Typowanie szczepów Pseudomonas aeruginosa opornych na karbapenemy techniką PCR-RAPD

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2010, 62: Tomasz Bogiel, Eugenia Gospodarek Typowanie szczepów Pseudomonas aeruginosa opornych na karbapenemy techniką PCR-RAPD Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu Kierownik: dr hab. n. med. E. Gospodarek, prof. UMK W związku ze znacznym wzrostem w 2007 roku liczby izolacji szczepów Pseudomonas aeruginosa opornych na karbapenemy, przeprowadzono genotypowanie techniką PCR-RAPD 16 wybranych izolatów z materiału od chorych leczonych w Szpitalu Uniwersyteckim nr 1 im. dr. A. Jurasza w Bydgoszczy. W roku objętym badaniem od 78 chorych izolowano 125 szczepów P. aeruginosa o fenotypie oporności na imipenem i meropenem. Wykazano, że wszystkie badane szczepy były odmienne, dowodząc przydatności techniki PCR-RAPD w typowaniu szczepów pałeczek ropy błękitnej. Pałeczki P. aeruginosa należą do najczęstszych etiologicznych czynników zakażeń szpitalnych spośród pałeczek niefermentujących (8). Nabywanie przez nie oporności na antybiotyki/chemioterapeutyki, niewrażliwość na czynniki fizyko-chemiczne i zdolność przeżycia w środowisku szpitala sprzyjają występowaniu zakażeń szpitalnych (8). Szczepy tego gatunku oporne na karbapenemy (carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa, CRPA) stanowią wyzwanie terapeutyczne, zarówno ze względu na ograniczoną liczbę opcji terapeutycznych, trudności w eradykacji oraz rodzaj i lokalizację zakażeń powstających z ich udziałem (8). Techniką uznawaną za złoty standard w typowaniu szczepów i często stosowaną do takich aplikacji jest genotypowanie polegające na cięciu chromosomalnego DNA enzymami restrykcyjnymi i jego rozdziale z wykorzystaniem elektroforezy w zmiennym polu elektrycznym (Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE) (13). Jest to jednak procedura długotrwała i kosztowna, zwłaszcza w rutynowych badaniach. Alternatywą jest inna metoda genotypowa oparta na losowej amplifikacji materiału genetycznego i polimorfizmie wielkości powstających w jej wyniku produktów PCR-RAPD (Polymerase Chain Reaction-Random Amplified Polymorphic DNA) (18). Celem pracy była ocena przydatności techniki PCR-RAPD do wewnątrzgatunkowego typowania szczepów CRPA. W analizie uwzględniono 16 szczepów CRPA o podobnych i/lub różnych wzorach lekowrażliwości na antybiotyki/chemioterapeutyki, wyosobnionych od różnych chorych Szpitala Uniwersyteckiego nr 1 im. dr. A. Jurasza w Bydgoszczy w 2007 roku. 1 Praca została sfinansowana z Grantu UMK nr 30/2009

2 212 T. Bogiel, E. Gospodarek Nr 3 MATERIAŁ I METODY Przedmiotem badań było 16 szczepów P. aeruginosa niewykazujących stref zahamowania wzrostu wokół krążków z imipenemem (10 μg) i meropenemem (10 μg) (Becton Dickinson) w metodzie krążkowo-dyfuzyjnej według Kirby-Bauer. Były to izolaty pochodzące od różnych pacjentów, o takich samych i/lub różnych wzorach lekowrażliwości. Badane szczepy zostały wybrane spośród 125 CRPA, izolowanych w 2007 roku w Zakładzie Mikrobiologii Klinicznej od 78 chorych Szpitala Uniwersyteckiego nr 1 im. dr. A. Jurasza Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy. Identyfikację gatunkową przeprowadzano na podstawie morfologii kolonii na podłożu Columbia Agar z dodatkiem 5% krwi baraniej (biomérieux), podłożu MacConkey Agar (Becton Dickinson, biomérieux), podłożu z cetrymidem (Becton Dickinson), zdolności wytwarzania barwników oraz wyników reakcji biochemicznych ujętych w testach ID 32 GN, ID 32 E lub API 20 NE (biomérieux) wykonywanych zgodnie z zaleceniami producenta i odczytywanych w systemie komputerowym ATB Expression V (biomérieux). Lekowrażliwość szczepów P. aeruginosa oznaczano metodą krążkowo dyfuzyjną według Kirby Bauer, zachowując warunki standaryzacji podane przez Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów (KORLD) (12) oraz interpretacji według Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (5). Używano zawiesiny bakteryjnej o gęstości 0,5 według skali MacFarlanda i podłoża Mueller-Hinton Agar (biomérieux). Krążki z antybiotykami (Becton Dickinson) dobierano zgodnie z zaleceniami KORLD. W celu kontroli oznaczania lekowrażliwości stosowano szczepy wzorcowe z kolekcji ATCC: Pseudomonas aeruginosa i Escherichia coli Płytki antybiogramowe inkubowano godzin w temperaturze 35ºC w atmosferze tlenowej. Wyniki interpretowano na podstawie wielkości średnic stref zahamowania wzrostu bakterii wokół krążków z antybiotykami stosując aktualne zalecenia CLSI. Po wykonaniu identyfikacji i ocenie lekowrażliwości, szczepy przeznaczone do genotypowania przechowywano w temperaturze -80 C w podłożu BHI (Brain Heart Infusion, Becton Dickinson) z dodatkiem glicerolu (POCh). Następnie, izolowano DNA bakteryjne zgodnie z instrukcją producenta, wykorzystując zestaw Genomic Mini (A&A Biotechnology). W technice PCR-RAPD zastosowano metodę opisaną przez Mahenthiralingam i wsp. (18). Reakcję przeprowadzano w probówkach o objętości 200 μl (Eppendorf) w końcowej objętości 25 μl. Stosowano polimerazę Taq w ilości 1 U/reakcję w pięciokrotnie rozcieńczonym buforze (Green GoTaq Flexi Buffer), MgCl 2 w stężeniu końcowym 3 mm (GoTaq Flexi DNA Polymerase, Promega) oraz zestaw dntp w stężeniu 250 μm (dntp Mix, Promega). W dwóch oddzielnych reakcjach użyto w ilości 40 pmoli/reakcję dwóch dziesięcionukleotydowych starterów (Integrated DNA Technologies): 208 o sekwencji 5 ACGGCCGACC 3 i temperaturze topnienia 45,5 C oraz 272 o sekwencji 5 AGCGGGCCAA 3 i temperaturze topnienia 43,7 C. Następnie dodawano wyizolowanego DNA bakteryjnego w ilości 40 ng i do końcowej objętości dopełniano wodą do aplikacji biologii molekularnej Molecular Biology Grade Water (Eppendorf). Wykorzystano termocykler GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems) oraz następujące warunki reakcji: 1. pre-amplifikacja - 4 cykle, temperatura: 94 C 5 minut, 36 C 5 minut, 72 C 5 minut,

3 Nr 3 Typowanie P. aeruginosa metodą PCR-RAPD amplifikacja właściwa - 30 cykli, temperatura: 94 C 1 minuta, 36 C 1 minuta, 72 C 2 minuty, 3. końcowy etap wydłużania, temperatura 72 C 10 minut. Produkt amplifikacji PCR-RAPD w ilości 6 μl rozdzielano elektroforetycznie w 2,5% żelu agarozowym (Bio-Rad) w 1xTBE (Bio-Rad) pod napięciem 9 V/cm przez 3 godziny w aparacie do elektroforezy SUB-CELL GT (BioRad). Wykorzystano wzorzec wielkości pz (SolisBiodyne). Po zakończeniu elektroforezy żel wybarwiano przez 30 minut roztworem bromku etydyny, odbarwiano przez 40 minut wodą dejonizowaną. Odczytu dokonywano w świetle UV i wynik zapisywano korzystając z systemu dokumentacji żeli GEL DOC 2000 (BioRad) i programu Quantity One (Bio-Rad). WYNIKI Liczba izolacji CRPA w ogólnej liczbie izolacji szczepów gatunku wzrosła z 92 w 2006 roku do 210 w 2007 roku. Wynika to głównie z ogólnie większej liczby izolacji szczepów P. aeruginosa 740 w 2006 roku, a 919 w 2007 roku. Zaobserwowano ponadto znaczący wzrost odsetka izolacji CRPA z 12,4% w 2006 roku do 22,9% w 2007 roku. Odnotowano Klinika Anestezjologii i Intensyw nej Terapii 6,3 6,3 6,3 25,0 Klinika Chirurgii Dziecięcej Klinika Rehabilitacji 6,3 Klinika Nefrologii, Nadciśnienia Tętniczego i Chorób Wew nętrznych Klinika Chirurgii Ogólnej i Endokrynologicznej 12,5 18,8 Klinika Transplantologii i Chirurgii Ogólnej Klinika Neurochirurgii i Neurotraumatologii 18,8 Klinika Chirurgii Ogólnej i Naczyń Ryc. 1. Pochodzenie badanych szczepów (n=16) 6,3% 6,3% 6,3% 25,0% Popłuczyny oskrzelow o-pęcherzykow e Mocz i mocz z cew nika Wymaz z rany 12,5% Krew Wydzielina z dróg oddechow ych 18,8% 25,0% Wymaz z odbytu Kał Ryc. 2. Materiał kliniczny, z którego izolowano badane szczepy (n=16)

4 214 T. Bogiel, E. Gospodarek Nr 3 również wzrost liczby i odsetka szczepów CRPA z 64 (8,6%) w 2006 roku do 125 (13,6%) w 2007 roku, izolowanych odpowiednio od 53 w 2006 roku i 78 pacjentów w 2007 roku. Pochodzenie badanych szczepów oraz rodzaj materiału klinicznego, z którego je wyosobniono zostały przedstawione, odpowiednio na rycinie 1 i 2. Najwyższy odsetek badanych szczepów pochodził od chorych leczonych w Klinice Anestezjologii i Intensywnej Terapii (25,0%). Były to najczęściej szczepy izolowane z popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych (25,0%), moczu (25,0%) i wymazów z ran (18,8%). Wyniki oceny lekowrażliwości szczepów CRPA przedstawiono na rycinie 3. Większość badanych szczepów była oporna na doripenem (81,3%) i piperacylinę (75,0%). Najwyższy odsetek szczepów wrażliwych notowano wobec amikacyny (81,3%), netilmycyny i norfloksacyny (po 75,0%). Wszystkie badane szczepy CRPA pozostawały wrażliwe na kolistynę. Karbenicylina Tikarcylina Piperacylina Piperacylina/tazobaktam Tikarcylina/kwas klawulanowy Antybiotyk/chemioterapeutyk Cefotaksym Ceftazydym Cefepim Aztreonam Doripenem Gentamicyna Tobramycyna Amikacyna Netilmycyna Norfloksacyna Ciprofloksacyna 0,0% 20,0% 40,0% 60,0% 80,0% 100,0% Ryc. 3. Lekowrażliwość badanych szczepów (n=16) Oporne Średniowrażliwe Wrażliwe

5 Nr 3 Typowanie P. aeruginosa metodą PCR-RAPD 215 W wyniku rozdziału produktu amplifikacji DNA 16 szczepów uzyskano 14 różnych wzorów prążków z wykorzystaniem startera 208 (Ryc. 4). Podobny układ otrzymano dla trzech szczepów (numery 8, 9 i 14, Ryc. 4). Szczepy te izolowano od chorych leczonych na różnych oddziałach szpitala. Dodatkowo, dwa z nich posiadały taki sam wzór lekowrażliwości. Stosując starter 272 otrzymano 16 układów prążków, różnych dla każdego z badanych szczepów. Zdjęcie przedstawiające rozdzielony i wybarwiony bromkiem etydyny efekt rozdziału produktu PCR-RAPD z wykorzystaniem startera 208 został przedstawiony na rycinie M* Ryc. 4. Rozdział produktu amplifikacji DNA badanych szczepów (n=16) techniką PCR-RAPD z wykorzystaniem startera 208 *M wzorzec wielkości par zasad, 1-16 numery kolejnych badanych szczepów Na podstawie układów prążków uzyskanych w wyniku rozdziału elektroforetycznego produktu PCR-RAPD z wykorzystaniem przynajmniej jednego startera nie stwierdzono szczepów powtarzających się, dowodząc przydatności techniki w różnicowaniu szczepów CRPA. DYSKUSJA Z każdym rokiem notowany jest wzrost częstości izolacji szczepów P. aeruginosa, w tym szczepów CRPA. Nabywanie przez nie oporności pod wpływem presji antybiotykowej i przekazywania genów kodujących mechanizmy oporności jest niezwykle groźnym zjawiskiem. Tymczasem, jak wskazują wykorzystujące technikę PCR-RAPD, badania Kersulyte i wsp. (17), możliwe jest z jej zastosowaniem potwierdzenie izolacji od jednego chorego więcej niż jednego szczepu.

6 216 T. Bogiel, E. Gospodarek Nr 3 Niezwykle ważna jest wiedza na temat utrzymywania się takich szczepów w środowisku szpitalnym i monitorowanie ich występowania. Szczepy izolowane od pacjenta, jak dokumentują wyniki badań Nazik i wsp. (19) mają zdolność utrzymywania się nawet przez kilka miesięcy i rozprzestrzeniania się wśród pacjentów tego samego zakładu leczniczego. Szybkie wykrycie, izolowanie i zachowanie racjonalnych procedur w odniesieniu do pacjentów, u których doszło do zakażenia lekoopornymi szczepami P. aeruginosa, umożliwia ograniczenie ich rozprzestrzeniania (3, 16). W typowaniu szczepów wykorzystywane są metody zarówno fenotypowe, jak i genotypowe (1, 6, 11, 14). Mało rozpowszechnioną, choć opracowaną już w latach 90. ubiegłego wieku jest technika PCR-RAPD (22, 23). Mimo tego, że jej przydatność w typowaniu szczepów P. aeruginosa została wykazana przez Kersulyte i wsp. (17), w dostępnym piśmiennictwie jest niewiele informacji dotyczących jej wykorzystania w Polsce (2, 9). Jednak, jak wskazują wyniki uzyskane przez innych autorów, dzięki możliwości uwidoczniania heterogenności badanej populacji (4), technika ta jest bardzo użyteczna w typowaniu szczepów P. aeruginosa, także izolatów wielolekoopornych (20). Umożliwia ponadto stwierdzenie występowania i różnicowania szczepów epidemicznych, stanowiących szczególne zagrożenie ze względu na lekooporność (3, 20). Z piśmiennictwa wynika, że technika PCR-RAPD jest przydatna nie tylko w odniesieniu do szczepów klinicznych ale również w badaniach populacyjnych, np. kolonizacji pacjentów szczepami P. aeruginosa, badań epidemiologicznych wywoływania przez nie zakażeń krzyżowych (15). Z dostępnego piśmiennictwa wynika, że porównanie przydatności różnych technik fenotypowych i metody PCR-RAPD, jednoznacznie wskazuje na tę drugą jako lepszą (1, 6, 11, 14). W badaniach własnych, wykorzystując w niezależnych reakcjach startery 208 i 272, również wykazano użyteczność tej metody zarówno w stosunku do szczepów o takich samych, jak i różnych wzorach lekowrażliwości. Na podstawie przedstawionych wyników w niniejszej pracy po amplifikacji DNA metodą RAPD-PCR odmienny układ prążków dla każdego szczepu uzyskano tylko dla startera 272. Tymczasem badania Budak i wsp. (2) wskazują, że badając 31 szczepów tyle samo wzorów PCR-RAPD uzyskano dla obydwu, wykorzystanych w niniejszej pracy, starterów. Wskazywałoby to na podobną siłę różnicującą starterów 208 i 272, czego nie zaobserwowano na podstawie badań własnych. Saitou i wsp. (21) w badaniach z wykorzystaniem startera 208, wykazali natomiast jego przydatność w potwierdzeniu różnorodności wzorów DNA. Spośród ocenianych przez Grundmann i wsp. (13) metod molekularnych, technika rozdziału metodą PFGE poddanego restrykcyjnemu trawieniu materiału genetycznego, wykazywała najwyższą siłę różnicującą 81 szczepów różnorodnych geograficznie, epidemiologicznie i pod względem czasu izolacji. Z punktu widzenia konieczności przeprowadzenia dużej liczby badań, PCR-RAPD jest jednak techniką bardziej efektywną i szybszą. Niewątpliwym utrudnieniem wykorzystania techniki PCR-RAPD, jak wskazują niektórzy autorzy (10), jest fakt, że duże znaczenie w uzyskiwaniu wyników ma stabilność genomu pałeczek P. aeruginosa.

7 Nr 3 Typowanie P. aeruginosa metodą PCR-RAPD 217 W innych badaniach wykazano, że szczepy posiadające takie same wzory RAPD mogą różnić się cechami fenotypowymi, jak chociażby zdolnością czy obfitością tworzenia biofilmu (7). Stąd, te właściwości szczepów nie są wystarczające do ich różnicowania. Technika PCR-RAPD jest prostszą i szybszą niż PFGE metodą, której wykorzystanie dzięki czułości i skuteczności (17) może przyspieszyć dochodzenia epidemiologiczne, ułatwić badanie pokrewieństwa szczepów i uczynić takie badania bardziej celowymi. WNIOSKI 1. Technika PCR-RAPD jest szybką i prostą metodą, przydatną w typowaniu szczepów P. aeruginosa opornych na karbapenemy. 2. Na podstawie układu prążków uzyskiwanego po rozdziale produktów amplifikacji DNA szczepów z wykorzystaniem techniki PCR-RAPD można w pełni odróżnić od siebie izolaty. 3. Szczepy, zarówno o takim samym, jak i różnym wzorze lekowrażliwości, mogą różnić się wzorami uzyskanymi techniką PCR-RAPD. T. Bogiel, E. Gospodarek PCR-RAPD typing of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains SUMMARY P. aeruginosa rods are opportunistic pathogens responsible generally for nosocomial infections. Resistance to carbapenems, observed among them, is a serious threat due to ability to be transmitted between bacterial species. The aim of our study was to evaluate the usefulness of PCR-RAPD technique in typing of 16 carbapenem-resistant P. aeruginosa strains isolated in 2007 from different patients of University Hospital No. 1 of dr A. Jurasz Collegium Medicum of L. Rydygier in Bydgoszcz Nicolaus Copernicus University in Toruń. Study shows increasing frequency of isolation that type of strains when compared to Percentage of carbapenem-resistant isolates raised from 12,4% in 2006 to 22,9% in The majority of examined strains were obtained from patients of the Intensive Care Units (25,0%) and were isolated from bronchoalveolar lavage (25,0%), urine (25,0%) and wound swabs (18,8%) samples. Examined P. aeruginosa strains demonstrated resistance to doripenem (81,3%) and piperacillin (75,0%) and susceptibility to colistin (100,0%), amikacin (81,3%), netilmicin and norfloxacin (75,0% each). Using PCR-RAPD amplification with 208 and 272 primers, 14 and 16 DNA patterns were obtained, respectively. Usefulness of PCR-RAPD in carbapenem-resistant P. aeruginosa strains typing was proved in case of strains presenting similar and/or different antimicrobials susceptibility patterns. PIŚMIENNICTWO 1. Ben Haj Khalifa A, Vu-Thien H, Pourcel C i inni. Phenotypic and genotypic (randomly amplified polymorphic DNA analysis and multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis) charaterization of 96 clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in the F. Bourguiba hospital (Monastir, Tunisia). Pathol Biol (Paris). 2010; 58: 84-8.

8 218 T. Bogiel, E. Gospodarek Nr 3 2. Budak A, Paluchowska P, Włodarczyk D i inni. Genetyczna charakterystyka szczepów Acinetobacter baumannii oraz Pseudomonas aeruginosa izolowanych od chorych z zapaleniem płuc hospitalizowanych w oddziale intensywnej terapii. Med Dosw Mikrobiol. 2010; 62: Cardoso O, Alves AF, Leitão R. Metallo-beta-lactamase VIM-2 in Pseudomonas aeruginosa isolates from a cystic fibrosis patient. Int J Antimicrob Agents. 2008; 31: Clarke L, Moore JE, Millar BC, Crowe M i inni. Molecular epidemiology of Pseudomonas aeruginosa in adult patients with cystic fibrosis in Northern Ireland. Br J Biomed Sci. 2008; 65: Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. Eighteenth informational supplement (M100-S18). CLSI Wayne, Pa Coban AY, Ciftci A, Onuk EE i inni. Investigation of biofilm formation and relationship with genotype and antibiotic susceptibility of Pseudomonas aeruginosa strains isolated from patients with cystic fibrosis. Mikrobiyol Bul. 2009; 43: Deligianni E, Pattison S, Berrar D i inni. Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates of similar RAPD genotype exhibit diversity in biofilm forming ability in vitro. BMC Microbiol. 2010; 10: Dzierżanowska D. Patogeny zakażeń szpitalnych. W: Zakażenia szpitalne. Red. D. Dzierżanowska, α-medica press, Bielsko-Biała. 2007, Fiett J, Trzciński K, Hryniewicz W, Gniadkowski M. The use of molecular biology in the modeling of Pseudomonas aeruginosa strains recovered from nosocomial infections Przegl Epidemiol. 1998; 52: Fothergill JL, White J, Foweraker JE i inni. Impact of Pseudomonas aeruginosa genomic instability on the application of typing methods for chronic cystic fibrosis infections. J Clin Microbiol. 2010; 48: Freitas AL, Barth AL. Typing of Pseudomonas aeruginosa from hospitalized patients: a comparison of susceptibility and biochemical profiles with genotype. Braz J Med Biol Res. 2004; 37: Gniadkowski M, Żabicka D, Hryniewicz W. Rekomendacje doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki Oznaczanie wrażliwości pałeczek Gram-ujemnych. 13. Grundmann H, Schneider C, Hartung D i inni. Discriminatory power of three DNA-based typing techniques for Pseudomonas aeruginosa. J Clin Microbiol. 1995; 33: Hafiane A, Ravaoarinoro M. Characterization of Pseudomonas aeruginosa strains isolated from cystic fibrosis patients by different typing methods. Pathol Biol (Paris) (Epub ahead of print). 15. Hoogkamp-Korstanje JA, Meis JF, Kissing J i inni. Risk of cross-colonization and infection by Pseudomonas aeruginosa in a holiday camp for cystic fibrosis patients. J Clin Microbiol. 1995; 33: Iglesias NG, Marengo JM, Rentería F i inni. Molecular typification of Pseudomonas aeruginosa strains isolated from patients with cystic fibrosis. Rev Argent Microbiol. 2008; 40: Kersulyte D, Struelens MJ, Deplano A, Berg DE. Comparison of arbitrarily primed PCR and macrorestriction (pulsed-field gel electrophoresis) typing of Pseudomonas aeruginosa strains from cystic fibrosis patients. J Clin Microbiol. 1995; 33: Mahenthiralingam E, Campbell ME, Foster J i inni. Random amplified polymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa isolates recovered from patients with cystic fibrosis. J Clin Microbiol. 1996; 34: Nazik H, Ongen B, Erturan Z, Salcioğlu M. Genotype and antibiotic susceptibility patterns of Pseudomonas aeruginosa and Stenotrophomonas maltophilia isolated from cystic fibrosis patients. Jpn J Infect Dis. 2007; 60: 82-6.

9 Nr 3 Typowanie P. aeruginosa metodą PCR-RAPD Pellegrino FL, Casali N, Dos Santos KR i inni. Pseudomonas aeruginosa epidemic strain carrying bla(spm) metallo-beta-lactamase detected in Rio de Janeiro, Brazil. J Chemother. 2006; 18: Saitou K, Furuhata K, Fukuyama M. Genotyping of Pseudomonas aeruginosa isolated from cockroaches and human urine. J Infect Chemother (Epub ahead of print). 22. Welsh J, McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Res. 1990; 18: Williams JG, Kubelik AR, Livak KJ i inni. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res. 1990; 18: Otrzymano: 19 VII 2010 r. Adres Autora: Bydgoszcz, ul. M. Skłodowskiej-Curie 9, Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum w Bydgoszczy, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu

10