KREW I HEMOPOEZA. Skład osocza krwi. Hct = Elementy morfotyczne krwi. Wskaźnik hematokrytu

Transkrypt

1 KREW I HEMOPOEZA Funkcje krwi: Krew jest tkanką płynną, ponieważ płynna jest istota międzykomórkowa (osocze) Komórki (erytrocyty i leukocyty) i fragmenty komórek (płytki krwi) to elementy morfotyczne transport tlenu i substancji odżywczych do komórek transport CO2 i metabolitów wydalanych przez komórki transport komórek i czynników uczestniczących w procesach obronnych transport substancji regulacyjnych (np. hormonów) do komórek udział w utrzymywaniu homeostazy ustrojowej (równowaga wodno-jonowa, buforowanie płynów ustrojowych, termoregulacja) krzepnięcie osocze elementy morfotyczne Wskaźnik hematokrytu leukocyty i płytki erytrocyty Hct = objętość elementów morfotycznych objętość krwi pełnej mężczyźni kobiety Na wartość wskaźnika hematokrytu największy wpływ ma ilość krwinek czerwonych Skład osocza krwi Woda 91 92% Białka: albuminy, globuliny α, β, γ (immunoglobuliny), fibrynogen 7 8% Inne substancje: 1 2% jony (Na +, K +, Ca ++, Mg ++, Cl -, HCO 3-, PO -3 4, SO -2 4 ) produkty przemiany materii (mocznik, kwas moczowy, kreatynina, sole amonowe) substancje odżywcze (glukoza, aminokwasy, lipidy) gazy (tlen, dwutlenek węgla, azot) substancje regulacyjne (hormony, enzymy, witaminy) Surowica: osocze pozbawione fibrynogenu i czynników krzepnięcia Rozmaz krwi (barwienie Romanowsky ego) Elementy morfotyczne krwi Erytrocyty (krwinki czerwone) /mm 3 Leukocyty (krwinki białe) /mm 3 Trombocyty (płytki krwi) /mm 3 granulocyty Neutrofile 55-65% (obojętnochłonne) Eozynofile 2-4% (kwasochłonne) Bazofile 0.5-1% (zasadochłonne) agranulocyty Limfocyty 25-35% Monocyty 4-8% 1

2 Erytrocyty (krwinki czerwone) średnica 7,5 µm brak jądra brak organelli hemoglobina gruby glikokaliks Spośród wszystkich elementów morfotycznych, tylko erytrocyty i płytki krwi pełnią swoje funkcje w obrębie łożyska naczyniowego - leukocyty przewędrowują przez ściany naczyń do tkanek (głównie tkanki łącznej), które są terenem ich działania retikulocyt (1-2%) Erytrocyty utrzymują kształt dzięki obecności wewnętrznego szkieletu błonowego Cukrowce glikokaliksu erytrocytów są antygenami układu AB0 Białka transportowe błony: białko III szczytu transporter anionowy (Cl - / HCO 3- ) pompa sodowo-potasowa Trzy parametry morfologii krwi określają kondycję układu czerwonokrwinkowego: 1. całkowita zawartość erytrocytów /mm 3 2. wskaźnik hematokrytu 3. zawartość hemoglobiny norma: g/dl u kobiet g/dl u mężczyzn GRANULOCYTY (neutrofile, eozynofile, bazofile) zawierają dużą ilość ziarn azurochłonnych * i swoistych LEUKOCYTY AGRANULOCYTY (limfocyty, monocyty) zawierają niewielką ilość ziarn azurochłonnych Zmniejszenie liczby krwinek czerwonych bądź zmniejszenie zawartości hemoglobiny nosi nazwę niedokrwistości (anemia) Przykład: anemia mikrocytarna z niedoboru żelaza prawidłowy anemia jądro segmentowane, nie dzielą się krótki czas życia (dni) * szczególna forma pęcherzyków hydrolazowych jądro niesegmentowane mogą się dzielić i różnicować, długi czas życia (tygodnie lata) 2

3 Neutrofile fagocytują i zabijają bakterie Ziarna neutrofila i ich zawartość (wybrane składniki) średnica ok. 12 µm segmentowane jądro ubogie organelle bardzo liczne ziarnistości Zdolne do: ruchu pełzakowatego fagocytozy zabijania bakterii produkcji mediatorów regulujących reakcje immunologiczne Ziarna azurochłonne kwaśne hydrolazy mieloperoksydaza lizozym defenzyny Ziarna swoiste lizozym laktoferryna kolagenaza fosfolipaza Ziarna gelatynazowe gelatynaza arginaza lizozym Neutrofile są głównymi komórkami ostrego stanu zapalnego Ruch pełzakowaty Pod wpływem czynników chemotaktycznych produkowanych przez bakterie i/lub komórki uczestniczące w procesach obronnych neutrofile (i inne leukocyty) przechodzą przez ścianę naczynia, a następnie migrują do źródła czynników chemotaktycznych. W przechodzeniu przez śródbłonek istotną rolę odgrywają cząsteczki adhezyjne błony komórkowej leukocyta i komórki śródbłonkowej. Fagocytoza: głównie bakterii szczególnie intensywna po opłaszczeniu bakterii przeciwciałami i/lub składnikami dopełniacza (mechanizm receptorowy) Etapy migracji leukocytów przez ścianę naczynia Zabijanie i trawienie bakterii wybuch tlenowy fuzja ziarn z fagosomem zabicie bakterii trawienie bakterii System zabijania bakterii: Czynniki tlenozależne NADPH-oksydaza: tworzenienie O 2 i H 2 O 2 mieloperoksydaza: H 2 O 2 + jony chlorkowe i jodkowe = HOCl, HOI (chlorowanie i jodowanie) jony ponadtlenkowe i rodniki hydroksylowe (utlenianie, hydroksylacja) Czynniki tlenoniezależne lizozym - trawi ściany kom. bakterii laktoferryna (wiąże Fe, hamuje metabolizm bakterii) defenzyny dziurawią błony kom. bakterii 3

4 Eozynofile zabijają larwy pasożytów i współpracują z mastocytami w reakcjach alergicznych W trakcie zabijania i trawienia bakterii neutrofile giną. Jeżeli proces zapalny jest bardzo intensywny, szczątki neutrofili i bakterii tworzą wydzielinę ropną Podwyższona liczba neutrofili w krwi obwodowej najczęściej świadczy o toczącym się procesie zapalnym wywołanym zakażeniem bakteryjnym średnica ok. 15 µm dwusegmentowe jądro ubogie organelle kwasochłonne ziarna swoiste, zawierające: - MBP (główne białko zasadowe) - ECP (białko kationowe eozynofili) - EDN (eozynofilową neurotoksynę) - eozynofilową peroksydazę - enzymy hydrolityczne Funkcje eozynofili zabijanie pasożytów (poprzez wydzielanie zawartości ziarn) współpraca z mastocytami i bazofilami, neutralizacja czynników prozapalnych (w tym w alergii) działanie immunoregulacyjne słaba zdolność do fagocytozy słabe własności bakteriobójcze i guzobójcze Podwyższona liczba eozynofili (eozynofilia) w krwi obwodowej jest wskaźnikiem chorób pasożytniczych i alergicznych Bazofile są podobne morfologicznie i czynnościowo do mastocytów, ale stanowią odrębną populację komórek Limfocyty odpowiadają za reakcje immunologiczne średnica 8 i µm ( małe i duże ) duże kuliste jądro ubogie organelle średnica ok. 10 µm jądro segmentowe lub nie zasadochłonne ziarna swoiste zawierające: - histaminę - siarczan chondroityny - czynnik chemotaktyczny dla eozynofili receptory dla IgE Limfocyty B humoralna odpowiedź immunologiczna Limfocyty T komórkowa odpowiedź immunologiczna Limfocyty NK zabijanie antygenowo nieprawidłowych komórek Wygląd dużych limfocytów mają również krążące w krwi komórki macierzyste 4

5 Monocyty migrują do tkanek, gdzie przekształcają się w makrofagi lub komórki prezentujące antygen Płytki krwi inicjują proces krzepnięcia krwi średnica µm nerkowate jądro dobrze rozwinięte organelle ziarna azurochłonne zdolność do fagocytozy średnica 2-4 µm brak jądra strefa obwodowa (hialomer) - mikrotubule - filamenty aktynowe - otwarty system kanalikowy (wpuklenia błony kom.) - zamknięty system kanalikowy (magazynuje jony Ca 2+ ) strefa centralna (granulomer) - organelle i ziarna - glikogen gruby glikokaliks Płytki krwi są bezjądrzastymi fragmentami większych komórek prekursorowych Twory pęcherzykowe obecne w granulomerze: Nazwa ziarna α ziarna δ (ciałka gęste) pęcherzyki hydrolazowe (ziarna λ) peroksysomy Zawartość czynniki krzepnięcia, tromboplastyna, trombospondyna, płytkowy czynnik wzrostu ATP, ADP, Ca 2+, histamina, serotonina, pirofosfataza enzymy hydrolityczne enzymy peroksysomowe Płytki agregują w miejscu uszkodzenia ściany naczyniowej i wydzielają substancje uruchamiające proces krzepnięcia krwi kontakt z uszkodzonym miejscem przyleganie uwalnianie zawartości ziarn agregacja utworzenie czopu płytkowego Szpik krwiotwórczy - miejsce hemopoezy Substancje uwalniane z płytek oraz inne czynniki krzepnięcia (osoczowe, tkankowe) doprowadzają do wytworzenia skrzepu 5

6 Przedział naczyniowy Cienkościenne naczynia zatokowe (odmiana naczyń włosowatych): śródbłonek brak blaszki podstawnej komórki przydankowe (odmiana perycytów) Przedziały: naczyniowy hemopoetyczny Komórki śródbłonkowe budujące ścianę naczynia tworzą doraźnie tzw. pory migracyjne dla komórek szpikowych przechodzących do krwi Komórki przydankowe regulują ten proces poprzez odsłanianie fragmentów ściany naczynia rusztowanie z tkanki łącznej siateczkowatej: włókna srebrochłonne i komórki zrębowe (fibroblasty, makrofagi, mezenchymatyczne kom. macierzyste) w jego obrębie grupy dojrzewających komórek krwi i nieliczne adipocyty jednopęcherzykowe Wszystkie komórki krwi wywodzą się z jednej komórki macierzystej Przedział hemopoetyczny Komórki o podobnej morfologii Rozmaz krwi Rozmaz szpiku Komórki różniące się morfologicznie Mielogram: linia rozwojowa erytrocytów: 20% linia rozwojowa granulocytów: 65% pozostałe linie: 15% 6

7 Powstawanie erytrocytów (linia erytropoezy) rybosomy proerytroblast retikulocyty mieloblast Powstawanie granulocytów (linia granulopoezy) erytroblast zasadochłonny promielocyt (wytwarzanie ziarn azurochłonnych) erytroblast polichromatofilny (wielobarwliwy) erytroblast kwasochłonny hemoglobina - erytrocyty zawierające skupiska rybosomów; wcześniejsza utrata jądra i przejście do krążącej krwi - specjalne barwienia Czynnik pobudzający erytropoetyna (produkowana głównie w nerkach) mielocyty (wytwarzanie ziarn swoistych) metamielocyty (wytwarzanie ziarn gelatynazowych w linii neutrofili) młody neutrofil (forma pałeczkowata) Powstawanie płytek krwi (linia trombopoezy) megakarioblast (endomitozy) promegakariocyt Megakariocyt duży (do 100 µm) DNA do 64N płatowate jądro obszary: - okołojądrowy (organelle) - pośredni (błony demarkacyjne) - zewnętrzny (mikrofilamenty) (endomitozy) megakariocyt uwalnianie płytek krwi błony demarkacyjne (głębokie wpuklenia błony komórkowej) Struktury histologiczne są optycznie obiektami fazowymi nie zmieniają ani amplitudy fali światła (obiekty nie są ciemniejsze ani jaśniejsze), ani jej długości (barwa), a jedynie powodują przesunięcie fazy Techniki histologiczne barwienie oko ludzkie nie jest w stanie zarejestrować tej zmiany stąd konieczność uwidocznienia struktur. W technikach mikroskopowych jest to realizowane przez barwienie preparatów. Stosując różne techniki barwienia jesteśmy w stanie uwidocznić konkretne składniki komórkowe lub tkankowe 7

8 Cząsteczka barwnika posiada: grupę chwytną grupę barwną Większość metod barwienia oparta jest na chemicznym wiązaniu cząsteczki barwnika ze składnikami tkankowymi. Łączenie barwnika z substratem tkankowym najczęściej oparte jest na tworzeniu różnorodnych oddziaływań chemicznych: - oddziaływania elektrostatyczne - wiązania kowalencyjne - oddziaływania van der Waalsa - wiązania wodorowe Czasami występuje konieczność wcześniejszej modyfikacji chemicznej tkanek, co dopiero umożliwia wiązanie cząsteczki barwnika taki proces nazywa się bejcowaniem błękit alcjanowy W zależności od zdolności wiązania barwnika z określonymi strukturami mówimy o swoistości barwienia. Barwienia histologiczne (strukturalne) cechują się raczej niewielką swoistością. Wybrane metody barwienia Barwienie rutynowe hematoksylina eozyna Rodzaje hematoksylin najczęściej stosowane: hemalauny konieczność utlenienia hematoksyliny barwienie progresywne / regresywne Barwienia trójbarwne (np. AZAN) Impregnacja solami srebra np. włókna srebrochłonne 8

9 Barwienia rozmazów i wymazów Przygotowanie skrawków do barwienia HE: Giemsa / May Grünwald Papanicolau - odparafinowanie (ksylen) - nawodnienie (alkohol etylowy) - barwienie w hematoksylinie - płukanie i utlenienie (woda bieżąca) - barwienie w eozynie - płukanie (krótko) Zamykanie: - odwadnianie (alkohol) - prześwietlanie (ksylen) - zamykanie w żywicy Barwienie (barwniki klasyczne, np. hematoksylina i eozyna) barwnik wiąże się ze strukturami zawierającymi wiele różnych związków chemicznych niska swoistość barwienia METODY O WYSOKIEJ SWOISTOŚCI Wybarwienie struktur zawierających tylko określony rodzaj substancji chemicznej wysoka swoistość barwienia Metody o wysokiej swoistości pozwalają na uwidocznienie w preparacie mikroskopowym (in situ) konkretnych związków chemicznych i umożliwiają określenie ich lokalizacji w strukturach komórkowych i tkankowych histochemia klasyczna histochemia enzymów immunohistochemia histochemia lektyn histochemia powinowactwa hybrydocytochemia znakowanie białkami fluoryzującymi autoradiografia REAKCJA HISTOCHEMICZNA: substancja wykrywana (w preparacie mikroskopowym) + swoisty(e) substrat(y) w roztworze, zanurzamy w nim preparat = produkt - widoczny (barwny, fluoryzujący, lub elektronowo gęsty) - nierozpuszczalny (gromadzący się w miejscu powstania) Reakcje histochemii klasycznej wykrywają: różne klasy białek różne klasy cukrowców różne klasy lipidów DNA i RNA niektóre substancje niskocząsteczkowe Typy reakcji histochemicznych jednoetapowe wieloetapowe Mechanizmy reakcji histochemicznych: reakcja chemiczna z tworzeniem nowych związków (produktów) wiązanie barwników na drodze oddziaływań elektrostatycznych wiązanie barwników na drodze oddziaływań stereospecyficznych (barwnik i wykrywana w preparacie substancja pasują do siebie przestrzennie i wytwarzają wiązania) wiązanie barwników na drodze ich selektywnej rozpuszczalności Przygotowanie materiału: utrwalanie: celowane, niekiedy materiał nieutrwalony zamrożenie lub zatopienie w parafinie 9

10 Wykrywanie białek Reakcje uwidaczniające określone aminokwasy. Obecnie rzadko stosowane, zastąpione przez znacznie bardziej swoiste metody immunocytochemiczne Wykrywanie cukrowców Reakcja P.A.S.: (1) Utlenianie w kwasie nadjodowym (2) Odczynnik Schiffa Reakcja P.A.S. wykrywa polisacharydy obojętne Glikogen w komórkach wątrobowych Barwienie błękitem alcjanowym: wykrywa polisacharydy kwaśne Śluz w komórkach kubkowych Metachromazja Struktury barwią się na kolor odmienny niż kolor barwnika w roztworze Cząsteczki barwnika wiążą się z regularnie i gęsto rozmieszczonymi grupami anionowymi i tworzą polimer monomer niebieski Barwienie błękitem toluidynowym - mastocyty Chrząstka szklista polimer fioletowy Metachromazja wykrywa polisacharydy kwaśne Wykrywanie lipidów barwniki niepolarne (rozpuszczalne w lipidach, ale nierozpuszczalne w wodzie), np. Sudan III, czerwień oleista, wybarwiają wszystkie lipidy Wykrywanie kwasów nukleinowych Reakcja Feulgena (DNA): 1. Kontrolowana hydroliza w HCl 2. Odczynnik Schiffa Komórki tkanki tłuszczowej żółtej barwione Sudanem III 10

11 Metoda Bracheta: bawienie zielenią metylową (barwi DNA) i pyroniną (barwi RNA) Wykrywanie DNA barwnikami fluorescencynymi DAPI jodek propidyny bromek etydyny Hoechst 33342, Błękit pruski żelazo Czerwień Kongo złogi amyloidu Fluorescencyjne wykrywanie amin biogennych (metoda FIF) 1. Liofilizacja 2. Utrwalanie w parach formaldehydu 3. Zatopienie w parafinie Wykrywa: adrenalinę, noradrenalinę, dopaminę, serotoninę Histochemiczne wykrywanie enzymów (barwienie histoenzymatyczne) (wykrywana jest aktywność danego enzymu) Wykrywany enzym (w preparacie) + swoisty(e) substrat(y) - w roztworze + czynniki optymalizujące reakcję (koenzymy, jony, ph) w roztworze = produkt (widoczny, nierozpuszczalny) Utrwalanie lub zatapianie materiału może zahamować aktywność badanego enzymu. Reakcję najczęściej przeprowadza się na skrawkach mrożeniowych. Niekiedy trzeba przeprowadzić reakcję na materiale nieutrwalonym i utrwalić go po reakcji. Reakcję przeprowadza się w warunkach optymalnych dla wykrywanego enzymu 11

12 Niektóre z enzymów są charakterystyczne dla wybranych organelli lub komórek, dlatego metody histoenzymatyczne mogą być stosowane do ich identyfikacji Rekacje histochemiczne uwagi: Podbarwienie tła Reakcje kontrolne Czułość metody Ocena ilościowa Fosfataza kwaśna (enzym lizosomowy) - makrofagi 12