(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (1) T3 Int.Cl. C12Q 1/68 (06.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 13/28 EP B1 (4) Tytuł wynalazku: Nieinwazyjne genetyczne badania przesiewowe płodu metodą analizy cyfrowej () Pierwszeństwo: US 7644 P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 08/43 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 14/03 (73) Uprawniony z patentu: The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University, Palo Alto, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 STEPHEN QUAKE, Stanford, US HEI-MUN CHRISTINA FAN, Fremont, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Agnieszka Marszałek SULIMA-GRABOWSKA-SIERZPUTOWSKA BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SP.J. Skr. poczt Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 SGS-4164/VAL EP B1 Opis ODNIESIENIA DO POWIĄZANYCH ZGŁOSZEŃ [0001] To zgłoszenie korzysta z pierwszeństwa tymczasowego zgłoszenia patentowego US nr 60/7644 złożonego 2 lutego 06 roku OŚWIADCZENIE O WSPARCIU RZĄDOWYM [0002] Wynalazku dokonano dzięki wsparciu rządu Stanów Zjednoczonych. Rząd Stanów Zjednoczonych może zatem mieć pewne prawa do tego wynalazku. ODNIESIENIE DO WYKAZU SEKWENCJI [0003] Zgłaszający zapewniają, że papierowa kopia wykazu sekwencji jest identyczna z wykazem sekwencji z postaci czytelnej dla komputera znajdującej się na załączonym dysku komputerowym. Zgłaszający wprowadzają zawartość wykazu sekwencji w całości przez odniesienie. TŁO WYNALAZKU Dziedzina wynalazku [0004] Niniejszy wynalazek dotyczy dziedziny genetycznych badań przesiewowych płodu oraz dziedziny ilościowej analizy kwasów nukleinowych. Powiązana dziedzina [000] Obecnie uznaje się, że DNA płodu wydostaje się z łożyska i miesza się z krwią matki na dość wysokim poziomie - między 3% a 6% DNA w krwi matki pochodzi od płodu. Obserwację tę w połączeniu z testami PCR stosuje się do różnych genetycznych badań przesiewowych płodu pod kątem płci, Rh i talasemii. Jednak technika ta pozostaje ograniczona z dwóch głównych powodów: po pierwsze, testy PCR wykazują kompromis między czułością i swoistością, przez co trudno jest zidentyfikować poszczególne mutacje, a po drugie, najczęstsza choroba genetyczna, zespół Downa, jest trisomią chromosomów i dlatego nie może być wykryta za pomocą standardowej PCR w mieszanej próbce. [0006] Obecnie stwierdzono, że problemy te można rozwiązać przez ilościowe zbadanie dużej liczby próbek chromosomów poprzez zastosowanie technik wysoce skalowalnych. Podejście to jest tu nazywane analizą cyfrową i obejmuje podzielenie pobranego materiału genomowego na oddzielne jednostki, tak że wykrycie sekwencji docelowej (np. chromosomu 21) może być w prosty sposób oznaczone ilościowo w systemie dwójkowym (0,1) lub jako proste wielokrotności, 2, 3 itp. Głównym przykładem techniki, która może być stosowana do uzyskania takich cyfrowych wyników jest cyfrowa PCR, która umożliwia skuteczną amplifikację pojedynczych cząsteczek, a następnie analizę ilościową. Cyfrowa PCR, w stosowanym tu znaczeniu, odnosi się do ilościowych rozcieńczeń granicznych próbki kwasu nukleinowego, takich jak na wielostudzienkowych płytkach, a następnie amplifikacji cząsteczki kwasu nukleinowego w studzience, która ze względu na rozcieńczenie, powinna zawierać 0 lub 1 cząsteczkę. Cyfrowa PCR z użyciem wielostudzienkowych płytek była wcześniej stosowana do wykrywania rzadkich mutacji drogą seryjnej analizy amplikonów pojedynczej cząsteczki (tj. klonalnych) (Vogelstein B, KW Kinzler. Proc Natl Acad Sci US A. 3 sierpnia 1999, 96 (16): ) lub drogą zwiększania czułości amplifikacji różnicowej. ( Poniżej opisano wynalazek, w którym cyfrową PCR można zastosować do nieinwazyjnej diagnostyki płodu w celu wykrycia mutacji płodu ze swoistością i czułością przewyższającymi te, które są możliwe w przypadku tradycyjnej analizy PCR.

3 [0007] Ponadto, co również opisano w związku z wynalazkiem opisanym poniżej, cyfrową PCR można stosować do wykrywania aneuploidii, takiej jak trisomia, która jest przyczyną zespołu Downa. Ponieważ aneuploidie nie wykazują mutacyjnej zmiany sekwencji, a są jedynie zmianą liczby chromosomów, nie było możliwe wykrycie ich u płodu, bez uciekania się do metod inwazyjnych, takich jak punkcja owodni lub pobranie próbki z kosmków kosmówki (Science 9, 2 września 0 r., str ). [0008] Inną formę cyfrowej PCR opisano jako emulsyjną PCR, która była stosowana do wytworzenia małych kulek z klonalnie zamplifikowanym DNA - w zasadzie, każda kulka zawiera jeden amplikon cyfrowej PCR. (Dressman i in., Proc Natl Acad Sci USA. 0, 8817 (22 lipca 03)). [0009] Inną formę cyfrowej PCR można przeprowadzić z zastosowaniem mikroprzepływłów. W tej postaci, opisanej poniżej, DNA rozcieńcza się i rozdziela na małe odrębne próbki w celu utworzenia próbek reakcyjnych przez szereg kanałów i zaworów. [00] Przykład odpowiedniego sposobu analizy pojedynczej cząsteczki, który można dostosować do niniejszych sposobów, podano w Braslavsky i in. Sequence information can be obtained from single DNA molecules, Proc. Nat. Acad. Sci. 0 (7): (03), gdzie stosuje się sekwencyjne włączanie znakowanych nukleotydów do unieruchomionej jednoniciowej matrycy DNA i monitorowanie metodą mikroskopii fluorescencyjnej. [0011] Inny aspekt odpowiedniej dziedziny obejmuje przygotowanie próbek w celu przeprowadzenia niniejszych procesów. Mianowicie, można wzbogacić próbki w DNA płodu w stosunku do DNA matki. Chan i in., Size Distribution of Maternal and Fetal DNA in Maternal Plasma, Clin. Chem. 0 (1): (04), donieśli, że cząsteczki DNA w osoczu są głównie krótkimi fragmentami DNA. Fragmenty DNA w osoczu kobiet ciężarnych są znacznie dłuższe niż fragmenty DNA od nieciężarnych kobiet i dłuższe niż DNA płodu. Powiązane publikacje i patenty [0012] Vogelstein i in., Digital Amplification, US 64706, wydanym 27 sierpnia 02, ujawnili identyfikację z góry zdefiniowanych mutacji, których obecności oczekuje się w niewielkiej części populacji komórek. [0013] Lo, Fetal DNA in Maternal Plasma: Biology and Diagnostic Applications, Clin. Chem. 46: (00) ujawnił wykazanie obecności DNA płodu w osoczu matki. Autorzy stwierdzili średni cząstkowy poziom 3,4% DNA płodu w DNA matki w osoczu we wczesnym okresie ciąży. Autorzy opisali wykrywanie genu RhD i polimorfizmów sekwencji mikrosatelitarnych w osoczu kobiet ciężarnych. [0014] Li i in., Detection of Paternally Inherited Fetal Point Mutations for β-thalassemia Using Size Fractionated Cell-Free DNA in Maternal Plasma, J. Amer. Med. Assoc. 293: (16 lutego 0) ujawnili, że analiza bezkomórkowego DNA płodu w osoczu matki okazała się wyjątkowo rzetelna do oceny płodowych loci nieobecnych w genomie matki, takich jak sekwencje swoiste dla chromosomu Y lub gen RhD u kobiet ciężarnych, które są Rh ujemne. Autorzy opisują ekstrakcję i zależne od wielkości frakcjonowanie DNA matki w osoczu z użyciem elektroforezy w żelu agarozowym. Następnie kwasy peptydonukleinowe (PNA) użyto do swoistego wiązania się z matczynym allelem, aby zahamować amplifikację PCR matczynego allelu typu dzikiego, co pozwala na zwiększenie zawartości zmutowanych sekwencji odziedziczonych po ojcu. Badano cztery różne mutacje punktowe w genie β-globiny. Stwierdzono, że etap PNA był konieczny do wykrycia zmutowanych alleli z użyciem PCR swoistej dla allelu. [00] Lo i in., Quantitative Analysis of Fetal DNA in Maternal Plasma and Serum: Implications for Noninvasive Prenatal Diagnosis, Am. J. Hum. Genet. 62: (1998) ujawnili ilościowy test PCR w czasie rzeczywistym do pomiaru stężenia DNA płodu w osoczu i surowicy matki. Autorzy stwierdzili średnio 2,4 równoważników genomu/ml DNA płodu we wczesnej ciąży. Odpowiada to około 3,4% całkowitego DNA we wczesnej

4 ciąży. [0016] Chan i in., Size Distribution of Maternal and Fetal DNA in Maternal Plasma, Clin Chem. 0:89-92 (styczeń 04) badali rozkład wielkości DNA w osoczu kobiet niebędących w ciąży i kobiet ciężarnych, z użyciem zestawu ilościowych testów PCR o różnych wielkościach amplikonów skierowanych na gen leptyny. Stwierdzili, że te fragmenty DNA w osoczu kobiet ciężarnych są znacznie dłuższe niż te w osoczu kobiet niebędących w ciąży, a cząsteczki DNA pochodzące od matki są dłuższe niż te, które pochodzą z płodu. [0017] Tufan i in., Analysis of Cell-Free Fetal DNA from Maternal Plasma and Serum Using a Conventional Multiplex PCR: Factors Influencing Success, Turk. J. Med Sci. 3: 8-92 (0) porównali wskaźniki skuteczności dwóch różnych technik ekstrakcji DNA, bezpośredniego sposobu opartego o wysoką temperaturę i sposobu z użyciem zestawu QI- AMP DNA blood mini kit. Odnotowano też kluczową rolę optymalizacji PCR. Autorzy używali markera DYS14 dla chromosomu Y i genu GAPH jako kontroli. Stwierdzono, że zestaw QIAMP mini kit daje najlepsze wyniki w analizie określającej płeć z użyciem multipleksowej PCR i barwienia bromkiem etydyny w żelach. [0018] Hromadnikova i in., Quantitative analysis of DNA levels in maternal plasma in normal and Down Syndrome pregnancies, BMC Pregnancy and Childbirth 2(4): 1- (02), zbadali poziom całkowitego DNA w osoczu matki i nie stwierdzili różnic w poziomie DNA płodu między pacjentkami noszącymi płody z zespołem Downa i kontrolnymi. Ilościową analizę PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono z użyciem starterów dla genu β-globiny i locus SRY. [0019] Grundevikk i Rosen, Molecular Diagnosis of Aneuploidies, opubikowanym w internecie na stronie diagnostics%of%aneuploidies%-%rapport.pdf, zasugerowali, że nieinwazyjne sposoby wykrywania aneuploidii (takich jak zespół Downa, zespół Edwardsa lub dodatkowe chromosomy płciowe) mogą być przeprowadzane na płodowych komórkach jądrzastych izolowanych z krwi matki. W pracy przeglądowej, autorzy opisali także ilościową fluorescencyjną łańcuchową reakcję polimerazy (QF-PCR), opartą o amplifikację krótkich powtórzeń tandemowych swoistych dla badanego chromosomu. Opisali oni testy, w których DNA amplifikowano z próbek owodni lub kosmków kosmówki. Autorzy zasugerowali, że markery STR dają produkty PCR o różnej wielkości, a te różnice w wielkości można badać poprzez analizę wielkości pików z elektroforezy. Zasugerowano również, że ilościową PCR w czasie rzeczywistym można stosować do diagnozowania zespołu Downa przez porównanie ilości genu znajdującego się na chromosomie 12 do ilości genu znajdującego się na innym chromosomie autosomalnym. Jeśli stosunek tych dwóch genów wynosi 1:1, płód jest zdrowy, ale jeśli stosunek tych genów wynosi 3:2, wskazuje to na zespół Downa. Autorzy zaproponowali zastosowanie markera zespołu Downa DSCR3. Zasugerowali oni również, że gen konstytutywny GAPDH na chromosomie 12 może być stosowany jako odniesienie. [00] Poon i in., Differential DNA Methylation between Fetus and Mother as a Strategy for Detecting Fetal DNA in Maternal Plasma, Clin. Chem. 48(1): 3-41 ujawnili wykrywanie genów lub mutacji u płodu, gdzie taka sama mutacja lub stan są również obecne w DNA matki. Oznacza to, że zastosowanie DNA płodu w osoczu matki jest ograniczone z uwagi na małą ilość DNA płodu w porównaniu z DNA matki. Autorzy pokonali to ograniczenie poprzez wykrywanie locus IGF2-H19, które jest utrzymywane w stanie metylacji DNA w allelu ojca i niemetylowane w allelu matki. Autorzy zastosowali zestaw do modyfikacji wodorosiarczynem, dzięki któremu niemetylowane reszty cytozyny zostały przekształcone w uracyl. Różnica sekwencji między metylowanymi i niemetylowanymi sekwencjami DNA mogła być rozróżniona z użyciem różnych starterów PCR. Stosowano DNA pobrane z kożuszka leukocytarno-płytkowego. [0021] W Science 9:1476 (2 września 0) News Focus An Earlier Look at Baby's Genes opisano próby opracowania testów w kierunku zespołu Downa z użyciem krwi

5 matki. Wczesne próby wykrycia zespołu Downa z użyciem płodowych komórek z krwi matki zostały opisane jako w nieznacznym stopniu zachęcające. W raporcie opisano również pracę Dennisa Lo w celu wykrycia genu Rh u płodu, gdy jest on nieobecny u matki. Doniesiono także o wykryciu innych mutacji przekazywanych od ojca, takich jak mukowiscydoza, beta-talasemia, pewien typ karłowatości i choroba Huntingtona. Jednakże, te wyniki nie zawsze były powtarzalne. [0022] W zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych , Dhallan, Ravinder S, opublikowanym lipca 04 r., pod tytułem Methods for detection of genetic disorders, opisuje sposób wykrywania zaburzeń genetycznych z użyciem PCR ze znaną matrycą DNA i analizy restrykcyjnej. Opisano także procedurę wzbogacania próbki w DNA płodu. Opisano również sposób stosowany do wykrycia mutacji i nieprawidłowości chromosomowych, w tym, lecz nie wyłącznie, translokacji, transwersji, monosomii, trisomii i innych aneuploidii, delecji, addycji, amplifikacji, translokacji fragmentu i rearanżacji. Liczne nieprawidłowości można wykryć jednocześnie. Uważa się, że ten sposób dostarcza nieinwazyjny sposób określania sekwencji DNA płodu z tkanki, takiej jak krew, pobrana od ciężarnej kobiety i sposób izolowania wolnego kwasu nukleinowego z próbki zawierającej kwas nukleinowy. KRÓTKIE STRESZCZENIE WYNALAZKU [0023] Poniższe krótkie streszczenie nie ma w zamierzeniu obejmować wszystkich cech i aspektów niniejszego wynalazku, ani nie oznacza, że wynalazek musi obejmować wszystkie cechy i aspekty omawiane w tym streszczeniu. [0024] W skrócie, niniejszy wynalazek dotyczy sposobu zgodnego z zastrzeżeniem 1 z niniejszego opisu. Otrzymuje się tkankę matki zawierającą materiał genetyczny zarówno matki, jak i płodu. Korzystnie, tą tkanką matki jest krew obwodowa lub osocze krwi matki. Określenie osocze może obejmować osocze lub surowicę. Materiałem genetycznym może być genomowy DNA lub RNA, korzystnie mrna. W przypadku mrna, można wybrać docelowe sekwencje odpowiadające genom, które ulegają wysokiej ekspresji w łożysku dla materiału genetycznego płodu. Materiał genetyczny (np. DNA) w każdej próbce reakcyjnej wykrywa się z użyciem odczynnika swoistego dla sekwencji skierowanego na co najmniej jedną z dwóch sekwencji docelowych w materiale genetycznym, aby uzyskać wykrywalny produkt reakcji, jeżeli docelowa sekwencja jest obecna w próbce reakcyjnej. Przykładowo sonda swoista dla chromosomu 21 wiąże się z próbką reakcyjną wraz z sondą kontrolną swoistą dla innego chromosomu. W większości przypadków wyniki będą pochodzić od DNA matki, ale mała liczba wyników będzie uzyskana z DNA płodu. W celu odróżnienia zmienności losowej wyników dla płodu, prowadzi się dużą liczbę reakcji, a do wyników stosuje się metody statystyczne. Znakowanie i wykrywanie w niniejszym sposobie stosuje się w celu rozróżnienia obecności lub braku pojedynczej sekwencji docelowej, co określa się jako analizę cyfrową, chociaż można to przeprowadzić z użyciem czułych metod wykrywania kwasów nukleinowych, które rozróżniają obecność jednej i więcej niż jednej sekwencji docelowej w pojedynczej próbce. Wiele technik fluorescencyjnych wykazuje taką czułość. Sekwencje docelowe są dobrane tak, aby sekwencja matki i sekwencja płodu były rozróżnialne, tak jak dwie kopie sekwencji matki w stosunku do dwóch kopii sekwencji płodu. [002] Otrzymany w ten sposób materiał genetyczny rozdziela się na oddzielne próbki, z których każda próbka będzie zawierała średnio nie więcej niż około jedną sekwencję docelową na próbkę. Średnio jedna docelowa sekwencja oznacza, że ze względów praktycznych, próbka będzie zawierać korzystnie 0,1 do 0,8 równoważników genomu na pojedynczą próbkę, idealnie 0, równoważnika genomu na próbkę. Sposób można prowadzić w rozcieńczeniach, przy czym więcej sekwencji docelowych wykrywa się w próbkach zawierających trisomiczną lub zwiększoną liczbę kopii docelowej sekwencji. Oznacza to, że jeśli analizuje się chromosom 21, mieszaninę można rozcieńczyć tak, by przeciętnie można by-

6 ło wykryć dwa chromosomy obecne w DNA matki i trzy chromosomy obecne w DNA płodu z zespołem Downa. Alternatywnie sposób ten można prowadzić w rozcieńczeniach, przy czym w tej sytuacji więcej próbek reakcyjnych będzie dodatnich. Wykrywa się obecność lub brak różnych sekwencji docelowych w oddzielnych próbkach, a wyniki analizuje się, przy czym ilość wyników z oddzielnych próbek będzie dostarczać dane wystarczające do uzyskania wyników rozróżniających różne sekwencje docelowe. W jednym aspekcie sposób obejmuje analizę trisomii. W tym sposobie, jedna z różnych sekwencji docelowych (np. chromosom 21) jest diploidalna w materiale genetycznym matki i aneuploidalna w materiale genetycznym płodu, a druga z różnych sekwencji docelowych (np. chromosom 12) jest diploidalna zarówno w materiale genetycznym matki, jak i płodu. [0026] Oddzielne próbki są w próbkach reakcyjnych, w których można analizować sekwencje docelowe. Próbkami reakcyjnymi mogą być, na przykład, studzienki na płytce do mikromianowania, wodne fazy w emulsji, obszary na powierzchni matrycy lub komory reakcyjne w urządzeniu mikroprzepływowym. Próbki reakcyjne mogą być użyte do analizy PCR oddzielnych próbek. Oddzielne próbki kontaktuje się z wieloma starterami do PCR, w tym z co najmniej jednym (lub jednym w przód i jednym w tył) starterem skierowanym swoiście na sekwencję kontrolną matki, przy czym oczekuje się, że jest ona taka sama zarówno dla matki i płodu. Startery do PCR są również skierowane swoiście na sekwencję płodu, to znaczy taką, która może być obecna zarówno u matki, jak i płodu, ale jest wzmocniona lub zmieniona u płodu. Amplifikacja drogą PCR umożliwi wykrycie tych dwóch różnych sekwencji, oraz, zgodnie z niniejszym sposobem, będzie różnicująca w przypadku nieprawidłowej sekwencji docelowej płodu. Metoda PCR może (ale nie musi) być ilościowa. Można zastosować ilościową PCR w czasie rzeczywistym, która obejmuje hybrydyzację docelowych sekwencji z kwasem nukleinowym zawierającym znacznik fluorescencyjny. Można też zastosować sondę fluorescencyjną hybrydyzującą z sekwencją docelową. Znanych jest kilka protokołów cyfrowej PCR służących do tego celu, jak również PCR na bazie kulek lub emulsyjna. Podczas gdy sondy fluorescencyjne są łatwo dostępne i mogą być stosowane w celu zapewnienia czułych wyników, np. w kombinacjach FRET, można zastosować inne techniki znakowania. [0027] Liczba oddzielnych próbek jest wybrana w zależności od pożądanych wyników. W jednym aspekcie korzystne jest uzyskanie wysokiego poziomu istotności statystycznej i liczba próbek wynosi co najmniej około 000. Aby poprawić poziom ufności statystycznej, korzystne jest stosowanie dużej liczby reakcji, korzystnie od 00 do 0000, korzystniej pomiędzy 000 i 0000 lub większej liczby reakcji, w zależności od zawartości procentowej DNA płodu obecnej w mieszaninie. Uzyskiwane wyniki powinny być istotne statystycznie dla celów przeprowadzanej analizy, np. wstępnych badań przesiewowych, początkowej diagnozy itp. Powszechnie stosowaną miarą istotności statystycznej, gdy pożądany jest wynik o wysokiej istotności, jest p< 0,01, tj. 99% przedział ufności w oparciu o test chi-kwadrat lub t-studenta. [0028] Jednakże, jak pokazano poniżej, wyniki można uzyskać z użyciem mniejszej liczby, np. rzędu około 00 próbek umieszczonych w oddzielnych próbkach reakcyjnych. Mniejsza liczba oddzielnych próbek może być analizowana wtedy, gdy materiał genetyczny występuje w większym stężeniu w mieszaninie. Mieszanina może być wzbogacona w materiał genetyczny płodu. Jedną z metod wzbogacania DNA z osocza w DNA płodu jest rozdzielenie zależne od wielkości, przy czym preparat zawierający tylko fragmenty DNA mniejsze niż około 0 pz jest używany do pomiaru sekwencji docelowych. [0029] Szereg nieprawidłowości genetycznych można wykryć zgodnie z niniejszym sposobem, w tym znane zmiany w jednym lub większej liczbie genów: CFTR, czynnik VIII (gen F8), beta globina, hemachromatoza, G6PD, nerwiakowłókniakowatość, GAPDH, beta amyloid i kinaza pirogronianowa. Sekwencje i powszechne mutacje tych genów są znane. Można wykryć inne nieprawidłowości genetyczne, takie jak te dotyczące sekwencji, która jest usunięta z ludzkiego chromosomu, jest przeniesiona w przypadku translokacji lub in-

7 wersji, lub jest zduplikowana w przypadku duplikacji chromosomu, przy czym ta sekwencja charakteryzuje się znanym zaburzeniem genetycznym w materiale genetycznym płodu nieobecnym w materiale genetycznym matki. Przykładowo, trisomie chromosomów mogą obejmować trisomie częściowe, mozaikowe, pierścieniowe, chromosomu 18, 14, 13, 8, 6, 4 itd. Wykaz znanych nieprawidłowości można znaleźć na mapie OMIM Morbid, [00] Ogólnie, określenie aneuploidia stosuje się w odniesieniu do występowania jednego lub większej liczby dodatkowych lub brakujących chromosomów. [0031] W jednym aspekcie, niniejszy sposób różnicującego wykrywania sekwencji docelowych może obejmować bezpośrednie sekwencjonowanie materiału genetycznego sekwencji docelowych. Sekwencjonowanie pojedynczych cząsteczek, które jest znane, jest szerzej opisane poniżej. Sposób ten może również obejmować sekwencjonowanie zamplifikowanych pochodnych klonów sekwencji docelowych lub amplikonów materiału genetycznego. Oznacza to, że sekwencja docelowa w oddzielnej próbce jest amplifikowana drogą PCR, tj. jako amplikon, lub wklonowana do wektora, który jest hodowany i w ten sposób amplifikowana przez uzyskanie wielu kopii insertu wektora. [0032] Opisane są również materiały wybrane i połączone w celu przeprowadzenia niniejszych sposobów. Tak więc dostarcza się zestaw do różnicującego wykrywania sekwencji docelowych w DNA matki i płodu w mieszanej próbce DNA, zawierający startery swoiste dla genetycznie nieprawidłowej sekwencji i sekwencji kontrolnej, takie jak dla dwóch chromosomów, z których jeden jest ewentualnie aneuploidalny i z których jeden przyjmuje się za diploidalny; bufor do reakcji PCR w celu wytworzenia próbki reakcyjnej do PCR ze starterami w urządzeniu mającym oddzielne próbki reakcyjne; i ośrodek do rozdzielania zależnego od wielkości w celu rozdzielenia próbki DNA na frakcję zawierającą mniej niż około 00 pz. Ośrodkiem do rozdzielania zależnego od wielkości może być żel lub materiał do wirowania do odzyskiwania mniejszych fragmentów DNA i tym samym wzbogacenia próbki w DNA płodu. Zestaw może ponadto zawierać parę starterów swoistych dla chromosomu 21. Zestaw może ponadto zawierać urządzenie mające oddzielne próbki reakcyjne dla oddzielnych próbek. Urządzenie może być urządzeniem mikroprzepływowym lub płytką do mikromianowania o co najmniej 00 oddzielnych próbkek reakcyjnych. KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW [0033] Figura 1 przedstawia schematyczną ilustrację niniejszego sposobu analitycznego, pokazującą rozdzielenie materiału genetycznego do przedziałów (1A), piki dla chromosomów o różnej wysokości (1B) i analizę statystyczną chromosomów (1C); Figura 2 przedstawia fotografię chipu mikroprzepływowego mającego 12 paneli (ponumerowanych 1-12) zawierających DNA z wyznakowanym chromosomem 21; Figura 3 przedstawia fotografię chipu mikroprzepływowego mającego 12 paneli (ponumerowanych 1-12) zawierających DNA z wyznakowanym chromosomem 12; oraz Figura 4 przedstawia wykres przedstawiający wyniki eksperymentów przeprowadzonych z użyciem analizy cyfrowej mieszaniny normalnego i trisomicznego DNA (zespół Downa, trisomia 21). SZCZEGÓŁOWY OPIS KORZYSTNEJ POSTACI Zarys I. Przegląd II. Opis etapów [0034] A. Przygotowanie tkanki B. Rozdzielanie cząsteczek DNA

8 C. Wykrywanie i oznaczanie ilościowe 1. Metody cyfrowej PCR 2. Emulsyjna PCR na kulkach 3. Rozcieńczanie mikroprzepływowe z PCR 4. Wykrywanie i/lub sekwencjonowanie pojedynczej cząsteczki D. Ocena ilościowa III. Określone zastosowania [003] A. Badanie trisomii z analizą częstości B. Protokół próbkowania IV. Przykłady I. Przegląd [0036] Opisane poniżej metody i materiały wykorzystują techniki analizowania licznych kwasów nukleinowych zawartych w próbce tkanki (korzystnie surowicy lub korzystniej osocza) zawierającej mieszaninę DNA zarówno od matki, jak i płodu, i umożliwiających wykrywanie małych, ale istotnych statystycznie różnic. [0037] Niniejszy wynalazek obejmuje analizę krwi matki w kierunku stanu genetycznego, w którym mieszane DNA płodu i matki we krwi matki analizuje się w celu odróżnienia mutacji lub nieprawidłowości genetycznej płodu od tła DNA matki. Stwierdzono, że stosując kombinację etapów, próbkę DNA zawierającą DNA zarówno od matki, jak i płodu można analizować w celu odróżnienia stanu genetycznego obecnego w mniejszej frakcji DNA, która reprezentuje DNA płodu. W tym sposobie stosuje się analizę cyfrową, w której DNA z próbki izoluje się do nominalnej pojedynczej cząsteczki docelowej w niewielkiej objętości reakcyjnej. Dla każdej próbki mieszaniny możliwe jest, że umieszczono w niej mniej niż jedną cząsteczkę docelową (tzn. 0 cząsteczek docelowych) lub więcej niż jedną cząsteczkę docelową. Następnie cząsteczki docelowe wykrywa się w każdej studzience reakcyjnej korzystnie jako sekwencje docelowe, które są zamplifikowane, co może obejmować zwielokrotnienie początkowej liczby kopii docelowej sekwencji, to znaczy 0, 1, 2, 3 itd. Sekwencja kontrolna jest używana do rozróżnienia nieprawidłowego wzrostu ilości sekwencji docelowych, np. trisomii. Zatem istnieje różnicujące wykrywanie sekwencji docelowych, z których jedna jest wybrana tak, aby reprezentowała normalny genotyp obecny zarówno u matki, jak i potomstwa, i z których jedna jest wybrana do wykrywania nieprawidłowego genotypu u potomstwa, gdy sekwencja docelowa u potomstwa będzie się różnić od tej u matki, na przykład w trisomii. [0038] Fig. 1A przedstawia postać, w której stosuje się wykrywanie ilościowe, np. drogą ilościowej PCR w czasie rzeczywistym. Krew poddaje się obróbce w celu uzyskania DNA 12 z osocza, które jest rozcieńczone i rozdzielane na porcje 14. Są one dodawane do studzienek reakcyjnych 1A do D. Pokazano w studzienkach cele reprezentujące chromosomy 21 i 22. W studzience 2A, nie stwierdza się docelowego DNA; niektóre studzienki (niepokazane) mogą zawierać nadmiar DNA. W studzience 3B, znajduje się DNA płodu z trisomią 21 (zespół Downa). Pozostałe studzienki zawierają DNA matki. DNA jest amplifikowane i/lub znakowane i uzyskuje się odczyt ilościowy, jak to pokazano na 16. Pik 18 reprezentujący studzienkę 3B będzie o 0% wyższy niż piki dla drugiej studzienki, albo piki dla sekwencji odniesienia na chromosomie 22. Studzienka A2 bez 21 lub 22 nie będzie wykazywała piku. Piki są pokazane jako. Pojedynczy przebieg będzie wykazywał dużą zmienność losową, tak jak studzienki, w których nie ma sekwencji docelowej, lub w których są duplikacje spowodowane zmiennością próbki. Ponadto, próbki bez sekwencji docelowej nie będą oczywiście wykazywać żadnego piku; studzienki z dwiema lub większą liczbą sekwencji docelowych dadzą piki wyraźnie wyższe niż pik 18, tj., 2X lub 2, X wyższy niż kontrolne. Wyniki te są możliwe do rozróżnienia po przeprowadzeniu wielu reakcji, a następnie analizie statystycznej, która pozwala odróżnić losową zmienność od

9 rzeczywistych wyników. [0039] Fig. 1C przedstawia postać, w której DNA jest rozdzielone w sposób bardziej rozcieńczony (mniej niż 1 lub około pół równoważnika genomu na studzienkę). W tym przypadku znaczniki (startery) chromosomu 21 będą generować więcej wyników dodatnich niż znaczniki (np. startery) swoiste dla chromosomu 22 (chromosom diploidalny), jedynie ze względu na nieco większą obfitość chromosomu 21 w próbce zawierającej trisomię. Jak pokazano, niektóre studzienki będą zawierać wyniki dodatnie dla obu chromosomów, niektóre będą zawierać wyniki ujemne 22 dla obu chromosomów, ale niektóre będą zawierać puste miejsca 24 dla chromosomu diploidalnego i piki dla chromosomu trisomicznego, ze względu na jego większą obfitość. Dane z wyższego piku 18 nie są używane w tym trybie. Jak wyjaśniono poniżej, tą niewielką różnicę można uczynić istotną statystycznie badając dużą liczbę studzienek i dzięki czułości sposobu według wynalazku na pojedyncze cząsteczki. [00] Tak więc niniejszy sposób obejmuje na ogół następujące etapy: 1. Uzyskiwanie tkanki zawierającej DNA od ciężarnej pacjentki, o którym wiadomo, że zawiera około 3% DNA płodu. Materiałem tym jest korzystnie pobrana krew, a krążące DNA znajduje się raczej w osoczu krwi, niż w komórkach. Krew lub osocze można ewentualnie wzbogacić w DNA płodu z użyciem znanych metod, takich jak frakcjonowanie zależne od wielkości w celu wyselekcjonowania fragmentów DNA mniejszych niż około 0 pz. Alternatywnie DNA matki, który wykazuje tendencję do wielkości powyżej około 00 pz, może zostać wykluczony. Kolejnym etapem wzbogacania może być traktowanie próbki krwi formaldehydem, jak opisano w Dhallan i in. Methods to Increase the Percentage of Free Fetal DNA Recovered From the Maternal Circulation, J.Am. Med. Soc. 291 (9): (marzec 04). 2. Rozdzielanie pojedynczych cząsteczek DNA z tej próbki na liczne oddzielne próbki reakcyjne, przy czym liczba próbek reakcyjnych jest dobrana tak, aby dawała wynik statystycznie istotny dla liczby kopii celu w cząsteczkach DNA. Ponadto próbkę reakcyjną ogranicza się do niewielkiej objętości, aby bardzo zbliżyć cząsteczki reakcyjne do siebie. Ilość cząsteczek DNA na próbkę reakcyjną jest korzystnie rzędu równoważnika jednej kopii interesującego chromosomu na próbkę reakcyjną. 3. Wykrywanie obecności celu w DNA w dużej liczbie próbek reakcyjnych, korzystnie z użyciem techniki swoistej dla sekwencji, takiej jak wysoce multipleksowe sekwencjonowanie przy krótkiej długości odczytu lub reakcja PCR, w której produkt PCR jest wyznakowany tak, by otrzymać dogodny odczyt ilościowy. Etap wykrywania jest tu nazywany cyfrową PCR i może być przeprowadzony różnymi sposobami, takimi jak: (a) PCR na próbkach rozcieńczonych do poszczególnych studzienek na płytce do mikromianowania (b) PCR na próbkach rozcieńczonych do emulsji zawierających startery unieruchomione na kulkach lub (c) PCR na próbkach zamkniętych w komorze mikroprzepływowej; oraz 4. Analiza ilościowa wykrywania sekwencji docelowych u matki i płodu. W niektórych przypadkach może to obejmować cele dla różnych obszarów, takie jak sondy dla celów na chromosomie, który podejrzewa się o występowanie w nieprawidłowej liczbie kopii (trisomia) w porównaniu z normalnym chromosomem diploidalnym, który jest stosowany jako kontrola. II. Opis etapów A. Przygotowanie tkanki [0041] Sposób według niniejszego wynalazku dotyczy badań nieinwazyjnych. Korzystnym materiałem wyjściowym jest żylna krew obwodowa matki. W celu uzyskania wystarczającej ilości DNA do badania, korzystnie pobiera się - ml krwi, w celu uzyskania co najmniej około 000 równoważników genomu całkowitego DNA. Ta wielkość próbki jest oparta na szacunkowej zawartości DNA płodu na poziomie około 2 równoważników ge-

10 nomu/ml osocza matki we wczesnym okresie ciąży i stężeniu DNA płodu na poziomie około 3,4% całkowitego DNA w osoczu. Można jednak pobrać mniej krwi do genetycznych badań przesiewowych, gdy wymagana jest niższa istotność statystyczna lub próbka DNA jest wzbogacona w DNA płodu. [0042] Należy podkreślić, że podczas gdy niniejszy opis odnosi się w całości do DNA, można również analizować płodowe RNA znajdujące się we krwi matki. Jak opisano w Ng i in. mrna of placental origin is readily detectable in maternal plasma, Proc. Nat. Acad. Sci. 0(8): (03), transkrypty mrna hpl (ludzki laktogen łożyskowy) i hcg (ludzka gonadotropina kosmówkowa) były wykrywalne w osoczu matki, co analizowano z użyciem odpowiednich testów PCR w czasie rzeczywistym. W niniejszym sposobie wykorzystuje się geny kodujące mrna eksprymowane w łożysku i obecne na interesującym chromosomie. Przykładowo, DSCR4 (region krytyczny dla zespołu Downa 4) znajduje się na chromosomie 21 i ulega ekspresji głównie w łożysku. Jego sekwencję mrna można znaleźć w GenBank NM_ W tym przypadku, korzystne jest stosowanie odwrotnej transkryptazy (RT) RNaza H minus (RNazy H-) w celu wytworzenia cdna do detekcji. RT RNaza H- są dostępne u różnych producentów, z których SuperScript II (Invitrogen) jest najczęściej stosowana. PCR z odwrotną transkryptazą może być stosowana, jak to opisano poniżej, dla chromosomalnego DNA. i. Wzbogacenie próbki w DNA lub RNA z osocza [0043] Krew matki można podać obróbce w celu zwiększenia stężenia DNA płodu w całkowitym DNA, jak opisano w Li i in., powyżej. W skrócie, krążące DNA poddaje się ekstrakcji z do ml osocza matki z użyciem komercyjnych technik kolumnowych (Roche High Pure Template DNA Purification Kit; Roche, Bazylea, Szwajcaria) w połączeniu z pompą próżniową. Po ekstrakcji, DNA rozdziela się metodą elektroforezy w żelu agarozowym (1%) (Invitrogen, Bazylea, Szwajcaria) i starannie wycina frakcję żelu zawierającą krążące DNA o wielkości około 0 pz. DNA poddaje się ekstrakcji z tego fragmentu żelu z użyciem zestawu do ekstrakcji (QIAEX II Gel Extraction Kit, Qiagen, Bazylea, Szwajcaria) i wymywa końcową objętością µl jałowego mm tris-kwasu chlorowodorowego, ph 8,0 (Roche). [0044] DNA można zatężyć znanymi sposobami, w tym z użyciem wirowania i różnych inhibitorów enzymów. DNA jest wiązane z selektywną membraną (np. krzemionką) w celu oddzielenia go od zanieczyszczeń. DNA jest korzystnie wzbogacone we fragmenty krążące w osoczu, które są mniejsze niż 00 par zasad, zazwyczaj mniejsze niż 0 pz. Tę selekcję zależną od wielkości prowadzi się w ośrodku do rozdzielania DNA zależnego od wielkości, takim jak żel elektroforetyczny lub materiał chromatograficzny. Taki materiał jest opisany w Huber i in., High-resolution liquid chromatography of DNA fragments on nonporous poly(styrene-divinylbenzene) particles, Nucleic Acids Res. 11 marca 1993; 21(): 61-66, chromatografia drogą filtracji żelowej, żel TSK, jak opisano w Kato i in., A New Packing for Separation of DNA Restriction Fragments by High Performance Liquid Chromatography, J. Biochem, 1984, tom 9, nr [004] Ponadto wzbogacenie można osiągnąć przez zahamowanie pewnych alleli poprzez zastosowanie kwasów peptydonukleinowych (PNA), które wiążą się z komplementarnymi do nich sekwencjami docelowymi, ale nie są namnażane. [0046] Ekstrakcja RNA z osocza jest opisana w Enders i in., The Concentration of Circulating Corticotropin-releasing Hormone mrna in Maternal Plasma Is Increased in Preec- lampsia, Clinical Chemistry 49: , 03. Jak tam opisano, osocze zebrane po etapach wirowania miesza się z odczynnikiem Trizol LS (Invitrogen) i chloroformem. Mieszaninę odwirowuje się, a warstwę wodną przenosi do nowych probówek. Do warstwy wodnej dodaje się etanol. Następnie mieszaninę nanosi się na minikolumnę RNeasy (Qiagen) i poddaje obróbce zgodnie z zaleceniami producenta. ii. Krew ekstrakcja z komórek płodowych [0047] W zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych , Dhallan, Ravin-

11 der S, opublikowanym lipca 04 r., pod tytułem Methods for detection of genetic disorders, opisano procedurę wzbogacania w DNA płodu, w której krew pobiera się do 9 ml probówek EDTA Vacuette (numer katalogowy NC ) i do każdej probówki dodaje się 0,22 ml % obojętnego buforowanego roztworu zawierającego formaldehyd (4% wag./obj.) i każdą probówkę delikatnie się odwraca. Probówki przechowuje się w 4 C do czasu, gdy są gotowe do obróbki. [0048] Środki hamujące lizę komórek lub stabilizujące błony komórkowe mogą być dodane do probówek, w tym, lecz nie wyłącznie, formaldehyd i pochodne formaldehydu, formalina, aldehyd glutarowy i pochodne aldehydu glutarowego, środki sieciujące, środki sieciujące reagujące z aminami pierwszorzędowymi, środki sieciujące reagujące z grupami sulfhydrylowymi, środki do addycji grupy sulfhydrylowej lub redukcji mostków dwusiarczkowych, środki sieciujące reagujące z węglowodanami, środki sieciujące reagujące z grupą karboksylową, fotoreaktywne środki sieciujące, rozszczepialne środki sieciujące, itd. Można dodać dowolne stężenie środka, który stabilizuje błony komórkowe lub hamuje lizę komórek. W korzystnej postaci środek, który stabilizuje błony komórkowe lub hamuje lizę komórek dodaje się w stężeniu, które nie hamuje, ani nie utrudnia kolejnych reakcji. [0049] W celu wzbogacenia w komórki płodowe można też zastosować techniki cytometrii przepływowej (Herzenberg i in., PNAS 76: (1979); Bianchi i in., PNAS 87: (1990); Bruch i in., Prenatal Diagnosis 11: (1991)). W opisie patentowym US nr 434 również opisano technikę oddzielania jądrzastych czerwonych krwinek płodu z użyciem probówki posiadającej szeroką górną część i wąskie kapilarne dno wykonane z polietylenu. Wirowanie z użyciem programu o zmiennej szybkości skutkuje układaniem się czerwonych krwinek w kapilarze w oparciu o gęstość cząsteczek. Frakcja gęstości zawierająca czerwone krwinki o małej gęstości, w tym płodowe czerwone krwinki, jest odzyskiwana, a następnie poddawana hemolizie w sposób różnicujący, aby preferencyjnie zniszczyć krwinki czerwone matki. Gradient gęstości w ośrodku hipertonicznym stosuje się do oddzielenia czerwonych krwinek, teraz wzbogaconych w czerwone krwinki płodu z limfocytów i rozerwanych komórek matki. Zastosowanie roztworu hipertonicznego powoduje kurczenie czerwonych krwinek, co zwiększa ich gęstość i ułatwia oczyszczanie z limfocytów o większej gęstości. Po izolacji płodowych komórek, płodowe DNA można oczyszczać z użyciem standardowych technik z dziedziny. [000] Ponadto środek, który stabilizuje błony komórkowe może być dodany do krwi matki w celu obniżenia lizy komórek matki, w tym, lecz nie wyłącznie, aldehydy, mocznik z formaldehydem, fenol z formaldehydem, DMAE (dimetyloaminoetanol), cholesterol, pochodne cholesterolu, wysokie stężenia magnezu, witamina E i pochodne witaminy E, wapń, glukonian wapnia, tauryna, niacyna, pochodne hydroksyloaminy, bimoklomol, sacharoza, astaksantyna, glukoza, amitryptylina, izomeru A fenyloctanu hopanotetraolu, izomer B fenyloctanu hopanotetraolu, cytykolina, inozytol, witamina B, kompleks witamin B, hemibursztynian cholesterolu, sorbitol, wapń, koenzym Q, ubichinon, witamina K, kompleks witaminy K, menachinon, zonegran, cynk, ekstrakt z miłorzębu japońskiego, difenylohydantoina, perftoran, poliwinylopirolidon, fosfatydyloseryna, tegretol, PABA, kromoglikan disodowy, nedokromil sodu, fenytoina, cytrynian cynku, meksytyl, dylantyna, hialuronian sodu lub polaksamer 188. [001] Przykład protokołu wykorzystującego taki środek jest następujący: krew przechowuje się w 4 C do czasu obróbki. Probówki odwirowuje się przy 00 obr./min przez dzie- sięć minut w wirówce przy sile hamowania ustawionej na zero. Probówki odwirowuje się po raz drugi, przy 00 obr./min przez dziesięć minut. Supernatant (osocze) z każdej próbki przenosi się do nowej probówki i odwirowuje przy 00 obr./min przez dziesięć minut z hamowaniem ustawionym na zero. Supernatant przenosi się do nowej probówki i przechowuje w -80 C. Około dwa mililitry kożuszka leukocytarno-płytkowego, który zawie- ra komórki matki, umieszcza się w oddzielnej probówce i przechowuje w -80 C. iii. DNA płodu pozbawione osocza

12 [002] Genomowe DNA można wyizolować z osocza z użyciem zestawu Qiagen Midi Kit do oczyszczania DNA z komórek krwi, zgodnie z instrukcjami producenta (QIAmp DNA Blood Midi Kit, nr katalogowy 1183). DNA wymywa się w 0 µ1 wody destylowanej. Qiagen Midi Kit stosuje się również do izolacji DNA z matczynych komórek zawartych w kożuszku leukocytarno-płytkowym. [003] Na koniec, podkreśla się, że w niektórych postaciach można także stosować próbki tkanki, śliny, moczu, łez, wydzieliny z pochwy, płynu z piersi, mleka z piersi lub potu. B. Rozdzielanie cząsteczek DNA [004] W zilustrowanym sposobie, genomowy DNA otrzymany z tkanki matki, jak to opisano powyżej, rozcieńcza się w wielu próbkach reakcyjnych, np. na wielostudzienkowych płytkach, tak by uzyskać średnio mniej niż jeden równoważnik genomu na studzienkę. Zatem kiedy poszczególne oddzielne próbki analizuje się pod kątem obecności nieprawidłowości genetycznych, które mają być badane, analizowane DNA (chromosom) będzie, przeciętnie, albo obecne albo nieobecne, co umożliwia tak zwaną analizę cyfrową. Próbka reakcyjna będzie zazwyczaj zawierać jedną cząsteczkę matrycy (haplotyp), dwie cząsteczki docelowe (diploid) lub trzy cząsteczki docelowe (trisomia). [00] Studzienki zapewniają oddzielne próbki reakcyjne i mogą być stosowane w wielu urządzeniach, takich jak płytki do mikromianowania, kulki w emulsji lub urządzenie mikroprzepływowe. Są one szczegółowo opisane poniżej. Urządzenie musi być zdolne do przeprowadzenia dużej liczby oddzielnych reakcji amplifikacji. Jak opisano poniżej, ta liczba powinna wynosić co najmniej 000 reakcji, a korzystnie rzędu 0000 reakcji. Próbka reakcyjna korzystnie stanowi około -0 µl próbki reakcyjnej do PCR zawierającej genomowy DNA, nukleotydy (dntp), polimerazę i odpowiednie startery do PCR. Startery są stosowane w połączeniu ze znacznikiem do szybkiego ilościowego wykrywania produktów PCR. Rodzaj znakowania będzie zależał od stosowanego systemu amplifikacji/detekcji, na przykład sonda fluorescencyjna typu molecular beacon do amplifikacji w oparciu o płytkę do mikromianowania. Ten rodzaj sondy jest opisany, na przykład, w Vogelstein i in., powyżej. Alternatywnie znakowanie można przeprowadzić z użyciem SYBR Green, który charakteryzuje się bardzo niską fluorescencją przy braku dwuniciowego DNA i bardzo wysoką fluorescencją w obecności dwuniciowego DNA. [006] Inną formą równoległej analizy przydatną w niniejszym wynalazku jest analiza pojedynczej cząsteczki. Ponownie, próbka jest rozcieńczana tak, aby zawierała mniej niż nominalny pojedynczy równoważnik genomu DNA, a obecność interesującego celu (tj. trisomii chromosomu 21) można wyznaczyć w dużej liczbie próbek. Poprzez analizę dużej liczby próbek, DNA płodu można odróżnić od DNA matki. Jest to określane jako analiza cyfrowa, ponieważ każda studzienka będzie zawierać średnio jeden równoważnik genomu na komorę, a ponadto, rozcieńczenie może być odczytane jako wynik dwójkowy tak-nie, pod względem obecności chromosomu lub innej zliczanej sekwencji. [007] Inny sposób analizy pojedynczej cząsteczki obejmuje zastosowanie znaczników fluorescencyjnych swoistych dla miejsca, które są wykrywane, gdy DNA przepuszcza się przez urządzenie mikroprzepływowe przy wydłużonym przepływie pojedynczych cząsteczek. Przykład tej techniki, opisany poniżej, jest określany jako bezpośrednia analiza liniowa lub DLA. C. Wykrywanie i oznaczanie ilościowe [008] Po wyodrębnieniu próbki DNA do postaci nominalnego równoważnika genomu, obecność interesującej sekwencji DNA lub chromosomu musi zostać oznaczona ilościowo. Może się to odbywać na poziomie pojedynczej cząsteczki lub produktu amplifikacji. [009] Chociaż korzystna postać wynalazku jest opisana w odniesieniu do reakcji PCR, wynalazek jest przeznaczony przede wszystkim do zastosowania przy wykrywaniu wielu poszczególnych sekwencji genetycznych. W niektórych postaciach, sposobem amplifikacji

13 może być na przykład samopodtrzymująca się reakcja sekwencyjna, reakcja łańcuchowa ligazy, szybka amplifikacja końców cdna, reakcja łańcuchowa polimerazy i reakcja łańcuchowa ligazy, amplifikacja z użyciem faga Q-beta, amplifikacja z wypieraniem nici lub łańcuchowa reakcja polimerazy ze składaniem drogą wydłużania nakładających się fragmentów. [0060] Ponadto, podczas gdy detekcję można dogodnie prowadzić z użyciem sondy swoistej dla sekwencji, detekcję można też przeprowadzić przez bezpośrednie sekwencjonowanie interesującego regionu w celu określenia, czy jest on interesującą sekwencją docelową. 1. Metody cyfrowej PCR [0061] Podczas gdy obecnie znane metody PCR mogą być multipleksowe, to znaczy, prowadzone z wieloma starterami dla wielu celów, korzystne jest ograniczenie liczby par starterów w danej reakcji. Zazwyczaj stosuje się dwie pary starterów: jedną do amplifikacji sekwencji testowej, a drugą parę do amplifikacji sekwencji kontrolnej. Startery są zaprojektowane zgodnie ze znanymi parametrami w celu uniknięcia struktur drugorzędowych i samo-hybrydyzacji. Co więcej, obie pary starterów powinny przyłączać się i topnieć mniej więcej w tych samych temperaturach. Startery [0062] Startery mogą być wytwarzane z użyciem różnych metod, w tym, lecz nie wyłącznie, klonowania odpowiednich sekwencji i bezpośredniej syntezy chemicznej z użyciem metod dobrze znanych w dziedzinie (Narang i in., Methods Enzymol. 68:90 (1979); Brown i in., Methods Enzymol. 68:9 (1979)). Startery można również otrzymać ze źródeł handlowych, takich jak Operon Technologies, Amersham Pharmacia Biotech, Sigma, i Life Technologies. Startery mogą mieć identyczną temperaturę topnienia. Długości starterów można wydłużać lub skracać na końcu ' lub końcu 3' w celu wytworzenia starterów o żądanych temperaturach topnienia. Ponadto, pozycja przyłączania każdej pary starterów może być zaprojektowana w taki sposób, by sekwencja i długość par starterów dawały żądaną temperaturę topnienia. Najprostszym wzorem do wyznaczania temperatury topnienia starterów mniejszych niż 2 par zasad jest zasada Wallace'a: (Td = 2 (A + T) + 4 (G + C)). Programy komputerowe mogą również być wykorzystane do projektowania starterów, w tym, lecz nie wyłącznie Array Designer Software (Arrayit Inc.), Oligonucleotide Probe Sequence Design Software for Genetic Analysis (Olympus Optical Co.), NetPrimer i DNAsis z Hitachi Software Engineering. TM (temperatura topnienia lub przyłączania) każdego startera jest obliczana z użyciem oprogramowania, takiego jak Oligo Design, dostępnego w Invitrogen Corp. [0063] Temperaturę przyłączania starterów można przeliczyć i zwiększyć po dowolnym cyklu amplifikacji, w tym, lecz nie wyłącznie, cyklu 1, 2, 3, 4,, cyklach 6-, cyklach -, cyklach -, cyklach -2, cyklach 2-, cyklach -3 lub cyklach 3-. Po początkowych cyklach amplifikacji, połowa ' starterów jest wbudowana w produkty każdego interesującego locus, a zatem TM można przeliczyć na podstawie obu sekwencji połowy ' i połowy 3' każdego ze starterów. Można zastosować dowolną polimerazę DNA, która katalizuje wydłużanie startera, w tym, lecz nie wyłącznie, polimerazę DNA E. coli, fragment Klenowa polimerazy DNA E. coli 1, polimerazę DNA T7, polimerazę DNA T4, polimerazę Taq, polimerazę DNA Pfu, polimerazę DNA Vent, bakteriofaga 29, genomową polimerazę DNA REDTaq.TM. lub sekwenazę. Korzystnie stosuje się termostabilną polimerazę DNA. Można też przeprowadzić PCR typu hot start, w którym mieszaninę reakcyjną ogrzewa się do 9 C przez dwie minuty przed dodaniem polimerazy lub polimerazę można przechowywać w stanie nieaktywnym do pierwszego etapu ogrzewania w cyklu 1. PCR typu hot start można zastosować w celu zminimalizowania nieswoistej amplifikacji. Do amplifikacji DNA można zastosować dowolną liczbę cykli PCR, w tym, ale nie wyłącznie, 2,,,,, 2,, 3, lub 4 cykli. W najkorzystniejszej postaci przeprowadza się taką liczbę cykli PCR, aby wytworzyć równą molową ilość każdego interesują-

14 cego locus. [0064] Kilka swoistych starterów PCR jest użytecznych w niniejszym sposobie, takich jak te ujawnione w literaturze technicznej z Qiagen. Ta literatura opisuje protokół, w którym DNA oczyszczono z krwi obwodowej i hodowli amniocytów z wykorzystaniem zestawu QIAmp DNA Blood Mini Kit. Do amplifikacji genu amyloidu na chromosomie 21 (NCBI ID genu nr dostępu NC_006488) starter i sekwencje sondy były następujące: SEQ ID NO: 1: starter w przód, '-GGG AGC TGG TAC AGA AAT GAC TTC-3'; starter w tył, SEQ ID NO: : '-TTG CTC ATT GCG CTG ACA A-3; i sonda SEQ ID NO: 2 '-(FAM) AGC CAT CCT TCC CGG GCC TAG G (TAMRA)-3'. [006] Do amplifikacji GAPDH, (GenBank locus 12p13.31-p13.1) startery i sonda były następujące: starter w przód, SEQ ID NO: 3, '-CCC CAC ACA CAT GCA CTT ACC-3'; starter w tył, SEQ ID NO: 4, '-CCT ACT CCC AGG GCT TTG ATT-3'; i sonda, SEQ ID NO:, '-(VIC) AAA GAG CTA GGA AGG ACA GGC AAC TTG GC (TAMRA)-3'. PCR przeprowadzono z użyciem systemu TaqMan, z użyciem 2 µl matrycy DNA w każdych 2 µl mieszaniny reakcyjnej i końcowych stężeń 0 nmoli/litr każdego ze starterów i 0 nmoli/litr każdej podwójnie wyznakowanej sondy TaqMan. Warunki cykli były następujące: inkubacja w 0 C przez 2 minuty, następnie 9 C przez minut, następnie cykli w 60 C przez 1 minutę i 9 C przez sekund. [0066] Z użyciem powyższego przykładowego protokołu, inna proporcja genu amyloidu do genu GAPDH w próbkach o normalnym kariotypie i z trisomią 21 była wyraźnie rozróżnialna w multipleksowym teście PCR, jak opisano w literaturze dotyczącej produktu Qiagen. Testy z użyciem serii rozcieńczeń matrycy DNA wykazały, że ta różnica pozostawała wyraźna w szerokim zakresie stężeń matrycy i przy wyjściowych stężeniach DNA nawet tak niskich jak mg/litr. Oczywiście, w próbce krwi matki, stężenie DNA płodu będzie znacznie niższe. Amplifikacja fluorescencyjna in situ [0067] Technologie oparte na sondach fluorescencyjnych, które można prowadzić z użyciem produktów PCR in situ (tj. w tych samych studzienkach), szczególnie dobrze nadają się do tego zastosowania. Ta metoda jest szczegółowo opisana w Vogelstein PNAS 96:9236 powyżej i w Vogelstein i in. Digital Amplification, US 6470, wprowadzonym tu przez odniesienie dla opisu tej procedury amplifikacji. [0068] Metoda digi-pcr z Vogelstein i in. jest opisana we wspomnianym powyżej patencie. Przykładowy protokół, jaki przedstawiono w tym patencie, jest następujący: PCR prowadzi się w objętości 7 µl w 96-studzienkowych polipropylenowych płytkach PCR (Marsh Biomedical Products, Rochester, NY). Skład mieszanin reakcyjnych jest następujący: 67 mm Tris, ph 8,8, 16,6 mm NH 4 SO 4, 6,7 mm MgCl 2, mm β-merkaptoetanol, 1 mm datp, 1 mm dctp, 1 mm dgtp, 1 mm TTP, 6% DMSO, 1 µm startera F1, 1 µm startera R1, 0,0 jednostek/µl polimerazy Taq Platinum (Life Technologies, Inc ), i pół równoważnika genomu DNA. [0069] W celu określenia ilości DNA odpowiadającej połowie równoważnika genomu, próbki DNA są seryjnie rozcieńczane i testowane metodą PCR. Ilość, która doprowadziła do powstania produktów amplifikacji w połowie studzienek, zwykle około 1, pg całkowitego DNA, określa się jako pół równoważnika genomu i stosuje w każdej studzience w kolejnych eksperymentach cyfrowej amplifikacji. Pięćdziesiąt µl lekkiego oleju mineralnego (Sigma M-316) dodaje się do każdej studzienki i reakcje prowadzi się w termocy- klerze HybAid w następujących temperaturach: denaturacja w 94 C przez 1 min; 60 cykli w 94 C przez s, C przez s, 70 C przez s; 70 C przez pięć minut. [0070] MB, lub sondy typu molecular beacon, które stają się fluorescencyjne po związaniu z sekwencją(-ami) docelową(-ymi), jak to opisano bardziej szczegółowo poniżej, można stosować w następujący sposób: [0071] Do analizy fluorescencji, do każdej studzienki dodaje się 3, µl roztworu o następującym składzie: 67 mm Tris, ph 8,8, 16,6 mm NH 4 SO 4, 6,7 mm MgCl 2, mm β-merka-

15 ptoetanolu, 1 mm datp, 1 mm dctp, 1 mm dgtp, 1 mm TTP, 6% DMSO, µm startera, 1 µm MB-GREEN, 1 µm MB-RED, 0,1 jednostek/µl polimerazy Taq Platinum. Płytki odwirowuje się przez sekund przy 6000 g i odczytuje fluorescencję przy długości fali wzbudzenia/emisji 48 nm/ nm dla MB-GREEN i nm/90 nm dla MB-RED. Następnie płytki umieszcza się w termocyklerze do asymetrycznej amplifikacji w następujących temperaturach: 94 C przez jedną minutę; - cykli w 94 C przez s, C przez s, 70 C przez sekund; 94 C przez jedną minutę; oraz 60 C przez pięć minut. Płytki następnie inkubuje się w temperaturze pokojowej przez dziesięć do sześćdziesięciu minut i mierzy się fluorescencję, jak opisano powyżej. [0072] Sondy MB są oligonukleotydami o strukturze typu łodyga-pętla, które zawierają barwnik fluorescencyjny na końcu ' oraz środek wygaszający (Dabcyl) na końcu 3'. Stopień wygaszania poprzez rezonansowe przeniesienie energii wzbudzenia fluorescencji jest odwrotnie proporcjonalny do 6 potęgi odległości między grupą Dabcyl i barwnikiem fluorescencyjnym. Po ogrzaniu i ochłodzeniu, sondy MB odtwarzają strukturę typu łodygapętla, która wygasza sygnał fluorescencyjny barwnika. Jeśli produkt PCR, którego sekwencja jest komplementarna do sekwencji pętli jest obecny podczas cyklu ogrzewania/chłodzenia, hybrydyzacja MB do jednej z nici produktu PCR będzie zwiększać odległość pomiędzy Dabcylem i barwnikiem, co prowadzi do zwiększonej fluorescencji. [0073] W poniższych przykładach zastosowano protokół PCR, który również opiera się na sondach typu MB, jednak w połączeniu z urządzeniem mikroprzepływowym. [0074] Niniejsze cyfrowe metody PCR można stosować z użyciem RNA, jak i DNA. Izolacja RNA z osocza jest opisana poniżej. W tym przypadku, wytwarza się kopie cdna, a następnie amplifikuje drogą PCR opartą na aktywności polimerazy DNA. Do syntezy cdna można stosować różne startery. Korzystne są swoiste matryce, oparte na sekwencjach genetycznych w interesujących chromosomach. Patrz, Bustina i in. Pitfalls of Quantitative Real-Time Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction, Journal of Biomolecular Techniques, :-166 (04). Zastosowanie mrna z genów eksprymowanych w sposób konstytutywny, tj. genów konstytutywnych, można użyć jako kontrolę i korzystne są geny silnie eksprymowane w łożysku (opisane poniżej). Obecne do PCR w czasie rzeczywistym dostępne są cztery różne systemy chemiczne, TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), sondy typu Molecular Beacon, startery typu Scorpion i SYBR Green (Molecular Probes). Wszystkie te systemy chemiczne umożliwiają wykrywanie produktów PCR poprzez wytwarzanie sygnału fluorescencyjnego i mogą zostać dostosowane do PCR z odwrotną transkrypcją. Zestaw MessageSensor RT Kit z Ambion zawiera RNazę H+ MMLV RT. MessageSensor zawiera całkowity kontrolny RNA, kontrolny zestaw starterów dla ludzkiego GAPDH, inhibitor RNazy i nukleotydy, jak również dodatek w postaci buforu, który umożliwia detekcję z użyciem barwnika SYBR Green. Ambion zaleca użycie 18S rrna jako kontroli wewnętrznej ponieważ wykazuje ono mniejsze zróżnicowanie ekspresji w innych warunkach eksperymentalnych niż β-aktyna i GAPDH. Gen kodowany na chromosomie 21 (LOC9062), który wykazuje silną ekspresję w łożysku podczas pierwszego trymestru podobnie jak CSH1 (ludzki laktogen łożyskowy) został wybrany do analizy osocza w Oudejans i in., Detection of Chromosome 21-encoded mrna of Placental Origin in Maternal Plasma, Clinical Chemistry 49: , 03. Swoiste startery do stosowania z tym genem są podane w tym dokumencie. Transkrypty eksprymowane unikalnie na chromosomie 21 są opisane w Gardiner i in., Analysis of human chromosome 21: correlation of physical and cytogenetic maps; gene and CpG island distributions, E.M.B.O.J. 9(1):2-34 (1990), a mianowicie cdna zidentyfikowanych produktów ETS2, MX1, MX2, CBS, COL6A1 i BCEI, które mogą zostać częściowo zsekwencjonowane lub zmapowane zgodnie z niniejszymi sposobami. 2. Emulsyjna PCR na kulkach [007] Emulsyjną PCR zastosowano do wytworzenia małych kulek z klonalnie namnożo-

16 nym DNA - w skrócie, każda kulka zawiera jeden rodzaj amplikonu z cyfrowej PCR. (Dressman i in., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.0, 8817 (22 lipca 03)). Dzięki zastosowaniu starterów swoistych dla regionów chromosomów A i B podczas przeprowadzania emulsyjnej PCR, wytwarza się kulki z cyfrowymi amplikonami tylko z tych dwóch chromosomów i konieczne jest wyłącznie zliczenie liczby dodatnich kulek każdego rodzaju. Istnieje wiele sposobów, aby to zrobić; my zwracamy uwagę na dwa z nich. Po pierwsze, zastosowanie dwóch różnych rodzajów kulek (pod względem wielkości lub znakowania fluorescencyjnego) do zakotwiczenia odpowiednio dwóch amplikonów. Alternatywnie można wyznakować niezakotwiczone startery różnymi fluoroforami i używać jednego rodzaju kulek. Po amplifikacji, dodatnie kulki (amplikony) każdego typu można zliczyć z użyciem metod, takich jak cytometria przepływowa lub po prostu przez zliczenie ich pod odpowiednio wyposażonym mikroskopem. [0076] Ta technika jest szczegółowo opisana w Dressman i in. (powyżej) oraz Dressman i in. publikacja PCT W00014, METHOD AND COMPOSITIONS FOR DETEC- TION AND ENUMERATION OF GENETIC VARIATIONS, opublikowana i wprowadzona tu przez odniesienie dla opisu procesu opartego na kulkach. W skrócie, w etapie 1 kulki magnetyczne powleczone kowalencyjnie streptawidyną są wiązane z biotynylowanymi oligonukleotydami ( oligo ). W etapie 2, wodną mieszaninę zawierającą wszystkie niezbędne składniki do PCR wraz z kulkami związanymi ze starterami i matrycą DNA miesza się razem z mieszaniną oleju/detergentu do wytworzenia mikroemulsji. Wodne przedziały (które mogą być przedstawione w postaci małych kropelek w warstwie oleju) zawierają średnio < 1 cząsteczkę matrycy i <1 kulkę. Różne matryce (kontrolna i testowa) mogą być zobrazowane w jednej lub mniejszej liczbie kulek, aby reprezentować dwie cząsteczki matrycy, których sekwencje różnią się jednym lub wieloma nukleotydami. W etapie 3, mikroemulsje poddaje się cyklom temperatury, jak w tradycyjnej PCR. Jeśli matryca DNA i kulka występują razem w jednym przedziale wodnym, oligonukleotydy związane z kulką działają jako startery do amplifikacji. Następnie, można wyobrazić sobie proste linie, odpowiadające produktom PCR dołączonym do odpowiednich matryc związanych z kulkami jako reprezentujące produkty wydłużania dwóch różnych rodzajów matryc. W etapie 4, emulsje rozbija się, a kulki oczyszcza z użyciem magnesu. W etapie, po denaturacji, kulki inkubuje sie z oligonukleotydami, które pozwalają rozróżnić sekwencje różnych rodzajów matryc. Następnie wykorzystuje się znakowane fluorescencyjnie przeciwciała do oznaczenia związanych sond hybrydyzacyjnych. Nadaje to kulkom zawierającym produkt PCR różne barwy (np. czerwony lub zielony) po odpowiednim wzbudzeniu laserem. W etapie 6, stosuje się cytometrię przepływową do zliczenia czerwonych i zielonych kulek. Korzystnie każda kulka jest związana z co najmniej, 0, 0, 00 lub 00 cząsteczek o tej samej sekwencji kwasu nukleinowego. [0077] Dla celów szczegółowego opisu, poniższy przykład wzięto z wyżej cytowanej publikacji PCT: Szczegółowy przykładowy protokół z użyciem emulsji z kulkami [0078] Etap 1 - sprzęganie oligonukleotydów z kulkami. Nadparamagnetyczne kulki o średnicy 1,0 ± 0,1 um, kowalencyjnie związane ze streptawidyną są zakupione z Dynal Biotech, Inc. (60.01, Lake Success; NY). Kulki przemywa się raz 1x buforem do PCR (3286, Invitrogen, Carlsbad, CA), następnie przeprowadza w zawiesinę w buforze do wiązania i przemywania (BWB) ( mm Tris-HCI, 0, mm EDTA, 1,0 MNaCl, ph 7,). Kulki inkubuje się w BWB przez min w temperaturze pokojowej w obecności µm oligonukleotydów. Te oligonukleotydy są zmodyfikowane przez podwójną grupą biotynową na końcu ', w której grupy biotynowe są rozdzielone sześciowęglowym łącznikiem (IDT, Coralville, IA). Po związaniu kulki przemywa się 3 razy 1x buforem PCR, aby dokładnie usunąć niezwiązane oligonukleotydy. [0079] Etap 2 - Wytwarzanie mikroemulsji. Mikroemulsje do PCR wytwarza się w fazie olejowej, która składa się z 4,% Span 80 (S6760, Sigma, St. Louis, MO), 0, % Tween

17 (Sigma S-8074) i 0,0% Triton X-0 (Sigma T-9284) w oleju mineralnym (Sigma M- 316). Faza wodna składa się z 67 mm Tris-HCl (ph 8,8), 16,6 mm NH 4 SO 4, 6,7 mm MgCl 2, mm 3-merkaptoetanolu, 1 mm datp, 1 mm dctp, 1 mm dgtp, 1 mm dttp, 0,0 µm startera w przód, 2 µm startera w tył, 4 jednostek Platinum Taq (Invitrogen ), różnych ilości matrycy DNA i ~8 kulek sprzężonych z oligonukleotydami w całkowitej objętości 0 µl. Starter w przód jest oligonukleotydem, którego sekwencja jest identyczna z nukleotydami 3'-22 tych opisanych w etapie 1 i nie jest modyfikowana biotyną. [0080] Mikroemulsje typu woda w oleju wytwarza się przez wkraplanie 0 mikrolitrów fazy wodnej do 0 mikrolitrów fazy olejowej uprzednio umieszczonej w 2 ml okrągłodennej probówce kriogenicznej (4661, Coming, Coming, Nowy Jork). [0081] Wkraplanie prowadzi się przez ponad minutę, przy czym mieszaninę miesza się przy 10 obr./min z użyciem magnetycznego mikromieszadełka ( VWR, Plainfield, NJ) na mieszadle magnetycznym modelu 6 VWR. Po dodaniu fazy wodnej, mieszaninę nadal miesza się przez całkowity czas minut. Dwie emulsje są wytwarzane jednocześnie dzięki umieszczeniu dwóch probówek w statywie umieszczonym na środku mieszadła magnetycznego. [0082] Etap 3 - Cykle PCR. Emulsje rozdzielono do pięciu studzienek 96-studzienkowej płytki do PCR, z których każda zawiera 0 µl. PCR przeprowadzono w następujących warunkach cyklizacji: 94 C przez 2 minuty, cykli w 94 C przez sekund, 7 C przez sekund, 70 C przez sekund. Produkty PCR analizowane w tym badaniu miały od 189 do 239 pz. [0083] Etap 4 - Magnetyczne wychwytywanie kulek. Po przeprowadzeniu cykli PCR, mikroemulsje z pięciu studzienek płytki do PCR połączono i rozbito przez dodanie 800 mikrolitrów buforu NX (0 mm NaCl zawierający 1% Triton X-0, mm Tris-HCl, ph 7,, 1 mm EDTA) w 1, ml probówce (Corning 4909). Po worteksowaniu przez s kulki osadza się przez odwirowanie w mikrowirówce przy 8000 obr./min (000 g) przez 90 sekund. Górną fazę olejową i całą fazę wodną poza 0 mikrolitrami, usuwa się z probówki i dodaje się 600 mikrolitrów buforu NX. Te etapy powtarza się. Następnie probówkę umieszcza się na magnesie (Dynal MPC-S), a pozostałość supernatantu ostrożnie odpipetowuje. Kulki przemywa się dodatkowo 3 razy 1x buforem do PCR z użyciem separacji magnetycznej, a nie wirowania, a na koniec ponownie przeprowadza w zawiesinę w 0 mikrolitrach 1x buforu do PCR. [0084] Etap - Rozróżnianie sekwencji. Dwie sondy oligonukleotydowe są stosowane do każdej reakcji. Jedna jest znakowana na końcu ' 6-karboksyfluoresceiną (6-FAM) i jest swoista dla jednego allelu, a druga jest znakowana na końcu ' biotyną i jest swoista dla innego allelu. Sondy są syntetyzowane metodą IDT. mikrolitrowe mieszaniny reakcyjne do hybrydyzacji zawierały µm każdej sondy i -2 milionów kulek w 1 x buforze do PCR. Reakcje prowadzi się na płytkach do PCR w termocyklerze przez ogrzewanie do 94 C przez sekund, a następnie chłodzenie do 7 C z szybkością 0, C na sekundę, chłodzenie do 4 C przy 0,2 C na sekundę, a na koniec chłodzi do C przy 1 C na sekundę. [008] Wszystkie kolejne etapy prowadzi się w temperaturze pokojowej. Próbki reakcyjne przenosi się do 96-studzienkowej płytki Costar (Corning 3797) i umieszcza na magnesie dla 96 studzienek. Kulki zbiera się magnetycznie przez wystawienie ich na działanie ma- gnesu przez 2 minuty. Supernatant usuwa się, a kulki przemywa się 3 razy 1x buforem do PCR przez pipetowanie ich i zbieranie przez dwie minuty. W końcu przeprowadza się je w zawiesinę w 0 mikrolitrach buforu B-PCR (1 mg/ml BSA w 1x buforze do PCR). [0086] Kulki następnie inkubuje się przez minut w całkowitej objętości 0 mikrolitrów buforu B-PCR zawierającego 3 µg króliczego przeciwciała przeciw fluoresceinie Alexa 488 (Molecular ProbesA-190, Eugene, OR) i 3 µl neutrawidyny znakowanej R- fikoerytryną (Molecular Sondy-2660) w buforze B-PCR. Kulki przemywa się trzykrotnie i

18 przeprowadza w zawiesinę w buforze B-PCR, jak opisano powyżej. Następnie inkubuje się je przez dziesięć minut w całkowitej objętości 0 mikrolitrów buforu B-PCR zawierającego 6 µg kurczęcego przeciwciała przeciwkróliczego sprzężonego z Alexa 488 (Molecular Probes-21441) i 3 µg biotynylowanego koziego przeciwciała przeciw awidynie (BA - 06, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Kulki przemywa się trzykrotnie i ponownie przeprowadza w zawiesinę w buforze B-PCR, jak opisano powyżej. Następnie inkubuje się je przez dziesięć minut w całkowitej objętości 0 mikrolitrów buforu B-PCR zawierającego 3 µg koziego przeciwciała przeciwkurczęcego sprzężonego z Alexa 488 (Molecular Probes A-139) i 3 mikrogramy streptawidyny znakowanej R-fikoerytryną (Molecular Probes S-866). Ten roztwór przemywa się następnie dodatkowe 3 razy 1x buforem do PCR i ponownie przeprowadza w zawiesinę w mikrolitrach 1 X buforu do PCR. [0087] Etap 6 - Cytometria przepływowa. Zawiesinę kulek rozcieńcza się do stężenia 6-7-kulek na ml w mm Tris-HCl, 1 mm EDTA ( , Quality Biological, Inc, Gaithersburg, MD) i analizuje z użyciem urządzenia LSR (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Urządzenie jest skonfigurowane do standardowej dwubarwnej analizy z użyciem lasera argonowego i filtrów optycznych, aby rozróżnić dwa barwniki fluorescencyjne. Nie wymagana jest dekonwolucja spektralna, jako że główne populacje kulek są dobrze rozdzielone. W niektórych przypadkach, prowadzi się skanowanie z użyciem urządzeń FAC- Scan lub FACSCalibur (BD Biosciences). 3. Rozcieńczanie mikroprzepływowe z PCR [0088] Kolejne podejście do cyfrowej PCR obejmuje zastosowanie mikroprzepływów do osiągnięcia warunków cyfrowej PCR stosowanej w niniejszym sposobie. [0089] Na ogół, próbkę DNA otrzymaną w sposób opisany powyżej rozcieńcza się do odpowiedniego stężenia, miesza się z odczynnikami do PCR, starterami, dntp, itp. i przepuszcza przez szereg kanałów, które mogą być zamykane na wielu odcinkach, zapewniając wiele odrębnych próbek reakcyjnych lub komór. Komory mogą być poddawane cyklom temperaturowym PCR, a produkty wykrywane ilościowo na podstawie fluorescencji, jak opisano powyżej. [0090] Odpowiednie urządzenie mikroprzepływowe jest wytwarzane przez Fluidigm Corporation, nazwane Digital Isolation and Detection IFC (integrated fluid circuit). Odpowiednie urządzenie jest też opisane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych , Enzelberger, i in., wydanym 1 listopada 0, pod tytułem Nucleic acid amplification utilizing microfluidic devices, opisującym urządzenie mikroprzepływowe zdolne do utrzymania wielu równoległych amplifikacji i detekcji kwasu nukleinowego. Jak opisano w tym patencie, przykładowe urządzenie mikroprzepływowe do prowadzenia reakcji termocyklicznych zawiera w warstwie z kanałami przepływowymi wiele wejść dla próbek, mieszające skrzyżowanie w kształcie litery T, centralną pętlę obiegu (tj. zasadniczo kolisty kanał przepływowy) oraz kanał wyjściowy. Przecięcie się kanału sterującego z kanałem przepływowym może tworzyć mikrozawór. Jest tak dlatego, że kanały sterujący i przepływowy są przedzielone cienką membraną elastomerową, która może być zaginana do kanału przepływowego lub wycofywana z niego. Ugięcie lub cofnięcie membrany elastomerowej jest osiągnięte poprzez wytworzenie siły, która powoduje wystąpienie odchylenia lub cofnięcia. W pewnych układach, osiąga się to poprzez zwiększenie lub zmniejszenie ciśnienia w kanale sterującym, w porównaniu z kanałem przepływowym, z którym przecina się kanał sterujący. Jednak można wykorzystać wiele różnych innych metod do uruchamiania zaworów w tym różnych metod elektrostatycznych, magnetycznych, elektrolitycznych i elektrokinetycznych. Inne urządzenie mikroprzepływowe, przystosowane do prowadzenia reakcji PCR i przydatne w niniejszych sposobach, jest opisane w US 0/022773, McBride, i in., opublikowanym 17 listopada 0, pod tytułem Thermal reaction device and method for using the same. [0091] Zasadniczo kolista pętla centralna i kanały sterujące, które przecinają się z nią two-

19 rzą środkową część pompy rotacyjnej. Pompa(-y), która(-e) powoduje(-ą) przepływ roztworu przez zasadniczo kolisty kanał przepływowy składa(-ją) się z zestawu co najmniej trzech kanałów sterujących, które sąsiadują ze sobą i które przecinają zasadniczo koliste odgałęzienie kanału przepływowego (tj. pętlę centralną). Gdy na kanały sterowania zadziała się sekwencją włączeń i wyłączeń, płyn w pętli centralnej może być perystaltycznie pompowany w wybranym kierunku, zgodnie lub przeciwnie do ruchu wskazówek zegara. Działanie pompy perystaltycznej skutkuje sekwencyjnym uginaniem membran rozdzielających kanały sterowania i kanał przepływowy, wywołując przepływ do lub z kanału przepływowego. Ogólnie, im wyższa jest częstotliwość uruchamiania, tym szybciej płyn krąży w pętli centralnej. Jednak w końcu osiąga się punkt nasycenia, w którym zwiększona częstotliwość nie spowoduje szybszego przepływu płynu. Jest to przede wszystkim związane z ograniczeniami w szybkości, z którą membrana może powrócić do nieuruchomionej pozycji. Jeden przykładowy układ ma dwa zestawy pomp (tj. dwa zestawy trzech kanałów sterujących, które nakładają się na zasadniczo kolisty kanał przepływowy) i można stosować pojedynczą pompę (np. jeden zestaw trzech kanałów sterujących, które nakładają się na zasadniczo kolisty kanał przepływowy). Ponadto, podczas gdy każda pompa jest pokazana jako zawierająca trzy kanały sterujące, można stosować więcej kanałów sterujących. Należy również rozumieć, że wszystkie trzy kanały sterujące mogą być różnymi segmentami pojedynczego kanału sterującego, który nakłada się na kanał przepływowy. [0092] Szczegółowy opis analizy wielu próbek przeprowadzonej w studzienkach nie oznacza, że sekwencje docelowe muszą być fizycznie rozdzielone do studzienek, jako że sekwencje mogą być w próbkach, które są odizolowane po prostu przez umieszczenie na różnych kulkach (jak opisano powyżej) lub przyleganie do różnych obszarów podłoża (jak opisano poniżej). 4. Sposoby wykrywania/sekwencjonowania pojedynczej cząsteczki [0093] Należy zauważyć, że sposoby obejmujące PCR lub inną amplifikację nie są jedynym sposobem wykrycia lub zliczenia cząsteczek w danej oddzielnej próbce reakcyjnej. Możliwe jest użycie cytometrii przepływowej pojedynczej cząsteczki, aby zliczyć pojedyncze cząsteczki, które zostały wyznakowane sondą fluorescencyjną swoistą dla sekwencji. Możliwe jest również zsekwencjonowanie sekwencji docelowej bezpośrednio w próbce reakcyjnej, po amplifikacji lub na poziomie pojedynczej cząsteczki. Wprowadzenie fluorescencyjnego nukleotydu przez polimerazę DNA [0094] Jak to opisano we wspomnianej powyżej publikacji PNAS autorstwa Braslavsky i in. można zastosować polimerazę DNA do zobrazowania informacji o sekwencji na jednej matrycy DNA, gdy jej nić komplementarna jest syntetyzowana. Nukleotydy są wstawiane po kolei; do rozróżnienia skutecznego wbudowywania wymagana jest tylko rozdzielczość czasowa. Po każdym udanym zajściu wbudowania, mierzy się sygnał fluorescencyjny, a następnie wygasza przez fotowybielanie. Ten sposób sam prowadzi do reakcji masowo równoległych. [009] W skrócie, ta technika umożliwia obserwacje fluorescencji pojedynczej cząsteczki z użyciem tradycyjnego mikroskopu wyposażonego w oświetlenie dla całkowitego wewnętrznego odbicia, co zmniejsza fluorescencję tła. Powierzchnia kwarcowego szkiełka jest poddana obróbce chemicznej w celu swoistego zakotwiczenia matryc DNA, zapobiegając nieswoistemu wiązaniu się wolnych nukleotydów, a komora przepływowa z tworzywa sztucznego jest przymocowana do powierzchni w celu wymiany roztworów. Oligonukleotydy matrycy DNA hybrydyzują z fluorescencyjnie wyznakowanym starterem i wiążą się z powierzchnią za pomocą streptawidyny i biotyny przy na tyle niskiej gęstości powierzchniowej, aby uzyskać pojedyncze cząsteczki. Matryce ze starterami są wykrywane przez ich znaczniki fluorescencyjne, ich lokalizacje są zapisywane do dalszych odniesień, a znaczniki są fotowybielane. Znakowane trifosforany nukleotydów i enzym polimeraza DNA są następnie wmywane do i wymywane z komory przepływowej, podczas gdy znane

20 lokalizacje matryc DNA monitoruje się pod kątem pojawienia się fluorescencji. W technice stosuje się wykorzystuje kombinację mikroskopii zanikającej fali i rezonansowego przeniesienia energii wzbudzenia fluorescencji dla pojedynczej pary (spfret) w celu odrzucenia niepożądanego szumu. Fluorofor donorowy wzbudza akceptory tylko w promieniu Forstera, skutecznie tworząc tym samym źródło bliskiego pola o niezwykle wysokiej rozdzielczości. Ponieważ promień Forstera dla tej pary fluoroforów wynosi nm, rozdzielczość przestrzenna tego sposobu przekracza granicę dyfrakcji o czynnik 0, a tradycyjnej mikroskopii bliskiego pola o rząd wielkości. [0096] Genomowy DNA z tkanki pobranej od matki, tj. mieszaninę materiału genetycznego płodu i matki, można rozdzielić na oddzielne próbki, które są zakotwiczone na powierzchni i sekwencjonować lub monitorować przez znakujące sondy w celu wykrycia swoistej sekwencji docelowej, np. unikalnego regionu chromosomu 21, np. AML1. Dalsze wskazówki dotyczące przygotowania unikalnych sekwencji chromosomu 21 można znaleźć na przykład w Fuscoe i in., An Efficient Method for Selecting Unique-Sequence Clones from DNA Libraries and Its Application To Fluorescent Staining of Human Chromosome 21 Using in Situ Hybridization, Genomics, tom, 1989, str Metodologia przydatna w niniejszym wynalazku opiera się na masowo równoległym sekwencjonowaniu milionów fragmentów z przyłączania z użyciem wiązania genomowego DNA poddanego losowej fragmentacji do płaskiej, optycznie przezroczystej powierzchni i amplifikacji na stałym podłożu w celu wytworzenia komory przepływowej do sekwencjonowania o wysokiej gęstości z milionami skupisk, z których każde zawiera ~ 00 kopii matrycy na cm kwadratowy. Matryce są sekwencjonowane z użyciem czterokolorowej technologii sekwencjonowania DNA przez syntezę. Patrz, produkty oferowane przez Illumina, Inc, San Diego, Kalifornia. Zobacz także US 03/00227, Balasubramanian, i in., opublikowany stycznia 03, pod tytułem Arrayed polynucleotides and their use in genome analysis. [0097] Sekwencjonowanie można połączyć z metodami opartymi na amplifikacji na chipie mikroprzepływowym mającym komory reakcyjne zarówno do PCR, jak i do mikroskopowego sekwencjonowania na bazie matrycy. Informacje dotyczące wyłącznie około pz z losowej sekwencji są niezbędne do identyfikacji sekwencji jako należącej do określonego ludzkiego chromosomu. Dłuższe sekwencje mogą jednoznacznie identyfikować bardziej konkretne cele. Algorytm do projektowania unikalnych sekwencji jest opisany w Yamada i in. PrimerStation: a highly specific multiplex genomic PCR primer design server for the human genome, Nucleic Acids Res., 1 lipca 06; 34 (Web Server issue): W66 W669, gdzie zilustrowano metody dla oprogramowania, które można stosować do identyfikacji sekwencji w porównaniu ze znaną sekwencją genomową. Zobacz także Zhu i in., Single molecule profiling of alternative pre-mrna splicing, Science. 8 sierpnia 03; 1 (634): , gdzie opisano technologię badania mrna w oparciu o pojedynczą cząsteczkę. Bezpośrednia analiza liniowa (DLA) [0098] Inny sposób określania tożsamości genomowego DNA z niniejszych próbek jest nazywany bezpośrednią liniową analizą i jest opisany w Chan i in. DNA Mapping Using Microfluidic Stretching and Single-Molecule Detection of Fluorescent Site-Specific Tags, Genome Research 14: (04). W tym sposobie, urządzenie mikroprzepływowe służy do rozciągania cząsteczek DNA w wydłużonym przepływie, który jest połączony z układem wielobarwnej detekcji o możliwej czułości względem pojedynczego fluoroforu. Dwuniciowe cząsteczki DNA są znakowane w miejscach występowania motywów o swoistej sekwencji fluorescencyjnymi znacznikami bispna (kwasy peptydonukleinowe). Cząsteczki DNA są następnie rozciągane w urządzeniu mikroprzepływowym i przepuszczane w strumieniu przepływu przez konfokalne detektory fluorescencji. DLA może zapewnić przestrzenne rozmieszczenie wielu swoistych motywów sekwencji wraz z poszczególnymi cząsteczkami DNA, i tysiące poszczególnych cząsteczek może być analizowanych na minutę.