KONCEPCJE BIOLOGII SYSTEMOWEJ W BADANIACH NAD BIOREMEDIACJĄ

Transkrypt

1 bioremediacja, mikrobiologia, biotechnologia, biologia molekularna, bioinformatyka Grzegorz PASTERNAK * KONCEPCJE BIOLOGII SYSTEMOWEJ W BADANIACH NAD BIOREMEDIACJĄ Bioremediacja jako technologia oczyszczania terenów zdegradowanych działalnością o charakterze antropogenicznym, stosowana jest od kilkudziesięciu lat. Podstawą do rozwoju tej technologii są badania nad biodegradacją. Procesy zachodzące podczas bioremediacji są skomplikowane i podlegają jednoczesnemu działaniu wielu czynników. Tradycyjne studia nad wpływem tych czynników mają szereg ograniczeń w kontekście ich wykorzystania w praktyce. Zaangażowanie biologii systemowej do badań nad bioremediacją stanowi nowoczesne podejście do rozwiązywania problemów dotyczących interakcji pomiędzy biotycznymi i abiotycznymi składnikami środowiska. W niniejszym artykule przybliżono podstawowe problemy badawcze oraz metody wykorzystywane w systemowym podejściu do bioremediacji, których wykorzystanie umożliwić może opracowanie skutecznych strategii w bioremediacji terenów zdegradowanych. 1. WSTĘP Bioremediacja jest techniką, która wykorzystuje zjawiska o podłożu biologicznym w celu usunięcia zanieczyszczeń o charakterze organicznym lub nieorganicznym z gruntu lub wód gruntowych. Techniką, która swój rozwój zawdzięcza takim dziedzinom nauki jak mikrobiologia, inżynieria środowiska oraz biotechnologia. Za dość ogólnikowym sformułowaniem definicji bioremediacji, kryją się interdyscyplinarne badania nad jej rozwojem. Potrzeba wykorzystywania bioremediacji wynika z potrzeb ludności w zakresie wykorzystania gruntów oraz wód gruntowych, a także z uwarunkowań prawnych. Na podstawie zestawienia kosztów bioremediacji oraz innych technik oczyszczania skażonych terenów stwierdzić można, że technika ta jest najbardziej opłacalna dla * Instytut Inżynierii Ochrony Środowiska Politechniki Wrocławskiej, Zakład Biologii i Ekologii, pl. Grunwaldzki 9, Wrocław, grzegorz.pasternak@pwr.wroc.pl.

2 502 Koncepcje biologii systemowej w badaniach nad biodegradacją dużej liczby przypadków. Koszty bioremediacji w Stanach Zjednoczonych oraz Wielkiej Brytanii wynosiły USD/m 3, podczas gdy składowanie (które nie rozwiązuje problemu zanieczyszczenia gleby) USD/m 3, natomiast koszty spalania dochodziły do 2150 USD/m 3 [2]. Z uwagi na niskie koszty oczyszczania z wykorzystaniem metod biologicznych, bioremediacja budzi powszechne zainteresowanie badaczy. Na skuteczny przebieg procesów biodegradacji wpływ ma wiele czynników takich jak obecność mikro- i makroelementów, biodostępność zanieczyszczeń, obecność łatwo dostępnych źródeł węgla, skład gatunkowy mikroorganizmów, warunki środowiskowe, odczyn czy warunki redoks. Znajomość interakcji zachodzących podczas procesów biologicznych jest kluczowym elementem opracowania skutecznej metody bioremediacji. Interakcje te zachodzą na poziomie ekosystemu, konsorcjów bakteryjnych, komórkowym i molekularnym. W środowisku naturalnym występuje skomplikowana sieć zależności pomiędzy poszczególnymi poziomami, a ich zrozumienie jest istotne w kontekście rozwoju nowoczesnych metod oczyszczania gruntów i wód podziemnych. Większa kontrola nad procesem biodegradacji pozwoliłaby uniknąć ryzyka związanego z powstawaniem bardziej toksycznych produktów metabolizmu zanieczyszczeń, a także zwiększyć efektywność oczyszczania. Zasadniczym problemem są jednak koszty związane z badaniami nad biodegradacją, zwłaszcza kiedy badania te reprezentują podejście systemowe. Prowadzenie tego typu badań wiąże się z zaangażowaniem nowoczesnych metod obejmujących transkryptomikę, proteomikę, metabolomikę, fenomikę oraz lipidomikę [3]. Celem niniejszej pracy jest przybliżenie zagadnień związanych z najnowszym trendami nauki w zakresie biologii systemowej w badaniach nad biodegradacją oraz bioremediacją. 2. INTERAKCJE ZACHODZĄCE PODCZAS BIODEGRADACJI Biodegradacja zachodząca w środowisku naturalnym stanowi dużo bardziej skomplikowane zagadnienie, niż wynikałoby to z typowych studiów nad biodegradacją modelowego związku z wykorzystaniem czystych kultur mikrobiologicznych. Takie konwencjonalne podejście do zagadnień związanych z bioremediacją, dostarcza cennych informacji o charakterze podstawowym, niemniej jednak możliwości jej wykorzystania w środowisku są w pewien sposób ograniczone. Środowisko, a zwłaszcza gleba jako układ trójfazowy jest przestrzenią interakcji pomiędzy czynnikami biotycznymi oraz abiotycznymi. W takich warunkach katabolizm związków chemicznych jest trudny do przewidzenia oraz trudny do kontrolowania. Podczas bioremediacji, najbardziej złożone interakcje zachodzą na

3 Stopień złożoności Kierunek interakcji Koncepcje biologii systemowej w badaniach nad biodegradacją 503 poziomie ekosystemu (rysunek 1.). Wśród najważniejszych czynników, których udział będzie wpływał na procesy biodegradacji w gruncie, wymienić należy warunki hydrogeologiczne, warunki meteorologiczne, skład i strukturę gleby, skład i stężenie związków zanieczyszczających glebę oraz pozostałych związków organicznych w glebie. Wszystkie te czynniki oddziałują na przemiany abiotyczne a także na pozostałe poziomy wchodząc w interakcję z czynnikami biotycznymi. Oddziaływania na poziomie ekosystemu wpływają na strukturę społeczności mikroorganizmów. Wpływ na liczebność przedstawicieli poszczególnych taksonów mogą mieć wszystkie wymienione przy okazji ekosystemu czynniki. Do interakcji dochodzi też pomiędzy poszczególnymi mikroorganizmami. Dochodzić wówczas może zarówno do stymulacji wzrostu poszczególnych grup (zatem symbiontycznych form współżycia) jak i hamowania wzrostu (antagonizm bakteryjny). Klasycznym przykladem ograniczania liczebności innych grup mikroorganizmów jest produkcja antybiotyków przez bakterie z rodzaju Streptomyces, powszechnie występujące w środowisku glebowym. Z drugiej jednak strony produkcja antybiotyków prowadzić może również do uodparniania się na nie drobnoustrojów bytujących w glebie. Badania zespołu D Costa i wsp. [4] dowiodły, że mechanizm ten jest szeroko rozpowszechniony. Spośród 480 szczepów Streptomyces sp. wyizolowanych z różnych środowisk, wszystkie wykazywały oporność na przynajmniej jeden antybiotyk, którego same nie biosyntezowały. EKOSYSTEM MIKROBIOCENOZA POPULACJA KOMÓRKA GENOM METABOLOM Rys. 1. Schemat interakcji zachodzących w środowisku naturalnym podczas procesów biodegradacji. Na podstawie [3,5].

4 504 Koncepcje biologii systemowej w badaniach nad biodegradacją Podczas bioremediacji bardzo duży wpływ na aktywność, liczebność oraz skład konsorcjów mikroorganizmów może mieć powstawanie toksycznych lub mutagennych produktów pośrednich oraz końcowych w szlakach biodegradacji. Wzrost mutagenności notowano dla odcieków z pryzmy podczas kompostowania, w której neutralizowano związki nitroaromatyczne [8]. Wyższą ekotoksyczność notowano również podczas biodegradacji karbazolu, w modelowym układzie [10]. W nieodpowiednich warunkach powstające metabolity stanowić mogą zatem czynnik, który warunkuje przebieg biodegradacji. Innym rodzajem interakcji jest powstawanie metabolitow, które mogą stymulować proces biodegradacji dzięki zjawisku kometabolizmu. Dochodzi wówczas do indukcji biosyntezy enzymow np. dzięki odblokowaniu operonów biorących udział w biodegradacji. Powstały enzym uczestniczy w biodegradacji substancji, której obecność oraz struktura nie prowadzą do indukcji biosyntezy tego enzymu. Takie zjawisko obserwowane było podczas biodegradacji 3,4-dichlorobenzoesanu [1], którego biotransformacja przez Acinetobacter sp. 4-CB1 zachodziła przy udziale 4-chlorobezoesanu, pochodzącym ze szlaku degradacji 4-chlorobifenylu, przy udziale szczepów z rodzaju Pseudomonas [7]. Mechanizmy warunkujące oddziaływania na poziomie społeczności wpływają zatem na zjawiska na poziomie komórkowym i molekularnym. Uwzględniając szereg innych procesów, takich jak np. horyzontalny transfer genów, do którego dochodzi w środowiskach zanieczyszczonych, interakcje te można poszeregować wg stopnia złożoności. Schemat, na którym przedstawiono powiązania pomiędzy poszczególnymi poziomami w kontekście badań nad bioremediacją przedstawiono na rysunku METODY BADAWCZE Opracowanie skutecznych metod bioremediacji nie byłoby możliwe, bez rozwoju wiedzy w obszarze badań nad biodegradację. Badania naukowe reprezentujące podejście biologii systemowej mogą prowadzić do zwiększenia kontroli nad bioremediacją, jednak ich prowadzenie jest skomplikowane i kosztowne. Wykorzystanie biologii systemowej wiąże się z wykorzystaniem nowoczesnych metod badawczych, sporej ilości próbek, oraz analizy dużej liczby danych eksperymentalnych. Zmiany na poziomie ekosystemu wymagają zaangażowania metod monitoringu fizyko-chemicznego, sejsmicznego oraz modelowania. Zmiany w strukturze zbiorowości mikroorganizmów tworzących mikrobiocenozę, wymagają m.in. znajomości wykorzystania technik biologii molekularnej. Najczęściej stosowanymi technikami metagenomiki w środowiskach zanieczyszczonych są PCR, qpcr oraz tworzone z ich wykorzystaniem biblioteki genów kodujących 16S rrna [12]. Metody

5 Koncepcje biologii systemowej w badaniach nad biodegradacją 505 qpcr oraz klonowanie wykorzystywane są również do oceny aktywności na poziomie populacji, jednak za najbardziej rozpowszechnione i jednocześnie najtańsze uważa się testy aktywności enzymatycznej [9]. Najszybszym, ale jednocześnie najdroższym narzędziem do studiowania potencjału genetycznego szczepów wykorzystywanych w biodegradacji jest sekwencjonowanie. W roku 2008 w bazach NCBI zdeponowane były sekwencje prawie 800 genomów szczepów bakteryjnych [5]. Dostępność informacji na temat genów odpowiedzialnych za szlaki metabolizmu ksenobiotyków umożliwia prowadzenie prac nad markerami biodegradacji, które mogą być wartościowym elementem badań nad sieciami biodegradacyjnymi. Badania nad metabolomem są relatywnie mniej skomplikowane, w kontekście tzw. poziomów omicznych (wśród których wyróżnić można również genomikę, transkryptomikę, proteomikę), z uwagi na wykorzystanie znanych metod chemii analitycznej. Metody badawcze obejmują tzw. profilowanie metaboliczne (ocena ukierunkowana na konkretny szlak metabolizmu), wyznaczanie metabolicznych odcisków palców (ocena wszystkich metabolitów wewnątrzkomórkowych) oraz wyznaczanie metabolicznych odcisków stóp (ocena wszystkich metabolitów zewnątrzkomórkowych. Do oceny metabolomu stosuje się głównie techniki GC/MS, LC/MS oraz CE/MS, a najczęściej stosowanym podejściem jest profilowanie metaboliczne [6]. Dane pochodzące z eksperymentów wymagają rozbudowanej analizy bioinformatycznej. Dzięki analizie, interakcje zachodzące pomiędzy poszczególnymi elementami tej rozbudowanej sieci zależności, umożliwią wyłonienie kluczowych elementów determinujących strategię bioremediacji. Za przykład takiego podejścia posłużyć mogą badania Pazos i wsp. [11], celem ich pracy było stworzenie oraz analiza uniwersalnego modelu sieci biodegradacji, której podstawę stanowiły dane z bazy UMBD dotyczące szlaków biodegradacji, enzymów oraz mikroorganizmów, które w niej uczestniczą. 3. PODSUMOWANIE Wykorzystanie biologii systemowej do badań nad biodegradacją umożliwić mogą opracowanie skutecznych strategii bioremediacji. Zaangażowanie rozbudowanej metodyki badań oraz analizy bioinformatycznej wiąże się jednak z szeregiem utrudnień. Do podstawowych czynników limitujących rozwój tej dziedziny nauki zaliczyć należy koszty oraz brak przyjaznych użytkownikowi narzędzi do analizy bioinformatycznej, które podołają takiemu zadaniu. Wraz z rozwojem i upowszechnieniem metod badawczych, ograniczenia te powinny jednak zostać zminimalizowane.

6 506 Koncepcje biologii systemowej w badaniach nad biodegradacją LITERATURA [1] ADRIAENS P. and D. D. FOCHT, Cometabolism of 3,4-dichlorobenzoate by Acinetobacter sp. strain 4-CB1, Applied and Environmental Microbiology, Vol. 57, (1991). [2] R. M. Atlas and J. Philip, Bioremediation: applied microbial solutions for real-world environmental cleanup, R. M. Atlas and J. Philip, eds., (ASM Press, Washington, DC, 2005). [3] CHAKRABORTY R., C. H. WU, and T. C. HAZEN, Systems biology approach to bioremediation, Current Opinion in Biotechnology, Vol. 23, (2012). [4] D'COSTA V.M., K. M. MCGRANN, D. W. HUGHES, and G. D. WRIGHT, Sampling the Antibiotic Resistome, Science, Vol. 311, (2006). [5] DE LORENZO V.+., Systems biology approaches to bioremediation, Current Opinion in Biotechnology, Vol. 19, (2008). [6] DETTMER K., P. A. ARONOV, and B. D. HAMMOCK, Mass spectrometry-based metabolomics, Mass Spectrometry Reviews, Vol. 26, (2007). [7] FUKUDA M., Y. YASUKOCHI, Y. KIKUCHI, Y. NAGATA, K. KIMBARA, H. HORIUCHI, M. TAKAGI, and K. YANO, Identification of the bpha and bphb Genes of Pseudomonas sp. Strain KKS102 Involved in Degradation of Biphenyl and Polychlorinated Biphenyls, Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 202, (1994). [8] JARVIS A.S., V. A. MCFARLAND, and M. E. HONEYCUTT, Assessment of the Effectiveness of Composting for the Reduction of Toxicity and Mutagenicity of Explosive-Contaminated Soil, Ecotoxicology and Environmental Safety, Vol. 39, (1998). [9] KALAM A., J. TAH, and A. K. MUKHERJEE, Pesticide effects on microbial population and soil enzyme activities during vermicomposting of agricultural waste, Journal of Environmental Biology, Vol. 25, (2004). [10] PASTERNAK G. and B. KOŁWZAN, Surface tension and toxicity changes during biodegradation of carbazole by newly isolated methylotrophic strain Methylobacterium sp. GPE1, International Biodeterioration & Biodegradation (2012). [11] PAZOS F., A. VALENCIA, and V. DE LORENZO, The organization of the microbial biodegradation network from a systems-biology perspective, Embo Reports, Vol. 4, (2003). [12] WANG P., Y. Y. QU, and J. T. ZHOU, Changes of microbial community structures and functional genes during biodegradation of phenolic compounds under high salt condition, Journal of Environmental Sciences-China, Vol. 21, (2009). SYSTEMS BIOLOGY CONCEPT IN BIODEGRADATION STUDIES Bioremediation, defined as technology for de-pollution of areas affected by anthropogenic activity, is widely used for decades. To develop this technology, detailed biodegradation studies were conducted in laboratories by many researchers. However, the processes occurring during bioremediation are complicated and simultaneously affected by many factors. Therefore, the classic approach for bioremediation studies might be insufficient and emerging field of systems biology in bioremediation studies is being developed. In this paper, the basic problems, limitations and profits of systems biology approach is presented. This modern field of science might be invaluable to predict the microbial reaction during bioremediation.