NOWY ALGORYTM IDENTYFIKACJI ZAKAŻEŃ MYCOBACTERIUM KANSASII

Transkrypt

1 NOWY ALGORYTM IDENTYFIKACJI ZAKAŻEŃ MYCOBACTERIUM KANSASII 1. AKTUALNY STAN WIEDZY Termin prątki niegruźlicze (NTM, ang. non-tuberculous mycobacteria) lub prątki inne niż gruźlicze (MOTT, ang. Mycobacteria other than tuberculosis) odnosi się do grupy różnych gatunków prątków niezaliczanych do kompleksu Mycobacterium tuberculosis. Bakterie te występują powszechnie w środowisku, głównie w glebie i zbiornikach wodnych. Izolowane są także z produktów spożywczych oraz tkanek zwierzęcych [1]. Mimo, że są wolnożyjącymi saprofitami, mogą w określonych warunkach wywoływać choroby u ludzi. Zwykle schorzenia wywołane prątkami niegruźliczymi, tzw. mykobakteriozy rozwijają się u osób z dysfunkcją układu odpornościowego, na przykład w wyniku leczenia nowotworów, terapii immunosupresyjnych, czy też u pacjentów z HIV/AIDS. (Mykobakteriozy należą do tzw. chorób wskaźnikowych AIDS). Bardzo rzadko choroby wywołane przez prątki NTM obserwowane są u osób immunokompetentnych. Mykobakteriozy występują najczęściej w postaci zapalenia płuc, zapalenia węzłów chłonnych, infekcji skóry i tkanek miękkich, a także zakażenia uogólnionego (szczególnie u pacjentów chorych na AIDS). Diagnostyka zakażeń prątkami NTM jest trudna i często niejednoznaczna. Podobnie, trudne i kontrowersyjne jest leczenie wymagające długotrwałego przyjmowania kombinacji leków, często źle tolerowanych przez pacjentów [2, 3]. Podczas gdy częstość występowania gruźlicy w krajach rozwiniętych systematycznie maleje, odsetek zakażeń prątkami NTM niepokojąco wzrasta. Wzrost liczby zachorowań wywołanych przez prątki NTM wiązany jest w znacznej mierze z szerzącą się na całym świecie epidemią HIV/AIDS [4]. Skuteczne leczenie chorych zakażonych prątkami NTM wymaga szybkich i wiarygodnych metod identyfikacji czynnika etiologicznego. Mycobacterium kansasii należy do najczęściej izolowanych gatunków prątków NTM z materiałów klinicznych i odpowiada za istotną część zakażeń prątkami niegruźliczymi w populacji ludzkiej. Identyfikacja prątków niegruźliczych, w tym prątków M. kansasii przez długi czas opierała się jednie na ocenie cech fenotypowych, głównie charakterystyce właściwości biochemicznych. Testy fenotypowe są czasochłonne (zajmują do 2 miesięcy), a ich wyniki nie zawsze są jednoznaczne. Do niedawna metodą referencyjną w identyfikacji gatunkowej prątków była analiza kwasów mykolowych techniką wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC, ang. high-pressure liquid chromatography) [5]. Technika ta obciążona jest jednak wysokimi kosztami aparaturowymi oraz koniecznością stosowania toksycznych rozpuszczalników organicznych. Upowszechnienie metod biologii molekularnej znacznie usprawniło identyfikację prątków NTM pozwalając choć w niewielkim stopniu przybliżyć epidemiologię wywoływanych przez nie zakażeń. W ciągu ostatnich dwóch dekad, opracowanych zostało kilka metod identyfikacji opartych na analizie DNA, które z powodzeniem stosowane są w różnicowaniu prątków M. kansasii od innych gatunków prątków. W 1991 roku, Huang i wsp. opracowali pierwszą sondę DNA (pmk1-9) specyficzną dla 1

2 M. kansasii, zarówno szczepów klinicznych, jak i środowiskowych [6]. Jednak w badaniu przeprowadzonym przez Ross i wsp. wykazano, że spośród 105 szczepów M. kansasii, 20 (19%) nie dawało sygnału dla sondy pmk1-9. Co ciekawe, wszystkie, poza jednym, szczepy negatywne w reakcji z sondą pmk1-9 zawierały odmienną sekwencję 16S rdna, sugerując istnienie różnych typów genetycznych w obrębie M. kansasii [7]. Analiza biblioteki genomowej szczepów M. kansasii negatywnych w reakcji z sondą pmk1-9 wykazała obecność repetytywnego DNA, które scharakteryzowano jako sekwencję insercyjną IS1652. Sekwencję tę wykryto wyłącznie w szczepach negatywnych dla sondy pmk1-9, przy czym źródłem polimorfizmu miedzy szczepami była liczba kopii sekwencji IS1652 w chromosomie (od 1 do 11) [8]. Kolejna sonda DNA, opisana przez Yang i wsp., obecna na plazmidzie p6123, zdolna była do specyficznej hybrydyzacji z DNA wszystkich badanych szczepów M. kansasii, także tych, które były negatywne w reakcji z sondą pmk1-9 [9]. Obecnie na rynku dostępne są 3 testy używane do identyfikacji M. kansasii (a także innych gatunków należących do prątków NTM), których zasada opiera się na technologii sond DNA. Są to test AccuProbe (Gen-Probe, San Diego, USA), wykrywający 16S rrna, a także test INNO LiPA MYCOBACTERIA v2 (Innogenetics, Ghent, Belgia) oraz Speed-oligo Mycobacteria (Vircell, Santa Fé Granada, Hiszpania), których celem jest region niekodujący ITS (ang. internal transcribed spacer), między genami kodującymi 16S i 23S rrna. Wszystkie te testy okazały się skuteczne w identyfikacji najczęściej występujących gatunków prątków, w tym M. kansasii. (System Accuprobe identyfikuje 5 taksonów Mycobacterium, a ściślej prątki kompleksu M. tuberculosis oraz 4 gatunki prątków NTM: M. avium, M. intracellulare, M. kansasii i M. gordonae. Z kolei testy INNO LiPA MYCOBACTERIA i Speed-oligo Mycobacteria wykrywają odpowiednio 17 i 14 różnych taksonów w oparciu o kombinację sygnałów pochodzących z hybrydyzacji z 14 lub 6 sondami) [10-13]. Stosunkowo od niedawna dostępny jest nowy kompleksowy system wykorzystujący specyficzne sondy DNA - GenoType Mycobacterium CM/AS (Hain Lifescience, Nehren, Niemcy). Zasada tego systemu opiera się na amplifikacji, techniką PCR multiplex, swoistych gatunkowo regionów w obrębie 23S rdna, a następnie hybrydyzacji produktów amplifikacji z odpowiednio zaprojektowanymi oligonukleotydami, związanymi na pasku nitrocelulozowym. Dwa najważniejsze testy to test GenoType Mycobacterium CM (ang. common mycobacteria) oraz GenoType Mycobacterium AS (ang. additional species), które pozwalają na jednoczesną identyfikację 15 gatunków Mycobacterium w tym M. tuberculosis, kompleksu M. avium, M. kansasii (CM) i 16 kolejnych mniej powszechnych patogennych prątków NTM, w tym: M. simiae, M. mucogenicum, M. goodii i M. celatum (AS). Użyteczność systemu GenoType Mycobacterium, jako szybkiego i skutecznego testu diagnostycznego potwierdzono w kilku badaniach ewaluacyjnych [14-16]. Alternatywną wobec technik opartych o hybrydyzację DNA metodę identyfikacji kilkunastu gatunków prątków NTM zaproponowali Plikaytis i wsp. W metodzie tej, amplifikuje się, techniką PCR, fragment genu kodującego białko szoku cieplnego (hsp65) o długości ok pz, a następnie otrzymany produkt poddaje się analizie restrykcyjnej (PCR-RFLP, ang. PCR-restriction fragment 2

3 length polymorphism) [17]. Metodę tę zmodyfikowali Telenti i wsp. [18] i w oparciu o nią zaproponowali algorytm identyfikacji umożliwiający różnicowanie 34, a później nawet 54 gatunków prątków [19, 20]. W identyfikacji gatunkowej prątków NTM zastosowanie znalazły także inne niż hsp65 geny metabolizmu podstawowego, m. in. dnaj [21], rpob [22] oraz tuf [23] kodujące odpowiednio: stresowe białko opiekuńcze, podjednostkę β polimerazy RNA oraz czynnik elongacji Tu (EF-Tu). Badania przeprowadzone przez Ross i wsp. [7] oraz późniejsze, poświęcone analizie regionu ITS [24], wykrywaniu sekwencji IS1652 [8], a także analizie PCR-RFLP genu hsp65 [18, 19], wykazały zróżnicowanie genetyczne w obrębie M. kansasii. Polimorfizm genetyczny tego gatunku potwierdzono w dwóch kompleksowych badaniach, w których zidentyfikowano 5 różnych typów genetycznych (I- V). Picardeau i wsp., badali zarówno szczepy kliniczne (38), jak i środowiskowe (24) stosując analizę reaktywności DNA z sondami wykrywającymi sekwencje IS1652 oraz powtórzone sekwencje typu MPTR (ang. major polymorphic tandem repeat; rodzaj powtórzonego DNA, stanowiący serię krótkich powtórzeń o długości 10 pz, występujący w szczepach M. kansasii, ale też M. tuberculosis i M. gordonae [25]), a także przy pomocy techniki PFGE (elektroforeza pulsacyjna w zmiennym polu elektrycznym; ang. pulsed-field gel electrophoresis), AFLP (polimorfizm długości amplifikowanych fragmentów; ang. amplified fragment length polymorphism) oraz hsp65 PCR-RFLP. Wszystkie metody, poza IS1652-RFLP, ujawniły wśród szczepów M. kansasii istnienie 5 różnych grup (klasterów), definiowanych jako typy genetyczne. Podczas gdy metody MPTR-RFLP i hsp65 RFLP generowały wzory specyficzne dla typów, analiza PFGE i AFLP wykazała dodatkowo zróżnicowanie wewnątrz poszczególnych genotypów [26]. Tylko dwa typy (II i III) zawierały sekwencję IS1652 (odpowiednio w 1 i 4-6 kopiach) i zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami Yang i wsp. [8], oba te typy były negatywne w reakcji z sondą pmk1-9, dając również negatywny wynik w teście AccuProbe. Wreszcie, wszystkie badane szczepy reagowały z sondą p6123 opisaną przez Yang i wsp. [9]. Wyniki przedstawione przez Picardeau i wsp. znalazły potwierdzenie w badaniu Alcaide i wsp., którzy zastosowali kilka markerów genetycznych w odniesieniu do próby 276 szczepów M. kansasii pochodzących z 4 krajów europejskich (Szwajcarii, Hiszpanii, Niemiec i Włoch) [27]. Przy użyciu analizy hsp65 RFLP, techniki PFGE oraz analizy sekwencyjnej regionu ITS, potwierdzono występowanie 5 typów genetycznych w obrębie M. kansasii. Ponadto, typy II i III dały negatywny wynik w teście AccuProbe i nie zawierały sekwencji kodującej inteinę genu gyra [27]. (Obecności sekwencji kodującej inteinę genu gyra dowiedziono wcześniej dla typu I, ale nie dla typu II) [28]. Niedawno opisano dwa nowe typy genetyczne M. kansasii (typ VI i VII) [29, 30]. Chociaż sekwencjonowanie regionu ITS oraz analiza hsp65 PCR-RFLP uważane są za jednakowo skuteczne w genotypowaniu M. kansasii, okazuję się, że mogą pojawiać się rozbieżności między tymi dwiema metodami. Iwamoto i Saito opisali 3 szczepy M. kansasii niosące sekwencję ITS specyficzną dla typu II, i generujące jednocześnie nieopisany wcześniej profil hsp65 PCR-RFLP. Ponadto 4 inne szczepy 3

4 zawierały sekwencję ITS specyficzną dla typu II, generując przy tym profil hsp65 RFLP charakterystyczny dla typu I. (Szczepy te oznaczono jako prezentujące tzw. pośredni typ I) [31]. W identyfikacji typów genetycznych M. kansasii (I-VI) skuteczną okazała się też metoda oparta o analizę restrykcyjną amplifikowanego fragmentu genu rpob o długości 342 pz [22]. W badaniu zróżnicowania genetycznego M. kansasii stosowano wiele markerów molekularnych. Tylko niewielki wewnątrzgatunkowy polimorfizm wykazano przy użyciu techniki LRF-(ang. large restriction fragment)-pfge [26, 27, 32-34] i analizy AFLP [26, 35]. Badania przeprowadzone przez Picardeau i wsp., pozwoliły wyróżnić 14 różnych wzorów LRF-PFGE wśród 60 szczepów M. kansasii, w tym 4 wzory obserwowane były wśród 24 szczepów należących do typu I. W tym samym badaniu, analiza AFLP przy użyciu jednego enzymu restrykcyjnego (PstI) nie ujawniła zróżnicowania genetycznego wśród szczepów reprezentujących typ I [26]. W innym badaniu, analiza AFLP z wykorzystaniem enzymu ApaI pozwoliła wyodrębnić wśród 253 szczepów M. kansasii typu I 12 odrębnych klasterów [35]. W badaniach Iinuma i wsp., przeprowadzono LRF-PFGE na próbie 84 szczepów klinicznych M. kansasii z Japonii. Wyróżniono 21 wzorów LRF-PFGE, stosując enzym VspI oraz 16 wzorów stosując enzym SpeI [32]. Analizę PFGE wykorzystał też Zhang i wsp., którzy wśród 71 szczepów opisali 28, 32 i 35 różnych wzorów, przy użyciu enzymów, odpowiednio: AseI (izoschizomer VspI), DraI i XbaI, przy czym różnice między wzorami były niewielkie [33]. Znaczenie typowania genetycznego M. kansasii polega przede wszystkim na różnicowaniu typów patogennych i środowiskowych (klinicznie obojętnych). Obecnie diagnostyka zakażeń prątkami NTM, a zwłaszcza tych wywołanych przez M. kansasii posiada istotne ograniczenia. Po pierwsze, wszystkie dostępne testy identyfikacji są zależne od hodowli i wymagają uzyskania kultury bakteryjnej (na podłożu płynnym lub stałym). To z kolei znacząco wydłuża czas i zwiększa koszty analizy. Po drugie, brak obecnie jakichkolwiek komercyjnych testów pozwalających na identyfikację poznanych dotąd genotypów M. kansasii. (Zestaw INNO LiPA rozpoznaje typ I i II, nie różnicując między typem III, IV i V; zestaw GenoType MYCOBACTERIA CM/AS nie różnicuje między typami I-VI). Po trzecie, żadna z dostępnych obecnie metod nie posiada wystarczającej rozdzielczości dla wiarygodnej oceny polimorfizmu genetycznego M. kansasii. Po czwarte, brak jest komercyjnych testów do szybkiego wykrywania lekoopormości w szczepach M. kansasii. Dwa dostępne na rynku testy: GenoType MTBDRplus oraz MTBDRsl (Hain Lifescience, Nehren, Niemcy) pozwalają na identyfikację oporności na izoniazyd, ryfampicynę, fluorochinolony, aminoglikozydy/cykliczne peptydy i etambutol poprzez wykrywanie mutacji związanych z opornością na poszczególne leki jedynie w szczepach M. tuberculosis [36, 37]). Niezwykle ograniczona wiedza na temat korelacji między genotypem a fenotypem, molekularnych mechanizmów i determinantów wirulencji i lekooporności prątków M. kansasii są przyczyną braku wystandaryzowanych procedur terapeutycznych (schematów leczenia) w przypadku chorób wywołanych przez te patogeny. 4

5 2. CHARAKTERYSTYKA PROBLEMU Obecnie znanych jest ponad 120 gatunków prątków NTM uznawanych za czynniki etiologiczne chorób człowieka, o zmiennym obrazie klinicznym, przebiegu i rokowaniach. Mycobacterium kansasii jest jednym z najczęściej izolowanych gatunków prątków niegruźliczych z próbek klinicznych na całym świecie. Chociaż prewalencja zakażeń prątkami M. kansasii wykazuje duże zróżnicowanie geograficzne, w większości regionów sytuują się one na pierwszym miejscu jako przyczyna chorób płuc wywołanych prątkami NTM w populacji HIV-seronegatywnej i na drugim miejscu jako przyczyna infekcji uogólnionych wśród pacjentów HIV-seropozytywnych [4, 38]. W Polsce liczba przypadków chorób wywołanych przez prątki NTM znacząco wzrosła w ostatnich latach. Za większość tych przypadków odpowiada właśnie M. kansasii [39]. (Częstość chorób wywołanych przez M. kansasii w Polsce nie jest znana, ponieważ nie istnieje obowiązek rejestracji tych przypadków. Można jedynie szacować ich liczbę pośrednio, tj. w odniesieniu do częstości występowania przypadków gruźlicy. Tak oszacowana częstość zachorowań wskutek zakażeń M. kansasii w Polsce, w 2010 roku, wyniosła 2,22 przypadków na osób [H. Grubek-Jaworska, doniesienie ustne, 2012]). Zakażenia wywołane przez M. kansasii mają szczególne znaczenie kliniczne i epidemiologiczne, a to głównie ze względu na utrzymującą się globalnie wzrostową tendencję w izolacji patogenu z próbek klinicznych, specyfikę leczenia zakażeń (leczenie wymaga długotrwałego przyjmowania kilku leków równocześnie) oraz skłonność bakterii do rozwoju lekooporności, w tym lekooporności złożonej. Wydaje się, że głównym źródłem zakażeń M. kansasii, podobnie jak w przypadku innych prątków NTM, jest środowisko. Transmisja zakażeń między ludźmi nie została w pełnie potwierdzona. Prątki M. kansasii rzadko izolowane są z gleby, naturalnych zbiorników wodnych, czy tkanek zwierzęcych. Często natomiast wykrywane są w wodzie wodociągowej, którą uważa się za główny rezerwuar patogenu. Jednak związek między naturalnym rezerwuarem M. kansasii a chorobą u ludzi pozostaje wciąż w dużej mierze niejasny. Co więcej, izolacja prątków M. kansasii od ludzi wcale niekoniecznie musi oznaczać prawdziwej infekcji, lecz jedynie kolonizację lub kontaminację [1, 4, 6]. Odróżnienie infekcji od pseudoinfekcji, a tym samym ocena klinicznego znaczenia prątków M. kansasii jest niezwykle istotna. Wiarygodna diagnoza choroby wywołanej prątkami M. kansasii oparta jest na wnikliwym badaniu klinicznym i laboratoryjnym, wymagającym syntetycznej oceny danych symptomatologicznych, radiologicznych i mikrobiologicznych. Zmienność w obrębie gatunku M. kansasii dowiedziona istnieniem 7 różnych typów genetycznych ma szereg klinicznie i epidemiologicznie ważnych implikacji. Wyniki przeprowadzonych dotychczas badań sugerują, że typ I M. kansasii jest najbardziej rozpowszechniony wśród szczepów klinicznych na całym świecie i rzadko izolowany jest ze środowiska. Udział poszczególnych typów genetycznych wśród szczepów M. kansasii zbadali po raz pierwszy Picardeau i wsp. [26]. Najczęstszym wśród wyróżnionych typów genetycznych (I-V) był typ I, który opisywał 25 (39,7%) z 63 badanych 5

6 szczepów M. kansasii zarówno pochodzenia środowiskowego, jak i klinicznego. Wśród szczepów klinicznych wykazano obecność wszystkich 5 typów genetycznych, przy czym typ I obejmował 16 (42,1%) spośród 38 takich szczepów. Częstość występowania I typu była znacznie wyższa w badaniach przeprowadzonych przez Alcaide i wsp. [27]. Opisywał on 109 (66,9%). spośród 163 badanych szczepów klinicznych pochodzących z krajów europejskich. Wyższy odsetek typu I M. kansasii wśród szczepów klinicznych stwierdzono w 3 kolejnych europejskich badaniach. Taillard i wsp. wykazali, że 77,9% (60/77) szczepów ze Szwajcarii prezentowało genotyp I [30], podczas gdy w badaniu przeprowadzonym w Hiszpanii przez Gaafar i wsp., spośród 252 szczepów M. kansasii tylko dwa należały do II typu genetycznego (pozostałe prezentowały genotyp I) [35]. W innym badaniu z Hiszpanii wykazano nieobecność II typu genetycznego wśród analizowanych szczepów klinicznych. Typ I opisywał 97,8% (91/93) szczepów. (Dwa szczepy należały do typu VI) [40]. Analiza szczepów klinicznych ze Stanów Zjednoczonych wykazała, że wszystkie szczepy, z wyjątkiem trzech, należały do I typu genetycznego. (Dwa szczepy należały do III typu genetycznego, jeden do typu II) [33]. Podobne wyniki otrzymali Chimara i wsp. w Brazylii. Wśród 184 szczepów klinicznych, tylko dwa prezentowały inny niż I typ genetyczny (jeden szczep należał do typu II, jeden do typu III) [41]. Podsumowując, wydaje się, że szczepy M. kansasii odpowiedzialne za zakażenia u ludzi należą niemal wyłącznie do typu I i II. Co ciekawe, pacjenci HIV-seropozytywni są szczególnie podatni na zakażenie typem II M. kansasii [26, 30, 42]. Związek między typem II M. kansasii a HIVseropozytywnością można tłumaczyć niskim potencjałem chorobotwórczym tego genotypu [30]. Epidemiologia i patogeneza chorób związanych z M. kansasii stanowi zaniedbany obszarem badań. W Polsce literatura poświęcona epidemiologicznym i molekularnym zagadnieniom związanym z prątkami M. kansasii jest prawie nieobecna. Jeszcze do niedawana gatunek M. kansasii traktowano jako wysoce klonalny. Pogląd ten podważyła identyfikacja różnych typów genetycznych (I-VII) w obrębie gatunku. Jednak rzeczywisty stopień polimorfizmu genetycznego w obrębie M. kansasii jest nieznany. Niezdefiniowana struktura genetyczna gatunku wynika z niewystarczającego warsztatu obecnie dostępnych metod genetycznych. Opracowanie nowych metod, charakteryzujących się wysokim potencjałem różnicującym jest niezbędne dla oceny zmienności genetycznej prątków M. kansasii. Chociaż w identyfikacji gatunkowej prątków NTM, włączając M. kansasii, stosowanych jest już kilka różnych metod, żadna nie jest optymalną, w tym sensie, że nie wykrywa jednego genu (sekwencji), specyficznego wyłącznie dla danego gatunku prątka. Znalezienie takich wysoko specyficznych gatunkowo markerów genetycznych jest jednym z największych wyzwań współczesnej diagnostyki mykobakteriologicznej. Istnieje wciąż zapotrzebowanie na nowe, niezależne od hodowli (tj. stosowane bezpośrednio w materiale klinicznym), wystandaryzowane systemy wykrywania M. kansasii, które umożliwią wiarygodną i szybką identyfikację patogenu na poziomie zarówno gatunku, jak i szczepu. (Obecnie taki system nie jest dostępny). 6

7 Istnieją tylko skąpe i kontrowersyjne doniesienia dotyczące epidemiologicznego i patogennego znaczenia dotychczas zidentyfikowanych genotypów M. kansasii, a zwłaszcza typów III-VII, które tylko sporadycznie wykrywane są jako sprawcy zakażeń u ludzi. Izolacja tych typów od pacjentów z chorobami płuc sugeruje ich rolę jako czynników kolonizujących lub kontaminujących, pochodzących ze środowiska. Dalsze badania są niezbędne dla wyjaśnienia epidemiologicznego znaczenia dotąd opisanych i jeszcze nie poznanych genotypów M. kansasii. Brak najmniejszych danych dotyczących mechanizmów wirulencji i oporności na leki w szczepach M. kansasii. Nie ustalone są także związki miedzy właściwościami genotypowymi a prezentowanym profilem fenotypowym. Ogromne luki w wiedzy na temat M. kansasii powodują, że epidemiologiczne aspekty zakażeń prątkami M. kansasii, w tym rezerwuar patogenu, zakaźność, drogi transmisji, rozpowszechnienie w różnych regionach geograficznych pozostają niejasne. To z kolei utrudnia wdrożenie jakichkolwiek procedur kontrolnych i profilaktycznych. Podsumowując, z uwagi na fakt, że brak jest obecnie skutecznej metody typowania genetycznego M. kansasii, pożądanym jest opracowanie nowej techniki o wysokim potencjale różnicującym. Ponadto, istnieje potrzeba opracowania nowych, szybkich i skutecznych metod wykrywania lekooporności oraz cech wirulencji prątków M. kansasii, umożliwiających odróżnienie zakażenia od stanu kolonizacji (lub kontaminacji), przez co pozwalających wdrożyć szybkie i efektywne leczenie. 3. CEL PROJEKTU Celem projektu jest przeprowadzenie wszechstronnej analizy struktury genetycznej szczepów Mycobacterium kansasii. Przeprowadzona zostanie dokładna charakterystyka gatunku, obejmująca m. in. poziom polimorfizmu genetycznego oraz genetyczne determinanty lekooporności, chorobotwórczości i wirulencji. W ramach projektu opracowane zostaną nowe markery molekularne o kapitalnym znaczeniu w badaniach epidemiologicznych (identyfikacja na poziomie gatunku i szczepu) oraz wykrywaniu lekooporności i wirulencji w szczepach M. kansasii. W oparciu o zdefiniowane markery genetyczne opracowana zostanie formuła nowych molekularnych testów diagnostycznych. Ostatecznym celem projektu jest zaproponowanie uniwersalnego algorytmu identyfikacji uwzględniającego wykrywanie nie tylko gatunku, ale poszczególnych szczepów i typów genetycznych M. kansasii, a także lekowrażliwości i wirulencji patogenu, składającego się z zestawu prostych, szybkich i wiarygodnych testów diagnostycznych optymalnie mających zastosowanie bezpośrednio do próbek klinicznych. 7

8 4. EFEKT KOŃCOWY Projekt pozwoli szczegółowo rozpoznać strukturę genetyczną szczepów M. kansasii oraz podać możliwie dokładną charakterystykę genetyczną gatunku. Wyniki genotypowania, w połączeniu z wnikliwą analizą dokumentacji medycznej (danych demograficznych i klinicznych) pomogą przybliżyć kluczowe cechy zakażeń prątkami M. kansasii. Wyniki badań projektu dostarczą odpowiedzi na pytania, takie jak: jakie są naturalne rezerwuary patogenu?; jaki jest związek między rezerwuarami patogenu a chorobą u ludzi?; czy wszystkie szczepy M. kansasii mają podobny potencjał epidemiologiczny?; czy istnieją specyficzne dla genotypów różnice w fenotypie wyrażające się odmienną wirulencją, tropizmem narządowym, czy też zdolnością transmisji? Wiedza na ten temat może mieć ogromne znaczenie dla postępowania z chorymi na mykobakteriozy, jak również dla opracowania i wdrożenia nowych strategii profilaktycznych. Poznanie genetycznych podstaw lekooporności i wirulencji M kansasii umożliwi zlokalizowanie i ocenę nowych celów molekularnych dla terapii zakażeń wywołanych prątkami NTM. Najważniejszym osiągnięciem projektu będzie zaproponowanie i wdrożenie nowych narzędzi metodologicznych, które usprawnią molekularną diagnostykę M. kansasii. Szczególne znaczenie będzie miało opracowanie nowej metody typowania genetycznego, charakteryzującej się wysokim potencjałem różnicującym, jak również molekularnych metod wykrywania lekooporności i czynników wirulencji M. kansasii. Na bazie tych metod podana zostanie formuła pod komercyjnie dostępne, proste, szybkie i wiarygodne testy diagnostyczne o wysokiej czułości i swoistości. Testy te zostaną włączone do nowego algorytmu identyfikacji zakażeń prątkami M. kansasii. Ważnym celem projektu będzie też utworzenie pierwszej bazy wzorów genetycznych M. kansasii, inicjującej powołania pierwszego, międzynarodowego rejestru takich wzorów. Ogólnie, wyniki przeprowadzonych badań przyczynią się znacząco do rozwoju diagnostyki molekularnej M. kansasii i diagnostyki mykobakteriologicznej w ogóle. Wyniki uzyskane w ramach projektu będą bez wątpienia stanowiły ważny krok na drodze wiodącej do całkowitej eliminacji zakażeń i chorób wywoływanych przez prątki NTM jako problemu zdrowotnego populacji ludzkiej. Wyniki otrzymane w ramach przedłożonego projektu pozwolą przygotować szereg publikacji do czasopism mikrobiologicznych o wysokim wskaźniku Impact Factor (m. in. Journal of Clinical Microbiology, Clinical Microbiology and Infection, European Respiratory Journal ). Wyniki projektu zostaną również przedstawione społeczności naukowej, ustnie i/lub w formie streszczeń na krajowych i międzynarodowych sympozjach i konferencjach (m. in. Polskiego Towarzystwa Chorób Płuc, European Respiratory Society, European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), czy the Annual Congress of the European Society of Mycobacteriology (ESM)). 8

9 5. HARMONOGRAM PRAC PRZYGOTOWANIE MATERIAŁU BADAWCZEGO. REWITALIZACJA SZCZEPÓW. WYWIAD EPIDEMIOLOGICZNY Na wstępie zostanie przygotowany materiał badawczy. Etap ten będzie obejmował staranne przeszukanie całej kolekcji szczepów należącej do Katedry Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego, w celu wyboru tylko takich szczepów, które wcześniej zostały zidentyfikowane jako M. kansasii przy użyciu standardowych procedur biochemicznych, testu AccuProbe lub wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC). Szczepy w liczbie ok będą ożywiane przez posiew na pożywce Löwenstein a-jensen a. Do badania zostaną również włączone szczepy M. kansasii (w tym szczepy referencyjne) reprezentujące siedem typów genetycznych (I-VII), zdeponowane w ogólnodostępnych kolekcjach międzynarodowych. Szczepy będą też pozyskiwane, na zasadach komercyjnych, od różnych ośrodków badawczych na całym świecie. Równolegle, przeprowadzona zostanie analiza retrospektywna danych o chorych, od których izolowano szczepy M. kansasii (zebrany zostanie szczegółowy wywiad demograficzny i kliniczny). Przeprowadzona zostanie wnikliwa analiza dokumentacji medycznej poszczególnych przypadków. Istotne znaczenie będą miały dane dotyczące wieku, płci, miejsca zamieszkania, zawodu, nałogów, dodatkowych schorzeń, dane radiologiczne i histopatologiczne, dane dotyczące badań mikroskopowych (na obecność prątków kwasoopornych), rodzaju materiału klinicznego, liczby hodowli pozytywnych na obecność prątków, a także czasu hospitalizacji chorych, schematów i czasu leczenia oraz wyników leczenia. W celu wstępnego rozróżnienia między infekcją a kolonizacją, wszystkie przypadki zakażeń M. kansasii zostaną zweryfikowane ściśle w oparciu o kryteria zalecane przez American Thoracic Society (ATS). IDENTYFIKACJA GATUNKOWA. WERYFIKACJA PRZYNALEŻNOŚCI WYBRANYCH SZCZEPÓW DO GATUNKU Celem tej części projektu będzie potwierdzenie przynależności gatunkowej wszystkich badanych szczepów przy użyciu najnowszych, dostępnych metod molekularnych. Wcześniej wszystkie szczepy będą miały uzupełnioną identyfikację przy pomocy konwencjonalnych testów biochemicznych [43], systemu Accuprobe (Gen-Probe, San Diego, USA) [10], oraz techniki HPLC [5]. Przeprowadzone zostanie, ściśle wg zaleceń producenta, typowanie testem GenoType Mycobacterium CM/AS (HAIN Lifescience, Niemcy). Wykonane zostaną analizy PCR-RFLP dla genów hsp65, rpob i tuf, wg wcześniej publikowanych protokołów [18, 22, 23]. Pozwoli to na ocenę zdolności rozdzielczej metod molekularnych w identyfikacji M. kansasii. Ostatecznym celem tej części projektu będzie przeprowadzenie analizy porównawczej 4 różnych metod stosowanych w identyfikacji M. kansasii, tj.: metody konwencjonalnej, opartej o kryteria biochemiczne (fenotypowe) (i), techniki HPLC (ii), 9

10 komercyjnego testu GenoType Mycobacterium, wykorzystującego zasadę hybrydyzacji DNA (iii) oraz analizy PCR-RFLP trzech różnych genetycznych loci (hsp65, rpob i tuf) (iv). Podobne badanie porównawcze nigdy wcześniej nie było przeprowadzone. Dla celów molekularnej identyfikacji gatunkowej, a także do dalszych etapów genotypowania wykonana zostanie izolacja genomowego DNA prątków [44]. TYPOWANIE GENETYCZNE M. KANSASII. STRUKTURA GENETYCZA M. KANSASII Ta część projektu będzie miała na celu ocenę zróżnicowania genetycznego szczepów M. kansasii. W pierwszym etapie, wyniki analizy hsp65 PCR-RFLP wykorzystane zostaną do identyfikacji typów genetycznych M. kansasii. Umożliwi to określenie występowania i rozpowszechnienia 7 dotychczas opisanych typów genetycznych M. kansasii (a być może ujawni istnienie nowych genotypów). Jako, że wyniki pochodzące z analizy hsp65 PCR-RFLP nie zawsze korespondują z wynikami analiz sekwencyjnych regionu ITS, zastosowana zostanie także ta metoda badawcza (analiza sekwencyjna regionu ITS). Dodatkowo, wyniki otrzymane przy pomocy obu metod zostaną porównane z wynikami uzyskanymi z analizy rpob PCR-RFLP. Wreszcie, aby lepiej poznać ewolucyjne powiązania między typami genetycznymi M. kansasii przeprowadzona zostanie analiza sekwencyjna genów rpob i hsp65. Znaczenie analizy sekwencyjnej genu rpob w typowaniu genetycznym M. kansasii nie zostało w pełni wyświetlone [45]. Drugim krokiem będzie ocena przydatności dwóch metod stosowanych dla oceny zróżnicowania wewnątrzgatunkowego M. kansasii tj. analizy PFGE i AFLP. Obecnie, metody te jako jedyne pozwalają różnicować w obrębie poszczególnych typów genetycznych [35, 33]. Wyniki uzyskane w dwóch wyżej wymienionych etapach zostaną skonfrontowane z wynikami innych autorów, co pozwoli ocenić, w perspektywie globalnej, heterogenność gatunku M. kansasii, a także zdefiniować potencjalne ewolucyjne relacje między poszczególnymi genotypami. Ważnym etapem tej części projektu będzie poszukiwanie nowych molekularnych narzędzi, zdolnych z większą rozdzielczością wykrywać polimorfizm genetyczny w obrębie M. kansasii. W tym celu wykonanych zostanie szereg analiz bioinformatycznych, w tym szczegółowa analiza in silico całego genomu M. kansasii (na bazie zdeponowanej sekwencji szczepu referencyjnego M. kansasii ATCC 12478). Poszukiwane będą charakterystyczne sekwencje genomowe, takie jak np. sekwencje repetytywne, mogące mieć zastosowanie jako markery genetyczne w identyfikacji (sub-)gatunkowej M. kansasii. Jednym z poszukiwanych rodzajów powtórzonego DNA będą sekwencje typu VNTR (ang. variable number of tandem repeats), a w szczególności sekwencje typu MIRU (ang. mycobacterial interspersed repetitive units), które z powodzeniem wykorzystane zostały w genotypowaniu kilkunastu gatunków prątków NTM [46-48]. Typowanie oparte o sekwencje typu VNTR jest odmianą typowania MLVA (ang. multiple-locus variable-number tandem repeat analysis) i polega na amplifikacji techniką PCR specyficznego locus zawierającego tandemowo ułożone sekwencje powtórzone, a następnie rozdziale elektroforetycznym produktów amplifikacji i określeniu 10

11 ich wielkości. Wielkość produktu zależy od liczby powtórzeń jednostki rdzeniowej w danym locus. Wzory genetyczne generowane w typowaniu MLVA stanowią kody numeryczne, odzwierciedlające liczbę powtórzeń motywu sekwencyjnego w każdym z analizowanych loci. Jest to szczególnie wygodne dla porównywania wyników między ośrodkami, a także w analizach filogenetycznych. Identyfikacja genetycznych loci mogących mieć zastosowanie w typowaniu VNTR będzie wymagała szczegółowej analizy bioinformatycznej na bazie sekwencji genomu szczepu referencyjnego ATCC Poszukiwane będą przede wszystkim sekwencje homologiczne wobec sekwencji typu MIRU występujących w szczepach M. tuberculosis, przy użyciu programów BLAST ( oraz Finder ( W przypadku wykrycia loci VNTR, zaprojektowane zostaną specyficzne startery ukierunkowane na sekwencje flankujące region VNTR umożliwiając jego amplifikację i dalszą analizę. Innym podejściem wykorzystywanym do genotypowania szczepów M. kansasii będzie użycie techniki MST (ang. multispacer sequence typing). Opiera się ona na analizie sekwencji regionów międzygenowych bakterii. Technikę MST uprzednio stosowano w genotypowania tylko kilku gatunków prątków, w tym M. tuberculosis [49] i prątków kompleksu M. avium [50]. W celu wytypowania regionów przydatnych do genotypowania MST, sekwencja genomu szczepu referencyjnego ATCC ponownie będzie poddana analizie bioinformatycznej przy użyciu oprogramowania EMBOSS ( Po wytypowaniu sekwencji międzygenowych zaprojektowane zostaną odpowiednie pary starterów. Produkty PCR będą następnie sekwencjonowane i analizowane przy użyciu oprogramowania CLUSTAL W ( W celu określenia wewnątrzgatunkowej zmienności genetycznej M. kansasii wykonane zostaną analizy PCR-RFLP oraz sekwencyjne innych niż dotąd badane genów metabolizmu podstawowego. Etap ten zakłada przeszukanie genomu M. kansasii w celu znalezienia homologów genów M. tuberculosis takich, jak np. katg kodujący enzym katalazę-peroksydazę, warunkujący wrażliwość prątków na izoniazyd. (M. kansasii jest naturalnie oporny na izoniazyd. Sekwencjonowanie homologu katg w M. kansasii, może przybliżyć molekularne podstawy oporności na ten lek) [43]). Wyniki otrzymane przy użyciu różnych metod typowania genetycznego zostaną porównane i poddane analizie skupień, tak aby dokładnie określić pokrewieństwo klonalne między szczepami M. kansasii. Potencjał różnicujący każdej metody genotypowania będzie obliczany przy użyciu tzw. Hunter Gaston Index [51]. W celu określenia pokrewieństwa genetycznego szczepów M. kansasii, na podstawie otrzymanych wzorów genetycznych, wykonana zostanie analiza skupień (a także konstrukcja drzew filogenetycznych) przy użyciu oprogramowania GelCompar (ver. 4.0; Applied Maths., Kortrijk, Belgia). Ogólnie, prezentowana część projektu pozwoli uzyskać szczegółowy wgląd w strukturę genetyczną szczepów M. kansasii. 11

12 BADANIE WRAŻLIWOŚCI NA LEKI I IDENTYFIKACJA GENÓW WIRULENCJI Badanie wrażliwości na leki (DST ang. drug susceptibility testing) jest integralnym elementem postępowania diagnostycznego przy zakażeniach prątkami M. kansasii. Obecnie nieznany jest związek między określonym typem genetycznym M. kansasii a opornością na leki. Ważne jest także określenie czynników ryzyka rozwoju lekooporności w szczepach M. kansasii. Celem tej części projektu będzie próba wyjaśnienia tych zagadnień. Ustalone zostaną profile lekowrażliwości dla wszystkich badanych szczepów M. kansasii. Będą one analizowane w kontekście wzorów genetycznych oznaczonych dla poszczególnych szczepów. Jak dotąd nie przeprowadzono jeszcze podobnego badania. Profile lekowrażliwości oznaczone zostaną metodą mikrorozcieńczeń, zgodnie ze standardowym protokołem Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) [52]. Testowane będą leki tzw. pierwszego rzutu: streptomycyna (SM), izoniazyd (INH), etambutol (EMB), ryfampicyna (RMP), a także tzw. drugiego rzutu: ryfabutyna (RFB), amikacyna (AMK), ciprofloksacyna (CFX), klofazymina (CFZ), klarytromycyna (CLR), etionamid (ETH), cykloseryna (CS). Stężenia graniczne stosowane do klasyfikowania szczepów jako wrażliwe lub oporne na dany lek będą zgodne z wytycznymi CLSI [52]. Do określenia minimalnego stężenia hamującego (MIC, ang. minimal inhibitory concentration) leków stosowane będą, zgodnie z instrukcją producenta, paski E-test (AB Biodisk, Solna, Szwecja). Czynniki ryzyka rozwoju lekooporności zostaną zdefiniowane poprzez porównanie przypadków zakażeń prątkami M. kansasii opornymi i wrażliwymi na poszczególne leki. Zbadane zostaną także determinanty wirulencji M. kansasii. Motywem do podjęcia takich badań jest fakt, że w literaturze światowej brak jakichkolwiek szerszych danych na temat patogenezy chorób wywołanych prątkami M. kansasii. Ponadto, jako, że wirulencja patogenu znacząco wpływa na jego epidemiologię, poznanie determinantów zjadliwości prątków M. kansasii pozwoli lepiej zrozumieć epidemiologię wywoływanych przez nie zakażeń. W celu identyfikacji genów wirulencji M. kansasii, na podstawie analizy dostępnej literatury oraz dostępnych baz danych utworzony zostanie wykaz genów kodujących potencjalne czynniki wirulencji. Wybrane zostaną geny, kodujące zarówno dobrze zdefiniowane, jako i hipotetyczne czynniki wirulencji dla M. tuberculosis, jak np. katg, hspx, plcabc, i fbpa [53], czy też geny MAV dla prątków M. avium [54]). Sekwencje tych genów będą poszukiwane w genomie M. kansasii (ATCCC 12478). Obecność danego genu zostanie potwierdzona jeśli jego białkowy produkt wykaże ponad 50% homologii z typowanym białkiem i jeśli długość białkowego produktu przekroczy 80% długości białka typowanego. Zidentyfikowane tak geny będą następnie amplifikowane i analizowane sekwencyjnie. Strategia PCR-MLST (ang. multilocus sequence typing) zostanie wykorzystana do różnicowania wewnątrzgatunkowego prątków. Ponadto, z uwagi na fakt, że obecność genu nie jest tożsama z ekspresją białka, oznaczony zostanie poziom transkrypcji genu przy użyciu techniki Real-Time (RT)-PCR. Wyniki uzyskane na tym etapie zostaną porównane z wynikami z wcześniejszych etapów. 12

13 INTEGRACJA DANYCH. ZAPORPONOWANIE METODOLOGICZNEGO ALGORYTMU GENOTYPOWANIA M. KANSASII Celem ostatniej części projektu będzie integracja danych molekularnych (pochodzących z badań nad zróżnicowaniem genetycznym szczepów M. kansasii) oraz społeczno-demograficznych i klinicznych (pochodzących z przeglądu dokumentacji medycznej chorych) w całościowej analizie epidemiologicznej zakażeń M. kansasii. Szczególnie ważne będzie porównanie wyników uzyskanych dla szczepów klinicznych i środowiskowych. Podjęta zostanie próba odpowiedzi na pytania dotyczące rezerwuaru M. kansasii, związku między nim a chorobą u ludzi, związku między cechami genotypowymi a określonym profilem fenotypowym, wyrażającym się odmienną wirulencją, tropizmem narządowym, czy też zdolnością transmisji, a także możliwości transmisji zakażeń między ludźmi oraz różnic w potencjale epidemiologicznym między różnymi genotypami (szczepami) M. kansasii. Wyniki wszystkich badań wykonanych w trakcie realizacji projektu będą poddawane licznym analizom porównawczym i statystycznym. Wyniki będą też zestawiane z danymi obecnymi w literaturze przedmiotu. Wnioski wyprowadzone z badań ujętych w projekcie zostaną skonfrontowane z istniejącą wiedzą i formułowanymi dotąd hipotezami na temat epidemiologii M. kansasii. Na podstawie kompleksowej analizy zebranych danych, zaproponowany zostanie nowy algorytm identyfikacji, typowania genetycznego oraz wykrywania lekooporności i wirulencji w szczepach M. kansasii. 13

14 SCHEMAT ILUSTRUJĄCY KLUCZOWE ETAPY PROJEKTU 14

15 PLANOWANE POSTĘPY W REALIZACJI PROJEKTU I. KAMIENIE MILOWE Kamień milowy Planowany czas rozpoczęcia Planowany czas zakończenia Planowany czas punktu krytycznego Planowany czas punktu ostatecznego 1. Zebranie materiału badawczego 1. miesiąc 6 miesiąc 2. miesiąc 6. miesiąc 2. Identyfikacja gatunkowa 7. miesiąc 12 miesiąc 9. miesiąc 12. miesiąc 3. Genotypowanie M. kansasii; Struktura genetyczna M. kansasii 13. miesiąc 30 miesiąc 23. miesiąc 28. miesiąc Lekowrażliwość i identyfikacja genów wirulencji Integracja danych. Propozycja nowego algorytmu identyfikacji M. kansasii 21. miesiąc 32 miesiąc 28. miesiąc 32. miesiąc 33. miesiąc 36 miesiąc 34. miesiąc 36. miesiąc II. WSKAŹNIKI PRODUKTU Nazwa wskaźnika Nowe testy diagnostyczne: 1. typowanie genetyczne; 2. oznaczanie lekooporności; 3. oznaczanie cech wirulencji Nowy algorytm identyfikacji zakażeń M. kansasii Określenie molekularnych celów dla nowych strategii terapeutycznych Jednostka miary wskaźnika Planowana wartość bazowa mierzona przed rozpoczęciem realizacji projektu Planowana wartość docelowa wskaźnika III. WSKAŹNIKI REZULTATU Nazwa wskaźnika Identyfikacja oraz wybór markerów genetycznych mających zastosowanie w różnicowaniu wewnątrzgatunkowym, wykrywaniu lekooporności i wirulencji Określenie profilów lekooporności dla szczepów M. kansasii Komercjalizacja opracowanych narzędzi metodologicznych Upowszechnienie wyników badań przez udział w konferencjach (referaty/plakaty) i publikacje naukowe Jednostka miary wskaźnika Planowana wartość bazowa mierzona przed rozpoczęciem realizacji projektu Planowana wartość docelowa wskaźnika

16 6. CEL EKONOMICZNY I ZNACZENIE PRAKTYCZNE PROJEKTU Celem ekonomicznym projektu jest opracowanie nowych testów diagnostycznych, pozwalających na szybką i wiarygodną identyfikację zakażeń M. kansasii. Szczególną wartość będą miały opracowania w formie komercyjnie dostępnych testów metod typowania genetycznego szczepów M. kansasii, charakteryzujących się wysokim potencjałem różnicującym, a także technik wykrywania lekooporności i cech (poziomu) wirulencji w szczepach M. kansasii. (Obecnie metody takie nie są komercyjnie dostępne). Na podstawie opracowanych testów diagnostycznych, zaproponowany zostanie nowy, uniwersalny algorytm molekularnej identyfikacji zakażeń M. kansasii, który w istotny sposób ułatwi i przyspieszy postawienie właściwej diagnozy i dokonanie wyboru najodpowiedniejszej terapii, prowadząc do wyleczenia w jak najszybszym czasie z wykluczeniem lub minimalizując działania niepożądane. Wyniki badań przeprowadzonych w ramach projektu będą miały istotne znaczenie dla praktyki klinicznej, tj. postępowania z chorymi na mykobakteriozy wywołane zakażeniem M. kansasii, czy też opracowania i wdrożenia nowych strategii terapeutycznych i profilaktycznych. Metody te zostaną włączone jako integralny element światowego programu walki na rzecz eliminacji tego patogenu. Wyniki uzyskane w trakcie realizacji projektu w istotny sposób poszerzą wiedzę na temat epidemiologii zakażeń wywoływanych przez prątki M. kansasii. W świetle wyjątkowo ubogiej literatury poświęconej temu problemowi, otrzymane wyniki pozwolą po raz pierwszy szczegółowo opisać cechy epidemiologiczne zakażeń M. kansasii, włączając źródła i dynamikę transmisji zakażeń, stopień osobniczej podatności na zakażenia, czy w końcu poziom wirulencji i inwazyjności szczepów M. kansasii. Wyniki molekularnych badań epidemiologicznych, wykonanych w ramach projektu, będą miały bezpośrednie przełożenie na praktykę kliniczną (leczenie chorych) oraz nadzór epidemiologiczny (profilaktyka medyczna). Z kolei opracowanie nowej metody wykrywania zakażeń M. kansasii przyczyni się do rozwoju diagnostyki bakteriologicznej. W końcu wyniki otrzymane w toku badań przewidzianych w projekcie będą miały znaczenie dla lepszego poznania filogenetyki i ewolucji NTM. Prezentowany projekt posiada wysoki potencjał aplikacyjny i komercjalizacyjny. Przy transferze wyników prac do gospodarki planujemy skorzystać z oferty Uniwersyteckiego Ośrodka Transferu Technologii (UOTT), który wspiera przedsięwzięcia mające na celu praktyczne wykorzystanie wyników pracy naukowej. W ramach działań przygotowujących wyniki badań do wdrożenia planowane jest zgłoszenie do ochrony patentowej opracowanych metod lub objęcie ich licencją know how oraz ustalenie prawnych zasad przejmowania projektu przez producenta. Działania w zakresie szczegółowego badania rynku dla przyszłego produktu, sporządzenia niezbędnej do wdrożenia dokumentacji technicznej, certyfikacji, określenia i zlecenia badań jakościowych, opracowania właściwej technologii wytwarzania i dokumentacji produkcyjnej będą 16

17 leżały po stronie producenta. Potencjalnymi odbiorcami wyników projektu są firmy farmaceutyczne i biotechnologiczne zajmujące się produkcją komercyjnych testów do identyfikacji drobnoustrojów patogennych czy też oferujące usługi w zakresie molekularnej diagnostyki mikrobiologicznej, a w konsekwencji szpitale i inne jednostki medyczne i ochrony zdrowia, a także ośrodki naukowe. PIŚMIENNICTWO 1. Falkinham, J. O Nontuberculous mycobacteria in the environment. Clin. Chest Med. 23: Heifets, L Mycobacterial infections caused by nontuberculous mycobacteria. Semin. Respir. Crit. Care Med. 25: Griffith, D. E., T. Aksamit, B. A. Brown-Elliott, A. Catanzaro, C. Daley, F. Gordin, S. M. Holland, R. Horsburgh, G. Huitt, M. F. Iademarco, M. Iseman, K. Olivier, S. Ruoss, C. F. von Reyn, R. J. Wallace Jr. K. Winthrop; ATS Mycobacterial Diseases Subcommittee; American Thoracic Society; Infectious Disease Society of America An official ATS/IDSA statement: diagnosis, treatment, and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 175: Falkinham, J. O Epidemiology of infection by nontuberculous mycobacteria. Clin. Microbiol. Rev. 9: Butler, W. R., and J. O. Kilburn Identification of major slowly growing pathogenic mycobacteria and Mycobacterium gordonae by high-performance liquid chromatography of their mycolic acids. J. Clin. Microbiol. 30: Huang, Z. H., B. C. Ross, and B. Dwyer Identification of Mycobacterium kansasii by DNA hybridization. J. Clin. Microbiol. 29: Ross, B. C., K. Jackson, M. Yang, A. Sievers, and B. Dwyer Identification of a genetically distinct subspecies of Mycobacterium kansasii. J. Clin. Microbiol. 30: Yang, M., B. C. Ross, and B. Dwyer Identification of an insertion sequence-like element in a subspecies of Mycobacterium kansasii. J. Clin. Microbiol. 31: Yang, M., B. C., Ross, and B. Dwyer Isolation of a DNA probe for identification of Mycobacterium kansasii, including the genetic subgroup. J. Clin. Microbiol. 31: Tortoli, E., M. T. Simonetti, and F. Lavinia Evaluation of reformulated chemiluminescent DNA probe (AccuProbe) for culture identification of Mycobacterium kansasii. J. Clin. Microbiol. 34: Tortoli, E., A. Nanetti, C. Piersimoni, P. Cichero, C. Farina, G. Mucignat, C. Scarparo, L. Bartolini, R. Valentini, D. Nista, G. Gesu, C. P. Tosi, M. Crovatto, and G. Brusarosco Performance assessment of new multiplex probe assay for identification of mycobacteria. J. Clin. Microbiol. 39: Quezel-Guerraz, N. M., Arriaza, M. M., Avila, J. A., Sánchez-Yebra Romera, W. E., Martínez-Lirola, M. J.; Indal-TB Group. Evaluation of the Speed-oligo Mycobacteria assay for identification of Mycobacterium spp. from fresh liquid and solid cultures of human clinical samples. Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 2010, 68: Hofmann-Thiel, S., Turaev, L., Alnour, T., Drath, L., Müllerova, M., Hoffmann, H. Multi-centre evaluation of the speed-oligo Mycobacteria assay for differentiation of Mycobacterium spp. in clinical isolates. BMC Infect. Dis. 2011, 11: Lee, A. S., P. Jelfs, V. Sintchenko, and G. L. Gilbert Identification of non-tuberculous mycobacteria: utility of the GenoType Mycobacterium CM/AS assay compared with HPLC and 16S rrna gene sequencing. J. Med. Microbiol. 58: Richter, E., S. Rüsch-Gerdes, and D. Hillemann Evaluation of the GenoType Mycobacterium Assay for Identification of mycobacterial species from cultures. J. Clin. Microbiol. 44:

18 16. Russo, C., E. Tortoli, and D. Menichella Evaluation of the new GenoType Mycobacterium assad for identification of mycobacterial species. J. Clin. Microbiol. 44: Plikaytis, B. B., B. D. Plikaytis, A. Mitchell, W. Yakrus, R. Butler, C. L. Woodley, V. A. Silcox, and T. M. Shinnick Differentiation of slowly growing Mycobacterium species, including Mycobacterium tuberculosis, by gene amplification and restriction fragment length polymorphism analysis. J. Clin. Microbiol. 30: Telenti, A., F. Marchesi, M. Balz, F. Bally, E. C. Böttger, and T. Bodmer Rapid identification of mycobacteria to the species level by polymerase chain reaction and restriction enzyme analysis. J. Clin. Microbiol. 31: Devallois, A., K. S. Goh, and N. Rastogi Rapid identification of mycobacteria to species level by PCRrestriction fragment length polymorphism analysis of the hsp65 gene and proposition of an algorithm to differentiate 34 mycobacterial species. J. Clin. Microbiol. 35: Brunello, F., M. Ligozzi, E. Cristelli, S. Bonora, E. Tortoli, and R. Fontana Identification of 54 mycobacterial species by PCR-restriction fragment length polymorphism analysis of the hsp65 gene. J. Clin. Microbiol. 39: Takewaki, S., K. Okuzumi, I. Manabe, M. Tanimura, K. Miyamura, K. Nakahara, Y. Mazaki, A. Ohkubo, and R. Nagai Nucleotide sequence comparison of the mycobacterial dnaj gene and PCR-restriction fragment length polymorphism analysis for identification of mycobacterial species. Int. J. Syst. Bacteriol. 44: Kim, B.-J., K.-H. Lee, B.-N. Park, S.-J. Kim, G.-H. Bal, S.-J. Kim, and Y.-H. Kook Differentiation of mycobacterial species by PCR-restriction analysis of DNA (343 base pairs) of the RNA polymerase gene (rpob). J. Clin. Microbiol. 39: Shin, J.-H., E.-J. Cho, J.-Y. Lee, J.-Y. Yu, and Y.-H. Kang Novel diagnostic algorithm using tuf gene amplification and restriction fragment length polymorphism is promising tool for identification of nontuberculous mycobacteria. J. Microbiol. Biotechnol. 19: Abed, Y., C. Bollet, and P. de Micco Demonstration of Mycobacterium kansasii species heterogeneity by the amplification of the 16S-23S spacer region. J. Med. Microbiol. 42: Hermans, P. W., D. van Soolingen, and J. D.A. van Embden Characterization of a major polymorphic tandem repeat in Mycobacterium tuberculosis and its potential use in the epidemiology of Mycobacterium kansasii and Mycobacterium gordonae. J. Bacteriol. 174: Picardeau, M., G. Prod hom, L. Raskine, M. P. LePennec, and V. Vincent Genotypic characterization of five subspecies of Mycobacterium kansasii. J. Clin. Microbiol. 35: Alcaide, F., I. Richter, C. Bernasconi, B. Springer, C. Hagenau, R. Schulze-Röbbecke, E. Tortoli, R. Martín, E. C. Böttger, and A. Telenti Heterogeneity and clonality among isolates of Mycobacterium kansasii: implications for epidemiological and pathological studies. J. Clin. Microbiol. 35: Sander, P., F. Alcaide, I. Richter, K. Frischkorn, E. Tortoli, B. Springer, A. Telenti, and E. C. Böttger Inteins in mycobacterial GyrA are a taxonomic character. Microbiology 144: Richter, E., S. Niemann, S. Rüsch-Gerdes, and S. Hoffner Identification of Mycobacterium kansasii by using a DNA probe (AccuProbe) and molecular techniques. J. Clin. Microbiol. 37: Taillard, C., G. Greub, R. Weber, G. E. Pfyffer, T. Bodmer, S. Zimmerli, R. Frei, S. Bassetti, P. Rohner, J. C. Piffaretti, E. Bernasconi, J. Bille, A. Telenti, and G. Prod hom Clinical implications of Mycobacterium kansasii species heterogeneity: Swiss National Survey. J. Clin. Microbiol. 41: Iwamoto, T., and H. Saito comparative study of two typing methods hsp65 PRA and ITS sequencing revealed a possible evolutionary link between Mycobacterium kansasii type I and II isolates. FEMS Microbiol. Lett. 254: