MECHANIZMY NAPRAWY USZKODZEŃ DNA

Transkrypt

1 MECHNIZMY NPRWY USZKODZEŃ DN Piotr Nowosad EFEKT KOŃCOWY Po zakończeniu seminarium powinieneś: zdefiniować pojęcia uszkodzenie DN i mutacja ; wymienić i opisać procesy naprawy uszkodzeń DN; określić rolę polimeraz, endonukleaz, egzonukleaz, ligaz i helikaz w mechanizmach naprawy uszkodzeń DN; wymienić zespoły chorobowe spowodowane niewłaściwie działającym mechanizmem naprawy uszkodzonego DN. Procesy, dzięki którym dochodzi do naprawy uszkodzeń zlokalizowanych na nici DN zachodzą przed replikacją DN, w czasie replikacji lub po replikacji. Uszkodzenia DN, czyli wszelkie zmiany związane z budową zasad azotowych lub strukturą przestrzenną DN są rozpoznawane przez enzymy naprawcze (reperacyjne), które w trakcie specyficznych procesów biochemicznych odtwarzają stan wyjściowy DN. W komórkach organizmów prokariotycznych i eukariotycznych występują setki Przypomnij wiadomości: pojęcie mutacji i czynnika mutagennego; podział czynników mutagennych. odrębnych genów i kodowanych przez nie enzymów naprawczych reperujących uszkodzenia DN. Ich aktywność prowadzi do utrzymania względnej stałości sekwencji nukleotydowych w cząsteczce DN (genomu), a poprzez to do utrzymania prawidłowego funkcjonowania komórek. Niepoprawione uszkodzenia DN (zmiany premutacyjne) po następnych cyklach replikacyjnych z reguły doprowadzają do utrwalenia błędu i powstawania mutacji. Natomiast zbyt wielka liczba mutacji w sekwencjach DN może doprowadzić do: niekontrolowanych podziałów komórkowych prowadzących do powstania nowotworu; apoptozy (samobójczej śmierci komórki); szybszego tempa starzenia się komórki; generowania dziedzicznych chorób genetycznych (propagacja mutacji następnym pokoleniom poprzez komórki generatywne zawierające zmutowany DN); śmierci komórki (lub organizmu). Mechanizmy naprawy uszkodzeń DN najlepiej poznano w badaniach nad Escherichia coli, dlatego omawiane w trakcie seminarium mechanizmy naprawy uszkodzeń DN dotyczą tego właśnie organizmu. Należy jednak pamiętać, że obecność wielu z tych procesów naprawczych wykazano również w komórkach eukariotycznych (w tym organizmu człowieka). eneralnie można wyróżnić pięć różnych mechanizmów naprawczych funkcjonujących w większości komórek: naprawa bezpośrednia; naprawa przez wycinanie (zasad azotowych/ nukleotydów); naprawa błędnie sparowanych nukleotydów; naprawa rekombinacyjna. Punkty kontrolne uszkodzenia DN Podczas przebiegu cyklu komórkowego, system komórkowy kontroluje uszkodzenia swojego genomu w tak zwanych punktach kontrolnych cyklu komórkowego. Punkty kontrolne wstrzymują replikację uszkodzonego genomu poprzez zatrzymanie cyklu komórkowego na stałe lub do czasu naprawy uszkodzeń DN; możliwe jest również skierowanie komórki na szlak apoptozy, czyli programowanej śmierci komórki.

2 Ważniejszym elementem warunkującym zatrzymanie cyklu komórkowego i apoptozę jest białko p53 supresor nowotworów ( strażnik genomu ). Defekt tego elementu powoduje, że komórki z uszkodzonym genomem mogą ominąć punkty kontrolne cyklu komórkowego i namnożyć się, prowadząc do generowania nowotworów. Innym białkiem związanym z punktem kontrolnym jest BRC1 i TM. Mutacje w genie BRC1 są związane z rakiem sutka, a mutacje genu TM wywołują autoimmunologiczną chorobę ataksja teleangiektazja. Bezpośrednia naprawa uszkodzeń DN W bezpośredniej naprawie uszkodzeń DN systemy naprawcze działają bezpośrednio na ujawnione uszkodzenie DN naprawiając je bez usuwania zasad azotowych bądź całych fragmentów nici DN. Z tego względu można je uznać za bardzo precyzyjne mechanizmy naprawcze. Należą do nich: 1. Naprawa pęknięć nici DN - reakcje ligazy DN, która katalizuje wytworzenie wiązania fosfodiestrowego, o ile po obu stronach pęknięcia nici DN występują nieuszkodzone grupy 5 -fosforanowa oraz 3 -hydroksylowa. Pęknięcia nici DN obserwowane są najczęściej, jako efekt ekspozycji na promieniowanie jonizujące. 2. Naprawa alkilowanych zasad azotowych reakcja alkilotransferazy, czyli enzymu, który posiada zdolność przenoszenia grupy alkilowej bezpośrednio z nukleotydu na swój łańcuch polipeptydowy. Reakcja ta w efekcie inaktywuje enzym powodując, że może on być użyty tylko raz. Przykładem jest enzym D wykryty w komórkach E. coli, który w odpowiedzi na występowanie w środowisku nawet małych stężeń czynnika alkilującego usuwa grupy alkilowe z tyminy i guaniny. Enzymy te także występują w komórkach ssaków w tym człowieka, jak np. enzym MMT (metylotransferaza O 6 - metyloguanino-dn). 3. Fotoreaktywacja - jest to proces enzymatyczny, w którym Przyłączenie fotoliazy uczestniczy fotoliaza DN. Enzym ten rozpoznaje region DN zawierający dimery (pirymidynowe) powstające na jednej nici DN na skutek ekspozycji na promieniowanie UV. Po przyłączeniu się do dimeru tworzy się kompleks dimer-fotoliaza. Odłączenie enzymu ktywacja enzymu zachodzi po absorbcji energii promieniowania widzialnego ( nm), po czym enzym hydrolizuje wiązania kowalencyjne między połączonymi zasadami w dimerze przy udziale flawoproteinowych chromoforów (np. FDH 2 ). W ten bsorbcja światła sposób następuje monomeryzacja dimeru na nukleotydy sekwencji wyjściowej DN. Fotoreaktywacja zachodzi w komórkach bakteryjnych oraz eukariotycznych; nie występuje w komórkach człowieka. Naprawa przez wycinanie Naprawa przez wycinanie jest systemem zasadniczo wolnym od błędów. Podstawą działania systemu jest obecność jednej, nieuszkodzonej nici DN, która służy jako matryca do odbudowy fragmentu nici DN zawierającej uszkodzenie. Można wyróżnić dwa główne procesy naprawcze: 1. Naprawę przez wycinanie zasady azotowej (BER, ang. base excision repair), kiedy zmodyfikowana zasada (uszkodzenie) jest rozpoznawana przez glikozydazę DN. Enzym odłącza zasadę przez hydrolizę wiązania N-glikozydowego między zasadą a cukrem. W ten sposób na nici DN powstaje miejsce apurynowe lub apirymidynowe (P).

3 Następnie endonukleaza P nacina nić DN i generowana jest luka przy aktywności egzonukleazowej. Powstała luka może mieć wielkość nawet jednego nukleotydu. W komórkach bakteryjnych luka jest niwelowana dzięki aktywności polimerazy Pol DN I, która syntetyzuje na matrycy nowy fragment nici DN. W organizmach eukariotycznych synteza nowego fragmentu jest możliwa dzięki aktywności polimerazy DN β. 2. Naprawę przez wycinanie nukleotydu (NER, ang. nucleotide excision repair), kiedy jest usuwany najczęściej dłuższy (w porównaniu z BER) fragment nici DN zawierający uszkodzony nukleotyd. Działanie NER umożliwia kompleks enzymatyczny określany, jako Rozpoznanie uszkodzenia Synteza nowego fragmentu (Pol I) kd i Nacięcie nici DN ktywność ligazy Usunięcie fragmentu z uszkodzeniem endonukleaza UvrBC. Początkowo do uszkodzenia na nici DN przyłącza się trimer enzymatyczny Uvr i UvrB. Po odłączeniu sie Uvr do kompleksu enzymatycznego przyłącza się UvrC tworząc dimer, który nacina nić DN po obu stronach uszkodzenia w ściśle określonych odległościach. Następnie fragment DN zawierający uszkodzenie jest usuwany przy pomocy helikazy DN i degradowany. Podobnie jak w BER powstała luka zostaje wypełniona zsyntetyzowanym na nowo fragmentem DN przy udziale polimerazy DN I. Synteza nowego odcinka DN przebiega od końca 5' do końca 3' na matrycy, którą stanowi nieuszkodzona nić DN. Ostatnim etapem tego procesu jest odtworzenie wiązania fosfodiestrowego między końcem 3' nowej nici DN a końcem 5' starej nici DN. Enzymem uczestniczącym w tym etapie jest ligaza DN I. W organizmach eukariotycznych synteza nowego fragmentu nici DN jest możliwa dzięki aktywności polimerazy DN δ lub ε. Należy pamiętać, że obecny w komórkach eukariotycznych system NER jest procesem bardziej skomplikowanym. Bierze w nim udział wiele specyficznych enzymów (przynajmniej 18). Ponadto proces ten dotyczy tylko dwuniciowego DN, ponieważ do odtworzenia prawidłowej sekwencji zasad konieczna jest nieuszkodzona komplementarna nić DN, która służy jako matryca. System NER usuwa nie tylko dimery pirymidynowe z nici DN, lecz również naprawia inne typy uszkodzeń. Proces ten prowadzi do bezbłędnego odtworzenia struktury DN i nie powoduje powstawania mutacji. Przykładem choroby autosomalnej recesywnej człowieka związanej z wadliwie działającym systemem NER jest Xeroderma pigmentosum (XP). Objawy choroby manifestują się skrajną wrażliwością na światło słoneczne i podwyższoną częstością występowania różnych odmian raka skóry, które związane są z uszkodzeniem siedmiu różnych genów kodujących enzymy naprawcze. W innej jednostce chorobowej zespół Cockayne a obserwuje się także wrażliwość osób na światło słoneczne, jednak bez predyspozycji do raka skóry.

4 Naprawa błędnie sparowanych nukleotydów Korekta błędów powstałych podczas replikacji odbywa się w procesie naprawy błędnie sparowanych zasad azotowych (MMR, ang. mismatch repair). Różnica w poziomie metylacji adeniny w sekwencji 5 -TC-3 (matylaza adeninowa DN - Dam) oraz cytozyny w sekwencji 5 -CC-3 i 5 -CCt-3 (metylaza cytozynowa DN - Dcm) wskazuje na nić matrycową DN zawierającą oryginalną sekwencję nukleotydów oraz na nowoutworzoną nić DN. Funkcjonowanie procesu zależy od aktywności kompleksu enzymatycznego: - białka MutH rozpoznają różnice w poziomie metylacji nici DN; - białka MutS wykrywają brak komplementarności pomiędzy nukleotydami dwóch nici DN; - rola białek MutL nie jest dokładnie poznana (możliwość koordynacji MutH i MutS). System MMR rozpoznaje i wycina niewłaściwie sparowaną zasadę. Powstające w ten sposób luki na nici DN są uzupełniane przez polimerazę DN I oraz ligazę DN. Zaburzenia funkcjonowania MMR prowadzą do utrwalania błędów replikacji. Efektem zaburzeń w komórkach człowieka systemu MMR są takie jednostki chorobowe jak, dziedziczny niepolipowaty rak okrężnicy i prawdopodobnie rak piersi (mutacje w genach MSH2, MSH3, MSH4, MSH6, MLH1, MLH3, PMS1 i MUTYH). TC CT rupa metylowa H TC CT H TC CT Przyłączenie MutH i MutS S MutH nacina nić DN S Usunięcie nici: egzonukleaza + helikaza DN II CT ktywność polimerazy DN I + ligazy DN TC CT T Metylacja nici DN TC CT T Naprawa dwuniciowych przerw w DN Uszkodzenia obserwowane na obu niciach (DSBs, ang. double strand breaks), z uwagi na nieodwracalność zmian są szczególnie niebezpieczne dla komórki. Można wyróżnić dwa odrębne mechanizmy naprawy takich uszkodzeń: łączenie niehomologicznych zakończeń (NHEJ, ang. nonhomologous end-joining) oraz naprawa rekombinacyjna (znana również jako rekombinacja homologiczna).

5 1. Łączenie niehomologicznych zakończeń pęknięcia dwuniciowe powstają w efekcie aktywności wielu czynników mutagennych (fizycznych i chemicznych), lecz także jako rezultat kontrolowanych przez komórkę rearanżacji genomowych (geny immunoglobulin, receptorów limfocytów T). W procesie NHEJ bierze udział kompleks enzymatyczny, w skład którego wchodzi enzym Ku, posiadający zdolność wiązania się z dwoma końcami DN po obu stronach pęknięcia. Naprawa NHEJ jest możliwa przy udziale kinazy, czynnika XRCC4 oraz ligazy DN IV. 2. Naprawa rekombinacyjna polega na przywróceniu prawidłowego zapisu genetycznego dzięki wymianie (rekombinacji) między dwoma siostrzanymi łańcuchami DN z dwóch homologicznych chromosomów. Kompleks enzymatyczny systemu naprawy rekombinacyjnej wymaga obecności identycznej lub prawie identycznej sekwencji matrycowej, która może być użyta jako wzór do naprawy uszkodzenia. Proces ten może prowadzić do powstawania mutacji. Wyniki doświadczeń nad E. coli sugerują, że rekombinacja, która zachodzi w tym procesie, zależy od ekspresji wielu genów. Przykładowo, enzymatyczny produkt genu rec bierze udział w procesie rozpoznawania i rekombinowania obszarów homologicznych dwóch cząsteczek DN. Zatem obecność rec + albo rec - w szczepach E. coli wpływa na to, czy szczepy te będą posiadać zdolność do rekombinacji a tym samym, czy będą bardziej lub mniej wrażliwe na działanie czynnika mutagennego (np. promieniowanie UV). System naprawy SOS W latach 70. wykryto w komórkach E. coli dodatkowy proces naprawy DN, który nazwano systemem naprawy SOS. Uważa się, że system ten jest odpowiedzią komórki na liczne uszkodzenia DN zagrażające jej życiu (stąd nazwa procesu SOS Save Our Souls ). W systemie naprawczym SOS bierze udział wiele genów, spośród których istotna jest funkcja dwóch: lex oraz rec. Enzymy kodowane przez lex i rec kontrolują działanie całego systemu naprawy SOS poprzez: represję genów naprawczych (w tym genu rec i lex) - enzym Lex, proteolityczną degradację represora Lex - enzym Rec. W stanie nieindukowanym Lex przyłącza się do regionów operatorowych genów naprawczych (w tym do własnego genu lex) hamując ich transkrypcję. Dzięki represji własnego genu stężenie Lex w komórce jest małe i nie wystarcza do całkowitego wstrzymania transkrypcji blokowanych genów, a zatem w stanie nieindukowanym enzymy naprawcze obecne są stale w komórce w stężeniach wystarczających do naprawy (w procesach fotoreaktywacji, NER, MMR itp.) spontanicznie powstałych uszkodzeń DN. Replikacja DN, która nastąpiła po zadziałaniu mutagenu, pozostawia na nowo zsyntetyzowanych niciach DN luki poreplikacyjne, które mogą być sygnałem aktywującym system naprawczy SOS. Rec, enzym o właściwościach naprawczych i rekombinacyjnych, zmienia swoje właściwości na proteolityczne degradując cząsteczki Lex, a tym samym powoduje derepresję genów naprawczych. Inaktywacja represora Lex pozwala zwiększyć częstość transkrypcji blokowanych genów, a tym samym zwiększyć w komórce dostępne ilości enzymów naprawczych, jako odpowiedź na liczne uszkodzenia DN spowodowane ekspozycją na czynnik mutagenny. Z chwilą, kiedy nastąpi usunięcie uszkodzeń z DN zanika sygnał indukujący system naprawy, spada poziom proteazy Rec oraz wzrasta poziom represora Lex. Tym samym zostaje przywrócony stan represji genów naprawczych i powrót systemu do stanu nieaktywnego.

6 Wadliwe działanie systemów naprawczych DN a zespoły chorobowe Obniżona zdolność do naprawy uszkodzonego DN jest powodem wystąpienia takich zespołów chorobowych, jak: xeroderma pigmentosum: nadwrażliwość na światło słoneczne, objawiająca się zwiększoną częstością występowania nowotworów skóry i przedwczesnym starzeniem się; zespół Cockayne'a: nadwrażliwość na UV i związki chemiczne; trichotiodystrofia: wrażliwa skóra, łamliwe włosy i paznokcie; zespół Wernera: przedwczesne starzenie i niskorosłość; zespół Blooma: nadwrażliwość na światło słoneczne, zwiększona zachorowalność na nowotwory (zwłaszcza białaczki); ataksja teleangiektazja: nadwrażliwość na promieniowanie jonizujące i niektóre związki chemiczne; niedokrwistość Fanconiego: nadwrażliwość na mutagenne działanie czynników alkilujących (np. mitomycynę C) w obecności promieniowania jonizującego; dziedziczny rak sutka; dziedziczny rak jelita grubego; niewłaściwie funkcjonujący w komórkach nerwowych system naprawy uszkodzeń DN może powodować stany zwyrodnieniowe mózgu w chorobach lzheimera i Huntingtona. Zalecane piśmiennictwo: 1. Bal J. Biologia molekularna w medycynie. Elementy genetyki klinicznej. Wyd. Naukowe PWN, Brown T. enomy. Wyd. Naukowe PWN, Drewa., Ferenc T. Podstawy genetyki dla studentów i lekarzy. Urban & Partner, Passarge E. enetyka. Ilustrowany przewodnik. PZWL, Turner P.C., McLennan.., Bates.D., White M.R.H. Biologia molekularna. Krótkie wykłady. Wyd. Naukowe PWN, Węgleński P. enetyka molekularna. Wyd. Naukowe PWN, Winter P.C., Hickey.I, Fletcher H.L. enetyka. Krótkie wykłady. Wyd. Naukowe PWN, 2008.