Wprowadzenie do genetyki sądowej

Transkrypt

1 DNA - kwas deoksyrybonukleinowy Wprowadzenie do genetyki sądowej część 2 odwójna helisa ok. 3,2 miliardy par zasad (base pairs) A=T, G=C ok genów onad 99% identyczności w populacji; 1% różnic wykorzystywany w genetyce sądowej DNA jądrowy - rejon kodujący (ok. 3 %) i niekodujący (ok. 97 %) mtdna - rejony kodujący (ok. 93 %) i niekodujący (ok. 7 %) 2016 racownia Genetyki Medycznej i Sądowej Katedra i Zakład Medycyny Sądowej DNA lokalizacja w komórce Komórki bez jądra Techniki i markery używane w genetyce sądowej Zróżnicowanie sekwencji tandemowych Analiza sekwencji tandemowo powtórzonych Sekwencje mikrosatelitarne STR Sekwencje minisatelitarne VNTR (znaczenie historyczne) Sekwencjonowanie DNA mitochondrialnego Analiza polimorfizmów typu SN Sekwencje minisatelitarne VNTR Sekwencje mikrosatelitarne STR 1

2 DNA typu minisatelitarnego: VNTR VNTR (variable number of tandem repeats) występujące w genomie sekwencje DNA o zmiennej liczbie tandemowych powtórzeń w locus Motyw powtórzony: od 9 do 100 bp Bardzo duże sekwencje - długość nawet do kilkudziesięciu tysięcy bp Dziedziczenie i segregacja cech wg zasad Mendla Bardzo wysoki polimorfizm olimorfizm wykrywany technikami: VNTR-RFL lub VNTR- rzykłady loci VNTR: D7S21, D12S11, D1S7 GCTCTTATGACGTATCATGACTAGT 25 bp DNA typu mikrosatelitarnego: STR STR krótkie powtórzenia tandemowe Motyw repetytywny: 2 6 bp Ilość powtórzeń w regionie może różnić się pomiędzy osobami Duży polimorfizm; metoda analizy - Szeroko rozpowszechnione w ludzkim genomie gł. w regionach niekodujących (brak informacji m. in. o rasie, predyspozycjach do chorób, cechach fenotypowych np.: wzrost, kolor oczu / włosów) TTCGAGTC AAGCTCAG TCAT TCAT TCAT TCAT TAAGCTCAG TCGA ACTC 4 powtórzenia 36 powtórzeń (= 900 bp) Markery STR Tok pracy Otrzymanie / pobranie materiału do badań Izolacja / ekstrakcja DNA omiar stężenia DNA Amplifikacja DNA metodą Rozdział elektroforetyczny produktów Genotypowanie Izolacja DNA - Kolumienki (Sherlock AX, Swab) - Kulki paramagnetyczne (repfiler) Izolacja DNA typu jądrowego metodą kolumienkową - Metoda organiczna (fenol-chloroform) Liza Wstępne oczyszczanie Wiązanie DNA łukanie (oczyszczanie) Elucja Wytrącanie Suszenie i zawieszanie w wodzie 2

3 Izolacja DNA jądrowego z materiału kostnego omiar stężenia DNA - zestaw: bufor specyficzny dla zestawu barwnik fluorescencyjny 2 standardy stężenia DNA -źródłem światła są diody wykrywające fluorescencję dsdna w badanej próbie omiar stężenia DNA omiar stężenia DNA Replikacja DNA proces stale zachodzący w komórkach olymerase Chain Reaction (Kary Mullis, 1985r.) Technika służąca powielaniu (amplifikacji) nici DNA w warunkach laboratoryjnych olimeraza DNA enzym syntetyzujący nić DNA Konieczna jest nić matrycowa wraz z krótkim odcinkiem dwuniciowym, powstałym po przyłączeniu się primera do matrycy Wydłużanie primera poprzez dobudowywanie kolejnych nukleotydów komplementarnych do nici matrycowej 3

4 3 3 Matryca DNA Mieszanina reakcyjna: - Komplementarne do sekwencji DNA primery - olimeraza Taq - Nukleotydy (A, G, C, T) - BSA - Mg 2+ rimer 1 rimer 2 zasada reakcji 94 o C Denaturacja nici pękanie wiązań wodorowych o C rzyłączanie primerów do nici TCATAAGT 3 3 AGTATTCATTCATT o C Wydłużanie przez olimerazę nici komplementarnej do nici matrycy 3 3 ok cykli 1 cykl = 2 2 = 4 odcinki DNA 3 3 odwojenie ilości DNA w każdym cyklu 1, 2, 4, 8,16, 32, 64, 128, 256, 512, 1024, 2048, 4096, 8192, 16384, 32768, 65536, , , (20), (21), , , , (25), , , , , (30), (31) Multiplex Mikrosatelitarny DNA Jednoczesna amplifikacja wielu loci w jednej reakcji Odpowiedni zestaw primerów w mieszaninie reakcyjnej uniknięcie parowania się rimery wyznakowane różnymi barwnikami fluorescencyjnymi odseparowanie od siebie loci o podobnym zakresie masy (bp) Oszczędność czasu i materiału (degradacja DNA) otrzeba niewielkiej ilości DNA (0,2 ng) Duża siła dyskryminacji zestawu 15 loci 104bp 110bp 4

5 Multiplex standardowy zakres analizy Y-STR - dziedziczenie w linii męskiej - ustalenie pochodzenia geograficznego (brak materiału referencyjnego) Y-STR: męska linia rodowa ten sam haplotyp Elektroforeza kapilarna detekcja optyczna DZIADEK WNUCZE K SNs Single Nucleotide olymorphisms Najczęstsza zmiana zachodząca w sekwencji DNA Występują w genomie średnio co bp Utrwalone mutacje punktowe (tranzycja / transwersja) Częstość przynajmniej 1% w populacji Większość to bialleliczne markery (dwa warianty) >> niska siła dyskryminacji Występowanie w kodujących i niekodujących regionach genomu 2/3 wszystkich SNs to zamiana C/T Niski polimorfizm pojedynczych SN Duża przydatność przy zdegradowanym materiale mtdna Genom mitochondrialny (16569 bp) został po raz pierwszy zsekwencjonowany przez Andersona i wsp. (1981r.) Standard sekwencja CRS Występowanie w mitochondriach - duża liczba kopii w komórce ( ) Brak rekombinacji, dziedziczenie wyłącznie od matki (homoplazmia) Duża zmienność mtdna w populacji wyższe tempo mutacji w porównaniu z jądrowym DNA (ok. 10x) Niekodująca część obejmuje 1200 bp - analiza poprzez odczytanie sekwencji mtdna w hiper-zmiennych segmentach regionu kontrolnego (pętli D) HV1 ( ), HV2 (73-340), HV3 rzydatność w badaniach pokrewieństwa, antropologicznych i ewolucyjnych, przy silnie zdegradowanym materiale (gdy brak DNA jądrowego) Bardzo duża czułość na kontaminację obcym DNA Hetroplazmia komórkowa u tej samej osoby występuje więcej niż 1 haplotyp mtdna 5

6 OLIMORFIZM Minisatelity Mikrosatelity SN MATERIAŁY BIOLOGICZNE: zabezpieczanie oraz testy wstępne (jakościowe) WIELKOŚĆ 2016 racownia Genetyki Medycznej i Sądowej Katedra i Zakład Medycyny Sądowej Genetyka sądowa - zastosowanie DNA jądrowy - źródła Ustalanie pokrewieństwa - ojcostwo / macierzyństwo - brak rodziców badanie krewnych Identyfikacja osobnicza (identyfikacja NN denatów / osób zaginionych / ofiar katastrof masowych) Kryminalistyka - analiza zabezpieczonego materiału dowodowego w postaci śladów biologicznych - szukanie profilu sprawcy / ofiary na dowodach Inne: tkanki zatopione w parafinie, utrwalone w formalinie (możliwa degradacja DNA) Analizy historyczne Materiały biologiczne: prawidłowe zabezpieczanie śladów Warunki Materiały suche: temp. pokojowa, dostęp powietrza Ciecze, tkanki miękkie: -20 o C do -80 o C (kości) Metody Krew na EDTA (-20 o C) lub FTA / bibuła / płótno (+20 o C) Wymazy (-20 o C lub + 20 o C po wysuszeniu) Wysuszenie / zapakowanie w papierową kopertę, temperatura pokojowa niedopałki, znaczki, odzież (pobranie fragmentów lub w całości), paznokcie wraz z materiałem znajdującym się pod nimi Materiały biologiczne nieprawidłowe zabezpieczanie śladów - praca w niesterylnych warunkach brak rękawiczek, masek; używanie niejałowej wody dest. kontaminacja przy zabezpieczaniu - zabezpieczanie krwi na heparynę (inhibicja ) - niedosuszenie wymazów / zabezpieczanych śladów / przechowywanie w szczelnie zamkniętych foliowych workach rozwój mikroorganizmów i późniejsze zgnicie - zabrudzenie materiałów glebą (kwasy humusowe), rdzą, detergentami, chemikaliami (kwasy / zasady) degradacja / inhibicja DNA - pozostawianie w nasłonecznionym miejscu degradacja (UV) 6

7 Materiały biologiczne - testy jakościowe Ślina - testy jakościowe α-amylaza - testy specyficzne: a) test immunochromatograficzny b) test odciskowy hadebas A. Ślina test niespecyficzny test płytkowy (agar + skrobia) test specyficzny test immunochromatograficzny test odciskowy B. Krew testy niespecyficzne (luminol, H 2 O 2 ) testy specyficzne - immunochromatograficzne C. Sperma test niespecyficzny UV / test bardziej specyficzny Bluemaxx test specyficzny - immunochromatograficzny (obecność SA) α-amylaza: test niespecyficzny Krew - testy jakościowe Krew - testy jakościowe test niespecyficzny 3% H 2 O 2 test niespecyficzny - LUMINOL Katalaza 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 test specyficzny - immunochromatograficzny Luminol to substancja wykazująca chemiluminescencję związaną z utlenianiem luminolu w środowisku alkalicznym, w obecności określonych aktywatorów (hem) i utleniaczy (H 2O 2) z uwolnieniem azotu oraz energii w formie światła. Nasienie - testy jakościowe a) test niespecyficzny UV b) test bardziej specyficzny Bluemaxx c) test specyficzny SA 7