Wpływ temperatury przechowywania surowicy krwi ludzkiej na stężenie interleukiny 12

Transkrypt

1 diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2009 Volume 45 Number Praca oryginalna Original Article Wpływ temperatury przechowywania surowicy krwi ludzkiej na stężenie interleukiny 12 Kinga Lis Katedra i Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej, Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu Streszczenie Cel: Interleukina 12 (IL-12) jest heterodimerem o masie cząsteczkowej około 70 kda. Jest wytwarzana przez makrofagi i komórki dendrytyczne, a także keratynocyty, granulocyty i komórki tuczne. IL-12 wpływa na komórki NK, limfocyty T, układ krwiotwórczy oraz reguluje wytwarzanie innych cytokin. Ma również właściwości przeciwbakteryjne, przeciwwirusowe i przeciwnowotworowe. Celem pracy była ocena stabilności IL-12 w surowicy przechowywanej przez okres 4 miesięcy w różnych warunkach temperatury. Metody: Materiał do badań stanowiła surowica krwi żylnej pobranej od 20 zdrowych osób w wieku od 20 do 34 lat. Surowica podzielona na 4 porcje przechowywana była w różnych warunkach temperatury: 4 miesiące w temperaturze 2-8 C, 2 tygodnie w temperaturze 2-8 C, a następnie w temperaturze -70 C do 4 miesięcy od pobrania, 4 miesiące w temperaturze -20 C oraz 4 miesiące w temperaturze -70 C. We wszystkich próbkach surowicy testem ELISA oznaczono stężenie IL-12. Badania wykonano w jednej serii. Wyniki: W wyniku analizy statystycznej otrzymanych wyników badań laboratoryjnych zaobserwowano, że długoterminowe przechowywanie surowicy w celu oznaczania stężenia IL-12 wymaga zamrożenia próbek badanych w temperaturze -70 C bezpośrednio po odwirowaniu wykrzepionej krwi i przechowywania ich w stanie głębokiego zamrożenia do czasu wykonania badania. Influence of the storage temperature of the human blood serum on the interleukin 12 concentration Summary Aim: Interleukin 12 (IL- 12) is a heterodimer of the molecular mass about 70 kda. It is being produced by macrophages and dendritic cells as well as keratinocytes, granulocytes and mast cells. IL- 12 influences in NK cells, T-lymphocytes and hematopoetic system functions and regulation of other citokines production. This cytokine also has antibacterial, antiviral and anticancerogenic properties.the aim of study was an evaluation of the IL- 12 stability in serum stored by the period of 4 months in different conditions of temperature. Methods: Serum of the venous blood collected from 20 healthy persons (20-34 years old), divided in 4 portions was stored in different conditions of the temperature: 4 months in temperature 2-8 C, 2 weeks in temperature 2-8 C and then in the temperature -70 C up to 4 months from collecting, 4 months in the temperature -20 C and 4 months in the temperature -70 C. Serum level of IL-12 was measured by ELISA technique in one series. Results: Statistical analysis of received results of the laboratory tests showed, that long-term storing serum intended to measuring of concentration IL-12 requires freezing samples of serum in the temperature -70 C directly after blood collected and storing them in this conditions until the assay. Słowa kluczowe: IL-12, surowica, temperatura przechowywania Key words: IL-12, serum, storing temperature Wstęp Cytokiny stanowią bardzo zróżnicowaną grupę białek, spośród których najlepiej poznane zostały jak dotąd interleukiny. Obecnie znanych jest około 37 interleukin, pełniących rozmaite funkcje regulatorowe [2, 12]. W zależności od przyjętych kryteriów wyodrębniono kilka grup cytokin. Podział umowny wyszczególnia chemokiny, interleukiny, czynniki wzrostu, interferony oraz czynniki martwicy nowotworów [2, 5, 9, 12]. Z kolei ze względu na charakter stymulowanych przez cytokiny procesów, można je podzie- 309

2 Wpływ temperatury przechowywania surowicy krwi ludzkiej na stężenie interleukiny 12 lić na działające prozapalnie (np.: interleukiny (IL) IL-1, IL-2, IL-8, IL-18 oraz czynnik martwicy nowotworów α (TNF-α)), czyli nasilające powstawanie i przebieg procesu zapalnego oraz działające przeciwzapalnie, czyli hamujące reakcje zapalne (np.: IL-4, IL-10, transformujący czynnik wzrostu (TGF-β) oraz antagonista receptora dla IL-1 (IL-1Ra)). Neutralną pozycję zajmuje IL-6, która wykazuje zarówno cechy cytokiny pobudzającej, jak i hamującej proces zapalny [9, 14, 15]. Zdolność syntetyzowania cytokin posiadają monocyty, makrofagi, komórki śródbłonka, fibroblasty, komórki dendrytyczne, keratynocyty, limfocyty T i B, mastocyty, granulocyty, komórki siateczki szpiku kostnego, komórki śledziony oraz osteoblasty [2, 5]. Interleukina 12 (IL-12) jest heterodimerem o masie cząsteczkowej około 70 kda, zbudowanym z dwóch podjednostek: p40 i p35, połączonych wiązaniami kowalencyjnymi. Jest wytwarzana przez makrofagi i komórki dendrytyczne, a także keratynocyty, granulocyty i komórki tuczne. Receptory dla IL-12 występują na limfocytach T, komórkach NK oraz jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej [2, 12]. IL-12 stymuluje proliferację, aktywację i cytotoksyczność komórek NK i limfocytów T, oddziałuje na układ krwiotwórczy oraz reguluje wytwarzanie wielu innych cytokin. Wykazuje działanie przeciwbakteryjne, przeciwwirusowe i przeciwnowotworowe. IL-12 indukuje wytwarzanie interferonu γ (IFN-γ) i TNF-α oraz stymuluje powstawanie limfocytów Th1. Hamuje wydzielanie immunoglobuliny E (IgE), stymuluje zaś syntezę przeciwciał podklasy IgG [2, 6, 12, 13]. Oznaczanie stężenia IL-12 oraz wielu innych cytokin w surowicy lub innych płynach biologicznych wykorzystywane jest zarówno w celach diagnostycznych, terapeutycznych, jak i badawczych [7, 12]. Badanie to przeprowadzane jest zazwyczaj technikami immunoenzymatycznymi w fazie stałej (testy ELISA), co narzuca konieczność gromadzenia materiału do badań celem wykonania oznaczenia w jednej, dużej serii. Taki sposób prowadzenia badań zmusza do długotrwałego przechowywania pobranego materiału. Celem pracy była ocena stabilności IL-12 w surowicy krwi przechowywanej przez okres 4 miesięcy w różnych warunkach temperatury. Materiał i metody Materiał do badań stanowiła surowica krwi żylnej pobranej od 20 zdrowych osób w wieku od 20 do 34 lat. Krew w objętości 7 ml pobrano z żyły łokciowej do suchej, szklanej probówki, bez dodatków, za pomocą zamkniętego systemu próżniowego Vacutainer (Becton Dickinson), w warunkach standardowych; pomiędzy godziną 7.00 a 9.00 rano, na czczo od osób po całonocnym wypoczynku. Próbki krwi po pobraniu pozostawiono w temperaturze pokojowej przez 30 minut celem wykrzepienia. Po tym czasie wykrzepioną krew odwirowano przez 15 minut z szybkością 3000 obr/min. Po odwirowaniu surowicę oddzielono od skrzepu krwinek. Oddzieloną surowicę w objętości około 3 ml od każdego pacjenta podzielono na 4 porcje po około 0,7 ml i przechowywano przez 4 miesiące w następujących warunkach: porcja A próbka surowicy przechowywana w temperaturze 2-8 C przez okres 4 miesięcy porcja B próbka surowicy przechowywana 2 tygodnie w temperaturze 2-8 C, a następnie do 4 miesięcy w temperaturze -70 C porcja C próbka surowicy przechowywana 4 miesiące w temperaturze -20 C porcja D próbka surowicy przechowywana 4 miesiące w temperaturze -70 C. Porcja D stanowiła próbkę odniesienia. Po upływie 4 miesięcy wszystkie próbki surowicy doprowadzono do temperatury pokojowej i oznaczono w nich stężenie IL-12 oraz stężenie białka całkowitego. Wszystkie badania laboratoryjne zostały wykonane w jednej serii. Oznaczenie stężenia IL-12 przeprowadzono techniką ELI- SA przy pomocy gotowego zestawu Human IL-12 ELISA Kit (Bender MedSystems). Absorbancję zmierzono przy długości fali 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek ELISA Lab- Systems Multiscan RC i przeliczono na stężenie przy pomocy oprogramowania GENESIS. Stężenie białka całkowitego w surowicy oznaczono metodą biuretową przy zastosowaniu odczynników firmy BioSystems. Absorbancję próby wzorcowej oraz prób badanych odczytano przy pomocy spektrofotometru firmy BioSystems. Analizę statystyczną otrzymanych wyników badań przeprowadzono testem nieparametrycznym ANOVA Friedmana, dla określenia zmian w serii pomiarów oraz przy pomocy testu kolejności par Wilcoxona, w celu porównania stężenia badanych parametrów z próbką surowicy przechowywaną w temperaturze -70 C, traktowaną jako próbka odniesienia. Za statystycznie istotne przyjęto p 0,05. Tabela I. Stężenie białka całkowitego w surowicy przechowywanej przez 4 miesiące w różnych temperaturach. Próbka Średnia [g/ml] A 0,0714 0,008 B 0,0695 0,007 C 0,0721 0,009 D 0,0709 0,

3 K. Lis Wyniki Stężenie białka całkowitego w badanych próbkach surowicy przedstawiono w tabeli I. Stężenie białka całkowitego w próbkach surowicy przechowywanych przez 4 miesiące w różnych temperaturach nie różniło się znamiennie (ryc. 1). Stężenie IL-12 w badanych próbkach surowicy przedstawiono w tabeli II. Zauważono, że stężenie IL-12 w badanych próbkach surowicy było znamiennie różne zależnie od temperatury przechowywania (ryc. 2). Stężenie IL-12 przeliczono na 1g białka całkowitego w badanych próbkach surowicy (tab. III). Zaobserwowano, że stężenie IL-12 w przeliczeniu na gram białka całkowitego w badanych próbkach surowicy różniło się znamiennie w zależności od temperatury przechowywania (ryc. 3). W badanych próbkach surowicy stężenie IL-12 przechowywanej w temperaturze 2-8 C przez 4 miesiące, przechowywanej 2 tygodnie w temperaturze 2-8 C, a następnie do 4 miesięcy w temperaturze -70 C oraz przechowywanej przez ten czas w temperaturze -20 C porównano ze stężeniem IL- 12 w surowicy przechowywanej przez 4 miesiące w temperaturze -70 C. Próbkę tę potraktowano jako próbkę odniesienia (tab. IV). Zaobserwowano, że stężenie IL-12 w surowicy krwi przechowywanej w temperaturze 2-8 C było znamiennie niższe niż w surowicy przechowywanej w temperaturze -70 C. Utrata IL-12 w tych warunkach wynosiła 62,3% w stosunku do próbki odniesienia (ryc. 4). Stężenie IL-12 w próbkach przechowywanych w lodówce przez 2 tygodnie, a następnie zamrożonych w temperaturze -70 C było znamiennie niższe Rycina 1. Stężenie białka całkowitego w surowicy przechowywanej przez 4 miesiące w różnych temperaturach (p 0,06). Rycina 2. Stężenie IL-12 w surowicy przechowywanej przez 4 miesiące w różnych temperaturach (p 0,00001). Tabela II. Stężenie IL-12 w surowicy przechowywanej przez 4 miesiące w różnych temperaturach. Próbka A 0,940 0,27 B 1,204 0,30 C 1,384 0,36 D 2,494 1,15 Tabela III. Stężenie IL-12 w przeliczeniu na 1g białka w badanych próbkach surowicy przechowywanej przez 4 miesiące w różnych temperaturach. Próbka Średnia [pg/1g białka] A 13,28 3,86 B 17,52 5,12 C 19,49 5,78 D 35,77 18,73 311

4 Wpływ temperatury przechowywania surowicy krwi ludzkiej na stężenie interleukiny 12 Rycina 3. Stężenie IL-12 w przeliczeniu na 1g białka w surowicy przechowywanej przez 4 miesiące w różnych temperaturach (p 0,00001). Rycina 4. Procentowa pozostałość IL-12 w próbkach surowicy przechowywanych w różnych warunkach w odniesieniu do próbki zamrożonej w temperaturze -70 C przez cały czas trwania eksperymentu, traktowanej jako 100%. Tabela IV. Porównanie stężenia IL-12 w badanych próbkach surowicy (A, B, C) oraz w próbce odniesienia przechowywanej w temperaturze -70 C (D). Próbka D Próbka A Próbka B Próbka C 0,940 ± 0,27 1,204 ± 0,30 1,384 ± 0,36 2,494 ± 1,15 2,494 ± 1,15 2,494 ± 1,15 p 0, , ,0001 próbka odniesienia niż w próbkach surowicy przechowywanej w temperaturze -70 C przez cały czas trwania eksperymentu. Utrata IL-12 w tych warunkach wynosiła 51,7% w stosunku do próbki odniesienia (ryc. 4). Stężenie IL-12 w próbkach przechowywanych w temperaturze -20 C było znamiennie niższe niż w próbkach surowicy przechowywanej w temperaturze -70 C. Utrata IL-12 w tych warunkach wynosiła 44,5% w stosunku do próbki odniesienia (ryc. 4). Dyskusja Oznaczanie stężenia cytokin w surowicy krwi jest aktualnie wykorzystywane nie tylko w celach badawczych, ale coraz częściej bywa wykonywane w celach diagnostycznych i terapeutycznych. Z tego względu zachodzi konieczność ustalenia optymalnych warunków przechowywania surowicy krwi jak również innych materiałów biologicznych tak, aby stężenie cytokin w badanym materiale nie uległo znaczącej zmianie nawet przez okres kilku miesięcy. Do tej pory dość dokładnie zbadano wpływ temperatury przechowywania próbek na stężenie IL-6, IL-10 oraz TNF-α. Z badań tych wynika, że różne cytokiny charakteryzują się różną stabilnością ściśle zależną od warunków przechowywania pobranego materiału. Kenis i wsp. [1] oraz Flower i wsp. [4] w niezależnych badaniach zaobserwowali, że IL-6 należy do cytokin stabilnych w różnych warunkach temperatury i jest niewrażliwa na naprzemienne cykle rozmrażania i zamrażania materiału biologicznego. IL-10 z kolei można zaliczyć do cytokin mało stabilnych i wrażliwych na następujące po sobie kilkukrotne rozmrażanie i zamrażanie [1]. W dostępnej literaturze brak jest jednak danych dotyczących wpływu przechowywania próbek materiału biologicznego na stężenie IL-12. Co może wynikać z faktu, iż cytokina ta jest jeszcze stosunkowo mało poznana, chociaż wykazano już silne właściwości przeciwnowotworowe IL-12 [6, 10]. Postuluje się również przydatność oznaczania stężenia tej cytokiny w przypadkach zatruć metalami ciężkimi [3]. Materiały informacyjne dołączone do zestawu testowego, którym wykonywano oznaczenia podają, że IL-12 nie należy do cytokin bardzo stabilnych. Jej stężenie nie ulega zmianie przy przechowywaniu zarówno w temperaturze -20 C, jak i 2-8 C przez 24 godziny. Jedynie w temperaturze 37 C dochodzić może do 20-procentowej utraty jej aktywności w badanych próbkach surowicy. Jest też umiarkowanie wrażliwa na wielokrotne rozmrażanie i zamrażanie. Dopiero po 312

5 K. Lis 3 cyklu zamrażania i rozmrażania obserwuje się utratę aktywności tej cytokiny w surowicy badanej [8]. Dane te dotyczą jednak dość krótkiego czasu przechowywania próbek surowicy. Oznaczanie stężenia cytokin testami ELISA niejednokrotnie wymaga długotrwałego gromadzenia materiału. Często czas zbierania próbek do badań znacznie przekracza 24 godziny i niejednokrotnie trwa wiele tygodni, a nawet miesięcy. Przeprowadzone w niniejszej pracy badania sugerują, że stężenie IL-12 w surowicy przechowywanej przez długi okres czasu jest w znacznym stopniu związane z temperaturą, w jakiej znajdowały się próbki. Jedynym sposobem zabezpieczenia przechowywanych długoterminowo próbek surowicy przed utratą aktywności IL-12 wydaje się głębokie ich zamrożenie w temperaturze -70 C bezpośrednio po pobraniu. Znamienny spadek stężenia tej cytokiny zaobserwowano zarówno w próbkach przechowywanych 2 tygodnie w temperaturze 2-8 C, jak i tych, które natychmiast po pobraniu zostały zamrożone w temperaturze -20 C i były w tych warunkach przechowywane przez cały czas trwania eksperymentu. Im wyższa była temperatura przechowywania próbek surowicy, tym niższe w nich było stężenie IL-12. Dodatkowo należy zwrócić uwagę, że stężenie białka całkowitego w tych samych próbkach nie zmieniło się znamiennie w ciągu czteromiesięcznego okresu przechowywania. Obserwowano natomiast zależny od temperatury przechowywania spadek stężenie IL-12 w surowicy w przeliczeniu na gram białka całkowitego. Jak wynika z cytowanych wcześniej danych [8] temperatura przechowywania materiału biologicznego w celu oznaczenia IL-12 nie odgrywa znaczącej roli w przypadku, gdy czas przechowywania nie przekracza 24 godzin. Gdy jednak istnieje konieczność dłuższego przechowywania pobranego materiału biologicznego, konieczne wydaje się zamrożenie próbek w temperaturze -70 C bezpośrednio po odwirowaniu wykrzepionych próbek krwi i przechowywanie ich w tych warunkach do czasu wykonania badania. Wnioski Długoterminowe przechowywanie surowicy w celu oznaczania stężenia IL-12 lub wymaga zamrożenia próbek badanych w temperaturze -70 C bezpośrednio po odwirowaniu wykrzepionej krwi i przechowywania ich w stanie głębokiego zamrożenia do czasu wykonania badania. 2. Gołąb J, Jakóbisiak M, Lasek W. Immunologia. PWN, Warszawa 2005, 96-97, Hemdan NY. The role of interleukin-12 in the heavy metal-elicited immunomodulation: relevance of various evaluation methods. J Occup Med Toxicol 2008; 3: Kenis G, Teunissen C, de Jongh R i wsp. Stability of IL-6, soluble IL-6 Receptor, IL-10 and CC16 in human serum. Cytokine 2002; 19: Kowalski ML. Immunologia kliniczna. MEDITON Oficyna Wydawnicza, Łódź 2000, 12-13, Kögler G, Radke TF, Lefort A i wsp. Cytokine production and hematopoiesis supporting activity of cord blood-derived unrestricted somatic stem cells. Exp Hematol 2005; 33: Malemud CJ. Cytokines as therapeutic targets for osteoarthritis. BioDrugs 2004; 18: Materiały informacyjne dołączone do zestawu testowego oznaczania Human IL-12 ELISA Kit firmy Bender MedSystems. 9. Opal SM, DePaolo VA. Anti-Inflammatory Cytokines. Chest 2000; 117: Nagarajan S, Selvaraj P. Glycolipid-anchored IL-12 expressed on tumor cell surface induces antitumor immune response. Cancer Res 2002; 62: Pützer BM, Rödicker F, Hitt MM i wsp. Improved treatment of pancreatic cancer by IL-12 and B7.1 costimulation: antitumor efficacy and immunoregulation in a nonimmunogenic tumor model. Mol Ther 2002; 5: Robak T. Biologia i farmakologia cytokin. PWN, Warszawa Sel S, Wegmann M, Sel S i wsp. Immunomodulatory effects of viral TLR ligands on experimental asthma depend on the additive effects of IL-12 and IL-10. J Immunol 2007; 178: van den Berg WB. The role of cytokines and growth factors in cartilage destruction in osteoarthritis and rheumathoid arthritis. Z Rheumatol 1999; 58: van den Berg WB. Joint inflammation and cartilage destruction may occur uncoupled. Springer Semin Immunopathol 1998; 20: Adres Autorów: Katedra i Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu ul. M. Skłodowskiej-Curie Bydgoszcz tel.: (052) faks: (052) kzlis@gazeta.pl (Praca wpłynęła do Redakcji: ) (Praca przekazana do opublikowania: ) Piśmiennictwo 1. Flower L, Ahuja RH, Humphries SE i wsp. Effects of sample handling on the stability of interleukin 6, tumor necrosis factor-α and leptin. Cytokine 2000; 12: