ISBN

Transkrypt

1

2 I N S T Y T U T O C H R O N Y R O Ś L I N PA Ń S T W O W Y I N S T Y T U T B A D AW C Z Y Dyrektor doc. dr hab. Marek MRÓWCZYŃSKI Z A K Ł A D U P O W S Z E C H N I A N I A, W Y D AW N I C T W I W S P Ó Ł P R A C Y Z Z A G R A N I C Ą Kierownik dr Stefan WOLNY ul. Władysława Węgorka 20, Poznań tel: , fax: upowszechnianie@ior.poznan.pl Redaktor wydawnictw upowszechnieniowych i wdrożeniowych: Dr Stefan Wolny Recenzent: Prof. dr hab. Marek Tomalak Autorzy opracowania: Dr Renata Dobosz Dr Aleksandra Obrępalska-Stęplowska Mgr Katarzyna Nowaczyk Prof. dr hab. Stefan Kornobis Autorzy fotografii: Dr Renata Dobosz Mgr Magdalena Gawlak Program Wieloletni Określanie zakresu zmienności morfologicznej i molekularnej nicienipasożytów roślin w celu identyfikacji gatunków objętych regulacjami prawnymi ISBN Copyright by Instytyt Ochrony Roślin Państwowy Instytut Badawczy Nakład: 150 egz. Opracowanie graficzne oraz projekt okładki: mgr inż. Dominik Krawczyk Druk: TOTEM, Świętokrzyska 53, Inowrocław, tel. (052) ,

3 SPIS TREŚCI 1. WYKRYWANIE IDENTYFIKACJA NA PODSTAWIE CECH MORFOLOGICZNYCH I MORFOMETRYCZNYCH....4 CHARAKTERYSTYKA GATUNKÓW IDENTYFIKACJA Z WYKORZYSTANIEM METOD BIOLOGII MOLEKULARNEJ LITERATURA WYKRYWANIE Gatunki z rodzaju Globodera posiadające status organizmów kwarantannowych: mątwik ziemniaczany [Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975]; mątwik agresywny [Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975]. G. rostochiensis i G. pallida są poważnymi szkodnikami roślin ziemniaka. Zarówno G. rostochiensis jak i G. pallida nie powodują wystąpienia specyficznych objawów na nadziemnych częściach roślin. Obserwowane żółknięcie i więdnięcie liści oraz zahamowanie wzrostu roślin można przypisać również działaniu innych szkodników, patogenów lub czynników abiotycznych. Niespecyficzność objawów sprawia, że zdiagnozowanie miejsca występowania któregoś z mątwików jedynie na podstawie obserwacji łodyg i liści roślin żywicielskich nie jest możliwe. Stuprocentową pewność uzyskuje się dopiero po przeprowadzeniu inspekcji korzeni lub wykonaniu analizy gleby na obecność cyst. W okresie kwitnienia ziemniaków, na korzeniach można zaobserwować młode samice G. rostochiensis (koloru złotego) lub samice G. pallida (mleczno-białe, gdyż w rozwoju osobniczym tego gatunku nie występuje faza koloru złotego). Istotnym czynnikiem ograniczającym przydatność tej metody jest możliwość jej zastosowana jedynie w okresie największego prawdopodobieństwa stwierdzenia obecności samic na korzeniach. Metodą bardziej uniwersalną jest badanie gleby według rekomendowanych metod. Wyizolowane z gleby cysty muszą być poddane dalszym etapom identyfikacji: przypisanie do rodzaju i oznaczenie gatunku poprzez wyeliminowanie innych gatunków z rodzaju Globodera niebędących organizmami kwarantannowymi, a występującymi w glebie pól uprawnych na terenie Polski G. achilleae (Golden et Klindrič, 1973) Behrens, 1975 i G. artemisiae. (Eroshenko et Kazachenko 1972) Behrens, 1975.

4 4 Diagnostyka nicieni pasożytów roślin objętych regulacjami prawnymi 2. IDENTYFIKACJA NA PODSTAWIE CECH MORFOLOGICZNYCH I MORFOMETRYCZNYCH 2.1. Selekcja cyst, identyfikacja na poziomie rodzaju Wyizolowane cysty mogą być zaszeregowane do rodzajów Heterodera, Globodera lub Punctodera na podstawie opisanych poniżej cech: Cysty Heterodera są bardzo charakterystyczne i niezależnie od rozmiaru mają kształt cytryny (fot.1). W przedniej części cysty widoczna jest szyjka cysty tj. część, którą nicień był połączony z rośliną. Tylna część cysty czyli stożek wulwalny jest wykorzystywany w diagnostyce gatunków. Na stożku wulwalnym można zaobserwować charakterystyczne dla rodzaju Heterodera okienko (typ bifenestralny) 1 oraz bullae (fot. 2). Przez ściankę młodej cysty często widoczne są jaja oraz Budowa okienka cysty z rodzaju Heterodera larwy. Cysty Punctodera mają najczęściej kształt jajowaty, często określany również jako workowaty (fot. 3). Przedni koniec cysty zamyka szyjka; tylna część jest zaokrąglona (brak wyraźnie wykształconego stożka wulwalnego). W tylnej części jest widoczne charakterystyczne dla Punctodera okienko (typu circumfenestralngo 1) 2, oraz punktowanie ścianki cysty (fot. 4). Wewnątrz młodej cysty zaobserwować można jaja oraz larwy. Cysty Globodera mogą mieć kształ bardzo zróżnicowany. W obrębie rodzaju spotkać można cysty okrągłe uznawane za najbardziej typowe dla rodzaju, cysty jajowate oraz takie, którym trudno przypisać kształt (fot. 5). Przód cysty jest zakończony szyjką; tył zaokrąglony, pozbawiony właściwego stożka wulwalnego, z okienkiem typowym dla Globodera (typ circumfenestralny 2) 3 oraz takimi strukturami jak wzór ścianki cysty czy fałdy oskórka. (fot. 6). Cysty mogą mieć ubarwienie brązowe w odcieniach od jasnego po ciemny. Przez ściankę młodych cyst widoczne są jaja oraz larwy. UWAGA: Obserwacja typu okienka jest niezwykle ważnym etapem identyfikacji w jego początkowej fazie, gdyż jajowatego kształtu cysty rodzaju Globodera można dość łatwo pomylić z cystami Punctodera. Typ okienka można rozpoznać przy odpowiednim ułożeniu cysty, już przy powiększeniu 40x uzyskiwanym przy pracy z optycznym mikroskopem stereoskopowym. 1 wulwa położona na mostku, który dzieli okienko na dwa bliźniacze półokienka. 2 wulwa i odbyt znajdują się w obrębie oddzielnych okienek, mających zwykle średnice porównywalnej wielkości. 3 obecne tylko okienko wulwalne, otwór odbytowy jest widoczny w postaci punktu.

5 Fot. 1. Cysty Heterodera Fot. 2. Okienko Heterodera Fot. 3. Cysty Punctodera Fot. 4. Okienko oraz ścianka cysty Punctodera z widocznymi punktami Fot. 5. Cysty Globodera na przykładzie G. artemisiae i G. rostochiensis Fot. 6. Struktury widoczne na ściance cyst Globodera: punkty (a), fałdy oskórka (b)

6 6 Diagnostyka nicieni pasożytów roślin objętych regulacjami prawnymi 2.2. Określenie gatunku Prawidłowe rozpoznanie gatunku Globodera jest możliwe jedynie na podstawie obserwacji kompleksu cech morfologicznych i morfometrycznych cyst i larw inwazyjnych (J 2 ) oraz analizy DNA. Najważniejsze cechy diagnostyczne budowy cyst to: indeks Graneka [odległość od odbytu (anus) do najbliższej krawędzi okienka wulwalnego podzielona przez średnicę tego okienka] i liczba fałdów oskórka pomiędzy okienkiem wulwalnym i odbytem. Za istotne cechy diagnostyczne larw inwazyjnych (J 2 ) Globodera przyjmuje się przede wszystkim: długość sztyletu oraz kształt jego guzów. Wykorzystuje się również takie parametry jak: długość ciała, długość ogona, a także długość hyalinowej (przezroczystej) części ogona. Zestawienie cech diagnostycznych oraz zakresy ich zmienności przedstawia tabela 1. Tabela 1. Cechy diagnostyczne oraz zakresy zmienności cech morfometrycznych wykorzystywane w diagnostyce gatunków mątwików z rodzaju Globodera Stadium Cecha* Globodera achilleae artemisiae rostochiensis pallida Indeks Graneka 0,3 1,9 (1,2 1,9) 0,6 4,5 (1 1,4) 1,3 9,5 (2,9 4,7) 1,2 3,6 (2,1 2,5) Cysty Liczba fałdów oskórka między okienkiem wulwalnym a odbytem 3 13 (5 6) 5 16 (7 8) 8 31 (12 19) 6 20 (10 12) Długość sztyletu (25) (21 23) (20 22) (22 23) Larwy inwazyjne (J 2 ) Kształt guzów sztyletu w kształcie kotwicy od zaokrąglonych do lekko wygiętych w części wierzchołkowej od zaokrąglonych do lekko wygiętych w części wierzchołkowej zwężone w szczytowej części, przypominające kotwicę *W tabeli podano zakresy zmienności cech; w nawiasach umieszczono minimalne i maksymalne średnie. Dane morfometryczne przygotowano w oparciu o dane literaturowe oraz badania własne. UWAGA: Ze względu na zmienność wewnątrzgatunkową zakresy wartości liczbowych opisujących wskazane cechy mogą się częściowo pokrywać.

7 CHARAKTERYSTYKA GATUNKÓW Globodera achilleae (Golden et Klindrič, 1973) Behrens, 1975 Cysty barwy od jasno do ciemnobrązowej, okrągłe, jajowate o nieregularnych kształtach. Powierzchnia ścianki cysty szorstka. Na ściance widoczne liczne punkty ułożone w regularne rzędy lub rozmieszczone nieregularnie. Pomiędzy okienkiem wulwalnym i odbytem oskórek pofałdowany. Larwy inwazyjne (J 2 ) o długości od 0,42 do 0,59 mm (średnio 0,49 0,52 mm). Szkielet głowy silnie załamujący światło. Według autorów oryginalnego opisu gatunku przednia powierzchnia guzów G. achilleae sztyletu jest spłaszczona, w opisie polskiej populacji kształt guzów sztyletu określono jako podobny do kotwicy (fot. 7a). Ogon długości 45 63µm (średnio w badanych populacjach µm). Przezroczysta (hyalinowa) część długości od 20 do 39µm (średnio µm). Koniec ogona zaokrąglony (fot. 7b). Fot. 7. Głowa z widocznymi guzami sztyletu (a) oraz ogon (b) larwy inwazyjnej G. achilleae

8 Globodera artemisiae (Eroshenko et Kazachenko 1972) Behrens, 1975 Cysty barwy brązowej w odcieniu od jasnego po ciemny, okrągłe, jajowate o nieregularnych kształtach (fot. 5). Ścianka cysty punktowana, punkty ułożone w regularne rzędy lub rozmieszczone nieregularnie (fot. 8). Między okienkiem wulwalnym a odbytem widoczne fałdy oskórka. Larwy inwazyjne (J 2 ) o długości od 0,36 do 0,52 mm (średnio 0,41 do 0, 48 mm). Szkielet głowy silnie załamujący światło. Obserwowana zmienność kształtu guzów sztyletu: od zaokrąglonych po lekko wygięte w części wierzchołkowej (fot. 9a). Ogon długości od 33 do 64 µm (średnio 40 51µm). Około 50 55% długości ogona stanowi część hyalinowa; (18 31 µm; średnio µm). Koniec ogona zaokrąglony (fot. 9b). Fot. 8. Cysta G. artemisiae: punktowanie ścianki cysty Fot. 9. Głowa z widocznymi guzami sztyletu (a) i ogon (b) larwy inwazyjnej G. artemisiae

9 Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975 Ubarwienie cyst od koloru jasnego do ciemnobrązowego, kształt okrągły, nieregularny lub zbliżony do jaja (fot. 5). Ścianka cysty z wyraźnymi rzędami punktów lub z punktami rozmieszczonymi w nieregularne wzory (fot. 10). Fałdy oskórka widoczne między okienkiem wulwalnym a odbytem. Larwy inwazyjne (J 2 ) o długości 0,37 0,56mm. Szkielet głowy silnie załamujący światło. Guzy sztyletu od zaokrąglonych po lekko wygięte w części wierzchołkowej (fot. 11a). Długość ogona w zakresie µm (średnio µm). Hyalinowa część ogona stanowi 42 56% jego całkowitej długości. Koniec ogona zaokrąglony (fot. 11b). Fot. 10. Cysty G. rostochiensis: punktowanie ścianki cysty Fot. 11. Larwy inwazyjne G. rostochiensis: głowa z widocznymi guzami sztyletu (a), ogon (b).

10 Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975 Cysty brązowe, okrągłe (choć może się zdarzyć wyizolowanie cyst o kształtach spotykanych u gatunków wymienionych powyżej). Według Brzeskiego (1998) na ściankach cysty brak charakterystycznego punktowania. Pomiędzy okienkiem wulwalnym i odbytem pofałdowany oskórek (fot. 12). Larwy inwazyjne (J 2 ) długości 0,41 0,53 mm. Szkielet głowy silnie załamujący światło. Guzy sztyletu zwężone w szczytowej części, przypominające kotwicę (fot. 13a). Ogon długości µm (średnio µm). Część hyalinowa stanowi około 40 53% całkowitej długości ogona. Koniec ogona zaokrąglony (fot. 13b). Fot. 12. Ścianka cysty G. pallida Fot. 13. Larwy inwazyjne G. pallida: głowa z widocznymi guzami sztyletu (a), ogon (b)

11 Instrukcja rozpoznawania gatunków mątwików z rodzaju Globodera IDENTYFIKACJA Z WYKORZYSTANIEM METOD BIOLOGII MOLEKULARNEJ 3.1. Identyfikacja G. rostochiensis i G. artemisiae metodą real-time PCR Metoda ta została opublikowana (Nowaczyk i wsp., 2008) i jest dostosowana do wykrywania i różnicowania polskich populacji obu gatunków. Składa się ona z trzech etapów: izolacji DNA, przeprowadzenia reakcji real-time PCR z sondą typu TaqMan oraz analizy wyniku [która odbywa się już w czasie trwania reakcji (analiza w czasie rzeczywistym)]. Etap I. Izolacja DNA Cysty (1 lub więcej) należy rozgnieść tak, aby uwolnić larwy i jaja oraz przynajmniej częściowo zmacerować ich tkanki. Następnie, stosuje się jedną z poniższych procedur: a) przy pomocy gotowych zestawów Najlepiej przeprowadzić izolację przy pomocy gotowych zestawów do izolacji DNA z tkanek zwierzęcych, dostępnych komercyjnie (np. DNeasy Isolation Kit, Qiagen). W pierwszym etapie rozgniecione cysty zalewa się niewielką ilością buforu lizującego (dokładna objętość wg instrukcji producenta) zawierającym proteinazę K. Etap ten należy wydłużyć do ok. 4 godzin, w celu dokładnej lizy tkanek. Później przemywa się materiał genetyczny związany na błonie kolumienek z zestawu, a procedurę kończy się wymyciem oczyszczonego DNA z błony i wykonaniem zawiesiny w wodzie lub 10mM roztworze TrisCl (ph7.5). b) izolacja metodą ekstrakcji fenolowej Rozgniecione cysty należy zmieszać z ok. 100 μl buforu do izolacji DNA (50 mm TrisCl ph7,5; 50 mm NaCl; 5 mm EDTA; 0,5% SDS) z dodatkiem proteinazy K, o stężeniu 50 μg/ml i trawić przez godzin w 37 C lub 56 C. Następnie dodać do próby równą objętość mieszaniny fenol/chloroform (1:1) i przeprowadzić kilkukrotnie ekstrakcję fenolową, aż do zaniku interfazy, po czym wykonać ekstrakcję chloroformem (1 raz). DNA z fazy wodnej wytrącać etanolem (2,5 objętości) w obecności octanu amonu (1/3 objętości, 7,5M) w 80 C przez 20 min. Osad zbierać przez wirowanie przy rpm, 20 min. w 4 C, a następnie przemyć 70% etanolem, suszyć i rozpuścić w wodzie lub buforze 1xTE (10 mm TrisCl ph7,5; 1mM EDTA). UWAGA: Jakość wyizolowanego DNA sprawdzić w świetle UV po rozdziale elektroforetycznym w 0,8% żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny (stęż. 0,5 μg/ml). Stężenie uzyskanego DNA można ocenić spektrofotometrycznie przy długości fali λ = 260 nm, natomiast czystość preparatu można ocenić na podstawie wartości A 260 / A 280 (wartość pomiędzy 1,7 1,9 świadczy o jego czystości); Wyizolowany DNA należy przechowywać w temperaturze 20 C.

12 12 Diagnostyka nicieni pasożytów roślin objętych regulacjami prawnymi Etap II. Reakcja real-time PCR Reakcję real-time PCR przeprowadza się w aparacie do tego typu reakcji. W zależności od jego typu stosuje się odpowiednie probówki zwykle o pojemności 0,2 ml, z wieczkiem optycznym. W trakcie przygotowywania i mieszania odczynników powinny one być przechowywane w lodzie. Należy zapewnić sterylność w miejscu przeprowadzenia reakcji (wysterylizowane komory z laminarnym przepływem powietrza). W opracowanej metodzie reakcję przeprowadza się w 10 μl, które powinny zawierać: a) do detekcji G. artemisiae: 0.25 μm starterów qga1 (5 CACTGCGCCAACAGAGGTAG3 ) oraz qga2 (5 TAGCACACAAACGCCGACATG 3 ), 0,3 μm sondy TaqMan TibA (5 Cy5-TGCTGACATGGAGTGTGTAGGCTTC BHQ3 3 ), polimerazę oraz bufor zazwyczaj dostępną w zestawach do reakcji real-time PCR (np. Novazym) ilość wg. wskazań producenta, oraz ok. 15 ng wyizolowanego DNA. Profil termiczny reakcji jest następujący: Wstępna denaturacja 95 C przez 10 min 40 cykli amplifikacji składających się z: denaturacji 95 C przez 30sek, przyłączania starterów i amplifikacji w 59 C przez 1 min. b) do detekcji G. rostochiensis: 0.75 μm starterów qgr1 (5 GTTGTTGCCCCTTGCGTAGA3 ) oraz qgr2 (5 TAGCACACAAGCGCAGACATG 3 ), 0,3 μm sondy TaqMan TibR (5 Cy3-CTAACATGGAGTGTAGCTGCTACTC BHQ2 3 ), polimerazę oraz bufor zazwyczaj dostępną w zestawach do reakcji real-time PCR (np. Novazym) ilość wg. wskazań producenta, oraz ok. 15 ng wyizolowanego DNA. Profil termiczny reakcji jest następujący: Wstępna denaturacja 95 C przez 10 min, 40 cykli amplifikacji składających się z: denaturacji 95 C przez 30sek, przyłączania starterów i amplifikacji w 58 C przez 1 min.

13 Instrukcja rozpoznawania gatunków mątwików z rodzaju Globodera 13 Etap III. Analiza wyników Wyniki analizuje się przy pomocy programów dostarczonych przez producenta aparatu do real-time PCR i mają one postać krzywych, jak na ryc. 1 i 2. Ryc. 1. Wyniki identyfikacji cyst G. rostochiensis w reakcji real-time PCR ze starterami qgr1, qgr2 i sondą TaqMan TibR. Brak krzywej amplifikacji dla próby zawierającej DNA izolowany z G. artemisiae i próby odczynnikowej (bez DNA). Ryc. 2. Wyniki identyfikacji cyst G. artemisiae w reakcji real-time PCR ze starterami qga1, qga2 i sondą TaqMan TibA. Brak krzywej amplifikacji dla próby zawierającej DNA izolowany z G. rostochiensis i próby odczynnikowej (bez DNA).

14 14 Diagnostyka nicieni pasożytów roślin objętych regulacjami prawnymi UWAGA: w każdej analizie powinny być nastawione trzy reakcje kontrolne pozytywna (zawierająca pewny materiał genetyczny pochodzący z nicienia, którego obecność próbujemy stwierdzić, np. DNA z G. artemisiae przy identyfikacji cyst G. artemisiae) negatywna (zawierająca DNA izolowany z innego nicienia) kontrola odczynnikowa (czyli próba zawierająca wszystkie odczynniki użyte do w/w analiz, bez DNA). Próby b i c powinny wyjść negatywnie, tzn. nie powinna powstać krzywa amplifikacji w reakcji real-time PCR. Opisana metoda nadaje się również do zastosowania bez izolacji DNA. Zamiast materiału genetycznego dodajemy do mieszaniny reakcyjnej tylko rozgniecioną cystę (wg. wskazań cytowanej publikacji) 3.2. Identyfikacja G. pallida Do celów jego wykrywania, a także różnicowania z innym powszechnie występującym mątwikiem G. rostochiensis zostało opracowanych wiele metod opartych głównie na standardowej reakcji PCR, w tym rekomendowana przez EPPO metoda detekcji Bulmana i Marshalla (1997) lub inna opisana przez Zouhara i wsp. (2000) Detekcja PCR z zastosowaniem metody Bulmana i Marshalla Reakcję przeprowadza się wykorzystując 10 μl mieszaniny reakcyjnej, która zawierać powinna: 0,2 U polimerazy Taq, 1x stężony bufor załączony do polimerazy zawierający zwykle: 10 mm Tris-HCl ph8,8, 1,5 mm MgCl 2, 50 mm KCl, 0,1% Triton X-100, 1 μm każdego ze starterów: PITSp4 (5 ACAACAGCAATCGTCGAG3 ) i ITS5 (White 1990) (5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3 ), 200 μm dntp, oraz wyizolowany DNA Reakcja powinna przebiegać według podanego poniżej profilu termicznego: wstępna denaturacja w 94 C przez 5 minut, 35 cykli składających się z: denaturacji w 94 C przez 45 sek, przyłączania starterów w 60 C przez 1 min, elongacji w 72 C przez 45 sekund. końcowej elongacji w 72 C przez 3 min. Długość produktu dla G. pallida z zastosowanymi starterami powinna wynosić ok. 266 nt. (Zastosowanie startera PITSr4 5 ACAACAGCAATCGTCGAG 3 w kombinacji z w/ w starterem ITS5 umożliwia detekcję G. rostochiensis, a długość produktu reakcji wynosi 434 nt).

15 Instrukcja rozpoznawania gatunków mątwików z rodzaju Globodera Detekcja PCR z zastosowanie metody Zouhara i wsp. Reakcję przeprowadza się wykorzystując 10 μl mieszaniny reakcyjnej, która zawierać powinna: 0,2 U polimerazy Taq, 1x stężony bufor załączony do polimerazy zawierający zwykle: 10 mm Tris-HCl ph8,8, 1,5 mm MgCl 2, 50 mm KCl, 0,1% Triton X-100, 1 μm każdego ze starterów: UNI (5 GCAGTTGGCTAGCGATCTTC 3 ) i GPA (5 GGTGACTCGACGATTGCTGT 3 ), 200 μm dntp, oraz wyizolowany DNA. Reakcję przeprowadza się stosując podany poniżej profil termiczny reakcji: wstępna denaturacja w 94 C przez 5 min, 35 cykli składających się z: denaturacji w 94 C przez 1 min, przyłączania starterów w 57 C przez 30 sek, elongacji w 72 C przez 1 min, końcowej elongacji w 72 C przez 7 min. Długość produktu dla G. pallida z zastosowanymi starterami powinna wynosić ok. 391 nt. (Zastosowanie startera GRO1 5 TGTTGTACGTGCCGTACCTT 3 w kombinacji z w/ w starterem UNI umożliwia detekcję G. rostochiensis, a długość produktu reakcji wynosi 238 nt). Wyniki reakcji PCR sprawdza się poprzez rozdzielenie produktów amplifikacji w 2% żelu agarozowym. Przykładowy wynik uzyskany w amplifikacji nicieni G. pallida oraz G. rostochiensis przedstawia ryc. 3. Ryc. 3. Różnicowanie G. pallida i G. rostochiensis w rekacji PCR. 1 marker masy cząsteczkowej, 2 G. pallida, 3 G. rostochiensis, 4 marker masy cząsteczkowej.

16 16 Diagnostyka nicieni pasożytów roślin objętych regulacjami prawnymi UWAGA: W związku z niekiedy zachodzącymi reakcjami krzyżowymi w detekcji z zastosowaniem w/w metod, związanymi z występującymi w niektórych populacjach G. pallida oraz G. rostochiensis zmian nukleotydowych w miejscach przyłączania się starterów, autorzy proponują oczyszczony produkt PCR poddać sekwencjonowaniu (w jednym z serwisów oferujących tego typu usługi) celem potwierdzenia otrzymanego wyniku. Do sekwencjonowania oprócz produktu należy przesłać jeden ze starterów, dzięki któremu produkt ten otrzymano. Wyniki sekwencjonowania należy porównać z danymi zdeponowanymi w Banku Genów. 4. LITERATURA Bulman SR, Marshall JW (1997) Differentiation of Australian potato cyst nematode (PCN) populations using the polymerase chain reaction (PCR). New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science. 25: Nowaczyk K, Dobosz R, Kornobis S, Obrępalska-Stęplowska A (2008) TaqMan REAL-Time PCR-based approach for differentiation between Globodera rostochiensis (golden nematode) and Globodera artemisiae species. Parasitology Research 103(3): Zouhar M, Rysanek, O, Kocova M (2000) Detection and differentiation of the potato cyst nematodes Globodera rostochiensis and Globodera pallida by PCR. Plant Protection Science 36,