (IV and VI) and gasoline on activity of enzymes involved in nitrogen transformations in soil: nitrate reductase (EC ), urease (EC ) and proteases (EC x). The experiment was carried out in laboratory conditions on a soil material taken from the topsoil of Brunic Arenosol. According to the classification of the United States Department of Agriculture, it was soil with a granulometric composition of loamy sand with organic carbon content of 8.7 g kg 1 d.m. and total nitrogen content 0.97 g kg 1 d.m. Different combinations of selenic (IV) acid or selenic (VI) acid (the Se amount was 0.05 mmol kg 1 ) and gasoline at the dosages of 2, 10 i 50 g kg 1 d.m. were added to soil samples. All samples were adjusted to 60% of the maximum water holding capacity and stored at a temperature of 20 C. Activity of nitrate reductase, urease and proteases was determined on days 1, 7, 14, 28 and 56 using spectrophotometer UV-1800 (Shimadzu) in three repetitions. The results were examined using Tukey s HSD test (p <0.05) and two-way η 2 analysis. Basing on obtained results there was also calculated influence factor of selenium. Which equals to quotient of activity of enzyme in soil with selenium and activity in control sample or with contamination. Soil treatment with gasoline at the dosage of 2 g kg 1 d.m. increased activity of nitrate reductase and urease during whole experiment except day 1 for nitrate reductase. Higher gasoline dosages caused inhibition of all measured enzymes. Application of Se (VI) to soil contaminated with gasoline at dosage 10 g kg 1 d.m. caused stimulation of nitrate reductase and proteases in all days of experiment. Selenium (IV) in soil with gasoline at the dosage 50 g kg 1 d.m. caused stimulation of all measured enzymes except day 1 for protease and urease. The η 2 analysis showed that gasoline had higher effect on activity of assayed enzymes than selenium, and percentage participations of this factors in the formation of nitrate reductase, urease and proteases were 88.66, and 51.16%, respectively. Percentage participation of selenium effect was considerably lower for all enzyme activities than gasoline impact. Key words: selenium, gasoline, soil, nitrate reductase, urease, proteases nr 587, 2016

40

41 Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych nr 587, 2016, WPŁYW SUPERSORBENTU POLIMEROWEGO NA WYBRANE PARAMETRY BIOCHEMICZNE W GLEBIE I SIEWKACH PSZENICY OZIMEJ (TRICTICUM AESTIVUM L.) Martyna Śnioszek 1, Maciej Płatkowski 1, Michał Stręk 1, Marcin Mielczarek 1, Arkadiusz Telesiński 1, Jacek Wróbel 1, Robert Biczak 2, Barbara Pawłowska 2 1 Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie 2 Akademia im. Jana Długosza w Częstochowie Streszczenie. Jednym ze sposobów częściowego zmniejszenia deficytu wody, szczególnie na glebach lekkich, może być zastosowanie supersorbentów polimerowych powodujących zwiększenie retencji wodnej i poprawiających strukturę gleby. Celem podjętych badań było określenie oddziaływania AgroHydroGelu na aktywność enzymów glebowych (dehydrogenaz i fosfataz), a także na wybrane parametry biochemiczne w siewkach pszenicy ozimej odmiany Skagen (aktywność katalazy i peroksydazy, zawartość polifenoli ogółem oraz zawartość barwników asymilacyjnych). Doświadczenie polowe założono na piasku gliniastym, do którego wprowadzono AgroHydroGel w ilościach odpowiadających dawkom sorbentu dla gleb o bardzo dużej przepuszczalności (1,19 g kg 1 ), dużej przepuszczalności (1,59 g kg 1 ) i średniej przepuszczalności (1,99 g kg 1 ). Na podstawie przeprowadzonych badań, stwierdzono istotne zmiany oznaczanych parametrów biochemicznych w glebie i siewkach pszenicy ozimej. Spośród oznaczanych enzymów glebowych największe zmiany wystąpiły w przypadku dehydrogenaz. Z kolei w siewkach pszenicy ozimej zaobserwowano głównie stymulację aktywności katalazy, inhibicję aktywności peroksydazy oraz wzrost zawartości barwników asymilacyjnych. Słowa kluczowe: AgroHydroGel, aktywność enzymatyczna, barwniki asymilacyjne, gleba, pszenica ozima, wskaźnik oporności martyna.snioszek@zut.edu.pl Copyright by Wydawnictwo SGGW

42 42 M. Śnioszek i inni WSTĘP W warunkach klimatycznych Polski coraz większym problemem staje się gospodarowanie niewielkimi zasobami wody w produkcji roślinnej [Kosterna i in. 2012]. Ostrowski i inni [2008] podają, że z 50% prawdopodobieństwem na terenie Polski mogą wystąpić niedobory opadów sięgające nawet 120 mm. W przypadku zbóż ozimych tak duże niedobory opadów mogą spowodować obniżenie plonu o 5 21%. Alternatywą dla instalowania kosztownych systemów nawadniających jest stosowanie supersorbentów polimerowych hydrożeli związków charakteryzujących się dużymi zdolnościami magazynowania wody [Kosterna i in. 2011]. Hydrożele mają właściwości łączenia cząstek elementarnych i mikroagregatów w wodoodporne agregaty glebowe, dzięki czemu mogą one kształtować zagęszczenie gleby i właściwości wodno-powietrzne [Paluszek i Żembrowski 2008]. W glebach z dodatkiem hydrożeli ulegają poprawie warunki powietrzno-wodne, kształtujące odpowiedni dla roślin klimat glebowy [Owczarzak i in. 2006]. Jednym z najlepszych wskaźników określenia stanu ekochemicznego gleby jest ocena aktywności enzymatycznej. Wszelkie zmiany w środowisku glebowym mogą skutkować powstawaniem nadmiernej ilości reaktywnych form tlenu w roślinach uprawnych, co w efekcie może prowadzić do zmian w podstawowych procesach metabolicznych [Demidchik 2015]. Celem podjętych badań było określenie oddziaływania różnych dawek supersorbentu polimerowego na aktywność fosfatazową i dehydrogenazową gleby lekkiej, a także aktywność katalazy, peroksydazy i zawartość polifenoli ogółem oraz barwników asymilacyjnych w siewkach pszenicy ozimej. MATERIAŁ I METODY Doświadczenie wazonowe w warunkach kontrolowanych założono na próbkach piasku gliniastego, pobranych z poziomu ornopróchniczego gleb rdzawych typowych RSD w Lipniku (woj. zachodniopomorskie). Części ziemiste materiału glebowego podzielono na 1 kg naważki i dodano do nich AgroHydroGelu (producent Agroidea) w dawkach 1,19; 1,59 i 1,99 g kg 1, co odpowiada ilościom sorbentu dla gleb o bardzo dużej przepuszczalności, dużej przepuszczalności i średniej przepuszczalności. Agro- HydroGel (AHG) jest z chemicznego punktu widzenia czystym, usieciowionym poliakrylanem potasu, wytwarzanym na drodze polimeryzacji rodnikowej, który przyjmuje i utrzymuje wodę o masie 300 do 500 razy większej od własnej. Tak przygotowanymi próbkami napełniano wazony, do których wysiano po 15 nasion pszenicy odmiany Skagen (Triticum aestivum L. cv. Skagen). Każda kombinacja została wykonana w trzech powtórzeniach. Punktem odniesienia była gleba bez dodatku AHG i rośliny w niej rosnące. Co drugi dzień próbki podlewano 25 cm 3 wody destylowanej. W trakcie trwania doświadczenia próbki były oświetlane lampą sodową Son-T-Agro-400W firmy Philips, o natężeniu promieniowania na poziomie podłoża 90 μe m 2 s 1 PAR (radiacji aktywnej fotosyntetycznie). Fotoperiodyzm został ustalony na 12 godzin dnia i nocy. Próbki glebowe pobierano w 1., 7., 14., 21. oraz 28. dniu doświadczenia i oznaczono Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

43 Wpływ supersorbentu polimerowego na wybrane parametry biochemiczne w nich spektrofotometrycznie aktywność fosfataz: kwaśnej (EC ) i zasadowej (EC ) metodą Tabatabaia i Bremnera [1969] oraz aktywność dehydrogenaz (EC x) metodą Thalmanna [1968]. Z kolei w 14., 21. i 28. dniu doświadczenia wykonano w częściach nadziemnych roślin analizy spektrofotometryczne aktywności katalazy (EC ) metodą Lücka [1963], peroksydazy (EC ) metodą Chance a i Maehly ego [1955] oraz zawartości polifenoli ogółem [Yu i in. 2002], a także barwników asymilacyjnych (chlorofilu a, chlorofilu b i karotenoidów) metodą Arnona i innych [1956] w modyfikacji Lichtenthalera i Wellburna [1983]. Do oznaczeń został użyty spektrofotometr UV-1800 firmy Shimadzu. Otrzymane wyniki opracowano statystycznie przy użyciu jednoczynnikowej analizy wariancji. Najmniejsze istotne różnice (NIR) obliczono według procedury Tukeya przy poziomie istotności p <0,05. Analizy wykonano niezależnie w każdym terminie pomiaru. Do analiz wykorzystano program Statistica 12.5 firmy StatSoft oraz arkusz kalkulacyjny Excel Na podstawie wartości średnich ze wszystkich terminów pomiarów obliczono również wskaźniki oporności oznaczanych parametrów, zgodnie ze wzorem zaproponowanym przez Orwin i Wardle a [2004]: RS = 1-(2 D /(C+ D )), gdzie: RS wskaźnik oporności, C wartość parametru w obiekcie kontrolnym, D różnica między wartością parametru w obiekcie kontrolnym i obiekcie poddanym działaniu supersorbentu. WYNIKI I DYSKUSJA Wprowadzenie supersorbentu spowodowało w większości terminów pomiarów istotny statystycznie spadek aktywności dehydrogenaz. Największa inhibicja po aplikacji dawki 1,19 g kg 1 wystąpiła w 21. dniu doświadczenia (23,64%). Większe dawki AHG obniżały aktywność dehydrogenaz w trakcie trwania całego doświadczenia na poziomie 13,10 51,02% dla dawki 1,59 g kg 1 oraz 7,58 48,37% dla dawki 1,99 g kg 1. Aktywność fosfatazy kwaśnej w glebie była głównie istotnie statystycznie inhibowana po aplikacji supersorbentu. Dodatek AHG w dawkach 1,19 i 1,59 g kg 1 w największym stopniu obniżył aktywność enzymu w 1. dniu doświadczenia (odpowiednio o 16,14 i 29,87%), a w dawce 1,99 g kg 1 w 7. dniu doświadczenia (o 15,08%). Z kolei aktywność fosfatazy alkalicznej podlegała nieregularnym zmianom w trakcie trwania doświadczenia. Największą stymulację aktywności enzymu odnotowano w 7. dniu doświadczenia w glebie z dodatkiem supersorbentu w dawce 1,99 g kg 1 (54,02%), a największą inhibicję w 21. dniu doświadczenia po wprowadzeniu dawki 1,19 g kg 1 (41,50%) (tab. 1). Obliczone średnie wartości wskaźników oporności (RS) dla enzymów glebowych wykazały, że największe zmiany po wprowadzeniu do gleby supersorbentu, zwłaszcza w dawkach 1,59 i 1,99 g kg 1, wystąpiły w aktywności dehydrogenaz: wartości RS wynosiły odpowiednio: 0,83, 0,47 i 0,48. W przypadku fosfatazy kwaśnej (RS od 0,79 do 0,84) i fosfatazy alkalicznej (RS od 0,61 do 0,69) zaobserwowany efekt był mniejszy (rys. 1). Zmiany aktywności enzymatycznej gleby wynikają najprawdopodobniej ze zdolności gromadzenia przez AHG znacznych ilości wody. Makowska i inni [2005] wykazali, że dodatek supersorbentu polimerowego do czarnej ziemi w dawce 3 g dm 3 zwiększył nr 587, 2016

44 44 M. Śnioszek i inni Tabela 1. Aktywność enzymów w glebie z dodatkiem AgroHydroGelu Table 1. Activity of enzymes in soil treated with AgroHydroGel Dawka AHG AHG dose [g kg 1 ] Dzień doświadczenia Day of experiment Dehydrogenazy [mg TPF kg 1 s.m. 16 h 1 ] Dehydrogenases [mg TPF kg 1 d.m. 16 h 1 ] 0 5,51 a 13,46 a 37,10 a 59,13 a 51,06 a 1,19 5,20 a 13,42 a 36,54 a 45,15 b 41,03 b 1,59 3,32 c 9,95 c 32,24 b 28,96 d 33,26 c 1,99 4,56 b 12,44 b 33,37 b 35,97 c 26,36 d Fosfataza kwaśna [mg p-np kg 1 s.m. h 1 ] Acid phosphatase [mg p-np kg 1 d.m. h 1 ] 0 192,27 a 196,23 a 195,62 a 199,62 a 194,18 b 1,19 161,23 c 200,80 a 165,46 b 198,67 a 229,75 a 1,59 138,34 d 202,63 a 166,98 b 207,50 a 177,64 c 1,99 179,78 b 166,63 b 198,97 a 179,47 b 178,86 c Fosfataza alkaliczna [mg p-np kg 1 s.m. h 1 ] Alkaline phosphatase [mg p-np kg 1 d.m. h 1 ] 0 49,06 b 53,02 c 48,75 b 67,95 a 69,47 c 1,19 43,88 c 65,21 b 50,58 ab 39,75 c 92,94 a 1,59 56,98 a 45,71 d 47,23 b 43,88 c 81,36 b 1,99 37,78 d 81,66 a 56,07 a 59,42 b 81,35 b Wartości oznaczone jednakowymi literami dla enzymu w każdym dniu doświadczenia nie różnią się istotnie na poziomie p <0,05. TPF trifenyloformazan, p-np p-nitrofenol Values denoted by the same letters for enzyme on every day of experiment do not differ statistically at level p < TPF triphenylformazan, p-np p-nitrophenol. 1,0 1,19 g 1,59 g 1,99 g 0,8 0,6 RS 0,4 Rys. 1. Fig. 1. 0,2 0,0 DHA Pac Pal Współczynniki oporności (RS) enzymów w glebie z dodatkiem AgroHydroGelu (DHA dehydrogenazy, Pac fosfataza kwaśna, Pal fosfataza alkaliczna) Resistance indices (RS) of enzymes in soil treated with AgroHydroGel (DHA dehydrogenases, Pac acid phosphatase, Pal alkaline phosphatase) Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

45 Wpływ supersorbentu polimerowego na wybrane parametry biochemiczne podczas okresu wegetacyjnego zawartość procentową wody w glebie średnio o 2,5%, a w dawce 6 g g dm 3 o 4,7%. Odpowiednie dane dla gleby piaszczystej wynosiły 1,4 i 2,9%. Badania Nowak i Kąklewskiego [2003] wykazały największą aktywność dehydrogenaz, fosfataz oraz reduktazy azotanowej przy wilgotności gleby 60% maksymalnej pojemności wodnej. Borowik i Wyszkowska [2016] stwierdziły natomiast, że dehydrogenazy, katalaza, ureaza, fosfatazy, β-glukozydaza oraz arylosulfataza wykazywały maksymalną aktywność przy wilgotności 20% maksymalnej pojemności wodnej. Geisseler i inni [2012] także odnotowali większą aktywność enzymatyczną gleby przy małym uwilgotnieniu. Aktywność katalazy w siewkach pszenicy ozimej rosnącej w glebie z dodatkiem supersorbentu w trakcie trwania całego doświadczenia była istotnie statystycznie większa niż w roślinach kontrolnych. W kolejnych terminach pomiarów największa stymulacja aktywności enzymu wystąpiła w 14. i 21. dniu doświadczenia przy dawce 1,99 g kg 1 (odpowiednio: 34,26 i 51,48%), a w 28. dniu doświadczenia przy dawce 1,19 g kg 1 (49,56%). Aktywność peroksydazy w dwóch pierwszych terminach pomiarów uległa istotnemu statystycznie obniżeniu w siewkach rosnących w glebie z dodatkiem AHG w dawkach 1,59 i 1,99 g kg 1 (w 14. dniu doświadczenia odpowiednio o 48,00 i 24,23%, a w 21. dniu doświadczenia o 14,65 i 16,39%). W ostatnim dniu doświadczania wykazano inhibicję aktywności peroksydazy pod wpływem dawki 1,19 g kg 1 (12,00%) i 1.99 g kg 1 (14,78%), podczas gdy w siewkach rosnących w glebie z subersorbentem w dawce 1,59 g kg 1 wystąpiła stymulacja aktywności enzymu (14,53%) (tab. 2). Tabela 2. Aktywność enzymów antyoksydacyjnych w siewkach pszenicy ozimej rosnących w glebie z dodatkiem AgroHydroGelu Table 2. Activity of antioxidant enzymes in seedlings of winter wheat grown in soil treated with AgroHydroGel Dawka AHG AHG dose [g kg 1 ] Dzień doświadczenia Day of experiment Katalaza [mmol H 2 O 2 kg 1 św.m. min 1 ] Catalase [mmol H 2 O 2 kg 1 f.w. min 1 ] 0 1,46 c 1,01 d 1,15 c 1,19 1,81 b 1,45 b 1,72 a 1,59 1,82 b 1,32 c 1,49 b 1,99 1,96 a 1,53 a 1,73 a Peroksydaza [mmol purpurogaliny kg 1 św.m. min 1 ] Peroxidase [mmol purpurogaline kg 1 f.w. min 1 ] 0 21,21 a 17,75 a 15,83 b 1,19 21,46 a 18,40 a 13,93 c 1,59 11,03 c 15,15 b 18,13 a 1,99 16,07 b 14,84 b 13,49 c Wartości oznaczone jednakowymi literami dla enzymu w każdym dniu doświadczenia nie różnią się istotnie na poziomie p <0,05. Values denoted by the same letters for enzyme on every day of experiment do not differ statistically at level p <0.05. nr 587, 2016

46 46 M. Śnioszek i inni Średnie wartości współczynników oporności enzymów antyoksydacyjnych w siewkach pszenicy ozimej wykazały największe zmiany katalazy w siewkach po wprowadzeniu supersorbentu w dawkach 1,19 g kg 1 (RS = 0,45) oraz 1,99 g kg 1 (RS = 0,48). Aktywność peroksydazy była najbardziej modyfikowana przez dodatek AHG w dawkach 1,59 g kg 1 oraz 1,99 g kg 1 (RS = 0,60) (rys. 2). Xiang i inni [2012] stwierdzili, że katalaza i peroksydaza są bardzo dobrymi wskaźnikami stresu wodnego zarówno suszy, jak i nadmiernej ilości wody w glebie. Wyniki otrzymane przez Islam i innych [2011] wykazały spadek aktywności katalazy, peroksydazy, dysmutazy ponadtlenkowej oraz reduktazy glutationowej w liściach owsa po zastosowaniu supersorbentu polimerowego do gleby z deficytem wody. Podobne wyniki uzyskali Mao i inni [2011] w roślinach kukurydzy. Zawartość barwników asymilacyjnych w siewkach rosnących w glebie z AHG była zazwyczaj większa niż w roślinach kontrolnych. Największe podwyższenie chlorofilu stwierdzono w 28. dniu doświadczenia po aplikacji dawki 1,59 g kg 1 (45,43%), a chlorofilu b oraz karotenoidów w 21. dniu doświadczenia, również po dodaniu dawki 1,59 g kg 1 (odpowiednio 74,37 i 50,31%) (tab. 3). Tabela 3. Zawartość barwników asymilacyjnych w siewkach pszenicy ozimej rosnących w glebie z dodatkiem AgroHydroGelu Table 3. Content of pigments in seedlings of winter wheat grown in soil treated with AgroHydroGel Dawka AHG AHG dose [g kg 1 ] Dzień doświadczenia Day of experiment Chlorofil a [mg kg 1 św.m.] Chlorophyll a [mg kg 1 f.w.] ,10 bc 1032,23 c 1048,02 d 1, ,09 c 1149,27 b 1242,99 c 1, ,20 ab 1405,84 a 1524,11 a 1, ,38 a 1145,01 b 1444,72 b Chlorofil b [mg kg 1 św.m.] Chlorophyll b [mg kg 1 f.w.] 0 433,34 b 349,37 c 414,83 c 1,19 400,11 c 473,09 b 438,85 c 1,59 439,98 b 609,19 a 634,05 a 1,99 464,15 a 458,03 b 515,78 b Karotenoidy [mg kg 1 św.m.] Carotenoids [mg kg 1 f.w.] 0 654,93 a 475,41 d 549,97 b 1,19 567,20 b 572,41 b 568,50 b 1,59 557,29 b 714,61 a 642,41 a 1,99 661,63 a 534,82 c 643,18 a Wartości oznaczone jednakowymi literami dla oznaczanych związków w każdym dniu doświadczenia nie różnią się istotnie na poziomie p <0,05. Values denoted by the same letters for measured compounds on every day of experiment do not differ statistically at level p <0.05. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

47 Wpływ supersorbentu polimerowego na wybrane parametry biochemiczne ,0 1,19 g 1,59 g 1,99 g RS 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Rys. 2. Fig. 2. CAT POX Phe Chl a Chl b Car Współczynniki oporności (RS) parametrów biochemicznych w siewkach pszenicy ozimej rosnących w glebie z dodatkiem AgroHydroGelu (CAT katalaza, POX peroksydaza, Phe polifenole ogółem, Chl a chlorofil a, Chl b chlorofil b, Car karotenoidy) Resistance indices (RS) of biochemical parameters in seedlings of winter wheat grown in soil treated with AgroHydroGel (CAT catalase, POX peroxidase, Phe total polyphenols, Chl a chlorophyll a, Chl b chlorophyll b, Car carotenoids) Na podstawie obliczonych wartości średnich współczynników oporności stwierdzono największe zmiany polifenoli ogółem po wprowadzeniu do gleby supersorbentu w dawce 1,99 g kg 1 (RS = 0,34), a barwników asymilacyjnych po aplikacji AHG w dawce 1,59 g kg 1 (RS dla chlorofilu a, chlorofilu b i karotenoidów wynosił odpowiednio 0,64, 0,53 i 0,58) (rys. 2). Wielu autorów stwierdziło, że zastosowanie supersorbentów polimerowych niweluje negatywne oddziaływanie suszy na zawartość barwników asymilacyjnych w różnych gatunkach roślin [Beig i in. 2014, Tongo i in. 2014]. WNIOSKI 1. Zastosowanie AgroHydroGelu spowodowało istotne zmiany aktywności enzymatycznej w glebie lekkiej. Spośród oznaczanych enzymów największe zmiany wystąpiły w aktywności dehydrogenaz. 2. Wprowadzenie do gleby AgroHydroGelu wywołało głównie stymulację aktywności katalazy i inhibicję aktywności peroksydazy w siewkach pszenicy ozimej, co może wskazywać na wystąpienie w nich stresu oksydacyjnego. 3. Zawartość barwników asymilacyjnych w siewkach pszenicy ozimej pod wpływem AgroHydroGelu uległa podwyższeniu w stosunku do roślin kontrolnych. LITERATURA Arnon D.J., Allen M.B., Whatley F., Photosynthesis by isolated chloroplast. IV General concept and comparison of three photochemical reactions. Biochim. Biophys. Acta 20, nr 587, 2016

48 48 M. Śnioszek i inni Beig A.V.G., Neamati S.H., Tehranifar A., Emami H., Evaluation of chlorophyll fluorescence and biochemical traits of lettuce under drought stress and super absorbent or bentonite application. J. Stress Physiol. Biochem. 10 (1), Borowik A., Wyszkowska J., Soil moisture as a factor affecting the microbiological and biochemical activity of soil. Plant Soil Environ. 62 (6), Chance B., Maehly A.C., Assay of catalase and peroxidases. Meth. Enzymol. 2, Demidchik V., Mechanisms of oxidative stress in plants: From classical chemistry to cell biology. Environ. Exp. Bot. 109, Geisseler D., Joergensen R.G., Ludwig B., Potential soil enzyme activities are decoupled from microbial activity in dry residue-amended soil. Pedobiologia 55, Islam M.R., Xue X., Mao S., Ren C., Eneji A.E., Hu Y., Effects of water-saving superabsorbent polymer on antioxidant enzyme activities and lipid peroxidation in oat (Avena sativa L.) under drought stress. J. Sci. Food Agric. 91 (4), Kosterna E., Zaniewicz-Bajkowska A., Rosa R., Franczuk J., The effect of AgroHydroGel and irrigation on Kohlrabi cv Oasis F1 yields. Acta Sci. Pol., Hortorum Cultus 10 (3), Kosterna E., Zaniewicz-Bajkowska A., Rosa R., Franczuk J., Wpływ AgroHydroGelu na plonowanie i wybrane elementy wartości odżywczej trzech odmian kalarepy. Infrastr. Ekol. Ter. Wiej. 2 (3), Lichtenthaler H.K., Wellburn A.R., Determinations of total carotenoids and chlorophyll a and b of leaf extracts in different solvents. Biochem. Soc. Trans. 11, Lück H., Catalase. W: Methods of enzymatic analysis. Red. H.-U. Bergmeyer. Chemie, New York i London, Makowska M., Borowski E., Ziemba A., Wpływ dodatku Ekosorbu do gleby na produktywno oraz zawartość N, P, K i Ca w liściach i korzeniach roślin truskawki. Ann. UMCS Sect. EEE 15, Mao S., Islam M.R., Hu Y., Qian X., Chen F., Xue X., Antioxidant enzyme activities and lipid peroxidation in corn (Zea mays L.) following soil application of superabsorbent polymer at different fertilizer regimes. Afr. J. Biotechnol. 10 (49), Nowak J., Kąklewski K., Wpływ różnych warunków przechowywania gleby na zmiany aktywności wybranych enzymów. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 492, Ostrowski J., Łabędzki L., Kowalik W., Kanecka-Geszke E., Kasperska-Wołowicz W., Smarzyńska K., Tusiński E., Atlas niedoborów wodnych roślin uprawnych i użytków zielonych w Polsce. Wyd. IMUZ, Falenty Warszawa, Owczarzak W., Kaczmarek Z., Szukała J., Wpływ hydrożelu Stockosorb na wybrane właściwości strukturotwórcze gleby płowej i czarnej ziemi. J. Res. Appl. Agric. Engin. 3, Orwin K.H., Wardle D.A., New indices for quantifying the resistance and resilience of soil biota to exogenous disturbance. Soil Biol. Biochem. 36, Paluszek J., Żembrowski W., Improvement of water-air properties of eroded soils in a loess landscape after the application of agrohydrogel. Ann. Warsaw Univ. of Life Sci. SGGW, Land Reclam. 39, Tabatabai M.A., Bremner J.M., Use of p-nitrophenyl phosphate for assay soil phosphatase activity. Soil Biol. Biochem. 1 (4), Thalmann A., Zur Methodik der Bestimmung der Dehydrogenaseaktivität im Boden mittels Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC). Landwirtsch. Forsch. 21, Tongo A., Mahdavi A., Sayad E., Effect of superabsorbent polymer aquasorb on chlorophyll, antioxidant enzymes and some growth characteristics of Acacia victoriae seedlings under drought stress. Ecopersia 2 (2), Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

49 Wpływ supersorbentu polimerowego na wybrane parametry biochemiczne Xiang J., Jiang A.N., Fang Y.P., Huang L.B., Zhang H., Effects of soil water gradient on stress-resistant enzyme activities in Phragmites australis from Yellow River delta. Proc. Environ. Sci. 13, Yu L., Haley S., Perret J., Harris M., Wilson J., Qian M., Free radical scavenging properties of wheat extracts. J. Agric. Food Chem. 50, EFFECT OF SUPERSORBENT POLYMER ON SOME BIOCHEMICAL PARAMETERS IN SOIL AND SEEDLINGS OF WINTER WHEAT (TRICTICUM AESTIVUM L.) Summary. Supersorbent polymer application may be a way to partial reduction of water deficit, especially in sandy soils. It causes an increase in water retention, at the same time improving soil structure. The aim of this study was to determine the impact of AgroHydroGel on the activity of soil enzymes (dehydrogenases and phosphatases), as well as on selected biochemical parameters in seedlings of winter wheat cv. Skagen (activity of catalase and peroxidase and content of total polyphenols and assimilation pigments). The pot experiment was carried out on soil material taken from the topsoil of Brunic Arenosol in Agricultural Experimental Station in Lipnik, located in the West Pomeranian District, Poland. According to the classification of the United States Department of Agriculture, it was soil with a granulometric composition of loamy sand, with C org content of 8.7 g kg 1. AgroHydroGel was added to the soil samples in amounts appropriate to doses for soils of a very high permeability (1.19 g kg 1 ), high permeability (1.59 g kg 1 ) and medium permeability (1.99 g kg 1 ). A monocotyledonous plant, winter wheat (Triticum aestivum L.) cv. Skagen, was used in the experiment. Seeds of the plant, originating from the same source, were sown into a plastic plant pots that were filled with reference soil and soil thoroughly mixed with the studied supersorbent. Soil samples were collected on days 1, 7, 14, 21 and 28, and activities of acid phosphatase (EC ), alkaline phosphatase (EC ) and dehydrogenases (EC x) were determined. Moreover, in winter wheat seedlings, analyses of catalase (EC ), peroxidase (EC ) activity and content of photosynthetic pigments (chlorophyll a, chlorophyll b and carotenoids) were performed on days 14, 21 and 28. Obtained results showed significant changes in measured biochemical parameters in soil and the seedlings of winter wheat. Among soil enzymes the highest changes were observed in dehydrogenases activity. However, in the seedlings of winter wheat, a stimulation of catalase activity, inhibition of peroxidase activity and increase in assimilation pigments concentration were mainly reported. These results showed that application of AgroHydroGel may cause disturbances in soil ecochemical state and initiate oxidative stress in wheat seedlings. Key words: AgroHydroGel, enzymatic activity, assimilation pigments, soil, winter wheat, resistance index nr 587, 2016

50

51 Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych nr 587, 2016, MIKROORGANIZMY WSKAŹNIKOWE W OCENIE STANU SANITARNEGO GLEBY Maria J. Chmiel, Krzysztof Frączek Uniwersytet Rolniczy im. Hugona Kołłątaja w Krakowie Streszczenie. Obecność mikroorganizmów wskaźnikowych w glebie odzwierciedla nie tylko stopień skażenia środowiska glebowego, ale stanowi również informację o potencjalnym ryzyku zanieczyszczenia płodów rolnych i zagrożeniu zdrowia ludzi i zwierząt. Obecnie wybór metod badawczych i kryteriów oceny stanu sanitarnego gleby nadal stanowi istotny problem badań środowiskowych, dlatego też w tej pracy podjęto próbę przedstawienia sposobów oceny jakościowej stanu sanitarnego środowiska glebowego na podstawie wybranych wskaźników mikrobiologicznych. W pracy scharakteryzowano normy i drobnoustroje rekomendowane w ocenie sanitarnej gleby: bakterie grupy coli, Escherichia coli, Salmonella spp., paciorkowce kałowe, bakterie przetrwalnikujące redukujące siarczany (IV), Clostridium perfringens. Słowa kluczowe: gleba, mikroorganizmy, wskaźniki sanitarne WSTĘP Wykorzystanie żywych organizmów w biomonitoringu jest niezwykle przydatne do oceny skażenia środowiska [Bednarek i in. 2004, Traczewska 2011]. Organizmy żywe są bowiem miarodajnym źródłem informacji o zachodzących procesach w środowisku, zarówno tych pozytywnych, jak i negatywnych. Ich wykorzystanie jest o tyle istotne, że każde środowisko ma własną specyfikę i praktycznie niemożliwe jest opisanie jego wszystkich możliwych reakcji na zanieczyszczenie. Nie bez znaczenia jest także fakt, że monitoring biologiczny jest tańszy niż inne metody [Bednarek i in. 2004, Świercz 2004, Avidano i in. 2005]. Organizmy określane mianem biologicznych wskaźników lub biowskaźników ustala się dzięki znajomości wymagań poszczególnych gatunków w stosunku do czynników m.chmiel@ur.krakow.pl Copyright by Wydawnictwo SGGW

52 52 M.J. Chmiel, K. Frączek środowiska oraz ich wrażliwości na różne rodzaje zanieczyszczeń wody, gleby i powietrza. Bardzo często wskaźniki biologiczne nie są organizmami najliczniej występującymi w badanym środowisku, ale przez swą obecność wskazują specyficzne właściwości i zmiany środowiska [Smyłła 2002, Schloter i in. 2003, Banaszak i Wiśniewski 2005]. Warto podkreślić, że dobrymi biowskaźnikami mogą być tylko organizmy łatwe do identyfikacji, szybko i jednoznacznie reagujące na zmiany zachodzące w środowisku, oraz pozwalające ocenić stopień i kierunek zmian zachodzących w środowisku przyrodniczym [Visser i Parkinson 1992, Smyłła 2002, Zmysłowska i in. 2002, Bednarek i in. 2004, Gajewska i in. 2012]. Mikroorganizmami wskaźnikowymi są najczęściej gatunki łatwe w hodowli laboratoryjnej lub inne jednostki systematyczne mikroorganizmów, charakteryzujące określone warunki środowiskowe bądź procesy przebiegające w środowisku. Obecność bądź nieobecność lub reakcja mikroorganizmów wskaźnikowych wskazuje na istnienie w danym miejscu czynnika zanieczyszczającego. W zależności od kierunku i zakresu prowadzonych badań środowiskowych można za organizmy wskaźnikowe przyjąć ogólną liczbę podstawowych grup mikroorganizmów w danym środowisku (bakterie, grzyby, promieniowce), ale również drobnoustroje czynne w wielu procesach, m.in.: mikroorganizmy nitryfikacyjne, denitryfikacyjne, diazotrofy i inne. Niewątpliwie należy rozróżnić mikroorganizmy wskaźnikowe, które reagują i wykrywają zmiany środowiska od tych, których sama obecność świadczy już o mikrobiologicznym zanieczyszczeniu gleb [Smyłła 2002, Schloter i in. 2003, Bednarek i in. 2004, Avidano i in. 2005, Banaszak i Wiśniewski 2005, Błaszczyk 2007, Pourcher i in. 2007, Brochier i in. 2012, Gajewska i in. 2012]. MIKROBIOLOGICZNE ZANIECZYSZCZENIE ŚRODOWISKA GLEBOWEGO Wśród elementów środowiska przyrodniczego gleba zajmuje szczególne miejsce jako ośrodek gromadzenia się zanieczyszczeń różnego typu. Aktualnie uważa się, że bez zdrowej czystej gleby nie może być zdrowego społeczeństwa. Z glebą związana jest zdrowa żywność, w dużej części zdrowa woda i powietrze, mikroklimat oraz zieleń wokół osiedli i miejsc pracy. Gleba pełni fundamentalną rolę w regulacji ilości zanieczyszczeń w ekosystemach. Może redukować zanieczyszczenia lub unieruchamiać je, a więc posłużyć do oceny środowiska w aspekcie biologicznym. Gleba może zapobiegać zanieczyszczeniom, dopóki nie zostanie przekroczona jej pojemność i zachowana aktywność biologiczna [Smyk 1985, Paul i Clark 2007]. Gleba stanowi również jeden z podstawowych rezerwuarów drobnoustrojów. Bioróżnorodność tego środowiska zależy od wielu czynników decydujących o rozwoju mikroorganizmów, takich jak: żyzność gleby, odczyn, wilgotność, struktura, temperatura, szata roślinna, zanieczyszczenie chemiczne i inne. Naturalna mikrobiota to różnorodne bakterie, grzyby i promieniowce oraz wirusy roślinne i pierwotniaki [Smyk 1985, Paul i Clark 2007, Libudzisz i in. 2007, Calver i in. 2009]. Mikrobiota gleby stanowi 0,2% ciężaru gleby, zajmując około 1,33% objętości. W zależności od typu gleby, sposobu jej użytkowania czy pory roku można zaobserwować w jednym jej gramie od 10 6 do jtk (jednostek tworzących kolonie) hodowalnych bakterii, 10 5 do 10 7 promieniowców, Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

53 Mikroorganizmy wskaźnikowe w ocenie stanu sanitarnego gleby do 10 7 grzybów [Sveshnikova i in. 2001, Uhlı řová i Šantrůčková 2003, Chmiel 2013]. Jednak wiele zespołów mikroorganizmów glebowych nie jest jeszcze rozpoznanych, gdyż stanowią je w większości tzw. VBNC (ang. viable but nonculturable) drobnoustroje żywe, lecz niezdolne do wzrostu w warunkach in vitro. Szacuje się, że tylko od 0,1 do 10% drobnoustrojów glebowych wzrasta na pożywkach mikrobiologicznych, pozostałe to komórki VBNC [Heim i in. 2002, Libudzisz i in. 2007]. W środowisku glebowym, oprócz mikroorganizmów naturalnie bytujących (mikroorganizmy autochtoniczne) typowych dla środowiska glebowego, mogą znajdować się również drobnoustroje napływowe (zymogenne), dla których gleba może stać się środowiskiem okresowego ich występowania. Dostając się do gleby z różnych źródeł, m.in. w wyniku nawożenia gleb czy wraz ze ściekami bytowo-gospodarczymi, same w sobie stanowią zanieczyszczenie. To właśnie w tej grupie mogą okresowo występować patogenne dla człowieka i zwierząt bakterie, zachowujące swoje właściwości chorobotwórcze przez długi czas [Czernomysy-Furowicz i Furowicz 1995, Zmysłowska 2002, Libudzisz i in. 2007, Paul i Clark 2007]. Do najważniejszych mikroorganizmów chorobotwórczych, które stwarzają zagrożenie dla środowiska glebowego, należą m.in. bakterie z rodzaju Salmonella wywołujące dur brzuszny, dur rzekomy i salmonellozy, bakterie z rodzaju Shigella wywołujące czerwonkę, bakterie z rodzaju Campylobacter, a także bakterie wywołujące gruźlicę, tularemię i żółtaczkę bakteryjną, wirusy jelitowe enterowirusy oraz grzyby i pierwotniaki chorobotwórcze. Ponadto zagrożenie stanowią jaja pasożytów jelitowych należących do Ascaris sp., Trichuris sp. oraz Toxocara sp. [Zagroda i Olańczuk-Neyman 2001, Zmysłowska i in. 2002]. Najczęściej mikroorganizmy chorobotwórcze, szczególnie wobec ludzi i zwierząt, nie odnajdują w glebie warunków korzystnych do wzrostu i rozwoju i podlegają stopniowej eliminacji. Do głównych czynników wpływających na długość czasu przeżycia bakterii zaliczamy: rodzaj bakterii, temperaturę, wilgotność, ph, zawartość substancji organicznych w glebie oraz obecność drobnoustrojów antagonistycznych i drapieżców. Czas przetrwania bakterii chorobotwórczych w glebie (od momentu jej kontaminacji) zmienia się w granicach od kilku godzin do kilku miesięcy, przy czym obniżenie ich do wartości niezagrażających zdrowiu następuje w ciągu 2 3 miesięcy. Bakterie z rodzaju Salmonella zdolne są przetrwać w glebie do 3 miesięcy, a z rodzaju Shigella utrzymują się przy życiu od kilku do kilkunastu dni. Należy jednak podkreślić, że niektóre bakterie mogą bytować w glebie kilka, kilkanaście a nawet kilkadziesiąt lat, np. Bacillus anthracis laseczka wąglika, Clostridium tetani laseczka tężca czy C. botulinum laseczka jadu kiełbasianego [Zagroda i Olańczuk-Neyman 2001, Zmysłowska 2002]. Gleba zanieczyszczona tymi mikroorganizmami stanowi groźne źródło zakażenia dla ludzi i zwierząt, może również przyczyniać się do zanieczyszczenia roślin i produktów rolnych. Typowymi drogami narażenia człowieka bezpośrednio na zanieczyszczenia z gleby są: kontakt poprzez skórę (kontakt z glebą), droga wziewna (dostawanie się kurzu), droga pokarmowa (spożywanie roślin rosnących na i w skażonej glebie) [Czernomysy-Furowicz i Furowicz 1995, Suchy 1998, Błaszczyk 2007, Gajewska i in. 2012, PN-ISO 15800]. nr 587, 2016

54 54 M.J. Chmiel, K. Frączek Omawiając występowanie bakterii patogennych w glebie, należy pamiętać, iż mimo że ich główne miejsce bytowania stanowią przede wszystkim różne tkanki zwierząt i ludzi (bakterie mezofilne), to wywodzą się one od drobnoustrojów zamieszkujących środowisko glebowe i wodne i stopniowo adaptowały się do wzrostu w organizmach ludzkich i zwierzęcych [Czernomysy-Furowicz i Furowicz 1995]. MIKROBIOLOGICZNE WSKAŹNIKI STANU SANITARNEGO GLEBY Powszechnie przyjęte kryteria i zalecenia sanitarne dla gleb mają na celu eliminację lub co najmniej redukcję potencjalnych zagrożeń do bezpiecznego poziomu dla zdrowia ludzi i zwierząt. Jest to konieczne, biorąc pod uwagę ścisłą zależność pomiędzy mikrobiotą gleby a paszy oraz transmisję czynników patogennych wzdłuż łańcucha żywnościowego [Stoczyńska-Sikorska i in. 1995, Kukier, i in. 2016, PN-Z ]. Dokonując oceny jakości sanitarno-higienicznej gleby, zrozumiałym jest, że jej badanie w kierunku wykrywania wszystkich organizmów chorobotwórczych i potencjalnie chorobotwórczych, które mogłyby przedostać się do gleby i w niej występować, jest niemożliwe, chociażby ze względu na kosztochłonność i czasochłonność analiz. Drobnoustroje chorobotwórcze nie występują też stale w środowisku glebowym. Istotnym elementem prowadzonych w tym zakresie badań jest więc ocena ich jakości sanitarnej na podstawie określenia poziomu odpowiednich wskaźników mikrobiologicznych (przede wszystkim wskaźniki bakteriologiczne), których obecność w glebie stanowi skażenie mikrobiologiczne [Suchy 1998, Gajewska i in. 2012, PrPN-Z ]. Ocena sanitarna gleby koncentruje się więc przede wszystkim na wykrywaniu bakterii uznawanych za wskaźniki kałowego zanieczyszczenia gleby, stanowiących charakterystyczną biotę przewodu pokarmowego człowieka oraz zwierząt. Ich obecność w glebie wskazuje na skażenie gleby treścią przewodu pokarmowego ludzi lub zwierząt, a tym samym na duże prawdopodobieństwo wystąpienia wtedy bakterii chorobotwórczych przewodu pokarmowego [Suchy 1998, Smyłła 2002, Zmysłowska 2002, Gajewska i in. 2012]. Aktualne normatywne wytyczne obowiązujące w Polsce zalecają badania mikrobiologiczne gleby pod względem obecności pałeczek Salmonella [PN-Z :2001] oraz badania parazytologiczne dotyczące obecności jaj pasożytów jelitowych Ascaris lumbricoides i Trichuris trichiura [PN-Z ]. W piśmiennictwie przedmiotu są także propozycje badań mikrobiologicznych dotyczących oznaczeń obecności w glebie typowych przedstawicieli mikrobioty przewodu pokarmowego ludzi i zwierząt, tj. bakterii grupy coli i coli typu fekalnego [PrPN-Z ], E. coli, C. perfringens [PrPN-Z ], a w przypadku bliskich źródeł zanieczyszczeń, jak składowiska odpadów, oczyszczalnie ścieków czy gospodarstwa hodowlane, także innych drobnoustrojów [Stroczyńska-Sikorska i in. 1995, Topp i in. 2003, Voidarou i in. 2011, Brochier i in. 2012]. W badaniach rutynowych wskaźnikami sanitarnymi pozwalającymi na określenie stanu sanitarnego gleby są: obecność jednostek tworzących kolonie bakterii z rodzaju Salmonella, miano i najbardziej prawdopodobna liczba (NPL) bakterii z grupy coli oraz redukujących siarczany (IV) bakterii przetrwalnikujących C. perfringens, a także stwierdzenie obecności i ocena stopienia żywotności jaj pasożytów jelitowych A. lumbricoides Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

55 Mikroorganizmy wskaźnikowe w ocenie stanu sanitarnego gleby 55 i T. trichiura. Wskaźniki te pozwalają ustalić nie tylko stan sanitarno-higieniczny gleby oraz stopień jej zanieczyszczenia, ale także określić pochodzenie zanieczyszczeń i przybliżony czas, w jakim gleba została skażona [Suchy 1998, PN-Z :2001, PrPN-Z ,3, PN-Z :2001]. CHARAKTERYSTYKA WYBRANYCH MIKROORGANIZMÓW WSKAŹNIKOWYCH Z dostępnych w piśmiennictwie przedmiotu danych wyraźnie wynika, że obecnie wymagania sanitarne dla gleb uwzględniają pasożyty jelitowe, pałeczki Salmonella spp. oraz limitują inne zanieczyszczenia kałowe. Kierując się powyższymi kryteriami, przyjęto, że jako wskaźniki stanu higienicznego i sanitarnego gleby mogą służyć mikroorganizmy pochodzenia fekalnego (bakterie grupy coli, E. coli, paciorkowce kałowe), świadczące o zanieczyszczeniu środowiska naturalnego odchodami ludzi i zwierząt, a także bakterie przetrwalnikujące redukujące siarczany (IV) C. perfringens [Stroczyńska-Sikorska i in. 1995, Suchy 1998, Zmysłowska i in. 2002, Gajewska i in. 2012, PN-Z ]. Do bakterii grupy coli zaliczane są przede wszystkim szczepy E. coli oraz należące do rodziny Enterobacteriaceae rodzaje: Citrobacter, Klebsiella i Enterobacter. Pałeczki z tej rodziny stanowią dużą grupę blisko spokrewnionych bakterii najczęściej wykorzystywanych jako wskaźniki złego stanu higienicznego nie tylko w ocenie środowiska. Większość bakterii z rodziny Enterobacteriaceae to patogeny oportunistyczne, czyli warunkowo chorobotwórcze, zasiedlające głównie jelita ludzi i zwierząt. Są to Gram-ujemne pałeczki, nietworzące przetrwalników, zdolne do wzrostu w warunkach tlenowych i względnie beztlenowych na zwykłych podłożach mikrobiologicznych w szerokim zakresie temperatury i odczynu, toteż doskonale nadają się one do roli wskaźników sanitarnych [Smyłła 2002, Stevens i in. 2003, Jarząb i in. 2011]. Obecność bakterii grupy coli lub grupy coli typu fekalnego (w normach ISO zastąpiono określeniem bakterie grupy coli termotolerancyjne) jest podstawowym parametrem jakościowym w ocenie wody [Grisey i in. 2010], ponadto grupa ta coraz częściej wykorzystywana jest również jako wskaźnik stanu środowiska glebowego. Ich obecność w glebie świadczy o stosunkowo świeżym zanieczyszczeniu gleby, odchodami, ściekami lub gnijącym materiałem roślinnym. Niemniej jednak tylko obecność E. coli bezpośrednio wskazuje świeże zanieczyszczenie fekalne [Tyski i Rogulska 1999, Topp i in. 2003, Frączek 2010, Brochier i in. 2012]. Pałeczka okrężnicy (E. coli) jest symbiontem jelita grubego ludzi i zwierząt stałocieplnych. Ich fizjologiczna rola polega na udziale w rozkładzie resztek pokarmowych i syntezie witamin z grupy B, K i C oraz antagonistycznym wpływie na inne, obce pod względem ekologicznym drobnoustroje. Główną drogą transmisji E. coli do środowiska są odchody ludzi i zwierząt. Liczba tych bakterii w jednym gramie kału ludzkiego sięga 10 9 komórek. Jest ona najlepiej poznanym i najbardziej rozpowszechnionym przedstawicielem rodziny Enterobacteriaceae, a także chyba najpowszechniej dotychczas stosowanym wskaźnikiem w ocenie stopnia zanieczyszczenia fekalnego środowiska (wody, gleby) i żywności. Pochodzenie i cyrkulacja E. coli w środowisku ma duże znaczenie, nr 587, 2016

56 56 M.J. Chmiel, K. Frączek szczególnie w przypadku szczepów patogennych zagrażających zdrowiu. Warunkami przeżycia E. coli w środowisku są zarówno czynniki abiotyczne (dostępność składników odżywczych, temperatura, ph, wilgotność), jak i czynniki biotyczne, do których zalicza się głównie obecność innych mikroorganizmów [Suchy 1998, Zagroda i Olańczuk-Neyman 2001, Liang i in. 2011, Van Elsas i in. 2011]. Dostępne dane literaturowe bazujące na szczegółowych analizach określają zdolność E. coli do przeżycia w środowisku naturalnym na około dni, przy czym podobnie jak w przypadku paciorkowców kałowych w sprzyjających warunkach (termicznych i pokarmowych) czas ten może znacząco się wydłużyć, a w skrajnych przypadkach (gleby tropikalne) może dochodzić do ponownego namnażania się bakterii i zafałszowania uzyskanych wyników [Topp i in. 2003, Whitman i in. 2003, Pourcher i in. 2007, Brochier i in. 2012, Chmiel 2013]. Innym wskaźnikiem zanieczyszczenia fekalnego środowiska są paciorkowce kałowe (enterokoki lub enterokoki jelitowe). Terminem tym określa się liczne gatunki Gram- -dodatnich ziarniaków zaliczanych do rodzajów Enterococcus oraz Streptococcus. Mikroorganizmy te są powszechnie akceptowane jako użyteczne wskaźniki zanieczyszczenia fekalnego środowiska, ponieważ mogą informować o źródle i charakterze fekalnego skażenia środowiska w przypadku, gdy ich liczba znacznie przekracza liczbę bakterii grupy coli. Pozwala to na wyodrębnienie zanieczyszczeń fekalnych spowodowanych przez zwierzęta. Enterokoki stanowią naturalny składnik flory jelitowej ludzi i zwierząt stałocieplnych i występują powszechnie w ich odchodach. Jednak nie są w stanie rozmnażać się intensywnie poza tymi organizmami, a ich przeżywalność w wodzie czy glebie jest zbliżona do przeżywalności wielu bakterii chorobotwórczych [Pinto i in. 1999, Borrego i in. 2002, Smyłła 2002, Lleò i in. 2005, Grisey i in. 2010]. Poszczególne gatunki enterokoków mogą charakteryzować się różnym czasem aktywności w środowisku: w zależności od panujących w nim warunków mogą przeżyć od kilku do około dni, chociaż liczba komórek zdolnych do ponownego wzrostu w korzystnych warunkach in vitro znacząco zmniejsza się już po kilkunastu dniach [Heim i in. 2002, Lleò i in. 2005, Pourcher i in. 2007, Brochier i in. 2012]. Jednak w wodach ciepłych i silnie zanieczyszczonych materią organiczną oraz glebach tropikalnych rola enterokoków jako dobrych indykatorów bywa kwestionowana, gdyż czas ich przeżywalności znacznie się wydłuża, a sporadycznie, w sprzyjających warunkach, obserwowany jest nawet wzrost ich populacji, co może prowadzić do mylnej interpretacji wyników badań [Fujioka 1997, Whitman i in. 2003]. Następnym z bakteriologicznych wskaźników zanieczyszczenia fekalnego środowiska są bakterie beztlenowe z rodzaju Clostridium redukujące siarczany (IV) głównie C. perfringens. Są one zdolne do wytwarzania spor umożliwiających im przetrwanie niekorzystnych warunków środowiskowych. Cechuje je długa przeżywalność w środowisku (woda, gleba, ścieki, osady rzeczne, gnijące resztki roślinne i zwierzęce), gdzie bytują jako organizmy saprofityczne. Nieliczne są również klasyfikowane jako patogeny człowieka i zwierząt. Stwierdzenie ich obecności wskazuje na odległe w czasie zanieczyszczenie fekalne środowiska. Są one stałym składnikiem mikrobioty przewodu pokarmowego ludzi i zwierząt stałocieplnych, przy czym liczba komórek Clostridium wydalanych z odchodami jest znacznie mniejsza od liczby paciorkowców kałowych czy E. coli [Suchy 1998, Tyski i Rogulska 1999, Ryan i in. 2010]. Wycieki z infrastruktury kanalizacyjnej i spływy powierzchniowe zawierające zanieczyszczenia z gleb oraz odchody Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

57 Mikroorganizmy wskaźnikowe w ocenie stanu sanitarnego gleby 57 zwierząt hodowlanych i dzikich mogą być przyczyną przedostawania się tych bakterii do wód [Smyłła 2002, Boehm i in. 2009, Viau i in. 2011]. Ze względu na długoletnią przeżywalność pałeczek C. perfringens w środowisku naturalnym i zagrożenie zdrowotne, jakie stwarza ich obecność w glebie i wodzie, często sugerowane jest wykorzystanie tych bakterii jako alternatywnych indykatorów do oceny czystości mikrobiologicznej środowiska naturalnego [Stroczyńska-Sikorska i in. 1995, Zmysłowska 2002, Fung i in. 2007, Viau i in. 2011]. Pałeczki Salmonella to bakterie jelitowe, które są obligatoryjnymi patogenami. Bakterie te są jednym ze wskaźników stanu sanitarnego gleby, ponieważ ich obecność może stanowić skażenie biologiczne zagrażające zdrowiu ludzi i zwierząt. Stanowią czynnik etiologiczny ponad połowy zatruć pokarmowych występujących u ludzi. Materiałem zakaźnym są głównie odchody, ścieki lub zakażona żywność pochodzenia zwierzęcego. W literaturze przedmiotu znajdują się bardzo różne dane dotyczące przeżywalności pałeczek Salmonella w środowisku naturalnym: od kilku do nawet kilkuset dni. Przeżywalność Salmonella w glebie i wodzie zależy od różnych czynników biotycznych i abiotycznych, jak również od początkowej liczby wprowadzonych pałeczek [Abirosh i Hatha 2005, Jacobsen i Bech 2012]. Najczęściej przeżywalność Salmonella określa się na 3 8 tygodni, jednak udowodniono również jej aktywność w glebie nawet po 300 dniach od zanieczyszczenia [Natvig i in. 2002, Islam i in. 2004, Brochier i in. 2012, Jacobsen i Bech 2012]. Ubogie w składniki pokarmowe środowisko wodne nie sprzyja długotrwałemu bytowaniu w nim pałeczek Salmonella. W zależności od różnych czynników środowiskowych żywotność tych bakterii jest określana na kilka [Abirosh i Hatha 2005], kilkadziesiąt bądź dni [Ramalho i in. 2001]. Coraz częściej postuluje się również wprowadzenie alternatywnych wskaźników sanitarnych, których obecność wskazywałaby wyraźne źródło skażenia. W badaniach epidemiologicznych gleby i wody jako wskaźniki sanitarne znalazły na przykład zastosowanie także wirusy bakteryjne bakteriofagi swoiste dla E. coli. Pozwalają one na wykazanie ścisłej zależności między liczbą wykrywanych bakteriofagów a liczbą obecnych komórek E. coli [Suchy 1998, Zmysłowska 2002]. WYMAGANIA HIGIENICZNE W OCENIE GLEBY W piśmiennictwie przedmiotu zwraca się uwagę, że obecnie w Polsce nadal brakuje ustalonego ustawowego zakresu badań i obowiązujących normatywów niezbędnych do oceny zanieczyszczenia mikrobiologicznego gleby, a także ustalonych metod badawczych. Przy ocenie stanu sanitarnego gleb możemy jedynie bazować na Polskich Normach, które należą do zbioru normy arkuszowej pod wspólnym tytułem: Jakość gleby Ocena stanu sanitarnego gleby. Jest ona podzielona na cztery arkusze: Arkusz 1 Wykrywanie bakterii z rodzaju Salmonella, Arkusz 2 Wykrywanie i oznaczanie ilościowe bakterii grupy coli, Arkusz 3 Wykrywanie i oznaczanie ilościowe bakterii przetrwalnikujących Clostridium perfringens, Arkusz 4 Wykrywanie jaj pasożytów jelitowych Ascaris lumbricoides i Trichuris trichiura. nr 587, 2016

58 58 M.J. Chmiel, K. Frączek Niestety przygotowane arkusze 2 i 3 tej normy i zawarte w nich wytyczne ciągle nie są obowiązujące. W pierwszym arkuszu normy [PN-Z :2001] podano metodę wykrywania bakterii z rodzaju Salmonella w glebie. W przypadku gdy stwierdzi się ich występowanie w glebie, to zaleca się wykonanie całościowych badań dotyczących stanu sanitarnego gleby, tj. wykrywanie i oznaczanie ilościowe bakterii grupy coli wg PrPN-Z , wykrywanie i oznaczanie ilościowe bakterii przetrwalnikujących C. perfringens wg PrPN-Z oraz wykrywanie jaj pasożytów jelitowych A. lumbricoides i T. trichiura wg PN-Z :2001. Mogą one być stosowane do badania wszystkich rodzajów gleb. Na podstawie wyżej wymienionych wskaźników bakteriologicznych oraz parazytologicznych glebę ocenia się według kryteriów podanych w tabeli 1. Tabela 1. Kryteria oceny stanu sanitarnego gleby Table 1. Soil sanitary conditions benchmark Wskaźnik stanu sanitarnego Sanitary condition indicator Gleba czysta Clean soil Gleba zanieczyszczona Contaminated soil Bakterie z rodzaju Salmonella nie wyizolowano wyizolowano Miano coli do 0,01 >0,01 Miano C. perfringens do 0,01 >0,001 Inwazyjne jaja A. lumbricoides T. trichiura do 10 szt. kg 1 >10 szt. kg 1 Warto jednak podkreślić, że ocenę sanitarną gleby należy przeprowadzić, stosując jednocześnie wszystkie wskaźniki mikrobiologiczne i parazytologiczne. PODSUMOWANIE Chociaż coraz częściej w ocenie środowiska naturalnego rutynowo wykorzystuje się bioindykatory, wybór metod badawczych i kryteriów oceny stanu sanitarnego gleby nadal stanowi istotny problem badań środowiskowych. Ze względu na brak powszechnie obowiązujących wartości normatywnych czy referencyjnych, dobór odpowiednich wskaźników do przeprowadzenia obiektywnej oceny stanu sanitarnego gleb zależy często od subiektywnej decyzji badacza. Aktualnie w interpretacji otrzymanych wyników możemy jedynie bazować na zbiorze należącym do normy arkuszowej Jakość gleby Ocena stanu sanitarnego gleby i propozycjach w nim zawartych. Jednakże podkreślić należy, że przygotowane arkusze norm nadal są na etapie dyskusji, co poniekąd uniemożliwia zapewnienie bezpieczeństwa osobom użytkującym gleby uprawne. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

59 Mikroorganizmy wskaźnikowe w ocenie stanu sanitarnego gleby 59 LITERATURA Abirosh Ch., Hatha, M.A.A., Relative survival of Escherichia coli and Salmonella typhimurium in a tropical estuary. Water Res. 39 (7), Avidano L., Gamalero E., Cossa G.P., Carraro E., Characterization of soil health in an Italian polluted site by using microorganisms as bioindicators. Appl. Soil Ecol. 30, Banaszak J., Wiśniewski H., Podstawy ekologii. Wyd. Adam Marszałek, Toruń, 587. Bednarek R., Dziadowiec H., Pokojska U., Pruszewicz Z., Badania ekologiczno-gleboznawcze. Wyd. Nauk. PWN. Warszawa, 344. Błaszczyk M.K., Mikroorganizmy w ochronie środowiska. Wyd. PWN. Warszawa, 195. Boehm A., Ashbolt N.J., Colford J.M., Dunbar L.E., Fleming L.E., Gold M., Hansel J., Hunter P.R., Ichida A.M., McGee C., Soller J.A., Weisberg S.B., A sea change ahead for recreational water quality criteria. J. Water Health 7 (1), Borrego J.J., Castro D., Figueras M.J., Fecal streptococci/enterococci in aquatic environments. W: G. Bitton (red.). The encyclopedia of environmental microbiology. John Wiley & Sons, New York, Brochier V., Gourlan P., Kallassy M., Poitrenaud M., Houot S., Occurrence of pathogens in soils and plants in a long-term field study regularly amended with different composts and manure. Agr. Ecosyst. Environ.160, Calver M., Lymbery A., McComb J., Bamford M., Environmental biology. Cambridge Unversity Press, Cambridge, 671. Chmiel M., Charakterystyka mikrobiologiczna i ocena sanitarna środowiska naturalnego Ojcowskiego Parku Narodowego ze szczególnym uwzględnieniem antropopresji. Zesz. Nauk. UR Kraków 505, Rozprawy 382. Czernomysy-Furowicz D., Furowicz A.J., Występowanie bakterii w glebie ze specjalnym uwzględnieniem drobnoustrojów chorobotwórczych. Aspekty epidemiologiczne i epizootiologiczne. Ekologia i Technika 3, Frączek K., Sezonowe zmiany wskaźników stanu sanitarnego gleb na terenie oraz w rejonie składowiska odpadów komunalnych aglomeracji krakowskiej. Woda Środ. Obsz. Wiej. 10, 2 (30), Fujioka R.S., Indicators of marine recreational water quality. W: C.J. Hurst, G.R. Knudsen, M.J. McInerney, L.D. Stetzenbach, M.V. Walter (red.). Manual of environmental microbiology. ASM Press, Washington DC, Fung D.Y.C., Fujioka R.S., Vijayavel K., Sato D., Bishop D., Evaluation of Fung double tube test for Clostridium perfringens and Easyphage test for F-specific RNA coliphages as rapid screening tests for fecal contamination in recreational waters of Hawaii. J. Rapid Meth. Aut. Mic. 15 (3), Gajewska J., Wycech M., Pladys W., Sysa P., Mikrobiologiczne wskaźniki skażenia sanitarnego gleby w okolicy przeciekającego zbiornika bezodpływowego na nieczystości ciekłe. Zesz. Nauk. UZ, Inżynieria Środowiska 146 (26), Grisey E., Belle E., Dat J., Muddry J., Aleya L., Survival of pathogenic and indicator organisms in groundwater and landfill leachate through coupling bacterial enumeration with tracer tests. Desalination 261 (1 2), Heim S., Lleo M.M., Bonato B., Guzman C.A., Canepari P., The viable but nonculturable state and starvation are different stress responses of Enterococcus faecalis, as determined by proteome analysis. J. Bacteriol. 184, Islam M., Morgan J., Doyle M.P., Phatak S.C., Millner P., Jiang X.P., Fate of Salmonella enterica serovar Typhimurium on carrots and radishes grown in fields treated with contaminated manure composts or irrigation water. Appl. Environ. Microbiol. 70, nr 587, 2016

60 60 M.J. Chmiel, K. Frączek Jacobsen C.S., Bech T.B., Soil survival of Salmonella and transfer to freshwater and fresh produce. Food Res. Int. 45 (2), Jarząb A., Górska-Frączek S., Rybka J., Witkowska D., Zakażenia pałeczkami jelitowymi diagnostyka, oporność na antybiotyki i profilaktyka. Post. Hig. Med. Dośw. 65, Kukier E., Kozieł N., Goldsztejn M., Kwiatek K., Aktualne wymagania sanitarno-weterynaryjne dla nawozów organicznych i polepszaczy gleby w Polsce. Życie Weterynaryjne 91 (2), Liang Z., He Z., Powell C.A., Stoffella P.J., Survival of Escherichia coli in soil with modified microbial community composition. Soil Biol. Biochem. 43 (7) Libudzisz Z., Kowal K., Żakowska Z., Mikrobiologia techniczna. Mikroorganizmy i środowiska ich występowania. Wyd. PWN, Warszawa, 353. Lleò M.M, Bonato B., Benedetti D., Canepari P., Survival of enterococcal species in aquatic environments. FEMS Microbiol. Ecol. 54 (2), Natvig E.E., Ingham S.T., Ingham B.H., Cooperbrand L.R., Roper T.R., Salmonella enterica serovar Typhimurium and Escherichia coli contamination of root and leaf vegetables grown in soils with incorporated bovine manure. Appl. Environ. Microbiol. 68, Paul E.A., Clark F.E., Soil microbiology and biochemistry. 3nd edition, Academic Press San Diego, 552. Pinto B., Pienotti R., Canale G., Reali D., Characterization of faecal streptococci as indicators of faecal pollution and distribution in the environment. Lett. Appl. Microbiol. 29, PN-Z Jakość gleby Ocena stanu sanitarnego gleby Wykrywanie bakterii z rodzaju Salmonella. PN-ISO Jakość gleby Charakteryzowanie gleby pod kątem narażenia człowieka. PN-Z :2001. Jakość gleby Ocena stanu sanitarnego gleby Wykrywanie jaj pasożytów jelitowych Ascaris lumbricoides i Trichuris trichiura. Pourcher A.M., Picard-Bonnaud F., Ferré V., Gosinska A., Stan V., Moguedet G., Survival of faecal indicators and enteroviruses in soil after land-spreading of municipal sewage sludge. Appl. Soil Ecol. 35 (3), PrPN-Z Jakość gleby Ocena stanu sanitarnego gleby Wykrywanie obecności i oznaczanie ilościowe bakterii z grupy coli. PrPN-Z Jakość gleby Ocena stanu sanitarnego gleby Wykrywanie obecności i oznaczanie ilościowe bakterii przetrwalnikujących Clostridium perfringens. Ramalho R., Afonso A., Cunha J., Teixeira P., Gibbs P.A., Survival characteristics of pathogens inoculated into bottled mineral water. Food Control 12 (5), Ryan K.J., Ray C.G., Nafees A., Drew W.L., Plorde J.J., Medical Microbiology. McGraw Hill, Schloter M., Dilly O., Muncha J.C., Indicators for evaluating soil quality. Agricul. Ecosyst. Environ. 98 (1 3), Smyk B., Mikroorganizmy a stabilność ekosystemów polowych. Zesz. Probl. Nauk Roln. 306, Smyłła A., Analiza sanitarna wody. Wyd. WSP, Częstochowa. Stevens M., Ashbolt N., Cunliffe D., Review of coliforms, as microbial indicators of drinking water quality. National Health and Medical Research Council, Australian Government, Stroczyńska-Sikorska M., Kłapeć T., Cholewa A., Wytyczne metodyczne (mikrobiologiczno- -parazytologiczne) do oceny sanitarnej gleby. Wyd. Instytut Medycyny Wsi w Lublinie, Lublin. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

61 Mikroorganizmy wskaźnikowe w ocenie stanu sanitarnego gleby 61 Suchy M., Mikrobiologiczne metody w monitoringu środowiska przyrodniczego. Wyd. PIOŚ, Biblioteka Monitoringu Środowiska, Rzeszów. Sveshnikova A.A., Polyanskaya L.M., Lukin S.M., The effect of tillage and mesorelief on the structure of soil microbial cenoses. Microbiology 70, Świercz A., Rola biowskaźników w monitoringu zanieczyszczeń środowiska i rekultywacji terenów poprzemysłowych. Red. M. Strzyż. Perspektywy rozwoju regionu w świetle badań krajobrazowych. Problemy Ekologii Krajobrazu PAEK, Kielce, Topp E., Welsh M., Tien Y-C., Dang A., Lazarovits G., Conn K., Zhu H., Strain-dependent variability in growth and survival of Escherichia coli in agricultural soil. FEMS Microbiol. Ecol. 44 (3), Traczewska T.M., Biologiczne metody oceny skażenia środowiska. Wyd. OWPW, Wrocław. Tyski, S., Rogulska B., Mikrobiologiczne kryteria jakości wody przeznaczonej do różnych celów obowiązujące zalecenia i przepisy oraz projekty nowelizacji. Mikrob. Med. 4 (21), Uhlı řová E., Šantrůčková H., Growth rate of bacteria is affected by soil texture and extraction procedure. Soil Biol. Biochem. 35 (20), Van Elsas J.D., Semenov A.V., Costa R., Trevors J.T., Survival of Escherichia coli in the environment: fundamental and public health aspects. The ISME Journal 5, Viau E.J., Goodwin K.D., Yamahara K.M., Layton B.A., Sassoubre L.M., Burns S.L., Tong H.I., Wong S.H.C., Lu Y., Boehm A.B., Bacterial pathogens in Hawaiian coastal streams. Associations with fecal indicators, land cover, and water quality. Water Res. 45 (11), Visser, S., Parkinson, D., Soil biological criteria as indicators of soil quality: soil microorganisms. American Journal of Alternative Agriculture 7, Voidarou, C., Bezirtzoglou E., Alexopoulos A., Plessas S., Stefanis C., Papadopoulos I., Vavias S., Stavropoulou E., Fotou K., Tzora A., Skoufos I., Occurrence of Clostridium perfringens from different cultivated soils. Anaerobe 17 (6), Whitman R.L., Shively D.A., Pawlik H., Nevers M.B., Byappanahalli M.N., Occurrence of Escherichia coli and enterococci in Cladophora (Chlorophyta) in nearshore water and beach sand of Lake Michigan. Appl. Environ. Microbiol. 69, Zagroda B., Olańczuk-Neymann K., Ochrona i rekultywacja podłoża gruntowego. Wyd. WPG, Gdańsk. Zmysłowska J., Filipowska Z., Gołaś I., Korzeniewska E., Lewandowska D., Mikrobiologia ogólna i środowiskowa. Teoria i ćwiczenia. Wyd. UWM, Olsztyn. INDICATOR MICROORGANISMS IN ASSESSMENT OF SOIL SANITARY CONDITION Summary. Soil plays a fundamental role in regulation of amount of pollutants in ecosystems. It can reduce pollution or to immobilize them and thus be used to assess the environment condition in terms of biology. The soil can prevent pollution, until it exceeded its capacity and retained biological activity. The use of living organisms in biomonitoring is extremely useful to assess the condition and contamination of the environment because they are the authoritative and reliable source of information about the processes occurring in the soil. Good bio-indicators can be easy to identify and cultivation organisms, quickly and unambiguously reacting to the changes in the environment, and allowing to assess the nr 587, 2016

62 62 M.J. Chmiel, K. Frączek degree and direction of changes in the natural environment. Depending on the direction and scope of the environmental research as indicator organisms can be assume the total number of basic groups of microorganisms in the environment (bacteria, fungi, actinomycetes) and also the microorganisms active in many processes as nitrification, denitrification, atmospheric nitrogen fixation and others. Undoubtedly, we should distinguish between bioindicators, which react and detect changes in the environment of those whose presence (zymogens) already proves microbiological contamination of soils. The presence of indicator microorganisms in the soil reflects not only the degree of contamination of the soil environment but also provides information on the potential risk of crops contamination and the threat of human and animal health. Today, range of research methods and evaluation criteria for the sanitary condition of the soil is still a major problem of environmental tests. Though increasingly in the assessment of the environment routinely are used bioindicators this is due to the lack of a universally applicable standard values or reference, selection of appropriate indicators to make an objective assessment of the health of soils often depends on the subjective decision of the investigator. Therefore, this study attempts to show some methods of qualitative assessment of the sanitary condition of the soil environment based on selected microbiological indicators. Good indicators in assessing the state of the environment are microorganisms constantly inhabiting the gastrointestinal tract of humans and animals and pathogens that may constitute a danger to the health people having contact with contaminated soil. The presence of pathogen in the soil may also cause contamination of crops and hence food and feed. Thus, the paper characterizes also the standards and microorganisms recommended in the soil sanitary evaluation, mainly based on number or titre of coliform bacteria, Escherichia coli, Salmonella spp., Streptococcus faecalis, endospore forming sulfite-reducing bacteria Clostridium perfringens. Key words: soil, microorganisms, sanitary indicators Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

63 Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych nr 587, 2016, WPŁYW POUŻYTKOWEJ WEŁNY MINERALNEJ NA WYBRANE WŁAŚCIWOŚCI FIZYCZNO-CHEMICZNE GLEBY Iwona Paśmionka Uniwersytet Rolniczy im. Hugona Kołłątaja w Krakowie Streszczenie. Wełna mineralna jest jednym z najczęściej wykorzystywanych podłoży inertnych, ponieważ jest wytwarzana z surowców pochodzenia naturalnego. Pomimo zalet posiada jedną wadę: po zakończeniu uprawy stwarza trudności w zagospodarowaniu, gdyż nie ulega biodegradacji. Problem ten można rozwiązać wykorzystując ją do rekultywacji gleb zdegradowanych. Celem pracy było określenie wpływu poużytkowej wełny mineralnej na wybrane właściwości fizyczno-chemiczne gleby. Badania realizowano w doświadczeniu polowym, którego schemat obejmował obiekt kontrolny i trzy obiekty z dawką wełny mineralnej wynoszącą odpowiednio 200, 400 i 800 m 3 ha 1. Po trzech latach doświadczenia wykonano podstawowe oznaczenia fizyczno-chemiczne gleby. Na podstawie badań stwierdzono, że dodatek wełny mineralnej do gleby korzystanie wpłynął na pojemność sorpcyjną, odczyn gleby, zawartość ogólnych i przyswajalnych form makroelementów, ale przyczynił się do nieznacznego wzrostu zawartości metali ciężkich takich jak ołów, chrom i kadm. Słowa kluczowe: wełna mineralna, makroelementy, metale ciężkie WSTĘP Podłoża z wełny mineralnej w uprawach szklarniowych zajmują aktualnie pierwsze miejsce, pokonując do niedawna najbardziej rozpowszechnione podłoża wytworzone na bazie torfu [Jaroszczuk-Sierocińska 2007]. Jest to podłoże sterylne, wolne od patogenów, substancji szkodliwych i balastowych. Charakteryzuje się bardzo dobrymi uwarunkowaniami powietrzno-wodnymi, przez co stwarza korzystne warunki do rozwoju roślin uprawnych [Pawlińska i Komosa 2004]. Technika uprawiania na podłożu i.pasmionka@ur.krakow.pl Copyright by Wydawnictwo SGGW

64 64 I. Paśmionka w formie wełny mineralnej zmniejsza ryzyko chorób pochodzenia glebowego. Sprzyja uprawianiu roślin w pomieszczeniach, w których ze względu na zanieczyszczone podłoże dalszej produkcji nie można by prowadzić [Komosa 2013]. Pomimo wielu zalet posiada jedną wadę: po zakończeniu uprawy stwarza duże trudności w zagospodarowaniu, gdyż nie ulega biodegradacji [Nurzyński 2006]. Problem ten można rozwiązać, wykorzystując wełnę odpadową do rekultywacji gleb słabej jakości. Zaistniała dlatego też potrzeba badania przydatności poużytkowej wełny mineralnej do rekultywowania terenów zniszczonych przez przemysł, bądź odnowienia gleb słabej jakości. Celem badań podjętych w ramach niniejszej pracy było określenie wpływu poużytkowej wełny mineralnej na wybrane właściwości fizyczno-chemiczne gleby, zmiany zawartości makroelementów oraz pierwiastków śladowych. MATERIAŁ I METODY Doświadczenie polowe założono metodą bloków losowanych w kwietniu 2012 roku w Miejsko-Przemysłowej Oczyszczalni Ścieków w Oświęcimiu, na terenie składowiska odpadów, przeznaczonego do selektywnego składowania mieszanek popiołowo-żużlowych. Wielkość każdego poletka wynosiła 2 5 m (10 m 2 ). Każde poletko otoczone było pasami ochronnymi wynoszącymi 1 m i obsiane rekultywacyjną mieszanką traw. Poletka zajmowały powierzchnię 160 m 2, z kolei z pasami ochronnymi 325 m 2. Do badań wykorzystano wełnę mineralną pochodzącą z dwuletniej uprawy pomidorów. Schemat doświadczenia obejmował obiekt kontrolny i trzy poletka z dodatkiem wełny mineralnej w dawkach 200, 400, 800 m 3 ha 1. Oznaczenia fizyczne i fizyczno-chemiczne gleby przeprowadzono w czterech powtórzeniach. Zakres badań obejmował analizę materiału glebowego w trzecim roku od założenia doświadczenia (próbki gleby zostały pobrane w 2015 roku z warstwy 0 20 cm). Badana gleba została zakwalifikowana do gleby ciężkiej o składzie granulometrycznym gliny średniej pylastej (klasa IIIb). Przed rozpoczęciem doświadczenia charakteryzowała się niską zawartością fosforu (91,3 mg kg 1 ), potasu (99,4 mg kg 1 ) i średnią zawartością magnezu (2084 mg kg 1 ). Zawartość węgla organicznego kształtowała się na poziomie 1,91 g kg 1, a azotu 0,13 g kg 1. Stopień nasycenia gleby zasadami wskazywał na kwaśny odczyn (tab. 1). Do badań wykorzystano poprodukcyjną wełnę mineralną z dwuletniej uprawy pomidorów. Maty miały wymiary ,5 cm i przed zastosowaniem do gleby zostały rozdrobnione. Chemiczne właściwości wełny mineralnej zastosowanej w doświadczeniu przedstawiono w tabeli 2. Materiał glebowy przed wykonaniem analiz został doprowadzony do stanu powietrznie suchego, a następnie przesiany przez sito o średnicy oczek 2 mm. W glebie oznaczono zawartość rozpuszczalnych form Fe, Zn, Cd, Pb, Ni, Cu, Mn, Cr ekstrahowanych 1 mol HCl dm 3, metodą Rinkisa, zawartość przyswajalnych form fosforu i potasu (metodą Egnera Riehma) oraz magnezu (metodą Schachtschabela w 0,0125 mol CaCl 2 dm 3 ), zawartość form całkowitych pierwiastków, w mieszaninie stężonych kawasów HNO 3 i HClO 3 (2 : 1), odczyn gleby (ph) potencjometrycznie, kwasowość hydrolityczną (Hh) metodą Kappena, sumę zasad (S), pojemność sorpcyjną (T), Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

65 Wpływ poużytkowej wełny mineralnej na wybrane właściwości fizyczno-chemiczne gleby 65 Tabela 1. Właściwości gleby wyjściowej Table 1. Properties of the initial soil Parametr Parameter Gleba Soil ph 5,12 mg P kg 1 91,28 Zawartość składników przyswajalnych Content of the constituents assimilable mg K kg 1 99,36 mg Mg kg ,00 Azot ogólny Total nitrogen 0,13 Węgiel organiczny Organic carbon g kg 1 1,91 Kwasowość hydrolityczna (Hh) Hydrolytic acidity 30,17 Suma zasad wymiennych (S) Sum of exchangeable bases mmol + kg 1 105,22 Pojemność sorpcyjna (T) Sorption capacity 136,81 Stopień nasycenia gleby zasadami V% Degree of saturation of the soil with alkalis 73,00 Tabela 2. Skład chemiczny poużytkowej wełny mineralnej Table 2. Chemical composition of postconsumer mineral wool Oznaczane pierwiastki Identified elements Zawartość Content [mg kg 1 ] Pb Cu Cd Ni Zn Fe Mn P K Mg 3,18 63,24 0,06 18,03 159, , ,13 73,16 91,32 961,11 kationy wymienne, zawartość azotu ogólnego metodą Kjeldahla, zawartość materii organicznej metodą Tiurina [Mercik 2002]. Wyniki opracowano statystycznie, wykonując jednoczynnikową analizę wariancji i wykorzystując do oceny istotności różnic test Tukeya na poziomie α 0,05. Do opracowania wyników zastosowano program statystyczny Statistica 10. WYNIKI I DYSKUSJA Wpływ wełny mineralnej na wybrane właściwości fizyczno-chemiczne i chemiczne gleb W przeprowadzonych badaniach nie stwierdzono istotnego wpływu dodatku wełny mineralnej na odczyn gleby (tab. 3). W obiekcie kontrolnym ph wynosiło 6,11, z kolei dodatek wełny mineralnej (III) spowodował wzrost wartości ph do 6,22. W przypadku kwasowości hydrolitycznej wzrost dawek powodował spadek z 19,38 mmol 1 + kg gleby w kontroli do17,99 mmol + kg 1 gleby w obiekcie III z największą dawką wełny mineralnej (800 m 3 ha 1 ). W badanej glebie stwierdzono wzrost sumy zasad wymiennych oraz pojemności sorpcyjnej wraz ze wzrostem dawki wełny mineralnej (tab. 3). nr 587, 2016

66 66 I. Paśmionka Tabela 3. Wpływ dawki wełny mineralnej na odczyn, kwasowość hydrolityczną, sumę zasad wymiennych i pojemność sorpcyjną badanej gleby Table 3. Dose effect of mineral wool on the ph, hydrolytic acidity, sum of exchangeable bases and sorption capacity of soil tested Obiekt badawczy Research facility ph Kwasowość hydrolityczna Hydrolytic acidity Suma zasad Sum of exchangeable bases Pojemność sorpcyjna Sorption capacity H 2 O KCl mmol + kg 1 gleby K 7,12 a 6,11 a 19,38 a 346,5 a 367,02 a I 7,06 a 6,12 a 18,84 b 361,0 a 381,12 a II 7,08 a 6,08 a 18,32 b 431,0 b 467,88 b III 7,23 a 6,22 a 17,99 b 498,0 b 516,84 b K: kontrola control, I: dawka wełny mineralnej dose of mineral wool 200 m 3 ha 1, II: dawka wełny mineralnej dose of mineral wool 400 m 3 ha 1, III: dawka wełny mineralnej dose of mineral wool 800 m 3 ha 1. a, b wartości średnie oznaczone różnymi literami w kolumnie różnią się w zależności od zastosowanych wariantów dawki wełny mineralnej mean values marked with different letters in the column differ depending on the dose of mineral wool variants. Podobne wyniki uzyskali Baran i inni [2008], oceniając możliwości zastosowania wełny Grodan z upraw oraz badając jej wpływ na właściwości sorpcyjne gruntu bezglebowego w okolicy wydobycia siarki metodą Frasha. Autorzy stwierdzili znaczący wzrost pojemności sorpcyjnej utworu bezglebowego w zależności od dawki wełny mineralnej. Gilewska [2005] również odnotowała wprost proporcjonalny wzrost pojemności sorpcyjnej w stosunku do zastosowanej dawki wełny mineralnej. Wełna mineralna nie wpływała również na zawartość kationów wymiennych magnezu (tab. 4). Z kolei wzrost dawki wełny mineralnej powodował wzrost zawartości kationów wymiennych sodu z 5,39 w obiekcie kontrolnym do 7,42 mg kg 1 gleby w obiekcie III. Zawartość kationów wymiennych potasu była najmniejsza w kontroli (130,92 mg kg 1 ), a największa w obiekcie II (164,29 mg kg 1 ). Wzrost dawki wełny mineralnej powodował zwiększenie zawartości kationów wymiennych wapnia. W glebie kontrolnej zawartość wapnia wynosiła 1197,36 mg kg 1, z kolei w obiekcie I 1449,27 mg kg 1. Analiza wariancji danych wskazuje, że dawki wełny mineralnej nie miały istotnego wpływu na poziom kationów wymiennych w glebie. Tabela 4. Zawartość kationów wymiennych w badanej glebie Table 4. Concentration of exchangeable cations in the soil tested Obiekt badawczy Mg Na K Ca Research facility mg kg 1 K 225,76 a 5,39 a 130,92 a 1197,36 a I 228,52 a 6,01 b 150,16 b 1449,27 b II 226,11 a 6,23 b 164,29 b 1136,78 a III 227,18 a 7,42 b 148,22 a 1203,05 a Objaśnienia takie jak w tabeli 3 Explanations as in Table 3. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

67 Wpływ poużytkowej wełny mineralnej na wybrane właściwości fizyczno-chemiczne gleby 67 W przeprowadzonych badaniach nie stwierdzono istotnego wpływu dodatku wełny mineralnej na zawartość węgla organicznego, próchnicy i azotu ogólnego (tab. 5). Ilość próchnicy w kontroli wynosiła 2,79%, a w obiekcie I zmniejszyła się do 2,56%. W obiekcie II zawartość próchnicy zwiększyła się do podobnej wartości jak w kontroli, z kolei w obiekcie III uległa obniżeniu. Zawartość azotu ogólnego utrzymywała się na podobnym poziomie. Ilość przyswajalnego magnezu i fosforu nieznacznie zwiększała się wraz ze wzrostem dawki wełny mineralnej. Zawartość przyswajalnego potasu zwiększała się wraz ze wzrostem dawki wełny mineralnej (obiekt II). W obiekcie III z największą dawką wełny mineralnej zawartość potasu nieco zmniejszyła się w porównaniu do obiektu II (tab. 5). Tabela 5. Zawartości materii organicznej, azotu ogólnego oraz przyswajalnych form magnezu, fosforu i potasu w badanej glebie Table 5. Concentration of organic matter, total nitrogen and assimilable forms of magnesium, phosphorus and potassium in the soil tested Obiekt badawczy Research facility C org Próchnica Humus Azot ogólny Total nitrogen Mg P K g kg 1 % g kg 1 mg kg 1 K 1,61 a 2,79 a 0,12 a 2095,3 a 77,1 a 82,9 a I 1,52 b 2,59 b 0,14 a 2158,1 b 84,9 a 88,7 a II 1,60 a 2,81 a 0,14 a 2160,1 b 107,8 b 110,9 b III 1,49 b 2,56 b 0,14 a 2198,3 b 113,2 b 100,2 b Objaśnienia takie jak w tabeli 3 Explanations as in Table 3. Zróżnicowanie dawek wełny mineralnej nie miało wpływu na zmianę zawartości azotu w poszczególnych próbach. Wapń stabilizuje gospodarkę wodną, wpływa także na procesy metaboliczne w roślinie. Magnez jest niezbędny dla procesu fotosyntezy, gdyż wchodzi w skład chlorofilu oraz jest aktywatorem w reakcjach enzymatycznych roślin. Potas oraz sód biorą udział w procesach uwodnienia tkanek rośliny. Fosfor jest składnikiem budującym komórki, a także bierze udział w procesie oddychania [Alexander i Parker 2002]. Wzrost dawki wełny mineralnej powodował wzrost zawartości ogólnej powyższych makroelementów. Zwiększenie zawartości tych składników wpływa na poprawę jakości gleby, co znalazło potwierdzenie w literaturze [Baran 2006, Sirok i in. 2008]. Wpływ wełny mineralnej na zawartość ogólną makroelementów W przeprowadzonych badaniach określono wpływ poszczególnych dawek wełny mineralnej na zawartość wapnia, potasu, magnezu, sodu i fosforu. Uzyskane wyniki zestawiono w tabeli 6. Nieznaczny wzrost zawartości wapnia zaobserwowano tylko w glebie z dodatkiem wełny mineralnej w dawce 400 i 800 m 3 ha 1. Zawartość potasu i magnezu, podobnie jak wapnia, zwiększała się wraz ze wzrostem dawki wełny mineralnej. Należy jednak zaznaczyć, że w obiekcie kontrolnym zawartość potasu była największa. Wraz ze wzrostem dawki wełny mineralnej obserwowano również wzrost zawartości sodu. Największą różnicę w zawartości tego pierwiastka zarejestrowano między obiektem kontrolnym nr 587, 2016

68 68 I. Paśmionka Tabela 6. Zawartości makroelementów w badanej glebie Table 6. Concentration of macroelements in the tested soil Obiekt badawczy Ca K Mg Na P Research facility g kg 1 K 2,46 a 1,60 a 1,63 a 0,21 a 0,77 a I 2,53 a 1,53 b 1,75 b 0,26 a 0,61 b II 3,21 b 1,55 b 2,16 b 0,31 b 0,60 b III 3,76 b 1,56 b 2,41 b 0,39 b 0,81 a Objaśnienia takie jak w tabeli 3 Explanations as in Table 3. a glebą z największą dawką wełny mineralnej. Podobną ilość tego pierwiastka zawierała gleba kontrolna oraz gleba z najmniejszą dawką wełny. Ilość fosforu wzrastała nieznacznie wraz ze zwiększoną dawką wełny mineralnej, ale w obiektach I i II była mniejsza niż w kontroli, z kolei w obiekcie III nieco większa. Zgodnie z przeprowadzoną analizą wariancji zmiany zawartości makroelementów w poszczególnych punktach badawczych nie były istotne. Zawartość ogólnych i rozpuszczalnych form pierwiastków śladowych W badaniach określono wpływ dawek wełny mineralnej na zawartość ogólnych i rozpuszczalnych form żelaza, cynku, kadmu, ołowiu, niklu, manganu, chromu i miedzi. Uzyskane wyniki zestawiono w tabelach 7 i 8. Tabela 7. Zawartość ogólnych form pierwiastków śladowych w badanej glebie Table 7. Concentration of the general forms of trace elements in the soil tested Obiekt badawczy Fe Zn Cd Pb Ni Mn Cr Cu Research facility mg kg 1 K 8031 a 293,41 a 3,27 a 97,21 a 9,83 a 682,41 a 19,16 a 11,97 a I 8039 a 262,13 b 3,02 a 87,03 b 9,01 a 600,22 b 19,11 a 11,91 a II 8272 b 261,23 b 2,75 b 91,24 b 9,12 a 605,17 b 20,19 b 12,17 a III 8384 b 258,87 b 3,16 a 95,17 a 11,06 b 653,38 a 22,31 b 12,96 b Objaśnienia takie jak w tabeli 3 Explanations as in Table 3. Tabela 8. Zawartość rozpuszczalnych form pierwiastków śladowych w badanej glebie Table 8. Concentration of soluble forms of trace elements in the soil tested Obiekt badawczy Fe Zn Cd Pb Ni Mn Cr Cu Research facility mg kg 1 K 1216,00 a 93,17 a 2,61 a 80,73 a 1,03 a 251,12 a 1,75 a 7,15 a I 1218,00 a 79,57 b 2,31 a 71,22 b 1,06 a 253,35 a 2,83 a 7,07 a II 1897,00 b 81,63 b 2,44 a 76,54 b 1,07 a 316,88 b 3,77 b 7,19 a III 2046,00 b 92,57 a 2,51 a 80,13 a 1,13 a 394,39 b 4,92 b 8,12 b Objaśnienia takie jak w tabeli 3 Explanations as in Table 3. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

69 Wpływ poużytkowej wełny mineralnej na wybrane właściwości fizyczno-chemiczne gleby 69 Ogólna zawartość żelaza w glebie zwiększała się wraz ze wzrostem dawki wełny mineralnej (tab. 7). Największe różnice obserwowano między obiektami I i III (345 mg kg 1 ). Wraz ze wzrostem dawki wełny mineralnej wzrastała również zawartość żelaza rozpuszczonego (tab. 8). Zbliżoną ilość żelaza stwierdzono w obiekcie kontrolnym i obiekcie I. Na podstawie przeprowadzonej analizy wariancji nie stwierdzono istotnej zmiany zawartości żelaza. Dodatek wełny mineralnej do gleby, niezależnie od dawki, spowodował zmniejszenie zawartość cynku ogólnego w stosunku do kontroli (tab. 7). Różnica pomiędzy zawartością cynku w obiekcie I i III wynosiła 3,26 mg kg 1. Zmiany zawartości cynku rozpuszczalnego były podobne jak zmiany zawartości żelaza rozpuszczalnego, ilość cynku wzrastała wraz ze zwiększeniem dawki wełny mineralnej (tab. 8). Większą różnice obserwowano między obiektem I (79,57 mg kg 1 ) i III (92,94 mg kg 1 ). Na podstawie przeprowadzonej analizy wariancji nie stwierdzono istotnej zmiany zawartości cynku. Największą zawartość kadmu, zarówno form ogólnych, jak i rozpuszczalnych, stwierdzono w kontroli (tab. 7 i 8). Zawartość kadmu w obiekcie I i II była mniejsza od zawartości tego pierwiastka w obiekcie III. Wraz ze zwiększeniem dawki wełny mineralnej wzrastała ogólna zawartość ołowiu (tab. 7). W obiekcie I wynosiła 87,03 mg kg 1, z kolei w obiekcie III 95,17 mg kg 1. Zawartość ołowiu w obiekcie III była niższa niż w kontroli. Zawartość rozpuszczalnego ołowiu w obiekcie I, II i III była nieco niższa od zawartości w kontroli. Podobnie jak w przypadku kadmu analiza wariancji nie wykazała istotnej zmiany w zawartości form rozpuszczalnych tego pierwiastka (tab. 8). Najwyższa dawka wełny mineralnej wpłynęła na wzrost ogólnej zawartość niklu w badanej glebie (tab. 7). W obiekcie I i II nie stwierdzono istotnych zmian. Ponadto zawartość niklu w obiekcie I była najniższa. W miarę zwiększania dawki wełny mineralnej zawartość rozpuszczalnego niklu uległa zwiększeniu, ale wzrost ten nie był istotny statystycznie (tab. 8). Podobne wyniki uzyskano w odniesieniu do miedzi (tab. 7 i 8). Zawartość manganu ogólnego w glebie z dodatkiem wszystkich dawek wełny mineralnej była mniejsza w porównaniu do kontroli (tab. 7). Im większa dawka wełny mineralnej, tym zawartość manganu rozpuszczalnego zwiększała się (tab. 8). Zbliżone zawartości tego pierwiastka zawierała kontrola oraz gleba z obiektu I. Największą różnice obserwowano pomiędzy kontrolną glebą a obiektem III (143,27 mg kg 1 ). Zwiększenie dawki wełny mineralnej powodowało istotny statystycznie wzrost zarówno ogólnej zawartości chromu (tab. 7), jak i chromu rozpuszczalnego (tab. 8). Największe różnice występują pomiędzy kontrolą a obiektem III. W miarę wzrostu dawki wełny mineralnej do gleby, zawartość niektórych badanych metali ciężkich zwiększała się. Podobne wyniki uzyskał Baran [2008] analizując wpływ osadu ściekowego i poużytkowej wełny mineralnej zastosowanych do rekultywacji zdewastowanego terenu przez silne zakwaszenie gruntu, na zawartość metali ciężkich w rekultywacyjnej mieszance traw. Autorzy stwierdzili, że wraz ze zwiększeniem dawki odpadowej wełny mineralnej nastąpił wzrost zawartości pierwiastków takich jak ołów, chrom oraz nikiel. Kolejne badania prowadzone przez Barana i innych [2009] wykazały, że rosnące dawki wełny mineralnej odpadowej powodowały podwyższenie ilości ołowiu i niklu w glebie, co znalazło potwierdzenie w badaniach prowadzonych w tym artykule. nr 587, 2016

70 70 I. Paśmionka Według wytycznych do oceny stopnia zanieczyszczenia gleb metalami ciężkimi Instytutu Uprawy Nawożenia i Gleboznawstwa ustalono, iż badana gleba ciężka zaliczana jest do I stopnia zanieczyszczenia gleb ołowiem. Najmniejsza dawka wełny mineralnej wpłynęła korzystnie, obniżając zawartość tego metalu ciężkiego. Kolejne większe dawki powodowały wzrost zawartości ołowiu w glebie, co nie rokuje pozytywnie, że problem wykorzystania poużytkowej wełny mineralnej na gleby zdegradowane będzie rozwiązany. WNIOSKI 1. Dodatek wełny mineralnej do gleby spowodował wzrost ph KCl, zmniejszył kwasowość hydrolityczną gleby oraz zwiększył udział kationów zasadowych w kompleksie sorpcyjnym. 2. Dawki wełny mineralnej powodowały zmiany zawartości kationów wymiennych w glebie. Porównując glebę kontrolną i glebę z największą dawką wełny mineralnej, można wnioskować, iż zwiększyła się zawartość kationów wymiennych (Na, Mg, K, Ca), co jest dowodem na poprawę jakości gleby spowodowaną dodatkiem wełny mineralnej. 3. Nie stwierdzono istotnego wpływu dodatku wełny mineralnej na zawartość materii organicznej i azotu ogólnego. 4. Zawartość przyswajalnych form potasu, magnezu oraz fosforu ulegała stopniowemu zwiększeniu wraz z kolejnymi dawkami wełny mineralnej. 5. Dodatek poużytkowej wełny mineralnej powodował wzrost zawartości makroelementów (Ca, K, Mg, Na, P). 6. Różnice w zawartości ogólnych i rozpuszczalnych form pierwiastków śladowych pod wpływem zwiększania dawki wełny mineralnej w większości przypadków były statystycznie nieistotne. Z kolei należy zwrócić uwagę na istotny statystycznie wzrost zawartości ołowiu, chromu i kadmu. LITERATURA Alexander T., Parker D., The best of the Growing Edge, Indoor and Outdoor gardening for today s grower. New Moon Publishing, Corvallis. Baran S., Ability to use of mineral wool in postmining reclamation. Development in Production and Use of New Agrochemicals. Chemistry for Agriculture, Chech-Pol Trade, Prague Brussels 7, Baran S., Możliwości wykorzystania wełny mineralnej Grodan do kształtowania właściwości wodnych gleb i gruntów. Zesz. Probl. Post. Nauk Roln. 533, Baran S., Wójcikowska-Kapusta A., Żukowska G., Bik M., Właściwości sorpcyjne utworu bezglebowego rekultywowanego osadem ściekowym i wełną mineralną. Zesz. Probl. Post. Nauk Roln. 533, Baran S., Pranagal J., Bik M., Możliwości wykorzystania wełny mineralnej Grodan i osadu ściekowego do kształtowania właściwości wodnych w glebach zdewastowanych w procesie wydobycia siarki metodą Frasha. Gospodarka Surowcami Mineralnymi Mineral Resources Management 24, 2/3, Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

71 Wpływ poużytkowej wełny mineralnej na wybrane właściwości fizyczno-chemiczne gleby 71 Gilewska M., Przydatność uprawy z wełny kamiennej do rekultywacji gruntów poeksploatacyjnych. Zesz. Probl. Post. Nauk Roln. 506, Jaroszczuk-Sierocińska M., Właściwości wodno-powietrzne wełny mineralnej Grodan Master. Acta Agrophysica 10 (1), Komosa A., Wszystko co jest w roślinie, pierwej znajdowało się w ziemi lub powietrzu. Ziemia Roślina Człowiek. Ogólnopolska Ogrodnicza Konferencja Naukowa, Kraków, Mercik S., Chemia rolna. Podstawy teoretyczne i praktyczne. Wyd. SGGW, Warszawa. Nurzyński J., Plonowanie i skład chemiczny pomidora uprawianego w szklarni w podłożach ekologicznych. Acta Agrophysica. 7 (3), Pawlińska A., Komosa A., Wpływ podłoży i pożywek na plonowanie pomidora szklarniowego. Rocz. AR Pozn. 361, Ogrodn. 37, Sirok B., Blagojević B., Bullen P., 2008, Mineral woll. Production and properties. Woodhead Publishing, Cambridge, THE EFFECT OF MINERAL WOOL WASTE ON SELECTED PHYSICO-CHEMICAL PROPERTIES OF THE SOIL Summary. The aim of the study was to determine the effect of postconsumer mineral wool on selected physico-chemical properties of the soil, changing the contents of macronutrients and trace elements. The field experiment was established with randomized blocks in April 2012 in the Municipal Industrial Wastewater Treatment Plant in Oświęcim, at the landfill. The size of each plot was 2 5 m (10 m 2 ). Each plot was surrounded by protective strips amounting to 1 m. The study used mineral wool derived from the 2-year growing tomatoes. The experimental scheme included control object and the three objects with a dose of mineral wool of 200, 400 and 800 m 3 ha 1. After three years of experience made the following determination: the content of soluble forms of Fe, Zn, Cd, Pb, Ni, Cu, Mn, Cr extracted 1mol HCl per 1 dm 3 (method of Rinkis), the content of available forms of phosphorus, potassium (method of Enger Riehm) and magnesium (method of Schachtschabel in 0,0125 mol CaCl 2 per 1 dm 3 ), the content of total elements form, in a mixture of concentrated acids HNO 3 and HClO 3 (2 : 1), ph potentiometrically, hydrolytic acidity (method of Kappen), the sum of exchangeable bases, sorption capacity, exchangeable cations, the contents of total nitrogen by Kjeldahl method and organic matter by Tiurin method. The study showed that the addition of postconsumer mineral wool into the soil caused an increase in ph KCl, decreased in hydrolytic acidity of soil and increased in the share of alkaline cations in the sorption complex. Mineral wool caused changes in the content of exchangeable cations in the soil. The addition of mineral wool caused an increase in the content of exchangeable cations (Na, Mg, K, Ca). There was no significant effect of the addition of mineral wool on content of organic matter and total nitrogen. The content of available forms of potassium, magnesium and phosphorus underwent gradual increase with successive doses of mineral wool. Addition of postconsumer mineral wool caused an increase in the content of macronutrients (Ca, K, Mg, Na, P). The content of total and soluble forms of trace elements under the effect of increasing doses of mineral wool, in most cases slightly increased. The addition of postconsumer mineral wool into the soil contributed to a slight increase in the content of heavy metals such as lead, chromium and cadmium. Key words: mineral wool, heavy metal, macronutrients nr 587, 2016

72

73 Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych nr 587, 2016, ANALIZA PORÓWNAWCZA MIKROBIOTA RYZOSFERY VACCINIUM CORYMBOSUM L. UPRAWIANEJ AMATORSKO I KOMERCYJNIE NA TERENIE MAŁOPOLSKI Maria J. Chmiel, Magdalena Korta-Pepłowska, Karol Bulski, Rafał Szyrszeń Uniwersytet Rolniczy im. Hugona Kołłątaja w Krakowie Streszczenie. Borówka wysoka (Vaccinium corymbosum L.), znana jako borówka amerykańska, obecnie jest głównym gatunkiem borówki uprawianym w Europie i na świecie. Badania miały na celu analizę liczebności i składu gatunkowego mikroorganizmów zasiedlających strefę ryzosferową borówki uprawianej w różnych warunkach. Analizy ilościowe wykonano metodą seryjnych rozcieńczeń, a przynależność systematyczną drobnoustrojów oznaczono metodą Maldi Tof. Gleby, na których uprawiana była borówka, istotnie różniły się odczynem. Liczebność bakterii kształtowała się na poziomie do 5,7 10 6, promieniowców od do 2,9 10 6, grzybów do 7, jtk g 1 s.m. gleby. Najlepszy wzrost wszystkich grup drobnoustrojów był obserwowany na podłożach o ph 6,5. Obecność Azotobacter sp. stwierdzono tylko w glebie o najwyższym ph (6.46). Zastosowane podłoża nie pozwoliły na wyizolowanie gatunków grzybów mykoryzowych typowych dla wrzosowatych. Wśród oznaczonych bakterii dominowały gatunki z rodzaju Bacillus, izolowano także przedstawicieli Pseudomonas, Pantonea, Lysinibacillus, Serratia, Citrobacter, Enterobacter, Solibacillus, Burkholderia i Azotobacter, a wśród promieniowców Streptomyces. Grzyby reprezentowane były najliczniej przez rodzaje Trichoderma i Penicillium, stwierdzono również występowanie Aspergillus, Fusarium, Rhizopus, Microsporum, Phialophora i Rhodotorula. Słowa kluczowe: Vaccinium corymbosum, mikroorganizmy, ryzosfera m.chmiel@ur.krakow.pl Copyright by Wydawnictwo SGGW

74 74 M.J. Chmiel i inni WSTĘP Borówka wysoka (Vaccinium corymbosum L.) jest w Polsce częściej znana jako borówka amerykańska, ponieważ wywodzi się ze Stanów Zjednoczonych to wieloletnia roślina z rodziny wrzosowatych (Ericaceae). Jest obecnie głównym gatunkiem borówki uprawianym w Europie i na świecie. Roślina ta ma wysokie wymagania glebowe i wodne, dlatego w okresach letnich wymaga intensywnego nawadniania, a pod uprawę należy zastosować kwaśne podłoże (ph 3,5 4,5), którego odczyn musi być stale monitorowany, gdyż na liściach mogą wystąpić chlorozy i zahamowanie wzrostu, co stanowi częsty problem w uprawach amatorskich [Lindsay 1984, Egilla 1994]. Z danych literaturowych wynika, że potwierdzono związki mykoryzowe u 92% rodzin botanicznych i u 80% poznanych gatunków roślin, co potwierdza ogromną rolę grzybów w wspomaganiu wzrostu roślin [Thangadurai i in. 2010]. W korzystnych warunkach glebowych korzenie borówki zasiedlane są głównie przez grzyby z gromady Ascomycota, z którymi nawiązują wysoce wyspecjalizowaną mykoryzę ericoidalną (ERM). Wśród grzybów mykoryzowych roślin wrzosowatych najczęściej wymieniane są rodzaje Hymenoscyphus, Oidiodendron, Scytalidium, Myxotrichum, Clavaria, ale zawiązywana jest również mykoryza z grzybami endomykoryzowymi, chociażby z rodzajów Gigaspora i Glomus [Scagel i in. 2005, Eccher et al. 2006, Smith i Read 2008, Arriagada i in. 2012]. Ze względu na specyficzną budowę korzeni roślin z rodziny wrzosowatych związki te są nadzwyczaj pożądane. Najwięcej drobnoustrojów znajduje się w wierzchniej warstwie gleby, do głębokości 30 cm, zwłaszcza w strefie przykorzeniowej roślin. Masa drobnoustrojów w 15-centymetrowej warstwie żyznych gleb może osiągać od kilku do kilkunastu megagramów (Mg) [Araújo i in. 2008, Braun i in. 2010, Marinari i in. 2010]. Aby przyspieszyć rozwój i wzmocnić rośliny warto zastosować szczepionki zawierające wyselekcjonowe szczepy grzybów wchodzących w mykoryzę, bowiem ich rolą jest enzymatyczny rozkład materii organicznej, dzięki czemu roślina otrzymuje łatwo przyswajalne mineralne formy składników pokarmowych. Należy jednak mieć na uwadze fakt, że istotny wpływ na wzrost i plonowanie roślin mają wszystkie mikroorganizmy zasiedlające środowisko glebowe, a szczególnie te bytujące w ryzosferze, i to właśnie populacja drobnoustrojów saprofitycznych może decydować o sukcesie uprawy oraz wielkości i jakości plonów. Mając na uwadze brak dostępnych informacji dotyczących liczebności i składu gatunkowego populacji drobnoustrojów saprofitycznych zasiedlających ryzosferę Vaccinium corymbosum L., autor artykułu miał na celu dokonanie analizy porównawczej mikrobiota strefy przykorzeniowej borówki amerykańskiej uprawianej komercyjnie i amatorsko na terenie południowej Polski. MATERIAŁY I METODY Próbki gleby pobrano ze strefy ryzosferowej z głębokości 5 20 cm [PN-ISO :2007, PN-ISO :2007] po zakończeniu okresu wegetacyjnego (listopad 2015 r.), jednak przed wystąpieniem przymrozków. Materiał badawczy pochodził z siedmiu stanowisk na terenie województwa małopolskiego: Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

75 Analiza porównawcza mikrobiota ryzosfery Vaccinium corymbosum L stanowiska 1 i 2 Mateczniki Szkółki Roślin Użytkowych, stanowisko 3 Stacja doświadczalna, stanowiska 4, 5, 6 i 7 Działki prywatne. Próbki poddano mikrobiologicznej analizie ilościowej metodą seryjnych rozcieńczeń [Pepper i Gerba 2005]. W ramach badań oznaczano liczebność drobnoustrojów saprofitycznych (bakterie, grzyby, promieniowce) i wskaźnikowych diazotrofów z rodzaju Azotobacter, stosując podłoża ogólne i selektywne [dla bakterii TSA (Biocorp), dla grzybów MEA (BTL), dla promieniowców podłoże wg PN-89/Z-04111/02, dla Azotobacter sp. podłoże wg Ashby za Kizilkaya 2009]. Analizy wykonano w trzech powtórzeniach przy zastosowaniu podłóż hodowlanych o zróżnicowanym odczynie (ph 4,5; 5,5; 6,5). Wyniki przeliczono i wyrażono jako liczbę jtk na 1 gram suchej masy gleby [PN-ISO 11465:1999]. Odczyn gleby oznaczono metodą potencjometryczną w KCl i wodzie [PN-ISO 10390:1997]. W ramach mikrobiologicznej analizy jakościowej oznaczono przynależność systematyczną dominujących szczepów drobnoustrojów wybranych i wyizolowanych w czystych kulturach na podstawie cech makroskopowych. Oznaczenia wykonano metodą spektrometrii masowej Maldi Tof [Wieser i in. 2012, Dingle i Butler-Wu 2013]. Wykonana analiza statystyczna polegała na obliczeniu wartości średnich, odchylenia standardowego oraz korelacji wg rang Spearmana. Do analizy danych wykorzystano program Statistica 12 (StatSoft, Inc., Tulsa, OK, USA). WYNIKI BADAŃ I DYSKUSJA Dokonując oceny gleby, należy brać pod uwagę bardzo wiele czynników fizycznych, chemicznych, biologicznych i ekologicznych, a i tak ze względu na złożoność tego środowiska analiza może nie być kompletna [Chmiel 2013]. Zdrową, urodzajną i o wysokiej jakości kultury glebę charakteryzuje duża aktywność biologiczna i enzymatyczna, toteż w badaniach środowiskowych są to parametry najczęściej sprawdzane w pierwszej kolejności. Badając populacje drobnoustrojów glebowych, należy zwracać uwagę nie tylko na ich liczebność i skład gatunkowy, ale przede wszystkim na funkcje, jakie pełnią w środowisku, ich rolę w ekosystemie i wpływ na inne współwystępujące organizmy [Badura 2006, Błaszczyk 2010]. Zawartość składników pokarmowych, odczyn oraz wilgotność gleby są czynnikami istotnie wpływającymi nie tylko na plonowanie roślin, ale przede wszystkim na aktywność biologiczną gleby i funkcjonowanie populacji mikroorganizmów glebowych [Borowik i in. 2011]. Przebadane próbki glebowe znacznie różniły się wilgotnością i odczynem (tab. 1). Badana gleba nie zawsze spełniała wymagania, jakie stawia uprawa borówki wysokiej ph na trzech stanowiskach było za wysokie i znacząco odbiegało od zalecanego w uprawie Vaccinium corymbosum L., które powinno mieścić się w zakresie 3,5 4,5. Chociaż rośliny na żadnym z badanych stanowisk nie wykazywały objawów chorobowych i ich plonowanie nie wzbudzało zastrzeżeń, to z całą pewnością należy zadbać o właściwy odczyn gleby w kolejnych latach. Chociaż wilgotność i odczyn badanych gleb były zróżnicowane, to nie potwierdzono statystycznie istotnego (analiza korelacji wg rang Spearmana) wpływu tych czynników na liczebność drobnoustrojów saprofitycznych w analizowanych próbkach. nr 587, 2016

76 76 M.J. Chmiel i inni Tabela 1. Odczyn i sucha masa badanych próbek gleby Table 1. The ph and dry mass of the tested soil samples Punkt pobrania Sampling point Sucha masa (SD) [%] Dry mass (SD) [%] ph w H 2 O ph in H 2 O ph w KCl ph in KCl 1 Matecznik Szkółki 1 78,83 (0,20) 4,10 3,55 2 Matecznik Szkółki 2 95,41 (0,11) 4,19 3,70 3 Stacja doświadczalna 46,62 (0,08) 6,40 5,80 4 Działka prywatna 1 68,91 (0,06) 5,76 5,13 5 Działka prywatna 2 62,44 (0,51) 4,63 3,90 6 Działka prywatna 3 51,05 (0,18) 4,73 4,16 7 Działka prywatna 4 55,79 (0,19) 6,46 5,89 SD odchylenie standardowe standard deviation. W zależności od sposobu użytkowania, typu gleby, a nawet pory roku w jednym gramie gleby można znaleźć od 10 6 do jtk hodowalnych bakterii, 10 5 do 10 7 jtk promieniowców, 10 4 do 10 7 jtk grzybów [Uhlı řová i Šantrůčková 2003, Gajda i in. 2004, Barabasz i in. 2005, Chmiel 2013]. Mając na uwadze powyższe informacje, należy stwierdzić, że oznaczone liczebności drobnoustrojów w badanych próbkach (rys.) można zaliczyć do średnich, jednak najliczniejszy wzrost wszystkich grup mikroorganizmów odnotowano na podłożach o odczynie najbardziej zbliżonych do obojętnego nawet w przypadkach, gdy izolowano je ze środowisk kwaśnych, jak gleba na stanowiskach 1, 2 czy 5 (tab. 2). Liczebność [jtk g 1 s.m. gleby] Number [CFU g 1 soil d.m.] 7,0E+06 6,0E+06 5,0E+06 4,0E+06 3,0E+06 2,0E+06 1,0E+06 0,0E+00-1,0E+06 Bakterie Bacteria Grzyby Fungi Promieniowce Actinomycetes Punkt pobrania Sampling point Rys. Fig. Porównanie średniej liczebności drobnoustrojów występujących w ryzosferze Vaccinium corymbosum L. w zależności od miejsca pobrania próbek The comparision of the mean number of microorganisms in the rhizosphere of Vaccinium corymbosum L. depending on sampling point location Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

77 Analiza porównawcza mikrobiota ryzosfery Vaccinium corymbosum L Tabela 2. Oznaczona liczebność badanych grup drobnoustrojów w glebie w zależności od pochodzenia próbki i odczynu zastosowanego podłoża hodowlanego Table 2. The determined number of studied groups of microorganisms in the soil, depending on the samples origin and ph of culture media Punkt pobrania Sampling point Ogólna liczba bakterii (SD) [jtk g 1 s.m. gleby] The total number of bacteria (SD) [cfu g 1 d.m. of soil] Podłoże o ph 4,5 Media ph 4.5 Podłoże o ph 5,5 Media ph 5.5 Podłoże o ph 6,5 Media ph Matecznik Szkółki 1 7, ( ) 2, (1, ) 2, (2, ) 2 Matecznik Szkółki 2 1, (2, ) 3, (8, ) 5, (2, ) 3 Stacja doświadczalna 1, (1, ) 3, (6, ) 5, (3, ) 4 Działka prywatna 1 1, (3, ) 2, (4, ) 4, (1, ) 5 Działka prywatna 2 1, (4, ) 3, (1, ) 5, (4, ) 6 Działka prywatna 3 1, (3, ) 1, (2, ) 2, (3, ) 7 Działka prywatna 4 1, (1, ) 3, (1, ) 5, (4, ) Ogólna liczba grzybów (SD) [jtk g 1 s.m. gleby] The total number of fungi (SD) [cfu g 1 d.m. of soil] 1 Matecznik Szkółki 1 4, (1, ) 3, (1, ) 4, (1, ) 2 Matecznik Szkółki 2 7, (5, ) 1, (4, ) 7, (2, ) 3 Stacja doświadczalna 2, (8, ) 2, (7, ) 2, (4, ) 4 Działka prywatna 1 8, (1, ) 1, (5, ) 9, (3, ) 5 Działka prywatna 2 1, (7, ) 1, (9, ) 1, (6, ) 6 Działka prywatna 3 2, (5, ) 2, (2, ) 2, (5, ) 7 Działka prywatna 4 1, (4, ) 8, (2, ) 4, (7, ) Ogólna liczba promieniowców [jtk g 1 s.m. gleby] The total number of actinomycetes (SD) [cfu g 1 d.m. of soil] 1 Matecznik Szkółki 1 4, (1, ) 5, (1, ) 6, (1, ) 2 Matecznik Szkółki 2 3, (4, ) 1, (6, ) 1, (5, ) 3 Stacja doświadczalna 4, (1, ) 1, (2, ) 2, (5, ) 4 Działka prywatna 1 1, (5, ) 3, (2, ) 4, (7, ) 5 Działka prywatna 2 2, (7, ) 4, (1, ) 1, (2, ) 6 Działka prywatna 3 1, (4, ) 1, (4, ) 2, (5, ) 7 Działka prywatna 4 2, (5, ) 2, (5, ) 2, (2, ) SD odchylenie standardowe standard deviation. Obecność bakterii z rodzaju Azotobacter stwierdzono jedynie w glebie stanowiska 7 (działka prywatna), wyizolowano je na podłożach o odczynie 5,5 oraz 6,5 w ilości odpowiednio 20 i 40 jtk g 1 s.m. gleby. Zrozumienie podstaw funkcjonowania ekosystemów glebowych wymaga znajomości różnorodności, dystrybucji, wzajemnych relacji, dynamiki zmian i funkcji drobnoustrojów glebowych więc ocena zmian bioróżnorodności przy użyciu prostych i łatwo dostępnych metod praktycznie nie jest możliwa [Pankhurst 1997, Torsvik i in. 1997, Filip 2002]. Ekologiczna metoda oceny jakości gleby może więc obejmować, oprócz analiz liczebności całych populacji drobnoustrojów, badanie poszczególnych grup organizmów nr 587, 2016

78 78 M.J. Chmiel i inni uznanych za istotny element bioróżnorodności ekosystemu glebowego lub ważny czynnik w przebiegu procesów w glebie [Filip 2002]. Dobrym wskaźnikiem do oceny żyzności gleby jest zdolny do wiązania azotu atmosferycznego rodzaj Azotobacter, którego obecność może oznaczać glebę o dobrej kulturze i wysokiej aktywności biologicznej [Moreno i in. 1986, Kizilkaya 2009]. W Europie Azotobacter jest izolowany z około 50 60% gleb uprawnych, a najczęściej izolowanym gatunkiem jest Azotobacter chroococcum [Martyniuk i Martyniuk 2003, Aquilanti i in. 2004, Lenart 2012]. Liczebność tych bakterii w glebach Polski waha się w szerokim zakresie od kilku do kilkuset, sporadycznie do kilku tysięcy komórek w jednym gramie gleby [Martyniuk i Martyniuk 2003, Lenart 2012]. Niniejsze badania wykazały obecność Azotobacter jedynie w glebie pochodzącej ze stanowiska 7 o najwyższym ph (6,46), co potwierdza informacje, że bakterie te najlepiej rozwijają się w środowisku o odczynie zbliżonym do obojętnego. Oznaczone drobnoustroje (tab. 3) zaliczono do kilkunastu rodzajów, których przedstawiciele zwykle typowo i powszechnie występują w środowisku glebowym, jednak zastosowana metoda badawcza nie umożliwiła wyizolowania gatunków grzybów Tabela 3. Dominujące gatunki/rodzaje drobnoustrojów Table 3. Predominant species/genera of microorganisms Punkt pobrania Sampling point 1 Matecznik Szkółki 1 2 Matecznik Szkółki 2 3 Stacja doświadczalna 4 Działka prywatna 1 5 Działka prywatna 2 6 Działka prywatna 3 7 Działka prywatna 4 Bakterie i promieniowce Bacteria and actinomycetes Bacillus cereus, B. megaterium, B. subtilis, Pantoea agglomerans, Pseudomonas sp., Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces sp. Bacillus cereus, B. megaterium, B. mycoides, Lysinibacillus fusiformis, Serratia proteamaculans, Streptomyces chartreusis, S. violaceoruber, Streptomyces sp. Bacillus cereus, B. megaterium, Citrobacter braakii, Enterobacter cloacae, Pseudomonas sp., Streptomyces phaeochromogenes, S. violaceorube, Streptomyces sp. Bacillus cereus, B. pseudomycoides, B. thuringiensis, Enterobacter cloacae, Streptomyces sp. Bacillus cereus, B. megaterium, B. pseudomycoides, B. subtilis, B. thuringiensis, Lysinibacillus fusiformis, Pantoea agglomerans, Solibacillus silvestris, Streptomyces sp. Bacillus licheniformis, B. pumilus, B. thuringiensis, Pseudomonas sp., Burkholderia fungorum, Streptomyces sp. Azotobacter chroococcum, Bacillus megaterium, B. pseudomycoides, B. subtilis, B. thuringiensis, Pantonea agglomerans, Pseudomonas sp., Solibacillus silvestris, Streptomyces lavendulae, Streptomyces sp. Grzyby Fungi Penicillium daleae Microsporum equinum, Penicillium glabrum Aspergillus fumigatus, Fusarium sporotrichioides, Penicillium daleae, P. funiculosum, Rhizopus stolonifer Aspergillus fumigatus, A. niger, Phialophora bubakii, Penicillium funiculosum, Trichoderma koningii Microsporum equinum, Penicillium funiculosum Trichoderma koningii, T. longibrachiatum Aspergillus fumigatus, Penicillium daleae, P. glabrum, Rhizopus stolonifer, Rhodotorula mucilaginosa, Trichoderma longibrachiatum Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

79 Analiza porównawcza mikrobiota ryzosfery Vaccinium corymbosum L mykoryzowych wymienianych wśród najczęściej zasiedlających korzenie Vaccinium corymbosum L., takich jak: Hymenoscyphus ericae, Scytalidium vaccinii, Oidiodendron griseum, Myxotrichum setosum, Clavaria sp. czy też Gigaspora rosea, Glomus claroideum, G. deserticola, G.viscosum, G. intraradices i G. constrictum [Scagel i in. 2005, Eccher i in. 2006, Smith i Read 2008, Arriagada i in. 2012]. WNIOSKI 1. Gleby, na których uprawiana była borówka, różniły się odczynem i wilgotnością, jednak nie potwierdzono istotnego statystycznie wpływu tych czynników na liczebność drobnoustrojów glebowych. 2. Podłoża laboratoryjne o odczynie zbliżonym do obojętnego pozwoliły na wyizolowanie największej liczby mikroorganizmów. 3. Ogólna liczebność drobnoustrojów w badanych glebach kształtowała się na średnim poziomie liczebności mikroorganizmów oznaczanych w glebach uprawnych. 4. Wśród oznaczonych mikroorganizmów dominowały gatunki typowe dla środowiska glebowego. Najczęściej izolowano bakterie z rodzaju Bacillus, a także przedstawicieli Pseudomonas, Pantonea, Lysinibacillus, Serratia, Citrobacter, Enterobacter, Solibacillus, Burkholderia i Azotobacter i promieniowce z rodzaju Streptomyces. Grzyby najliczniej były reprezentowane przez rodzaje Trichoderma i Penicillium, stwierdzono również występowanie Aspergillus, Fusarium, Rhizopus, Microsporum, Phialophora i Rhodotorula. LITERATURA Aquilanti L., Favilli F., Clementi F., Comparison of different strategies for isolation and preliminary identification of Azotobacter from soil samples. Soil. Biol. Biochem. 36, Araújo A.S.F., Santos V.B., Monteiro R.T.R., Responses of soil microbial biomass and activity for practices of organic and conventional farming systems in Piauí state, Brazil. Eur. J. Soil. Biol. 44, Arriagada C., Manquel D., Cornejo P., Soto J., Sampedro I., Ocampo J., Effects of the co-inoculation with saprobe and mycorrhizal fungi on Vaccinium corymbosum growth and some soil enzymatic activities. J. Soil Sci. Plant Nutr. 12 (2), Badura L., Rozważania nad rolą mikroorganizmów w glebach. Zesz. Nauk. UP we Wrocławiu, Rolnictwo 89, 456, Barabasz W., Chmiel M., Dzieniewicz M., Sechman H., Microbiological characteristic and gaseous hydrocarbons, carbon dioxide and hydrogen distribution in the near-surface zone of Starunia area, fore-carpathian region, Ukraine. Polish and Ukrainian geological studies ( ). Starunia the area of discoveries of Woolly Rhinoceroses. Red. M.J. Kotarba. Państwowy Instytut Geologiczny. Warszawa Kraków, Błaszczyk M.K., Mikrobiologia środowisk. PWN, Warszawa. Borowik A., Wyszkowska J., Kucharski M., Różnorodność drobnoustrojów funkcją uwilgotnienia gleb. Zesz. Probl. Postępów Nauk Roln. 567, nr 587, 2016

80 80 M.J. Chmiel i inni Braun B., Bockelmann U., Grohman E., Szewzyk U., Bacterial soil communities affected by water-repellency. Geoderma 158, 3 4, Chmiel M., Charakterystyka mikrobiologiczna i ocena sanitarna środowiska naturalnego Ojcowskiego Parku Narodowego ze szczególnym uwzględnieniem antropopresji. Zesz. Nauk. UR w Krakowie 505, 382, 200. Dingle T.C., Butler-Wu S.M., Maldi-tof mass spectrometry for microorganism identification. Clin. Lab. Med. 33 (3): doi: /j.cll Eccher T., Noé N. and Bacchetta M., The influence of ericoid endomycorrhizae and mineral nutrition on the growth of micropropagated plants of Vaccinium corymbosum L. Acta Hortic. 715, doi: /ActaHortic Egilla J.N., Byrne D.H., and. Reed D.W., Iron stress response of three peach rootstock cultivars: Ferric-iron reduction capacity. J. Plant Nutr. 17, Filip Z., International approach to assessing soil quality by ecologically-related biological parameters. Agr. Ecosyt. Environ. 88, 2, Gajda A., Stachyra A., Martyniuk S., 2004 Aktywność mikrobiologiczna i biochemiczna różnych gleb w doświadczeniu mikropoletkowym. Acta Agr. et Silv., Ser. Agraria 42, Kizilkaya R., Nitrogen fixation capacity of Azotobacter spp. strains isolated from soils in different ecosystems and relationship between them and the microbiological properties of soils. J. Environ. Biol. 30, 1, Lenart A., Occurrence, characteristics, and genetic diversity of Azotobacter chroococcum in various soils of southern Poland. Pol. J. Environ. Stud. 21, 2, Lindsay W.L., Soil and plant relationships associated with iron deficiency with emphasis on nutrient interactions. J. Plant Nutr. 7, Marinari S., Liburdi K., Corradini D., Grego S., Reversed-phase high performance liquid chromatographic profile of organic fractions extracted by solvents with different polarity as a tool to evaluate the hydrophobic character of soil under different management. Soil Tillage Res., 109, Martyniuk S., Martyniuk M., Occurrence of Azotobacter spp. in some Polish soils. Pol. J. Environ. Stud. 12, Moreno J., Gonzalez-Lopez J., Vela G.R., Survival of Azotobacter spp. in Dry Soils. Appl. Environ. Microbiol. 51, 1, Pankhurst C.E., Biodiversity of soil organisms as an indicator of soil health. Biological Indicators of Soil Health. Red. C. Pankhurst. CAB International, Wallingford, Pepper I.L., Gerba C.G., Environmental Microbiology. A laboratory manual. 2nd edition. Elsevier AP, Amsterdam. PN-ISO 10390:1997. Jakość gleby Oznaczanie ph. PN-ISO 11465:1999. Jakość gleby Oznaczanie zawartości suchej masy gleby i wody w glebie w przeliczeniu na suchą masę gleby. Metoda wagowa. PN-89/Z-04111/02. Ochrona czystości powietrza Badania mikrobiologiczne. Oznaczanie liczby bakterii w powietrzu atmosferycznym (imisja) przy pobieraniu próbek metodą aspiracyjną i sedymentacyjną. PN-ISO :2007. Jakość gleby Pobieranie próbek. Część 2: Zasady dotyczące technik pobierania. PN-ISO :2007. Jakość gleby Pobieranie próbek. Część 4: Zasady dotyczące postępowania podczas badań terenów naturalnych, zbliżonych do naturalnych oraz uprawnych. Scagel C.F., Wagner A., Winiarski P., Inoculation with Ericoid Mycorrhizal Fungi Alters Root Colonization and Growth in Nursery Production of Blueberry Plants from Tissue Culture and Cuttings. Small Fruits Review 4, Smith S.E., Read D.J., Mycorrhizal symbiosis. Third Edition. Academic Press. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

81 Analiza porównawcza mikrobiota ryzosfery Vaccinium corymbosum L Thangadurai D., Busso C.A., Hijri M., Mycorrhizal Biotechnology. CRC Press, Enfield, New Hampshire.. Torsvik V.L., Daae F.L., Goksoyr J., Sorheim R., Overas L., Diversity of bacteria in soil and marine environments. W: Progress in microbial ecology. Red. M.T. Martins. SBM Brazil. Soc. Microbiol./ICOME, Sao Paulo, Uhlı řová E., Šantrůčková H., Growth rate of bacteria is affected by soil texture and extraction procedure. Soil Biol. Biochem. 35, 2, Wieser A., Schneider L., Jung J., Schubert S., MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics identification of microorganisms and beyond (mini review). Appl. Microbiol. Biot. 93, 3, , doi: /s COMPERATIVE ANALYSIS OF THE RHIZOSPHERE MICROBIOTA OF VACCINIUM CORYMBOSUM L. GROWN AMATEUR AND COMMERCIALLY IN LESSER POLAND REGION Summary. Highbush blueberry (Vaccinium corymbosum L.), known as the American blueberry, is now the main species of blueberries grown in Europe and the world. This plant has high requirements of soil and water, so during the summer months requires intensive irrigation and use of acidic substrate to the cultivation, because the normal development of plants can be carried out only in the presence of mycorrhizal fungi like Hymenoscyphus, Oidiodendron, Scytalidium, Myxotrichum, Clavaria and Gigaspora or Glomus. To accelerate the development and enhance of the plants is also worth to applied the vaccine containing selected strains of fungi forming mycorrhiza with plants, because their role is an enzymatic decomposition of organic matter, so that the plant receives easily digestible form of mineral nutrients. But very important is also the fact that a significant impact on the growth and yield of crops have all the microorganisms inhabiting the soil environment, especially those that live in the rhizosphere, and the population of saprophytic microbes may determine the success of the harvest and the size and quality of crops. The study aimed to analyze the abundance and species composition of microorganisms inhabiting the rhizosphere of blueberries grown in different conditions. Quantitative analysis was performed by serial dilution method on substrates of different ph value (4.5; 5.5 and 6.5), was determined the total count of bacteria, fungi, actinomycetes and indicator microorganisms of the genus Azotobacter. Taxonomy of microorganisms was determined by mass spectrometry method Maldi Tof. Soils on which was cultivated blueberry differed significantly in site reaction. The number of bacteria was at a level of to , actinomycetes from to , fungi to cfu g 1 soil dry mass. The best growth of all microbial groups was observed in microbiological media having a ph of 6.5. The presence of Azotobacter sp. was found only in soil with a high ph (6.46). Among the identified bacteria dominated species of the genus Bacillus, also isolated were representatives of Pseudomonas, Pantonea, Lysinibacillus, Serratia, Citrobacter, Enterobacter, Solibacillus, Burkholderia and Azotobacter and among the actinomycetes Streptomyces. Fungi most frequently were represented by genus Trichoderma and Penicillium, the presence of Aspergillus, Fusarium, Rhizopus, Microsporum, Phialophora and Rhodotorula genus was also indicated. The species of mycorrhizal fungi, typical for ericaceous, were not isolated from tested soil samples. Key words: Vaccinium corymbosum, microorganisms, rhizosphere nr 587, 2016

82

83 Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych nr 587, 2016, MICROBIOLOGICAL AIR RATING IN A VARIETY OF OBJECTS DURING TREATMENT OF THE POST-SLAUGHTER POULTRY WASTES PART III. MOULDS AND YEASTS Sanaa Mahdi Oraibi, Krystyna Cybulska West Pomeranian University of Technology in Szczecin Summary. Contamination with bioaerosols most affects the livestock production, and especially the poultry. Prolonged or repeated exposure to high concentrations of airborne fungal spores is considered a major risk factor for human health and contributes to the deterioration of lung functions, and particularly allergic diseases. The aim of the study was to determine the number and quality of moulds and yeasts in the air of various objects for poultry post-slaughter waste processing. The study allowed to detect the presence of moulds and yeasts in the air of all sampling points. There were: Aspergillus sp., Penicillium sp., Scopulariopsis sp., Trichoderma sp., Acremonium sp., Cephalosporium sp., Alternaria sp., Pithomyces sp., Eurotium sp., and: Rhodotorula sp., Candida sp., Yarrovia sp. and Saccharomyces sp. Statistical analysis confirmed the presence of highly significant influence of the sampling point, date, and interaction of these factors on the fungi population. Key words: bioaerosol moulds and yeasts, composting, poultry waste INTRODUCTION The global poultry sector is characterized by faster growth of consumption and trade than any other major agricultural sector. Structural changes in poultry production and marketing have been driven by the growing demands of urban markets [FAO 2008]. Poultry production facilities generate bioaerosols in poultry houses containing particles released mainly from settled dust, which originates from food, manure, litter, feather fragments and animal skin, as well as microorganisms (bacteria, fungi, viruses), their krystyna.cybulska@zut.edu.pl Copyright by Wydawnictwo SGGW

84 84 S. Mahdi Oraibi, K. Cybulska bioproducts and fragments [Karwowska 2005, Oppliger et al. 2008, Millner 2009, Khan and Karuppayil 2010, Just et al. 2011]. Microorganisms, such a fungi, are small enough to remain airborne once they have been dispersed into the air, and can be found as single organisms and aggregates of cells or spores [Eduard and Halstensen 2009]. The highest levels of microorganisms among various sectors dealing with animal production were found in poultry breeding [Viegas et al. 2012]. In recent years, the effects of ambient bioaerosols have drawn much attention. Among various bioaerosols, fungal spores are of major concern because of their abundant sources and ubiquitous presence in environments [Ho et al. 2005]. The airborne fungal spores (bioaerosols) are formed mainly by filamentous fungi, especially: Aspergillus, Penicillium, Cladosporium, Alternaria, Paecilomyces, Scopulariopsis and different species of yeasts including: Candida, Rhodotorula, Cryptococcus, Trichosporon and Geotrichum [Jo and Kang 2005, Lee et al. 2006, Sautour et al. 2009]. The fungi present in the poultry dust bioaerosols may be derived from soil, dust feed and litter, but to a lesser extent from the birds themselves. Fungi are ubiquitous in all environments. Atmosphere is dominated by representatives of the Cladosporium, Penicillium, Aspergillus, Alternaria genera and by yeasts and mycelia sterilia. Cladosporium is nearly always the dominant fungus in outdoor as well as indoor air. The abundance of the other fungi varies with the season and place. In relation to outdoor environments, indoor air typically display lower diversity [Araujo and Cabral 2010]. Long-term or repeated exposure to high concentrations of airborne fungal spores is recognised as contributing to the decline in lung function and allergic diseases such as asthma and allergic alveolitis known as farmer s lung disease [Crook et al. 2008, Awad et al. 2013] and classified as allergenic fungi [Gómez de Ana et al. 2006]. Exposure to airborne pathogens is a major risk factor for human health [Fernstrom and Goldblatt 2013]; the biological risk is present not only from the direct or indirect contact with animal matter (innards, feathers), but also from the exposure to bioaerosols [Sexton and Hattis 2007, Paba et al. 2014]. MATERIAL AND METHODS Study upon the composition of quantity and quality of moulds and yeasts was carried out in period from March 2015 until January 2016 in the composting facility on a selected example of poultry company in Western Poland. Analyses of bioaerosols in these facilities with the participation of numerous bacterial genera and species are presented in other works [Oraibi and Cybulska 2016a, b]. Air samples were collected at five sampling points with different characteristics (different locations): reservoirs for liquid wastes, preparation of wastes after processing for composting, storage of sediments from biological treatment plant, proper composting facility, building for pre-treatment with chemical processing. Air samples were taken at four terms under following weather conditions (Table 1). Analyzed objects such as buildings, composting facility, other devices for management Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

85 Microbiological air rating in a variety of objects during treatment and processing of waste into compost, were fenced depending on the stage of processing using concrete fence of height from 2 to 5 m. Table 1. Weather conditions during air sampling in composting facility and buildings for poultry waste management Tabela 1. Warunki pogodowe podczas poboru prób powietrza z przyzakładowej kompostowni i budynków zagospodarowania odpadów drobiarskich Date Data Temperature Temperatura [ C] Parameter Parametr Relative humidity Wilgotność względna [%] Wind speed Prędkość wiatru [m s 1 ] I II III IV The study applied sedimentation method and microorganism concentration was expressed as number of cells able to develop in 1 m 3 (cfu m 3 ) [PN-89/Z-04111/03]. Moulds and yeasts RBA medium supplemented with antibiotic (incubation at 25 C; 3 to 5 days) [Downes and Ito 2001]. Colonies of moulds and yeasts were counted and recalculated onto cfu per m 3 of air. Identification of the most common units was preceded by microscopic and genetic analysis 18S ribosomal RNA gene, partial sequence. The amplification reaction was carried out in two stages. Amplification using primers and probes differentiating the moulds onto a group of yeasts and yeast-like one. Assessment of the differences in the number of moulds and yeasts occurrence at the individual measurement points depending on dates, was compared using analysis in Statistica 12 software. RESULTS AND DISCUSSION The study allowed detected in the air of all sampling points the presence of moulds in amounts from 52 to as much as 15,728 cfu m 3, but both their occurrence frequency in different times and observed counts considerably varied (Figs 1 and 2). Air pollution due to these organisms occurred for all measurements made. Environment associated with poultry production is abundant in bio-aerosols located mainly in the dust that comes from feed, droppings, litter, feather fragments, and animal skins [Karwowska 2005, Oppliger et al. 2008, Millner 2009, Khan and Karuppayil 2010, Just et al. 2011, Viegas et al. 2012]. The analysis most often revealed the isolation of the following moulds: Aspergillus sp. Penicillium sp., Scopulariopsis sp., Trichoderma sp., Acremonium sp., Cephalosporium sp., Alternaria sp., Pithomyces sp. Eurotium sp. and referring to yeasts and yeast-like fungi: Rhodotorula sp., Candida sp., Yarrovia sp. and Saccharomyces sp. Species and genera of moulds and yeasts isolated from the air of tested objects have been confirmed also by Jo and Kang [2005], Lee et al. [2006] and Sautour et al. [2009]. nr 587, 2016

86 2000 Location 1 Lokalizacja Location 2 Lokalizacja 2 Number of microorganisms [cfu m 3 ] Liczebność mikroorganizmów [jtk m 3 ] Sampling time Terminy pomiarów Number of microorganisms [cfu m 3 ] Liczebność mikroorganizmów [jtk m 3 ] Sampling time Terminy pomiarów Number of microorganisms [cfu m 3 ] Liczebność mikroorganizmów [jtk m 3 ] Location 3 Lokalizacja Sampling time Terminy pomiarów Number of microorganisms [cfu m 3 ] Liczebność mikroorganizmów [jtk m 3 ] Location 4 Lokalizacja Sampling time Terminy pomiarów Fig. 1. Rys. 1. Number of microorganisms [cfu m 3 ] Liczebność mikroorganizmów [jtk m 3 ] Location 5 Lokalizacja Sampling time Terminy pomiarów The number of moulds in the air of studied locations in each measurement date Liczebność grzybów pleśniowych w powietrzu w badanych lokalizacjach w poszczególnych terminach pomiarowych

87 Microbiological air rating in a variety of objects during treatment Fig. 2. Rys. 2. Characteristics of observed distributions in the number of moulds in the air at the sampling points Charakterystyka stwierdzonych rozkładów liczebności grzybów pleśniowych w powietrzu w badanych punktach pomiarowych The largest mean count of moulds (4,201 cfu m 3 ) was recorded over the landfill of waste prepared for composting (location 2). In the other locations, the pollution amount oscillated about cfu m 3. Among four measurement dates, the largest quantities of moulds were found in the second date in may (1,049 cfu m 3 ). In other dates, pollution was much lower, from 52 to 629 cfu m 3. Fungi are small enough to remain in the air and they can be found in the form of individual organisms, aggregates of cells or spores [Eduard and Halstensen 2009]. In opinion of Araujo and Cabral [2010], abundance of fungi depends on the season and location. Comparing to the outer environment, inner space usually shows poorer diversity. Count of moulds in the air over the landfill of wastes prepared for composting (location 2) was characterized by very large spread, while in other locations, it was much lower. The cluster analysis indicates that among measurement points, location 5 (chemical treatment plant) is a separate group. The second one is composed of all the other locations closely related to each other, with locations 2, 3 and 4 (the landfill of waste prepared for composting, landfill for waste from the centrifuge, and composting facility) forming a group with the greatest association. The study allowed to detect the yeasts presence in the air of all the research points (Fig. 3), however, both their occurrence frequency in particular dates and observed numbers considerably varied. Air pollution with yeasts occurred in 50% of measurements. Observed number of yeasts in the air ranged from 0 to 629 cfu m 3. Statistical analysis confirmed the presence of highly significant effect of the sampling point, date, and interaction of these factors on the count of tested microorganisms. nr 587, 2016

88 88 S. Mahdi Oraibi, K. Cybulska Presence of yeasts in the air was recorded at all measurement points, but almost exclusively in the first and fourth dates. The measurement points can be lined up in an increasing sequence: landfill of waste prepared for composting (location 2 72 cfu m 3 ), landfill of waste from centrifuge and composting facility (locations 3 and cfu m 3 ), reservoir with liquid wastes (location cfu m 3 ), chemical treatment plant (location cfu m 3 ). The largest number of yeasts was found in the air on the first date (346 cfu m 3 ), slightly lower on the second (204 cfu m 3 ), traces on the third (10 cfu m 3 ), while on the fourth date, no microorganisms were detected. The number of yeasts in the air was characterized by similar dispersion, and only in the air above the chemical treatment plant (location 5) it was slightly larger. The cluster analysis indicates that among tested sampling points, location 5 (chemical treatment plant) is a separate group. The second group is composed of all the other locations closely related to each other, with locations 2 and 4 (landfill of waste prepared for composting and composting facility) forming a group with the greatest association. Fig. 3. Rys. 3. Characteristics of observed distributions in the number of yeast in the air at the sampling points Charakterystyka stwierdzonych rozkładów liczebności drożdży w powietrzu w badanych punktach pomiarowych Exposure to airborne pathogens is a major risk factor to human health [Fernstrom and Goldblatt 2013]. The biological factor is present not only in a direct but also indirect contact with the raw materials, or animal waste such as gut or even the feathers [Sexton and Hattis 2007, Paba et al. 2014]. Such threats are also confirmed by the authors of this work. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

89 Microbiological air rating in a variety of objects during treatment CONCLUSIONS Significant contamination of the air with mould fungi occurred in all observations, dates, and points of measurement of studied poultry waste processing objects. Yeasts have been found in half of measurements at all points, especially in the first and fourth dates. The range of air pollution due to moulds was from 52 up to as much as 15,728 cfu m 3 of air. The largest quantities were found in the air over the landfill of waste prepared for composting (location 2), while at other points these amounts were much lower. The pollution with yeasts amounted from 0 to 629 cfu m 3 of air. Studied locations can be lined up in terms of the increasing pollution: landfill of waste prepared for composting (2), landfill of waste from centrifuge, and composting facility (3, 4), reservoir with liquid wastes (1), chemical treatment plant (5). The greatest dispersion of measurement results of air pollution due to moulds occurred in the air above the landfill of waste prepared for composting (location 2), whereas in the case of yeast, the measurement points did not differ greatly in this respect. In terms of the nature of air contamination with moulds and yeasts, clearly distinct group is composed of the chemical treatment plant (location 5). The other measurement points form the second group, in which landfill of waste prepared for composting and composting facility (locations 2 and 4) are the closest. REFERENCES Araujo R., Cabral J., Fungal air quality in medical protected environments. In: Air Quality, Ashok Kumar, Sciyo, Awad A., Gibbs S., Tarwater P., Green C., Coarse and Fine Culturable Fungal Air Concentrations in Urban and Rural Homes in Egyp. Int. J. Environ. Res. Public Health 10, Crook B., Easterbrook A., Stagg S., Exposure to dust and bioaerosols in poultry farming. Summary of observations and data. Prepared by the Health and Safety Laboratory for the Health and Safety Executive. Downes F.P., Ito K., Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4 th ed. APHA, Washington. Eduard W., Halstensen A., Quantitative exposure assessment of organic dust. SJWEH 7, FAO Poultry in the 21st century: avian influenza and beyond. Proceedings of the International Poultry Conference, Bangkok, 5 7 Nov. 2007, red. O. Thieme, D. Pilling. FAO Animal Production and Health Proceedings 9, Rome. Fernstrom A., Goldblatt M., Aerobiology and its role in the transmission of infectious diseases. J. Pathog. doi: /2013/ Gómez de Ana S., Torres-Rodríguez J., Alvarado Ramírez E., Mojal García S., Belmonte-Soler J., Seasonal Distribution of Alternaria, Aspergillus, Cladosporium and Penicillium species Isolated in Homes of Fungal Allergic Patients. J. Investig. Allergol. Clin. Immunol. 16 (6), Ho H.M., Rao C.Y., Hsu H.H., Chiu Y.H., Liu C.M. and Chao H.J., Characteristics and determinants of ambient fungal spores in Hualien, Taiwan. Atmos. Environ. 39 (32), nr 587, 2016

90 90 S. Mahdi Oraibi, K. Cybulska Jo WK., Kang J.H., Exposure levels of airborne bacteria and fungi in Korean swine and poultry sheds. Arch. Environ. Health 60 (3), Just N., Kirychuk S., Gilbert Y., Letourneau V., Veillette M., Singh B., Duchaine C., Bacterial diversity characterization of bioaerosols from cagehoused and floor-housed poultry operations. Environ. Res. 11, Karwowska E., Microbiological air contamination in farming environment. Pol. J. Environ. Stud. 14, Khan A.H., Karuppayil S.M., Potential natural disinfectants for indoor environments. IJCA 7, 1 5. Lee S., Adhikari A., Grinshpun S., McKay R., Shukla R., Reponen T., Personal exposure to airborne dust and microorganisms in agricultural environments. J. Occup. Environ. Hyg. 3, doi: / Millner P.D., Bioaerosols associated with animal production operations. Bioresource Technology 100, Oppliger A., Charrie N., Droz P., Rinsoz T., Exposure to bioaerosols in poultry houses at different stages of fattening; use of real-time PCR for airborne bacterial quantification. Ann. Occup. Hyg. 52, doi: /annhyg/men021 Oraibi S., Cybulska K., 2016a. Microbiological air rating in a variety of objects during treatment of the post-slaughter poultry wastes. Part I. Escherichia coli. J. Ecol. Eng. 17 (5), doi: / /64215 Oraibi S., Cybulska K., 2016b. Microbiological air rating in a variety of objects during treatment of the post-slaughter poultry wastes. Part II. Bacteria. FPUTS 330 (40), 4. Paba E., Chiominto A., Marcelloni A.M., Proiettol A.R., Sisto R., Exposure to Airborne Culturable Microorganisms and Endotoxin in Two Italian Poultry Slaughter-houses. J. Occup. Environ. Hyg. 11, doi: / PN-89/Z-04111/03. Ochrona czystości powietrza. Badania mikrobiologiczne. Oznaczenie liczby grzybów mikroskopowych w powietrzu atmosferycznym (imisja) przy pobieraniu próbek metodą aspirometryczna i sedymentacyjną. Sautour M., Sixt N., Dalle F., L Ollivier C., Fourquenet V., Calinon C., Paul K., Valvin S., Maurel A., Aho S., Couillault G., Cachia C., Vagner O., Cuisenier B., Caillot D., Bonnin A., Profiles and seasonal distribution of airborne fungi in indoor and outdoor environments at a French hospital. Sci. Total Environ. 407 (12), doi: / j.scitotenv Sexton K., Hattis D., Assessing cumulative health risks from exposure to environmental mixtures three fundamental questions. Environ. Health Pesrp. 115, Viegas C., Carolino E., Malta-Vacas J., Sabino R., Viegas S., Veríssimo C., Fungal Contamination of Poultry Litter: A Public Health Problem. J. Toxicol. Environ. Health., Part A: Current Issues 75, 22 23, MIKROBIOLOGICZNA OCENA POWIETRZA W RÓŻNYCH OBIEKTACH W CZASIE PRZERÓBKI POUBOJOWYCH ODPADÓW DROBIOWYCH CZĘŚĆ III. GRZYBY PLEŚNIOWE I DROŻDŻE Streszczenie. Przy zagospodarowaniu odpadów poubojowych w produkcji zwierzęcej, a szczególnie hodowli drobiu, istnieje problem znacznego zanieczyszczenia powietrza bioaerozolem. Dotyczy to różnych grup mikroorganizmów, a zwłaszcza grzybów i ich zarodników mających wpływ na samopoczucie i zdrowie ludzi. Dotyczy to głównie Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

91 Microbiological air rating in a variety of objects during treatment zagrożenia rozwojem chorób płuc i różnorodnych alergii. Celem badań było określenie liczebności i jakości grzybów pleśniowych oraz drożdży w powietrzu różnych obiektów przetwarzania poubojowych odpadów drobiowych. Analiza przeprowadzonych badań i otrzymanych wyników potwierdziła obecność grzybów pleśniowych i drożdży, m.in.: Aspergillus sp., Penicillium sp., Scopulariopsis sp., Trichoderma sp., Acremonium sp., Cephalosporium sp., Alternaria sp., Pithomyces sp., Eurotium sp. i Rhodotorula sp., Candida sp., Yarovia sp. i Saccharomyces sp. w powietrzu. Analiza statystyczna potwierdziła zależność występowania grzybów od miejsca poboru próbek, terminu, a także interakcji tych czynników. Słowa kluczowe: bioaerozol, grzyby pleśniowe, drożdże, kompostownie, odpady drobiowe nr 587, 2016

92

93 Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych nr 587, 2016, KONDYCJONOWANIE KUKURYDZY DO PRODUKCJI BIOETANOLU Teresa Krzyśko-Łupicka, Magdalena Kręcidło, Łukasz Kręcidło, Magdalena Mysłek Uniwersytet Opolski Streszczenie. Wydajność produkcji bioetanolu zależy od jakości ziarna kukurydzy oraz zawartości szkodliwych dla gorzelnianych drożdży metabolitów. Niepożądane procesy mikrobiologiczne zachodzące w wilgotnym ziarnie kukurydzy powodują obniżenie wydajności alkoholu. Z tego powodu ziarno nie nadaje się do dłuższego przechowywania bez konieczności dosuszania, co powoduje wzrost kosztów i ceny surowca. W praktyce ziarno przechowywane jest w warunkach beztlenowych, w tzw. rękawach, i/lub konserwowane związkami chemicznymi, które mogą zaburzać proces technologiczny. Celem badań była ocena skuteczności preparatu ANTY-CYD, wprowadzonego metodą zamgławiania do cyklu technologicznego w przemysłowej produkcji bioetanolu z ziarna kukurydzy przechowywanego w rękawach. Metodą hodowlaną oznaczono liczebność mikrobioty ziarna kukurydzy. Równolegle oznaczono ph i suchą masę próbek. Obiecujące wyniki uzyskano, stosując zamgławianie ekologicznym preparatem ANTY-CYD. W konsekwencji uzyskano poprawę jakości surowca wyraźne obniżenie ogólnej liczebności bakterii, dzikich drożdży i grzybów strzępkowych oraz bakterii fermentacji mlekowej i beztlenowych. Słowa kluczowe: ziarno kukurydzy, produkcja bioetanolu, ANTY-CYD WSTĘP Bioetanol to bezwodny alkohol etylowy produkowany z biomasy lub biodegradowalnych odpadów. Jego produkcja ma znaczenie strategiczne, ponieważ stanowi odnawialne źródło energii, zmniejszając zależność od importu ropy naftowej, a także przynosi dodatkowe dochody rolnikom. Kluczową rolę w produkcji bioetanolu odgrywa duża zawartość skrobi w surowcu i efektywność fermentacji alkoholowej. Surowcami do produkcji bio- teresak@uni.opole.pl Copyright by Wydawnictwo SGGW

94 94 T. Krzyśko-Łupicka i inni etanolu w świecie są: trzcina cukrowa (Ameryka Południowa), kukurydza (USA i Kanada), a w krajach UE zboża, burak cukrowy i ziemniaki [Szymanowska i Grajek 2009, Gumienna i in. 2013, Malinowska i in. 2014]. Najtańszym i najwydajniejszym z surowców do produkcji bioetanolu jest ziarno kukurydzy. Z 1 t ziarna kukurydzy uzyskuje się dm 3 bioetanolu, to jest ponadczterokrotnie więcej niż z 1 t buraków cukrowych i ponadtrzykrotnie więcej niż z 1 t ziemniaków. Ziarno kukurydzy charakteryzuje się dużą zawartością skrobi, nawet 76% [Sapińska i in. 2011], i związaną z tym dużą wydajnością alkoholu, a także uzyskiwaniem korzystnych produktów ubocznych [Kawa-Rygielska 2007, Dynkowska 2009, Świątkiewicz i in. 2014]. Warunki klimatyczne Polski sprawiają, że w momencie zbioru, nawet w początkach pory zimowej, ziarno kukurydzy cechuje znaczna wilgotność w granicach 30 38% [Warzecha 2005], porażenie przez patogeny grzybowe i bakteryjne oraz podwyższone stężenie mykotoksyn [Kłosowski i in. 2010]. Toksynotwórcze grzyby pleśniowe rozwijają się i produkują toksyny zarówno w czasie wegetacji roślin, jak i podczas magazynowania ziarniaków w niewłaściwych warunkach. W warunkach polowych główny problem stanowią grzyby rodzaju Fusarium i tworzone przez nie mykotoksyny fuzaryjne [Wolny-Koładka 2014], a w trakcie przechowywania Penicillium i Aspergillus [Fandohan i in. 2005]. Niepożądane procesy mikrobiologiczne zachodzące w wilgotnym ziarnie powodują zagrożenie dla przebiegu procesu fermentacji (obniżenie wydajności alkoholu średnio o 1 dm 3 EtOH 100 kg 1 ) i jakości surowego alkoholu oraz wywaru gorzelniczego częściowo zawracanego do kadzi fermentacyjnych lub wykorzystywanego jako pasza [Kłosowski i in. 2010, Świątkiewicz i in. 2014]. Niebezpieczeństwo potęguje migracja mykotoksyn z paszy do organizmu zwierzęcia, a stąd (drogą carry over) do produktów żywnościowych pochodzenia zwierzęcego (mleko, mięso, podroby, jaja) [Cavret i Lecoeur 2006]. Ponieważ w Polsce technologię klasyczną zastępuje się energooszczędną metodą bezciśnieniowego uwalniania skrobi (BUS), eliminuje się dezynfekcyjne działanie wysokiej temperatury (152 C) [Samar i in. 2007, Kłosowski i in. 2011]. Ważnym problemem w produkcji etanolu z kukurydzy jest przechowywanie ziarna zwłaszcza w okresie mokrego i krótkiego lata. Przedłużenie trwałości i jakości ziarna kukurydzy można uzyskać, stosując odpowiednią konserwację i przechowywanie. Jedną z metod jest suszenie ziarna, które zapewnia jego stabilność, ale ten proces jest kosztowny, ponieważ obniża przychód średnio o 20 30% [Nicholas i in. 2006]. Alternatywnym rozwiązaniem jest samokonserwacja ziarna, tzw. inertacja w szczelnych rękawach foliowych, zapewniająca warunki beztlenowe. Konserwantem jest wydzielający się w procesie oddychania ziarna dwutlenek węgla oraz kwasy powstające na powierzchni ziarna. Mimo wszystko powstają jednak straty, wynikające z niekontrolowanej fermentacji w rękawach. Jednym z rozwiązań jest przechowywanie mokrej kukurydzy uprzednio zakonserwowanej preparatami chemicznymi [Nowak i in. 2008]. Aby zapobiec stratom surowca po inertacji, należy opracować i wdrożyć odpowiednie metody kondycjonowania ziarna kukurydzy bezpośrednio w cyklu technologicznym, takie jak mieszanie z ziarnem suchym lub zastosowanie antymikrobiologicznego preparatu i odpowiedniej techniki jego dozowania. Celem badań była ocena skuteczności preparatu ANTY-CYD, wprowadzonego metodą zamgławiania do cyklu technologicznego produkcji przemysłowej bioetanolu z ziarna kukurydzy przechowywanego w rękawach. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

95 Kondycjonowanie kukurydzy do produkcji bioetanolu 95 MATERIAŁ I METODY BADAŃ W okresie od maja do lipca przeprowadzono badania mikrobiologiczne i fizykochemiczne surowca gorzelniczego. Próbki ziarna kukurydzy do produkcji bioetanolu pochodziły z pełnoprodukcyjnej gorzelni stosującej technologię BUS. Badania prowadzono w czterech etapach: I ziarna kukurydzy o obniżonej jakości technologicznej, pobrane z rękawów (B/k), a następnie po kondycjonowaniu preparatem ANTY-CYD (K). II w przypadku gdy jakość surowca nie odpowiadała warunkom technologicznym gorzelni, ziarno kukurydzy z rękawów mieszano z ziarnem suchym. Zmieszany surowiec pobierano z młyna przed mieleniem (P1) bez kondycjonowania i po kondycjonowaniu preparatem ANTY-CYD (P1k). III zmieszany surowiec po zmieleniu bez kondycjonowania (P2) oraz po kondycjonowaniu na ślimaku preparatem ANTY-CYD (P2k). IV ze zbiornika do hydrolizy (P3) bez kondycjonowania i po kondycjonowaniu preparatem ANTY-CYD (P3k). Próbki ziarna kukurydzy zabezpieczano przed zmianą właściwości podczas transportu w workach foliowych, a próbki płynne zacierów pobierano do jałowych pojemników o pojemności 300 cm 3. Pobrany materiał przechowywano w chłodni w temperaturze 4 C do momentu wykonywania analizy mikrobiologicznej i fizykochemicznej. Instalację do kondycjonowania ziarna kukurydzy metodą zamgławiania preparatem ANTY-CYD zainstalowano na ślimaku doprowadzającym ziarno do młyna. Preparat ANTY-CYD otrzymywany w reaktorze anodowo-katodowym (Avalon) w wyniku elektrochemicznej aktywacji roztworu soli (w stężeniu 5 g dm 3 NaCl) wykorzystywano bez rozcieńczania w postaci aerozolu o zawartości aktywnego chloru 0,05% oraz ph 8,0 w ilości 0,1% objętościowych. Analizę mikrobiologiczną próbek wykonano metodą hodowlaną (dziesięciokrotnych rozcieńczeń Kocha) na podstawowych i wybiórczych pożywkach mikrobiologicznych typowych dla poszczególnych grup mikroorganizmów w standardowych warunkach inkubacji (tab. 1). Tabela 1. Podłoża mikrobiologiczne oraz warunki inkubacji mikroorganizmów Table 1. Microbial media and incubation conditions Grupa mikroorganizmów Type of microorganism Ogólna liczba bakterii Total number of bacteria (OLB) Ogólna liczba grzybów strzępkowych Total number of fungi (OLG) Ogólna liczba drożdży Total number of yeast (OLD) Bakterie beztlenowych Anaerobic bacteria (BC) Podłoże Medium Agar odżywczy Nutrient agar (PCA) Temperatura Temperature Czas inkubacji Incubation time 22 C h Martina 25 C 7 14 dni Sabouround 25 C h Schaedler Anaerobe LAB AGAR TM 25 C h nr 587, 2016

96 96 T. Krzyśko-Łupicka i inni cd. tabela 1 cont. Table 1 Grupa mikroorganizmów Type of microorganism Przetrwalnikujące Bacilli spore (BC) Amylolityczne Amylolytic (MA) Podłoże Medium Agar odżywczy BIOCORP Nutrient agar BIOCORP Temperatura Temperature Czas inkubacji Incubation time 25 C h Waksman 25 C h Enterobacteriaceae (E) Hektoen BTL 25 C h Staphylococcus (ST) Parker BioMaxima 25 C h Enterococcus (ENT) Enterococcus Agar BTL Enterococcus Agar BTL 25 C h Acetobacter (A) CHROMagar TM Acinetobacter 25 C h Pseudomonas King B BTL 25 C h Liczebności mikroorganizmów podano w jtk g 1 s.m. ziarna kukurydzy. Identyfikację grzybów strzępkowych przeprowadzono na podstawie cech morfologicznych [Silva i in. 2011, Pitt i Hocking 2013], a dominujących bakterii z wykorzystaniem testów API. Równolegle wyznaczano ph próbek metodą potencjometryczną i suchą masę [%] metodą suszenia w temperaturze 105 C. Próby pobrano w czterech powtórzeniach. Wyniki opracowano statystycznie z użyciem programu R (R Fundation, Austria). Istotność statystyczną oceniono, stosując dwuczynnikową analizę wariancji (2-way ANOVA) oraz sparowanego testu T. WYNIKI I DYSKUSJA Ocena mikrobiologiczna ziarna przechowywanego w rękawach W próbkach kukurydzy pobranych z rękawów stwierdzono wyraźne makroskopowe oznaki uszkodzeń (pokruszenia i zapleśnienie) i specyficzny, nieprzyjemny zapach. Odczyn wynosił 6,5 (±0,4). Sucha masa ziarna w poszczególnych próbkach wynosiła od 73,6 do 77%. Badany surowiec charakteryzował także wysoki stopień zanieczyszczeń mikrobiologicznych (rys. 1). Na podstawie uzyskanych wyników, a także informacji producenta o tworzeniu się w trakcie fermentacji alkoholowej (w kadzi fermentacyjnej) dużych ilości kwasu mlekowego i octowego można wnioskować, że za jakość surowca, a w konsekwencji za zakłócenie procesu fermentacji mogą być odpowiedzialne mikroorganizmy produkujące kwasy organiczne (m.in. kwas mlekowy i octowy) i hydrolizujące skrobię. Surowce gorzelnicze są często porażone przez mikroorganizmy, które mogą rozwijać się zarówno w okresie wegetacji roślin, zbioru ziarna kukurydzy, jak i jego przechowywania. W badanym materiale stwierdzono dużą liczbę przetrwalnikujących laseczek, głównie gatunku Bacillus cereus, bakterie rodziny Enterobacteriaceae, bakterie fermentacji mlekowej LAB, amylolityczne, dzikie drożdże i grzyby strzępkowe. W grupie grzybów strzępkowych dominowały gatunki potencjalnie toksynotwórcze: Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

97 Kondycjonowanie kukurydzy do produkcji bioetanolu 97 Rys. 1. Fig. 1. a log [jtk g 1 s.m.] log [CFU g 1 DM 1 ] b log [jtk g 1 s.m.] log [CFU g 1 DM 1 ] B/K OLB OLG OLD BT LAB BC E ST ENT P MA Grupa mikroorganizmów Microorganisms group OLB OLD OLG BT LAB BC E ST ENT Grupa mikroorganizmów Microorganisms group Skład mikrobiologiczny log [jtk g 1 s.m.]: a ziarna kukurydzy przechowywanego w rękawach bez kondycjonowania (B/K) oraz poddanego kondycjonowaniu na ślimaku (K); b pobranej z młyna mieszanki ziarna suchego i przechowywanego w rękawach bez kondycjonowania (P1) oraz poddanego kondycjonowaniu na ślimaku (P1k), OLB ogólna liczba bakterii, OLD ogólna liczba drożdży, OLG ogólna liczba grzybów, BT liczebność mikroorganizmów beztlenowych, LAB liczebność bakterii kwasu mlekowego, BC liczebność laseczek przetrwalnikujących, E liczebność Enterobacteriaceae, ST liczebność Staphylococcus, ENT liczebność Enterococcus, P liczebność Pseudomonas, MA liczebność mikroorganizmów amylolitycznych (p 0,05) Microbial content of log [CFU g 1 DM]: a corn grain stored in sleeves with no conditioning (B/K) and subjected to conditioning at the screw (K); b the mixture taken from the mill the grain dry and stored in the sleeves without conditioning (P1) and subjected to conditioning at the screw conveyor (P1K), OLB total number of bacteria, OLD total number of yeast, OLG the total number of fungi, BT number of anaerobic microorganisms, LAB number of lactic acid bacteria, BC bacilli spore numbers, E number of Enterobacteriaceae, ST number of Staphylococcus, ENT number of Enterococcus, number of Pseudomonas, MA number of amylolytic microorganisms (p 0.05) P1 K P1k nr 587, 2016

98 98 T. Krzyśko-Łupicka i inni Penicillium viridicatum, Mucor hiemalis, Gliocladium roseum i Fusarium ssp. W żadnej z tych prób nie stwierdzono obecności bakterii octowych rodzaju Acetobacter. Na podstawie uzyskanych wyników można wnioskować, że tę partię kukurydzy bezwzględnie należy poddać kondycjonowaniu, aby nie dopuścić do zakłócenia procesu fermentacji. Zastosowanie kondycjonowania przechowywanego ziarna metodą zamgławiania preparatem ANTY-CYD w warunkach technologicznych istotnie obniżyło liczebność wszystkich badanych grup mikroorganizmów, a tym samym poprawiło jakość mikrobiologiczną surowca (rys. 1a). Ocena mikrobiologiczna mieszanki ziarna przechowywanego w rękawach i suchego W warunkach pełnoprodukcyjnych gorzelni, stosujących bezciśnieniowe uwalnianie skrobi (BUS), nie można pozwolić na straty, dlatego ziarno kukurydzy z rękawów mieszano z ziarnem suchym. Jakość tego surowca oceniano w próbkach pobranych w trzech wyznaczonych punktach procesu produkcyjnego z młyna (P1), za młynem (P2) i ze zbiornika do hydrolizy (P3). Zastosowana operacja mieszania ziarna wyraźnie wpłynęła na obniżenie liczebności badanych grup mikroorganizmów w porównaniu do ziarna pochodzącego z rękawów. Dodatkowo zastosowanie kondycjonowania ziarna kukurydzy na ślimaku doprowadzającym do młyna (P1) istotnie obniżyło liczebność wszystkich mikroorganizmów (rys. 1b). Zmielenie mieszanego ziarna kukurydzy (z rękawów i suchego) na młynach młotkowych (P2) w porównaniu do ziarna nierozdrobnionego (P1) prowadziło do zróżnicowanych zmian ilościowo-jakościowych badanej mikrobioty. W wyniku tej operacji i po kondycjonowaniu istotnie zmniejszyła się liczba mikroorganizmów prokariotycznych, nie zaobserwowano natomiast istotnego wpływu na liczebność mikroorganizmów eukariotycznych. Szymanowska i Grajek [2009] także podają, że warunkiem pomyślnego przebiegu procesu produkcji bioetanolu jest przeprowadzenie wstępnej dezynfekcji ziarna przed jego mieleniem, a najkorzystniejszym rozwiązaniem może być dezynfekcja chemiczna połączona z rozdrabnianiem na mokro. Z kolei Nowak i inni [2008] stosując metodę chemicznej konserwacji ziarna kukurydzy z użyciem preparatu na bazie kwasu mrówkowego i propionowego (KemiSile 2000 Plus), uzyskali porównywalną wydajność etanolu zarówno z ziarna poddanego bezciśnieniowemu (BUS), jak i po ciśnieniowym parowaniu przed procesem zacierania (87 94% w stosunku do wydajności teoretycznej). W zbiorniku do hydrolizy (P3) po kondycjonowaniu nie zaobserwowano istotnych zmian w liczebności mikroorganizmów eukariotycznych i bakterii rodzaju Enterococcus w porównaniu do próbek bez kondycjonowania (rys. 2). Przyczyną może być jakość dodawanej do zbiornika hydrolizy wody zarobowej i recyrkulowanego wywaru gorzelnianego. W naszych badaniach wskazano możliwość usuwania niepożądanej mikrobioty zanieczyszczającej ziarna kukurydzy przy użyciu preparatu ANTY-CYD, otrzymanego z wykorzystaniem innowacyjnej technologii elektrochemicznej aktywacji solanki. Preparat ten jest całkowicie bezpieczny dla ludzi i otoczenia, ponieważ w czasie dnia chlor ulega bezpośredniej fotolizie w ciągu 2 4 godzin. Wyznaczony niski współczynnik korelacji pomiędzy wyjściową (przed kondycjonowaniem) i końcową (po kondycjonowaniu) Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

99 Kondycjonowanie kukurydzy do produkcji bioetanolu 99 a log [jtk g 1 s.m.] log [CFU g 1 DM] b log [jtk g 1 s.m.] log [CFU g 1 DM] OLB OLD OLG BT LAB BC E ST ENT Grupa mikroorganizmów Microorganisms group P2 P2k OLB OLD OLG BT LAB BC E ST ENT Grupa mikroorganizmów Microorganisms group P3 P3k Rys. 2. Fig. 2. Skład mikrobiologiczny log [jtk g 1 s.m.]: a mieszanki ziarna kukurydzy suchego i przechowywanego w rękawach po zmieleniu bez kondycjonowania (P2) oraz poddanego kondycjonowaniu na ślimaku (P2k); b mieszanki ziarna kukurydzy suchego i przechowywanego w rękawach ze zbiornika hydrolizy bez kondycjonowania (P3) oraz poddanego kondycjonowaniu (P3k) (oznaczenia jak na rys. 1) Microbiological composition of [CFU g 1 DM]: a the mixture of corn grain dry and stored in the sleeves after milling log without conditioning (P2) and subjected to conditioning at the screw conveyor (P2K); b the mixture of corn grain dry and stored in the sleeves from the hydrolysis tank without conditioning (P3) and subjected to conditioning (P3K) (signs like on Fig. 1) nr 587, 2016

100 100 T. Krzyśko-Łupicka i inni liczbą mikroorganizmów wskazuje, że preparat ANTY-CYD niezależnie od wyjściowego zanieczyszczenia mikrobiologicznego surowca i procesu technologicznego jest skuteczny (rys. 3). Poprzez kondycjonowanie w cyklu technologicznym ziarna kukurydzy badanym preparatem liczba mikroorganizmów zanieczyszczających surowiec obniżyła się krotnie. Na uwagę zasługuje zarówno zmniejszenie liczebności mikrobioty obniżającej jakość surowca, jak i stanowiącej potencjalne zagrożenie procesu fermentacji: przetrwalnikujących laseczek, które zdolne są nie tylko do hydrolizy skrobi (głównie Bacillus cereus), ale także uaktywniają się w procesie zacierania, gdyż szybciej opanowują środowisko niż szczepionka drożdżowa, bakterii rodziny Enterobacteriaceae zdolnych do prowadzenie fermentacji rzekomomlekowej, bakterii beztlenowych zdolnych do produkcji kwasu octowego, bakterii fermentacji mlekowej LAB, amylolitycznych, dzikich drożdży i toksynotwórczych grzybów strzępkowych [Grajek i in. 2008] B/K [jtk g 1 s.m.] B/K [CFU g 1 DM] y = 18,086x ,5 R 2 = 0,2848 p 0, Rys. 3. Fig. 3. K [jtk g 1 s.m.] K [CFU g 1 DM] Korelacja między liczebnością mikroorganizmów przed kondycjonowaniem i po nim Correlation between the number of microorganisms before and after conditioning WNIOSKI 1. Kondycjonowanie ziarna kukurydzy o obniżonej jakości gorzelniczej, jak również w mieszaninie z ziarnem suchym z wykorzystaniem w cyklu technologicznym preparatu ANTY-CYD istotnie obniżyło liczbę mikroorganizmów zanieczyszczających surowiec. 2. W wyniku przeprowadzonego procesu kondycjonowania ziarna kukurydzy uzyskano poprawę jakości surowca poprzez usunięcie szczególnie niepożądanych w procesie technologicznym grup mikroorganizmów zaburzających proces fermentacji. 3. Stosowana technika zamgławiania surowca do produkcji bioetanolu powoduje, że preparat dociera nawet do trudnodostępnych miejsc i zwiększa jego efektywność dezynfekcyjną, co może przyczynić się do poprawy jakości bioetanolu i jego wydajności. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

101 Kondycjonowanie kukurydzy do produkcji bioetanolu 101 LITERATURA Cavret S., Lecoeur S., Fusariotoxin transfer in animal. Food Chem. Toxicol. 44, Fandohan P., Zoumenou D., Hounhouigan D.J., Marasas W.F.O., Wingfield M.J., Hell K., Fate of aflatoxins and fumonisins during the processing of maize into food products in Benin. Int. J. Food Microbiol. 98, Kawa-Rygielska J., Bioetanol z kukurydzy czy warto produkować. Przem. Ferm. Owoc.- -Warz. 5, Kłosowski G., Mikulski D., The effect of raw material contamination with mycotoxins on the composition of alcoholic fermentation volatile by-products in raw spirits. Bioresource Technol. 101, Kłosowski G., Błajet-Kosicka A., Mikulski D., Grajewski J., Ocena możliwości redukcji stężenia mikotoksyn w procesie produkcji etanolu z ziarna kukurydzy technologią BUS i klasyczną. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość 2 (75), Malinowska E., Wiśniewska-Kadżajan B., Jankowski K., Sosnowski J., Wyrębek H., Ocena przydatności biomasy różnych roślin na cele energetyczne. Zesz. Nauk. Uniwersytetu Przyrodniczo-Humanistycznego w Siedlcach, 102, Administracja i Zarządzanie (29), Nichols N.N., Dien B.S., Bothast R.J., Cotta M.A., The corn ethanol industry. W: red. S. Minteer, Alcoholic Fuel. Taylor & Francis. Nowak J., Szambelan K., Miettinen H., Nowak W., Czarnecki Z., Effect of the corn grain storage method on saccharification and ethanol fermentation yield. Acta Sci. Pol. Technol. Aliment. 7 (1), Pitt J.I., Hocking A.D., Fungi and food spoilage (3rd ed.). Springer-Verlag, New York. Samar M., Resnik S.L., González H.H.L., Pacin A.M., Castillo M.D., 2007: Deoxynivalenol reduction during the frying process of turnover pie covers. Food Control 18, Sapińska E., Balcerek M., Stanisz M., Fermentacja alkoholowa gęstych zacierów kukurydzianych. Acta Agrophysica 18 (2), Silva D.M., Batista L.R., Rezende E.F., Fungaro, Maria Helena P., Sartori D., Alves E., Identification of fungi of the genus Aspergillus section nigri using polyphasic taxonomy. Braz. J. Microbiol. 42 (2), Szymanowska D., Grajek W., Fermentacja etanolowa połączona z jednoczesną hydrolizą skrobi kukurydzianej i zawracaniem frakcji cieńkiej wywaru w warunkach gorzelni rolniczej. Acta Sci. Pol. Biotechnologia 8 (3), Świątkiewicz M., Hanczakowska E., Olszewska A., Suszony zbożowy wywar gorzelniany (DDGS) w żywieniu świń. Wiadomości Zootechniczne 70, 4, Wolny-Koładka K., Grzyby z rodzaju Fusarium występowanie, charakterystyka i znaczenie w środowisku. Kosmos 63 (4), THE SELECTION OF METHODS FOR ASSESSING MICROBIOLOGICAL PURITY OF THE AIR IN FOOD INDUSTRY Summary. A key role in the production of bioethanol plays a high content of starch in the raw material and the efficiency of alcoholic fermentation. Quality of corn grain, and the metabolites harmful for yeast S. cerevisiae have effect on the productivity. Undesirable microbiological processes in the moist corn grain are cause performance decrease of alcohol, and the development of filamentous fungi which poses a risk of mycotoxin contamination. nr 587, 2016

102 102 T. Krzyśko-Łupicka i inni For this reason grain is not suitable for long-term storage without drying, which increases the cost price of the alkohol production. This expenditure can be reduced by usage of undried grain. These grain should be used within a short time. In practice, grain are stored in anaerobic conditions and/or with use of chemical preparations. The aim of the study was to evaluate the efficacy of conditioning of grain maize using ANTI-CYD preparation by fogging method in conditions of industrial production of bioethanol. Conditioning installation to fogging of corn grain using ANTI-CYD preparation was installed at the screw conveyor to the mill. ANTI-CYD preparation was obtained in the anode-cathode reactor by electrochemical activation of NaCl solution. The resulting liquid was characterized by a strong properties of oxidizing-reducing, due to the presence of ozone, chlorine dioxide, hypochlorous acid and hypochlorite ions that determine the properties of the disinfectant. The culture method total number of bacteria, yeast, fungi, anaerobic microorganisms, lactic acid bacteria, acetogenic bacteria, amylolytic microorganisms, bacteria of family Enterobacteriaceae and genera: Bacillus, Pseudomonas, Staphylococcus and Enterococcus were determined. Parallelly ph of the samples and the dry mass [%] were determined. The results were given in the CFU g 1 DM. The dependence analysis were taken in the R software (R Foundation, Switzerland). Promising results were obtained using fogging ecological ANTI-CYD preparation. Consequently, the obtained improvement of the quality of the grain maize; reducing the total number of bacteria, wild yeast and filamentous fungi, and lactic bacteria and anaerobic bacteria. Conditioning grain corn of reduced quality of distilling as well as in a mixture of dry grain, using a series of technological preparation ANTI-CYD, significantly reduced the number of microorganisms contaminating material. Fogging technique used raw material for bioethanol production makes the preparation reaches even difficult to reach areas and improves its efficiency disinfection, which can contribute to improving the quality of bio-ethanol and its performance. Key words: corn grain, bioethanol, ANTI-CYD Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

103 Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych nr 587, 2016, OCENA ZANIECZYSZCZENIA CHEMICZNEGO I MIKROBIOLOGICZNEGO BULW ZIEMNIAKA UPRAWIANEGO W OTOCZENIU SKŁADOWISKA KOMUNALNEGO Krzysztof Frączek, Dariusz Ropek, Karol Bulski Uniwersytet Rolniczy im. Hugona Kołłątaja w Krakowie Streszczenie. Powszechnie wiadomo, że każde składowisko odpadów komunalnych, nawet prawidłowo zaprojektowane i eksploatowane stanowi potencjalne źródło zanieczyszczenia okolicznych gleb zanieczyszczeniami chemicznymi i mikrobiologicznymi prowadzącymi m.in. do pogorszenia warunków wegetacyjnych roślin uprawnych. Celem przeprowadzonych badań była ocena składu chemicznego i mikrobiologicznego zanieczyszczeń znajdujących się na powierzchni bulw ziemniaka oraz analiza wpływu ich występowania w glebie na zawartość na bulwach. Zanieczyszczenia chemiczne znajdujące się na powierzchni bulw ziemniaka i w glebie analizowano za pomocą mikroskopu elektronowego NOVA NANO SEM s 300 metodą EDS, natomiast analizy mikrobiologiczne przeprowadzono metodą seryjnych rozcieńczeń. Wyniki przeprowadzonych analiz wykazały na powierzchni bulw ziemniaka uprawianego na obszarze i w bezpośrednim otoczeniu składowiska komunalnego obecność oprócz pierwiastków zaliczanych do makro- i mikroelementów również pierwiastki z grupy metali ciężkich, a także występowanie bakterii i grzybów. Wykazano, że usytuowanie poletka względem składowiska miało znaczący wpływ na obserwowane zanieczyszczenia. Słowa kluczowe: składowisko komunalne, ziemniaki, metale ciężkie, mikroorganizmy WSTĘP Składowiska odpadów komunalnych przez wiele lat były i pozostają nadal najprostszą metodą unieszkodliwiania odpadów. Jednak każde składowisko, nawet prawidłowo zaprojektowane i eksploatowane, stanowi potencjalne źródło zanieczyszczenia w swoim otoczeniu. Związane jest to przede wszystkim z możliwością skażenia okolicznych gleb zanieczyszczeniami mikrobiologicznymi, chemicznymi i fizycznymi, prowadzą- rrfracze@cyfronet.pl Copyright by Wydawnictwo SGGW

104 104 K. Frączek, D. Ropek, K. Bulski cymi m.in. do pogorszenia warunków wegetacyjnych roślin uprawnych [Nowak i in. 1997, Adani i in. 2000, Zach i in. 2000, Warith 2002]. O tym, jak niebezpiecznym źródłem skażenia gleby są składowiska, może świadczyć różnorodność zawartych w nich zanieczyszczeń, np. związków organicznych, w tym substancji ropopochodnych, związków nieorganicznych (w tym metali ciężkich) oraz dużych ilości drobnoustrojów (w tym patogennych) [Nowak i in. 1998, Zadroga i Olańczuk-Neyman 2001]. Należy podkreślić, że określenie form pierwiastków śladowych oraz poznanie mechanizmu migracji w układzie roślina-środowisko ma podstawowe znaczenie dla określenia biodostępności tych pierwiastków dla człowieka. Celem pracy była ocena składu chemicznego i mikrobiologicznego zanieczyszczeń znajdujących się na powierzchni bulw ziemniaka oraz analiza wpływu ich występowania w glebie na zawartość na bulwach. MATERIAŁ I METODY Doświadczenie poletkowe założono w sąsiedztwie składowiska odpadów komunalnych. Położenie składowiska i wyznaczonych poletek doświadczalnych w jego okolicy przedstawiono na rysunku 1. Rys. 1. Fig. 1. Lokalizacja terenu badań Research area localization Poletka polowe były położone z każdej strony od badanego obiektu, w dwóch strefach i m od jego granic oraz na terenie już zrekultywowanego sektora odpadów (tab. 1). Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych