18 testów TEST POTWIERDZENIA WYKRYWANIA PRZECIWCIAŁ ANTY-HIV 1 W SUROWICY / OSOCZU METODĄ IMMUNOBLOTU

Transkrypt

1 NEW LAV BLOT I 18 testów TEST POTWIERDZENIA WYKRYWANIA PRZECIWCIAŁ ANTY-HIV 1 W SUROWICY / OSOCZU METODĄ IMMUNOBLOTU Wyrób do diagnostyki in vitro Kontrola jakości producenta Wszystkie produkty wytwarzane i wprowadzane do obrotu przez Bio-Rad podlegają naszemu systemowi jakości poczynając od momentu otrzymania surowców aż do chwili wprowadzenia do obrotu ostatecznego produktu komercyjnego. Każda seria odczynników jest poddana kontroli jakości i jest dopuszczona do sprzedaży po spełnieniu określonych kryteriów jakości. Dane dotyczące procesu produkcji oraz kontroli jakości każdej serii produkcyjnej są archiwizowane u producenta.

2 SPIS TREŚCI 1 - ZASTOSOWANIE 2 - ZNACZENIE KLINICZNE 3 - ZASADA TESTU 4 - SKŁAD ZESTAWU 5 - ZALECENIA DLA UŻYTKOWNIKA 6 - HIGIENA I BEZPIECZEŃSTWO PRACY 7 - INNE NIEZBĘDNE MATERIAŁY 8 - PRZYGOTOWANIE ODCZYNNIKÓW 9 - PRÓBKI 10 - PROCEDURA 11 - WALIDACJA, ODCZYT I INTERPRETACJA WYNIKÓW 12 - CHARAKTERYSTYKA TESTU 13 - OGRANICZENIA TESTU 14 - LITERATURA 2

3 1- ZASTOSOWANIE TESTU Zestaw NEW LAV-BLOT I jest testem potwierdzenia przeznaczonym do wykrywania przeciwciał anty-hiv 1 w ludzkiej surowicy lub osoczu metodą immunoblotingu oraz określenia swoistości antygenowej podczas diagnostyki AIDS. 2- ZNACZENIE KLINICZNE Zespół nabytego niedoboru odporności (AIDS) rozpoznano i opisano jako dokładnie zdefiniowaną jednostkę chorobową w 1981 roku. Z limfocytów pacjentów, którzy zapadli na AIDS wyizolowano trzy retrowirusy (LAV, HTLV III, ARV), należące do podrodziny Lentiviridae, nie rozróżnialne za pomocą konwencjonalnych testów serologicznych. W 1986 roku sklasyfikowano wszystkie trzy wirusy pod nazwą HIV. Wirus HIV jest przenoszony przede wszystkim drogą płciową oraz przez krew. Jednym ze sposobów ograniczenia transmisji wirusa jest kontrolowanie dawców krwi i eliminacja krwi potencjalnie zakaźnej. Skrining polega na wykrywaniu przeciwciał w surowicy lub osoczu metodą immunoenzymatyczną. Zastosowane w tych testach antygeny nie wykluczają wystąpienia nieswoistych reakcji krzyżowych. Ze względu na znaczenie postawionej diagnozy, zaleca się potwierdzenie wyniku uzyskanego w metodzie skriningowej inną techniką. Metodą rekomendowaną przez WHO jest immunobloting (Western blot). Metoda ta pozwala scharakteryzować przeciwciała, skierowane przeciwko antygenom białkowym wirusa, co jednocześnie potwierdza seropozytywność i identyfikuje reakcje nieswoiste. Zestaw NEW LAV-BLOT I zawiera wszystkie odczynniki niezbędne do wykonania testu potwierdzenia metodą immunoblotingu. 3- ZASADA TESTU W teście zastosowano metodę pośredniej reakcji ELISA przebiegającej na pasku nitrocelulozowym zawierającym wszystkie konstytutywne białka wirusa HIV 1 oraz wewnętrzną kontrolę anty-igg. Prążek odpowiadający kontroli wewnętrznej nie ma numeru i znajduje się na końcu paska, przed białkiem p18; służy on zarówno do kontroli dodania próbki i odczynników jak i kontroli prawidłowego wykonania testu. Na pasku nitrocelulozowym naniesione są inaktywowane białka wirusa HIV 1, uprzednio rozdzielone w żelu poliakrylamidowym zgodnie z ich ciężarem cząsteczkowym, w buforze zapewniającym warunki dysocjacji i redukcji. Procedura obejmuje następujące etapy: 1. Rehydratacja paska 2. Inkubacja paska z próbkami badanymi lub surowicami kontrolnymi. Jeśli w próbce występują przeciwciała anty-hiv 1, zwiążą się one z określonymi białkami wirusowymi znajdującymi się na pasku. 3. Po etapie płukania, dodanie koniugatu przeciwciał anty-igg znakowanych fosfatazą alkaliczną, które podczas inkubacji zwiążą się z przeciwciałami anty-hiv 1 osadzonymi na pasku w poprzednim etapie. 3

4 4. Po kolejnym płukaniu i usunięciu nadmiaru koniugatu, następuje dodanie substratu dla alkalicznej fosfatazy, co ujawnia za pomocą reakcji barwnej aktywność enzymatyczną kompleksu związanego na fazie stałej. 5. Wystąpienie swoistych barwnych prążków potwierdza obecność przeciwciał anty-hiv 1 w surowicy. 4- SKŁAD ZESTAWU Wszystkie odczynniki zestawu przeznaczone są wyłącznie do diagnostyki in vitro. Każdy zestaw zawiera ilości odczynników pozwalające na wykonanie 18 oznaczeń. Oznaczenia mogą być wykonywane w niezależnych seriach oznaczeń. OZNACZENIE CHARAKTERYSTYKA ODCZYNNIKA OPAKOWANIE R1 Paski nitrocelulozowe HIV 1 Zawierają rozdzielone elektroforetycznie białka wirusa HIV 1 i kontrolę wewnętrzną anty-igg Paski znajdują się na jednorazowych tackach R2 Bufor do płukania / rozcieńczalnik (stężony 5x) Zawiera 0.5% chloroform R3 Kontrola ujemna Ludzka surowica ujemna pod względem antygenów HBs i przeciwciał anty-hiv 1, anty-hiv 2 i anty-hcv; konserwowana < 0.1% azydkiem sodu R4 Kontrola dodatnia anty-hiv 1 Ludzka surowica dodatnia pod względem przeciwciał anty- HIV 1, ujemna pod względem przeciwciał anty-hcv i antygenu HBs, inaktywowana termicznie, konserwowana < 0.1% azydkiem sodu R5 Koniugat Przeciwciała kozie przeciwko ludzkim IgG znakowane fosfatazą alkaliczną; konserwowane < 0.1% azydkiem sodu R6 Substrat (BCIP/NBT) 5 bromo-4-chloro-3-indolylo fosforan (BCIP) + nitro-blue tetrazolium (NBT) 5- ZALECENIA DLA UŻYTKOWNIKA 18 pasków na 3 tackach (6 komór każda) 1 fiolka 100 ml 1 fiolka 0.2 ml 1 fiolka 0.2 ml 1 fiolka 40 ml 1 fiolka 40 ml Uzyskanie prawidłowego wyniku zależy od przestrzegania zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej: Nie używać odczynników po upływie terminu przydatności. Podczas jednego oznaczenia używać wyłącznie odczynników o tym samym numerze serii. Uwaga: Podczas danego oznaczenia pod warunkiem stosowania tej samej serii w jednym oznaczeniu można używać następujących odczynników z innej serii: buforu (oznaczonego: R2 na niebiesko) i roztworu substratu wywołującego reakcję barwną (R6). Przed użyciem przenieść odczynniki na 30 minut do temp. pokojowej (18-30 C) Unikać zanieczyszczenia podczas rekonstytucji odczynników. Używać dobrze umytego i wypłukanego wodą destylowaną szkła lub preferencyjnie materiałów jednorazowych. Do każdej badanej próbki zmieniać końcówkę pipety automatycznej. Nigdy nie używać tego samego pojemnika do nanoszenia koniugatu i roztworu wywołującego. Dokładnie nastawić objętości pobierane pipetą i sprawdzać prawidłowe pobieranie. 4

5 Nie zmieniać procedury wykonania oznaczenia. Podczas każdego oznaczenia nastawiać surowice kontrolne. Nie dopuszczać do wysuszenia pasków pomiędzy etapem płukania a dodawaniem kolejnego odczynnika (odstęp nie powinien przekraczać 10 minut). Jeśli w roztworze substratu występują zawieszone cząstki, należy pozwolić im opaść przed pipetowaniem (nie interferują one z oznaczeniem). 6- HIGIENA I BEZPIECZEŃSTWO PRACY Wszystkie odczynniki zestawu służą do diagnostyki in vitro. Nie przenosić pasków gołymi rękami, używać plastikowej pęsety. Podczas pracy z odczynnikami i próbkami używać rękawiczek jednorazowych. Nie pipetować ustami. Ludzkie surowice używane do przygotowania kontroli ujemnej (R3) były ujemne pod względem przeciwciał anty-hiv 1 i anty-hiv 2, antygenów HBs oraz przeciwciał anty-hcv. Ludzkie surowice używane do przygotowania kontroli dodatniej (R4) były ujemne pod względem antygenów HBs oraz przeciwciał anty-hcv. Zostały one inaktywowane termicznie. Ponieważ nie ma metod absolutnie wykluczających obecność czynników zakaźnych, takich jak wirusy HIV, wirusy zapalenia wątroby typu B lub C, lub innych, odczynniki pochodzące z materiału ludzkiego oraz badane próbki powinny być uważane za materiał potencjalnie zakaźny i traktowane z należytą ostrożnością. Materiały mające kontakt z próbkami lub surowicami kontrolnymi, oraz z buforem, należy traktować jako skażone biologicznie i odpowiednio z nimi postępować. Unikać rozlania próbek i odczynników je zawierających. Zanieczyszczone powierzchnie czyścić 10% roztworem podchlorynu. Jeśli nastąpiło zanieczyszczenie kwasem, należy go najpierw zneutralizować dwuwęglanem sodu. Powierzchnie po traktowaniu wybielaczem przemyć wodą destylowaną i wysuszyć bibułą. Materiał używany do czyszczenia wyrzucić do pojemnika na odpady. Próbki, surowice kontrolne i materiały zanieczyszczone nimi zdekontaminować przed wyrzuceniem: - przez moczenie w 5% podchlorynie sodu (1 objętość podchlorynu na 10 objętości zanieczyszczonego płynu lub wody) przez 30 minut w temp. pokojowej, - lub przez autoklawowanie w temp. minimum 121 C, przez co najmniej 2godziny. Autoklawowanie jest najlepszą metodą inaktywacji wirusów HIV i HBV. Uwaga: Nie autoklawować roztworów zawierających podchloryn sodu. Zawsze neutralizować i/lub autoklawować roztwory i inne płyny zawierające materiał biologiczny przed wylaniem do zlewu. Ze środkami chemicznymi należy postępować zgodnie z zasadami pracy laboratoryjnej. Niektóre odczynniki są konserwowane azydkiem sodu. Związek ten może reagować z miedzią i ołowiem, tworząc azydki metali o właściwościach wybuchowych. Aby zapobiec akumulacji azydku 5

6 w zlewie i rurach, po wylaniu zinaktywowanych odczynników zawierających azydek spłukać zlew dużą ilością wody. 7- INNE NIEZBĘDNE MATERIAŁY Woda destylowana lub dejonizowana Cylindry miarowe na 100 ml, 250 ml i 500 ml Pipety z podziałką na 2 ml Pipety automatyczne lub półautomatyczne, pobierające 20 μl Rękawiczki jednorazowe Pompa próżniowa z kolbą ssącą Podchloryn sodu (wybielacz) Bibuła Pęseta Wytrząsarka 1, 2 lub 3-wymiarowa (mieszanie w celu homogenizacji środowiska reakcji i całkowitego zanurzenia pasków w trakcie mieszania). Pojemnik na materiał zakaźny i zanieczyszczone odpady Okulary ochronne 8- PRZYGOTOWANIE ODCZYNNIKÓW Zestaw zawiera odczynniki do wykonania 18 oznaczeń. Testy można wykonywać w niezależnych seriach oznaczeń. Odczynniki gotowe do użycia: R1: Paski nitrocelulozowe HIV 1 R3: Kontrola ujemna R4: Kontrola dodatnia anty-hiv 1 R5: Koniugat R6: Substrat (BCIP / NBT) Odczynniki do rekonstytucji R2: bufor do płukania / rozcieńczalnik (5x stężony) Przygotowanie: Wstrząsnąć zawartość fiolki i rozcieńczyć wodą destylowaną 1:5 (np. na całą tackę potrzeba 30 ml buforu ml wody destylowanej), dobrze wymieszać. Przechowywanie: Zestaw, także po otwarciu, powinien być przechowywany w temp C, wówczas wszystkie odczynniki są trwałe zgodnie z datą ważności (z wyjątkiem specjalnych instrukcji). Rozcieńczony bufor do płukania / rozcieńczalnik (R2) jest stabilny w temp C przez miesiąc. Należy unikać zanieczyszczenia mikrobiologicznego odczynników. 6

7 9- PRÓBKI Próbki krwi należy pobrać zgodnie z rutynową procedurą. Do testu używać niezhemolizowaną, nierozcieńczoną surowicę lub osocze (pobrane na antykoagulant np. EDTA, heparynę, cytrynian). Jak najszybciej oddzielić surowicę lub osocze od skrzepu, aby nie dopuścić do hemolizy. Silna hemoliza może wpływać na wynik testu. Próbki zawierające widoczne agregaty odwirować przed oznaczeniem. Cząstki fibryny obecne w próbce mogą dać fałszywie dodatni wynik testu. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze +2 do +8ºC, jeśli test będzie wykonany w przeciągu 7 dni, lub mogą być zamrożone w temperaturze -20ºC. Zamrożone próbki osocza należy szybko rozmrozić przez umieszczenie na kilka minut w temp. 40ºC, aby ograniczyć precypitację fibryny. Próbki można rozmrozić i ponownie zamrozić najwyżej 3 razy. W razie potrzeby odwirować je po rozmrożeniu. Jeśli próbki będą przesyłane, należy je zapakować zgodnie z przepisami dotyczącymi transportu materiałów zakaźnych. NIE UŻYWAĆ PRÓBEK ZANIECZYSZCZONYCH, HIPERLIPEMICZNYCH LUB SILNIE ZHEMOLIZOWANYCH. UWAGA: Na wyniki testu nie ma wpływu zawartość 90 g/l albumin, 100 mg/l bilirubiny, lipemia na poziomie 36 g/l trioleiny (trójglicerydy) ani hemoliza wynosząca do 10 g/l hemoglobiny. 10- PROCEDURA 1. Przed użyciem przenieść odczynniki na 30 minut do temp. pokojowej w celu stabilizacji. Usunąć przezroczystą osłonę tacki. Sprawdzić, czy paski są położone na zewnątrz stroną zawierającą białka wirusa, na której znajdują się oznaczenia i numer. Ta strona pasków będzie się kontaktować z odczynnikami dodawanymi kolejno podczas testu. Paski należy przenosić za pomocą plastikowej pęsety. Nie pozwalać na ich wysychanie pomiędzy kolejnymi etapami oznaczenia (przerwy nie mogą być dłuższe niż 10 minut). Równolegle z badanymi próbkami zawsze należy oznaczać surowice kontrolne. Kontrola dodatnia jest niezbędna do walidacji testu i prawidłowej interpretacji uzyskanych prążków. 2. Do każdej komory dodać 2 ml zrekonstytuowanego buforu płuczącego / rozcieńczalnika. Inkubować 5 ± 1 minut w temp. pokojowej (18-30ºC) mieszając. 3. Do odpowiednich komór dodać po 20 µl próbek lub surowicy kontrolnej. Inkubować 2 godziny w temperaturze pokojowej (18-30ºC) mieszając. 4. Całkowicie osuszyć zawartość każdej komory przy pomocy pompy próżniowej z pułapką zawierającą środek dezynfekujący (podchloryn sodu w stężeniu 25%). Należy uważać, aby podczas aspiracji nie wessać paska, należy korzystać ze studzienki aspiracyjnej. 7

8 Pomiędzy osuszaniem kolejnych próbek przemywać końcówkę ssącą, która kontaktuje się z próbkami, aby uniknąć krzyżowego zanieczyszczenia próbek. Przepłukać każdy pasek 2 ml rekonstytuowanego roztworu płuczącego / rozcieńczalnika i natychmiast zaaspirować płyn stosując zasady ostrożności jak wyżej. Każdy pasek przepłukać 2 razy za pomocą 2 ml zrekonstytuowanego buforu płuczącego / rozcieńczalnika; pozostawiając roztwór na 5 minut z wytrząsaniem; po każdym płukaniu roztwór usunąć poprzez aspirację (tzn. razem trzy etapy płukania). 5. Do każdej komory nanieść po 2 ml koniugatu. Roztwór koniugatu powinien być uprzednio stabilizowany w temperaturze pokojowej. Inkubować przez 1 godzinę ± 5 minut w temperaturze pokojowej ( C) na wolnym biegu wytrząsarki. 6. Płukanie: jak opisano w punkcie Do każdej komory nanieść po 2 ml roztworu substratu wywołującego reakcję barwną. Jeśli w fiolce z tym roztworem znajdują się zawieszone cząstki, należy pozwolić im opaść na dno przed pipetowaniem (nie interferują one z oznaczeniem). Inkubować mieszając i obserwować wystąpienie barwy. Na pasku, na który naniesiono kontrolną surowicę dodatnią muszą pojawić się prążki odpowiadające wszystkim białkom wirusa. (Czas wywołania reakcji barwnej minimum 5 minut). 8. Zatrzymać reakcję usuwając roztwór substratu i przemywając paski 3 razy wodą destylowaną. 9. Wysuszyć paski pomiędzy dwoma kawałkami bibuły w temperaturze pokojowej (18-30ºC). Ułożyć paski wg położenia znaku referencyjnego. Przed interpretacją sprawdzić ważność testu (walidacja). UWAGA: Nie zaklejać plastikowymi taśmami samoprzylepnymi pasków po stronie zawierającej białka wirusa. 11- WALIDACJA I INTERPRETACJA WYNIKÓW Walidacja Prążki kontroli wewnętrznej anty-igg muszą mieć intensywną barwę. Kontrola ta służy potwierdzeniu dodania próbki i odczynników oraz wykonania testu zgodnie z procedurą. Brak lub słabe zabarwienie prążków kontroli anty-igg wskazuje na brak próbki lub odczynników lub postępowanie niezgodne z procedurą. Kontrola dodatnia: obecność prążków odpowiadających wszystkim białkom wirusa oraz prążka kontrolnego. Kontrola ujemna: brak prążków odpowiadających białkom wirusa, obecność prążka kontrolnego. Odczyt O obecności w badanych próbkach przeciwciał przeciwko białkom wirusa HIV 1 świadczy wystąpienie barwnych prążków (niebiesko-purpurowych). Ich położenie odpowiada masie cząsteczkowej białek wirusa wymienionych w tabeli: 8

9 WAŻNE Do lokalizacji i identyfikacji wykrytych przeciwciał należy używać kontroli dodatniej (patrz fot. str. 14) i sprawdzić, czy na każdym pasku pojawił się prążek kontroli wewnętrznej. Należy zinterpretować każdy specyficzny i odczytywalny prążek. OZNACZENIE GENOM RODZAJ BIAŁKA WESTERN BLOT GP 160 ENV Glikoproteinowy prekursor GP 110/120 i GP 41 Prążek o rozmytych brzegach GP 110/120 ENV Glikoproteina otoczki Prążek o rozmytych brzegach P 68/66 POL Odwrotna transkryptaza Wyraźny prążek P 55 GAG Prekursor białka rdzeniowego Dublet P 52/51 POL Odwrotna transkryptaza Wyraźny prążek GP 41 ENV Glikoproteina transbłonowa Prążek rozmyty P 40 GAG Prekursor białka rdzeniowego Wyraźny prążek P 34/31 POL Endonukleaza Wyraźny prążek P 24/25 GAG Białko rdzeniowe Wyraźny prążek P 18/17 GAG Białko rdzeniowe Czasami dublet Interpretacja INTERPRETACJA Kryteria WHO* Kryteria CRSS** Wynik dodatni* 2 ENV ± GAG ± POL 1 ENV + (1 GAG LUB POL) Wynik nieokreślony Wynik ujemny 1 ENV ± GAG ± POL GAG + POL GAG POL Prążki nie sklasyfikowane Brak prążków GAG + POL GAG POL ENV Prążki nie sklasyfikowane Brak prążków * WHO, World Health Organization ** CRSS: Consortium for Retrovirus Serology Standarisation UWAGI: Wynik nieokreślony można uzyskać w przypadku serokonwersji, obecności wirusa HIV 2 lub reakcji krzyżowej z innymi retrowirusami. Dodatnie lub wyniki nieokreślone można otrzymać przez zanieczyszczenie próbki surowicą dodatnią. 12- CHARAKTERYSTYKA TESTU Z użyciem zestawu NEW LAV BLOT I (NLB I) przebadano 419 próbek ujemnych w kierunku HIV w badaniu metodą ELISA (w tym, 214 próbek od dawców krwi i 205 próbek od pacjentów hospitalizowanych). Uzyskano identyczne, podane niżej, wyniki, niezależnie czy stosowano kryteria interpretacji WHO, czy też kryteria CRSS. 9

10 Wyniki Próbki Liczba próbek Ujemne Nieokreślone Dodatnie Dawcy krwi Pacjenci hospitalizowani Razem % 13% 0% Swoistość testu dla próbek mogących generować reakcje krzyżowe Swoistość testu badano z użyciem 57 próbek ujemnych pod względem HIV, pobranych od pacjentów ze stwierdzoną obecnością innych wirusów, takich jak HBV, HCV, HTLV, HSV, EBV, VZV, CMV lub patologiami takimi jak HAMA, RF, ANA, toksoplazmoza, oraz 5 próbek od kobiet ciężarnych. Próbki Wyniki 5 myeloma, 4 HBV, 5 HSV IgG Wszystkie ujemne 5 HAMA 1 nieokreślony (p25) 5 RF 2 nieokreślone (słabe p18) 5 ANA 3 nieokreślone (słabe p68, p55, p34) 5 kobiet ciężarnych 1 nieokreślony (p52) 4 HTLV 1 nieokreślony (p55) 4 HCV 1 nieokreślony (p55, p18) 5 CMV IgG 1 nieokreślony (p25) 5 EBV IgG 2 nieokreślone (p55, p25) 5 VZV IgG 1 nieokreślony (słabe p55) 5 Toxo IgG 1 nieokreślony (p18) Dla 48 próbek uzyskano wynik ujemny, dla 14 próbek uzyskano wynik nieokreślony: 3x p25, 3x p18, 5x p55, 1x p52, 1x p34 i 1x p68. Nie stwierdzono żadnej próbki dodatniej. Uzyskano identyczne wyniki, niezależnie czy stosowano kryteria interpretacji WHO, czy też kryteria CRSS. Czułość dla próbek HIV-1 dodatnich Przebadano 203 próbki dodatnie w kierunku HIV w badaniu metodą ELISA: 5 HIV grupy O, 8 próbek z początkowej fazy zakażenia (dodatni wynik badania w kierunku obecności antygenu lub ładunku wirusa) oraz 84 próbki pochodzące z różnych krajów, takich jak Chiny, Niger, oraz Indie. Poniżej podano wyniki w podziale wg. kryteriów interpretacji. WHO CRITERIA* CRSS CRITERIA** 2 ENV ± GAG ± POL 1 ENV + (1 GAG or 1 POL) Próbki Liczba próbek Nieokreślone Dodatnie Nieokreślone Dodatnie HIV Dodatnie % 96% 0.5% 99.5% * WHO, World Health Organization ** CRSS: Consortium for Retrovirus Serology Standarisation 10

11 Czułość dla próbek HIV-2 dodatnich W sumie z użyciem NLB I przebadano 101 próbek anty-hiv-2 dodatnich, pośród których 6 było HIV- 1 oraz HIV-2 dodatnich w teście Pepti-Lav. Próbki Liczba próbek of samples WHO CRITERIA* CRSS CRITERIA** 2 ENV ± GAG ± POL 1 ENV + (1 GAG or 1 POL) Nieokreślone Dodatnie Nieokreślone Dodatnie HIV Dodatnie % 45% 23% 78% * WHO, World Health Organization ** CRSS: Consortium for Retrovirus Serology Standarisation Czułość dla paneli serokonwersyjnych Czułość testu badano na 55 próbkach z 17 paneli serokonwersyjnych (BBI, NABI oraz BCP) oraz 10 próbkach od hospitalizowanych pacjentów, co daje sumę 21 paneli serokonwersyjnych przebadanych z użyciem testu New Lav Blot I. WHO CRITERIA* CRSS CRITERIA** 2 ENV ± GAG ± POL 1 ENV + (1 GAG or 1 POL) Próbki Dodatnie Nieokreślone Ujemne Dodatnie Nieokreślone Ujemne % 71% 26% 57% 17% 26% * WHO, World Health Organization ** CRSS: Consortium for Retrovirus Serology Standarisation Podsumowując, stosowanie kryteriów CRSS prowadzi do podniesienia czułości testu poprzez redukcję liczby wyników nieokreślonych na korzyść wyników dodatnich. Powtarzalność Powtarzalność wewnątrztestowa Jedna próbka ujemna oraz 3 rozcieńczone próbki dodatnie (2 słabo-dodatnie i jedną średniododatnią) badano 6 razy w tej samej serii. Wykonano interpretację z użyciem obu kryteriów. Uzyskano identyczne wyniki, niezależnie czy stosowano kryteria interpretacji WHO, czy też CRSS. Powtarzalność międzytestowa (odtwarzalność) Jedna próbka ujemna, 6 rozcieńczonych próbek dodatnich (3 słabo-dodatnie i 3 dodatnie) oraz 3 silnie dodatnie próbki badano przez 5 dni. Wykonano interpretację z użyciem obu kryteriów. Uzyskano identyczne wyniki, niezależnie czy stosowano kryteria interpretacji WHO, czy też CRSS. 13- OGRANICZENIA TESTU Zmienność wirusa HIV 1 (grupa M i grupa O) może być przyczyną uzyskania wyników fałszywie ujemnych. Nie ma obecnie metody całkowicie wykluczającej zakażenie wirusem HIV. Dodatni wynik testu skriningowego i ujemny wynik testu potwierdzenia można uzyskać u pacjentów w pierwszej fazie zakażenia; wynik ujemny wskazuje na brak przeciwciał anty-hiv, 11

12 wykrywanych w teście NEW LAV BLOT I. Wynik taki nie wyklucza możliwości zakażenia HIV 1 / HIV 2. Oznaczenie należy powtórzyć z próbki pobranej później Obecność pojedynczego paska ENV w próbce, która zestala uznana za dodatnią w teście New Lav Blot I zgodnie z kryteriami CRSS, nie wyklucza możliwości infekcji wirusem HIV-2. Profil nieokreślony można uzyskać w kilku sytuacjach: podczas serokonwersji, zakażenia wirusem HIV 2 lub jako wynik reakcji krzyżowej z innymi retrowirusami. Profil nietypowy, ze słabo zaznaczonymi białkami otoczki (gp120/gp160), kontrastującymi z wyraźnymi prążkami dla GAG i POL, sugeruje możliwość zakażenia wirusem HIV 2 lub wirusem HIV 1 z grupy O i wymaga wykonania uzupełniających badań. 14- LITERATURA 1. CLAVEL F., BRUN-VEZINET F., GUETARD D. et al. : LAV II - un second rétrovirus associé au SIDA en Afrique de l'ouest. C.R. Acad. Sc. Paris, 1986, 13, CLAVEL F., GUYADER M., GUETARD D. et al. : Molecular cloning and polymorphism of the human immune deficiency virus type 2. Nature, 1986, 324, NEWMARK P. : AIDS in an African context. Nature, 1986, 324, POPOVIC M., SARNGADHARAN M.G., READ E., GALLO R.C. : Detection, isolation and continuous production of cytopathic retroviruses (HTLV III) from patients with AIDS and pre AIDS Science, 1984, 224, KANKI P.J., BARIN F., M BOUP S. et al. : New human T-lymphotropic retrovirus related to Simian T - lymphotropic virus type III. (STLV III Agm). Science, 1986, 232, BRUN-VEZINET F., REY M.A., KATLAMA et al. : HIV/LAV2 in AIDS and ARC patients : Clinical and virological studies. Lancet. 7. REY F., SALAUN D. LESBORDES J.L. et al. : Evidence for HIV-1 and HIV-2 double infection in Central African Republic. Lancet, II, 1986, MOLBAK K., LAURITZEN E., FERNANDES D. et al. : Antibodies to HTLV IV associated with chronic, fatal illness ressembling slim disease. Lancet, II, 1986, BIBERFELD G., BOTTIGER B., BREDBERG - RADEN U. et al. : Findings in fowe HTLV-IV seropositive women from West Africa. Lancet, II, ESTEBAN J.I., CHANG - CHIN T., KAY J.W.D. et al. : Importance of Western Blot analysis in predicting infectivity of anti-htlv III/LAV positive blood. Lancet, II, 1985, LAURITZEN E., LINDHARDT B.O. : Antibodies against human immuno-deficiency (HIV) detected by immunobloting. In BJERRUM O.J., HEEGAARD N.H., eds. : Handbock of immunobloting of proteins CRC Press. 12. TOWBIN H., STAEHLIN T., GORDON J. : Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets : procedure and some applications. Proc. Nat. Acad. Scien., USA, 1979, 76, SOUTHERN E.M. et al. : Detection of specific sequences among DNS fragments separated gel electrophoresis. J. Mol. Biol., 1975, 98, ARNHEIM N., SOUTHERN E.M. et al. : Heterogeneity of the ribosomal genes in mice and men. Cell. 1977, 11, KHYSE - ANDERSEN J. : Electroblotting of multiple gels : a simple apparatus without buffer - tank for rapid transfer of proteins. J. Biochem. Biophys. Meth., 1984, 10, JOHNSON D.A., GAUTSCH J.W., SPORTMAN J.R., ELDER J.H.T.: Improved technic utilizing non - fat dry milk for analysis of proteins and nucleic acids transfer to nitrocellulose.gene. Annals. Tech., 1984, 1, DESJARLIS DC, MARMOR M, COHEN H, et al :Antibodies to a retrovirus etiologically associated with acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) in populations with increased incidence of the syndrome. Morbidity Mortality Weekly Rep 1984, 33 : BARRE-SINOUSSI F. CHERMANN J.C., REY F., et al :Isolation of T-lymphotropic retroviruses from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS), Science 1983, 220: GALLO R.C., SALAHUDDIN S.Z., POPOVIC M. et al. :Frequent detection and isolation of 12

13 cytopathic retrovirus (HTLV-III) from patients with AIDS and at risk for AIDS; Science 1984, 224: CLAVEL F. GUETARD D., BRUN-VEZINET F. : Isolation of a new human retrovirus from West African patients with AIDS. Science 1986, 233: CENTERS FOR DISEASE CONTROL :AIDS due to HIV-2 infection - New Jersey. Morbidity Mortality Weekly Rep 1988, 37: VALKIRS G.E., BARTON R. : Immunoconcentration - A new format for solid phase immunoassays Clin. Chem. 1985, 31 : , RESNICK L., VEREN K., SALAHUDDIN S.Z., et al. :Stability and inactivation of HTLV-III/LAV under clinical and laboratory environments. JAMA 1986, 255 : BOND W.W., FAVERO M.S., PETERSEN N.J., et al. :Inactivation of hepatitis B virus by intermediate to high level disinfectant chemicals. J. Clin. Micro. 1983, 18 : WHO (World Health Organisation) weekly epidemiological record 1990, 37 Page

14 14 Uwaga: Szczegółowy obraz uzyskany w rzeczywistości może być różny od przedstawionego. Nie należy stosować załączonego fotogramu jako podstawy do końcowej interpretacji. W celu identyfikacji przeciwciał w próbce pacjenta, należy wykonać rozdział kontroli dodatniej (R4) oraz sprawdzać obecność prążka kontroli wewnętrznej (internal control) na każdym pasku.

15 CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) Znak CE (Dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady nr 98/79/CE o wyrobach diagnozy medycznej in vitro) For in vitro diagnostic use Wyrób do diagnostyki in vitro Catalogue number Numer katalogowy Manufacturer Wytwórca Authorised Representative Autoryzowany przedstawiciel Batch code Kod partii Expiry date YYYY/MM/DD Użyć przed RRRR/MM/DD Storage temperature limitation Przestrzegać zakresu temperatur Consult Instruction for use Sprawdź w instrukcji obsługi Bio-Rad 3, Bd Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tél. : 33 (0) Fax.: 33 (0) /2009 nr