Analiza genomu człowieka przy wykorzystaniu NGS w kontekście diagnostyki medycznej

Transkrypt

1 Analiza genomu człowieka przy wykorzystaniu NGS w kontekście diagnostyki medycznej dr inż. Tomasz Gambin 1 Instytut 2 Zakład 1,2 Informatyki, Politechnika Warszawska Genetyki Medycznej, Instytut Matki i Dziecka w Warszawie

2 Spis treści 1 Wprowadzenie do genomiki 2 Sekwencjonowanie Następnej Generacji 3 Przetwarzanie danych z NGS 4 Filtrowanie i priorytetyzacja wariantów 5 Detekcja zmian strukturalnych 6 Poszukiwanie nowych genów chorobowych 7 Wyzwania w analizie danych z NGS ZSI-Bio Wprowadzenie do genomiki 2 / 50

3 Genom ludzki 23 pary chromosomów: chr1,...,chr22, X, Y w sumie 2 x 3 Gbp Genom referencyjny publicznie dostępna sekwencja, wygenerowana na podstawie sekwencji kilku zdrowych osób Wariant genetyczny różnica pomiędzy genomem osoby badanej a genomem referenyjnym Różnice genetyczne pomiędzy dwoma osobami: % genomu (3-12 Mbp) - stanowią warianty pojedynczych nukleotydów (ang. Single Nucleotide Variants, SNVs) 0.5 % genomu (15Mbp) - Zmiany strukturalne w tym zmiany liczby kopii ZSI-Bio Wprowadzenie do genomiki 3 / 50

4 Czemu warianty są istotne? ZSI-Bio Wprowadzenie do genomiki 4 / 50

5 Skąd się biorą warianty? Dzieci dziedziczą większość DNA od rodziców Jednak, ok zmian pojedynczych nukleotydów oraz kilka zmian strukturalnych pojawia się de novo. ZSI-Bio Wprowadzenie do genomiki 5 / 50

6 Choroby Mendlowskie, modele dziedziczenia Choroby Mendlowskie Choroby jednogenowe, czyli wywołane przez wariant(y) w pojedynczym genie. Choroby autosomalnie dominujące Choroby autosomalnie recesywne Choroby sprzężone z chromosomem X (dominujące i recesywne) ZSI-Bio Wprowadzenie do genomiki 6 / 50

7 Choroby autosomalnie dominujące ZSI-Bio Wprowadzenie do genomiki 7 / 50

8 Choroby autosomalnie recesywne ZSI-Bio Wprowadzenie do genomiki 8 / 50

9 Choroby sprzężone z X ZSI-Bio Wprowadzenie do genomiki 9 / 50

10 Częstość chorób uwarunkowanych genetycznie Choroby dominujące Częstość występowania (na 1000 żywo urodzonych) Pląsawica Huntingtona 0,5 Neurofibromatosis 0,4 Dystrofia miotoniczna 0,2 Torbielowatość nerek 0,8 Ślepota dominująca 0,1 Hipercholesterolemia 2,0 Sferocytoza wrodzona 0,2 Dentinogenesis imperfecta 0,1 Osteogenesis imperfecta 0,04 Zespół Marfana 0,05 Choroby recesywne Autosomalne Częstość występowania (na 1000 żywo urodzonych) Mukowiscydoza 0,4 Głuchota (różne postaci) 0,5 Ślepota (różne postaci) 0,2 Fenyloketonuria 0,08 Galaktozemia 0,025 Mukopolisacharydozy (różne postaci) 0,04 Glikogenozy 0,02 Sprzężone z chromosomem X Dystrofia mięśniowa Duchenne a 0,14 Hemofilia A 0,01 ZSI-Bio Wprowadzenie do genomiki 10 / 50

11 Spis treści 1 Wprowadzenie do genomiki 2 Sekwencjonowanie Następnej Generacji 3 Przetwarzanie danych z NGS 4 Filtrowanie i priorytetyzacja wariantów 5 Detekcja zmian strukturalnych 6 Poszukiwanie nowych genów chorobowych 7 Wyzwania w analizie danych z NGS ZSI-Bio Sekwencjonowanie Następnej Generacji 11 / 50

12 Przykładowe zastosowania kliniczne NGS diagnostyka chorób rzadkich; diagnostyka chorób uwarunkowanych genetycznie, które przebiegają w sposób nietypowy lub bezobjawowy; personalizowana terapia medyczna; badania przesiewowe (ang. screening) w szczególności new born screening; identyfikacja markerów nowotworowych (liquid biopsy) szybka identyfikacja patogenów ożywionych (np. bakterii, wirusów, robaków pasożytniczych) metagenomika;... ZSI-Bio Sekwencjonowanie Następnej Generacji 12 / 50

13 Dlaczego potrzebujemy informacji o wszystkich wariantach? ZSI-Bio Sekwencjonowanie Następnej Generacji 13 / 50

14 documents/products/illumina_sequencing_introduction.pdf. ZSI-Bio Sekwencjonowanie Następnej Generacji 14 / 50 (Re)sekwencjonowanie w technologii SBS A Genomowe DNA B Fragmentacja Płytka reakcyjna Adaptery Przyłączanie adapterów do fragmentów DNA Amplifikacja mostkowa Biblioteka DNA Klastry C D Cykle sekwencjonowania Odczyty Obraz cyfrowy Genom referencyjny Eksport danych do pliku Plik tekstowy

15 Sekwencjonowanie całogenomowe vs. celowane Całogenomowe Stosunkowo równomierne pokrycie odczytami całego genomu Łatwiejsza identyfikacja zmian strukturalnych Wysoki koszt Duże wolumeny danych (100Gb/ pacjent) Względnie mniejesze pokrycie niż w przypadku sekw. celowanego (mozaiki) Celowane (np. całoeksomowe, panele genów) Nierównomierne pokrycie odczytami całego genomu Ograniczone możliwości wykrywania zmian strukturalnych Niższy koszt sekwencjonowania Mniejszy wolumen danych Większe pokrycie odczytami (do kilkuset x w zastosowaniach klinicznych) ZSI-Bio Sekwencjonowanie Następnej Generacji 15 / 50

16 Spis treści 1 Wprowadzenie do genomiki 2 Sekwencjonowanie Następnej Generacji 3 Przetwarzanie danych z NGS 4 Filtrowanie i priorytetyzacja wariantów 5 Detekcja zmian strukturalnych 6 Poszukiwanie nowych genów chorobowych 7 Wyzwania w analizie danych z NGS ZSI-Bio Przetwarzanie danych z NGS 16 / 50

17 Główne kroki: mapowanie/uliniowienie > wykrywanie wariantów > adnotowanie > priorytetyzacja i interpretacja ZSI-Bio Przetwarzanie danych z NGS 17 / 50 Tok przetwarzania PRZETWARZANIE WSTĘPNE WYKRYWANIE WARIANTÓW ANALIZA WTÓRNA Nieuliniowione odczyty Wykrywanie wariantów HaplotypeCaller (GATK) Adnotacja wariantów VEP, SNPEff, ANNOVAR Dopasowanie/uliniowienie do sekwencji referencyjnej BWAmem Oznaczenie duplikatów Picard Rekalibracja oceny jakości detekcji nukleotydów BQSR (GATK) Uliniowione odczyty gotowe do dalszej analizy Surowe warianty SNP y Indel e Rekalibracja i filtrowanie wariantów VQSR (GATK) Warianty gotowe do dalszej analizy SNP y Indel e Ocena jakości wariantów Priorytetyzacja wariantów, analiza kosegregacji wariantów w rodzinach (analiza trio), korelacje genotypowo fenotypowe Exomiser, PhenIX, Phevor Walidacja Sangerem Raportowanie wyników

18 Surowe sekwencje odczytów pliki FASTQ identyfikator sekwencja odczytu nukleotyd=t; jakość(q)= : =25 współczynniki jakości (Q) Współczynnik Q (Phred Quality Score) Q = 10 log 10 (P), gdzie P oznacza prawdopodobieństwo, że nukleotyd został zidentyfikowany niepoprawnie; np.: Q = 10 dokładność 90%, Q = 20 dokładność 99%, Q = 30 dokładność 99,9%, itd. ZSI-Bio Przetwarzanie danych z NGS 18 / 50

19 Zmapowane/uliniawione odczyty pliki BAM głębokość pokrycia odczyty wariant heterozygotyczny warianty homozygotyczne eksony Do mapowania wykorzystuje się transformację BWT (Burrows Wheeler Transform): ZSI-Bio Przetwarzanie danych z NGS 19 / 50

20 Wykrywanie wariantów GATK HaplotypeCaller ZSI-Bio Przetwarzanie danych z NGS 20 / 50

21 Lista wariantów - pliki VCF ##fileformat=vcfv4.0 ##filedate= ##source=myimputationprogramv3.1 ##reference=1000genomespilot-ncbi36 ##phasing=partial ##INFO=<ID=NS,Number=1,Type=Integer,Description="Number of Samples With Data"> ##INFO=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Total Depth"> ##INFO=<ID=AF,Number=.,Type=Float,Description="Allele Frequency"> ##INFO=<ID=AA,Number=1,Type=String,Description="Ancestral Allele"> ##INFO=<ID=DB,Number=0,Type=Flag,Description="dbSNP membership, build 129"> ##INFO=<ID=H2,Number=0,Type=Flag,Description="HapMap2 membership"> ##FILTER=<ID=q10,Description="Quality below 10"> ##FILTER=<ID=s50,Description="Less than 50% of samples have data"> ##FORMAT=<ID=GT,Number=1,Type=String,Description="Genotype"> ##FORMAT=<ID=GQ,Number=1,Type=Integer,Description="Genotype Quality"> ##FORMAT=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Read Depth"> ##FORMAT=<ID=HQ,Number=2,Type=Integer,Description="Haplotype Quality"> #CHROM POS ID REF ALT QUAL FILTER INFO FORMAT NA00001 NA00002 NA rs G A 29 PASS NS=3;DP=14;AF=0.5;DB;H2 GT:GQ:DP:HQ 0 0:48:1:51,51 1 0:48:8:51,51 1/1:43:5:., T A 3 q10 NS=3;DP=11;AF=0.017 GT:GQ:DP:HQ 0 0:49:3:58,50 0 1:3:5:65,3 0/0:41: rs A G,T 67 PASS NS=2;DP=10;AF=0.333,0.667;AA=T;DB GT:GQ:DP:HQ 1 2:21:6:23,27 2 1:2:0:18,2 2/2:35: T. 47 PASS NS=3;DP=13;AA=T GT:GQ:DP:HQ 0 0:54:7:56,60 0 0:48:4:51,51 0/0:61: microsat1 GTCT G,GTACT 50 PASS NS=3;DP=9;AA=G GT:GQ:DP 0/1:35:4 0/2:17:2 1/1:40:3 ZSI-Bio Przetwarzanie danych z NGS 21 / 50

22 Adnotowanie wariantów Kategoria Efekt oddziaływania na białko Komponenty (VEP, SNPEff, ANNOVAR) x (Ensemble/Genecode, RefSeq) Predykcje funkcjonalne (warianty missensowne oraz splicingowe) dbscsnv, FATHMM, LRT, MetaLR, MetaSVM, MutationTaster, MutationAcessor, Polyphen2, SIFT Predykcje funkcjonalne (warianty niekodujące) Częstości alleli Znane warianty patogenne Konswerwacja Epigenomika Opisy genów CADD, FATHMM-MKL, Funseq, Funseq2, RegulomeDB GnomAD, ExAC, UK10K, ESP, 1000Genomes ClinVar, COSMIC, GWAS catalog, GRASP GERP++, phastcons, PhyloP, SiPhy Encode, FANTOM5, Roadmap Znane korelacje genotypowo-fenotypowe (OMIM, Medgen), ekspresja, interakcje gen-gen, ścieżki sygnałowe, fenotypy organizmów modelowych ZSI-Bio Przetwarzanie danych z NGS 22 / 50

23 Genome Aggregation Database (gnomad) Zawiera informację o częstości wariantów z 123,136 sekwencji całoeksomowych oraz 15,496 sekwencji całogenomowych. ZSI-Bio Przetwarzanie danych z NGS 23 / 50

24 Kontrola jakości ZSI-Bio Przetwarzanie danych z NGS 24 / 50

25 Spis treści 1 Wprowadzenie do genomiki 2 Sekwencjonowanie Następnej Generacji 3 Przetwarzanie danych z NGS 4 Filtrowanie i priorytetyzacja wariantów 5 Detekcja zmian strukturalnych 6 Poszukiwanie nowych genów chorobowych 7 Wyzwania w analizie danych z NGS ZSI-Bio Filtrowanie i priorytetyzacja wariantów 25 / 50

26 Filtrowanie wariantów tys. Usuwanie wariantów o niskiej jakości Filtracja MAF < 1% w kontrolnych bazach ~ 1 tys. ~100 tys. Usuwanie wariantów z poza regionów celowanych Choroby dominujące (warianty nieobecne bądź bardzo rzadkie w kontrolnych bazach) Choroby recesywne (homozygoty i potencjalne podwójne heterozygoty) ~30 tys. Usuwanie wariantów synonimicznych ~ 50 warianty de novo Analiza trio ~ 100 homozygoty i podwójne het. in-trans ~15 tys. ~ 2 ~50 ZSI-Bio Filtrowanie i priorytetyzacja wariantów 26 / 50

27 Identyfikacja wariantów potencjalnie patogennych ZSI-Bio Filtrowanie i priorytetyzacja wariantów 27 / 50

28 Analiza wariantów w rodzinach ZSI-Bio Filtrowanie i priorytetyzacja wariantów 28 / 50

29 Analiza wariantów w rodzinach ZSI-Bio Filtrowanie i priorytetyzacja wariantów 29 / 50

30 Zbieranie danych fenotypowych ZSI-Bio Filtrowanie i priorytetyzacja wariantów 30 / 50

31 Wykorzystanie informacji fenotyowej do priorytetyzacji wariantów ZSI-Bio Filtrowanie i priorytetyzacja wariantów 31 / 50

32 Spis treści 1 Wprowadzenie do genomiki 2 Sekwencjonowanie Następnej Generacji 3 Przetwarzanie danych z NGS 4 Filtrowanie i priorytetyzacja wariantów 5 Detekcja zmian strukturalnych 6 Poszukiwanie nowych genów chorobowych 7 Wyzwania w analizie danych z NGS ZSI-Bio Detekcja zmian strukturalnych 32 / 50

33 Rodzaje metod do wykrywania zmian liczby kopii, translokacji, inwersji ZSI-Bio Detekcja zmian strukturalnych 33 / 50

34 Przykład algorytmu wykorzystującego analizę głębokości pokrycia ZSI-Bio Detekcja zmian strukturalnych 34 / 50

35 Wykrywanie zmian liczby kopii z sekwencjonowania celowanego c.d.: Niezbędna jest grupa kontrolna (kilkadziesiąt - kilkaset próbek) Typowe metody (np. Conifer, XHMM) składają się z czterech kroków: [1] Wyliczenie głębokości pokrycia (np. RPKM); [2] Normalizacja (np. z-rpkm); [3] Wygładzenie/redukcja szumu (np. SVD, PCA); Zazwyczaj wykrywają zmiany większe od 3 eksonów Wymagają weryfikacji ortogonalną metodą biologiczną (acgh, FISH, PCR) ZSI-Bio Detekcja zmian strukturalnych 35 / 50

36 Wykrywanie delecji homozygotycznych ZSI-Bio Detekcja zmian strukturalnych 36 / 50

37 Spis treści 1 Wprowadzenie do genomiki 2 Sekwencjonowanie Następnej Generacji 3 Przetwarzanie danych z NGS 4 Filtrowanie i priorytetyzacja wariantów 5 Detekcja zmian strukturalnych 6 Poszukiwanie nowych genów chorobowych 7 Wyzwania w analizie danych z NGS ZSI-Bio Poszukiwanie nowych genów chorobowych 37 / 50

38 Centers for Mendelian Genomics ZSI-Bio Poszukiwanie nowych genów chorobowych 38 / 50

39 Testy asocjacyjne ZSI-Bio Poszukiwanie nowych genów chorobowych 39 / 50

40 Odkrycia nowych genów chorobowych ZSI-Bio Poszukiwanie nowych genów chorobowych 40 / 50

41 Spis treści 1 Wprowadzenie do genomiki 2 Sekwencjonowanie Następnej Generacji 3 Przetwarzanie danych z NGS 4 Filtrowanie i priorytetyzacja wariantów 5 Detekcja zmian strukturalnych 6 Poszukiwanie nowych genów chorobowych 7 Wyzwania w analizie danych z NGS ZSI-Bio Wyzwania w analizie danych z NGS 41 / 50

42 Koszt sekwencjonowania ZSI-Bio Wyzwania w analizie danych z NGS 42 / 50

43 Genomika jako problem Big Data Figure: Źródło: Knights Cancer Institute, Oregon Health Sciences University & Intel ZSI-Bio Wyzwania w analizie danych z NGS 43 / 50

44 Podejście tradycyjne vs. Big Data ZSI-Bio Wyzwania w analizie danych z NGS 44 / 50

45 The Hadoop Ecosystem Hadoop - środowisko do przetwarzania rozproszonego wielkich zbiorów danych, zapewniające: Skalowalność aplikacja uruchomiona dla 10GB danych wykona się tak samo dla 10PB Automatyczne zrównoleglenie i odporoność na błędy Do ekosystemu hadoop należy: Rozproszony system plików HDFS (Hadoop Distributed File System) Rozproszone silniki obliczeń MapReduce, Spark, Flink Interfejsy SQL Hive, Impala Rozproszone bazy danych: HBase, Cassandra Wiele innych... ZSI-Bio Wyzwania w analizie danych z NGS 45 / 50

46 Wybrane projekty Big data w genomice Big Data Genomics (ADAM) Hadoop-BAM SeqPig Seal SparkSeq SparkSW VariantSpark SeqHBase Halvade GenoMetric Query Language http: // ZSI-Bio Wyzwania w analizie danych z NGS 46 / 50

47 Problemy w wykorzystaniu narzędzi Big Data Formaty plików nie są przystosowane do przetwarzania rozproszonego Centralne nagłówki Kompresja Podział oparty o wiersze Niespójne definicje formatów Różnorodność wykorzystywanych narzędzi C, Python, Perl, R, shell Sekwencyjne schematy przetwarzania cięzkie do podziału Brak mechanizmów bezpieczeństwa konieczne przy przetwarzaniu w chmurach obliczeniowych Aby móc w pełni korzystać z zasobów chmurowych narzędzia muszą być przeprojektowane i zaimplementowane od nowa. ZSI-Bio Wyzwania w analizie danych z NGS 47 / 50

48 Korzyści wynikające z wykorzystania narzędzi Big Data Szybsza analiza Szybkie eksomy/genomy (np. w przypadkach zagrożenia życia) Zwiększone możliwości testowania, kalibracji - poprawienie skuteczności algorytmów Implementacja w chmurach obliczeniowych Zniesienie barier utrudniających dzielenie danych Łatwość skalowania rozwiązań Nowe możliwości badawcze Integracja danych z wielkich projektów genomowych Integracja danych z wielu platform NGS ZSI-Bio Wyzwania w analizie danych z NGS 48 / 50

49 Future... ZSI-Bio Wyzwania w analizie danych z NGS 49 / 50

50 Dziękuje za uwage Tomasz Gambin ZSI-Bio Wyzwania w analizie danych z NGS 50 / 50