UNIWERSYTET PRZYRODNICZY W LUBLINIE, BUP

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: (51) Int.Cl. C08B 37/08 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (54) Sposób otrzymywania chitozanu (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 21/09 (73) Uprawniony z patentu: UNIWERSYTET PRZYRODNICZY W LUBLINIE, Lublin, PL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 06/15 (72) Twórca(y) wynalazku: JANUSZ KALBARCZYK, Lublin, PL WIOLETTA ŻUKIEWICZ-KOC, Biskupice, PL

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania chitozanu z grzybów wyższych, przeznaczonego zwłaszcza na środki dla ludzi. Chitozan jako pochodna chityny jest polimerem, który ze względu na swoją bioaktywność, nietoksyczność i biodegradalność znajduje coraz szersze zastosowanie między innymi w medycynie, weterynarii, kosmetyce, jako środek wspomagający odchudzanie, w ochronie roślin, ochronie środowiska, czy szeroko pojętej biotechnologii. Powszechnie znana jest metoda otrzymywania chitozanu ze skorupiaków. Podstawową wadą tej metody jest konieczność sprowadzania skorupiaków z zagranicy, przy jednoczesnej niepewności ich dostaw. Znana jest również metoda otrzymywania chitozanu polegająca na wydzieleniu go ze ścian komórkowych grzybów strzępkowych należących do Zygomycetes (szczepy Mucom, Absidia, Rhizopus, Gongronella). Grzyby te hoduje się w specjalnych reaktorach w kierunku zwiększenia zawartości biopolimeru w ścianach komórkowych grzybów poprzez dodanie odpowiednich enzymów odpowiedzialnych za tworzenie chitozanu. Następnie, z otrzymanej biomasy wydziela się chitozan za pomocą alkalicznej separacji frakcji nierozpuszczalnej w zasadach, a potem za pomocą kwasu ekstrahuje się z niej czysty chitozan. Z kolei z rosyjskiego opisu patentowego nr RU znany jest sposób otrzymywania chitozanu z grzybów Basidiomycetes. W jednym z zawartych tam przykładów owocniki grzyba Ganoderma lucidum suszy się i miele, po czym zalewa się 10% roztworem NaOH o temperaturze pokojowej i stale miesza się przez 1,5 godziny. Następnie tak otrzymaną zawiesinę odsącza się, pięciokrotnie przemywa wodą i zalewa na 15 minut alkoholem propylenowym, po czym ponownie odsącza się i przez dalsze 15 minut podaje działaniu acetonu, odsącza się i suszy. Dalej osuszony materiał przemywa się wodnym roztworem zawierającym między innymi siarczan żelaza, po czym przez godzinę traktuje się z 1% roztworem KOH o temperaturze 40 C, przemywa wodą i suszy się. Uzyskany produkt zawiera 95% chitynowych włókien oraz 5% magnetytu. W innych przykładach ilość niepożądanych substancji dochodzi do 60%, a są wśród nich substancje zawierające nikiel i kobalt. Celem tego wynalazku jest w zasadzie pobieranie metali ciężkich z zanieczyszczonego środowiska a nie otrzymywanie chitozanu jako takiego. Jeżeli chitozan otrzymany tym sposobem miałby być przeznaczony do produkcji środków dla ludzi, to będzie konieczne usunięcie niepożądanych substancji, zwłaszcza że są one toksyczne i zabarwiają chitozan. Odrębną kwestią jest, czy w ogóle z biomasy zawierającej metale ciężkie da się otrzymać chitozan nadający się do stosowania u ludzi. Istota sposobu otrzymywania chitozanu z grzybów wyższych, w którym wysuszone grzyby miele się, usuwa się związki białkowe poprzez działanie wodorotlenkiem, przemywa wodą, po czym uzyskany osad kolejno traktuje się rozpuszczalnikami organicznymi, stale mieszając i ewentualnie płucząc wodą lub/i susząc po każdym etapie, polega na tym, że zmielone grzyby traktuje się gorącym etanolem, po czym oddziela się osad, na który następnie działa się wodorotlenkiem, płucze wodą, traktuje się etanolem, po czym działa się roztworem kwasu nieorganicznego, a następnie przemywa się acetonem i tak otrzymany produkt suszy się, a korzystnie liofilizuje się. Zmielone grzyby korzystnie traktuje się 80% etanolem o temperaturze 80 C przez jedną godzinę jednocześnie mieszając. Natomiast mieszaninę osadu i wodorotlenku podgrzewa się do temperatury 60 C i utrzymuje się przez trzy godziny, przy czym wodorotlenek stanowi 4% roztwór wodny NaOH. Z kolei na osad działa się roztworem kwasu nieorganicznego przez dwie godziny w temperaturze 25 C, przy czym roztwór kwasu nieorganicznego to 10% roztwór kwasu solnego. Po zakończeniu każdej operacji osad oddziela się od fazy ciekłej za pośrednictwem wirówki lub prasy filtracyjnej. Surowe grzyby przed wysuszeniem korzystnie chłodzi się lub/i inaktywuje się zawarte w nich enzymy, po czym grzyby suszy się i rozdrabnia, przy czym inaktywację enzymów przeprowadza się poprzez zalanie zmielonych grzybów 3% roztworem NaCl z dodatkiem 1% kwasu cytrynowego, zaś tak uzyskaną mieszaninę podgrzewa się do 100 C. Grzyb stanowi korzystnie jeden lub kilka grzybów wybranych spośród Armillariella mella, Agaricus blazei, Agaricus bisporus, Lyophyllum ulmarium, Grifola frondosa, Ganoderma lucidum, Polyporus squmosus, Pleurotus plumonarius, Pleurotus cornucopiae, Flammulina velutipes, Pleutotus citrinopileatus, Lentinula edodes, Coprinus comatus, Hypholoma sublaterituum, Hypsizigus ulmarius, Pholoiota nameko, Pleurotus osteratus, Psilucybe cyanescens, Stropharia rugosoanulata, Volvariella volvacea.

3 PL B1 3 Grzyby korzystnie pochodzą z hodowli, przy czym hodowlę prowadzi się na podłożu stałym albo na pożywkach w fermentorze. W szczególnie korzystnym przypadku hodowlę prowadzi się w kierunku zwiększenia zawartości chityny w grzybach. Wysuszone grzyby stanowią owocniki zebrane korzystnie w pełni dojrzałości fizjologicznej. Sposób według wynalazku pozwala na otrzymanie bezpiecznego dla ludzi chitozanu z szeroko dostępnego w kraju, zarówno w naturze jak i z hodowli, materiału biologicznego. Chitozan według wynalazku nadaje się do stosowania w nanotechnologii. Wchłania szybciej i więcej wody niż chitozan ze skorupiaków, dzięki czemu jest łatwiejszy w wykorzystaniu. Natomiast zastosowanie chitozanu grzybowego do klarowania soków całkowicie pozbawia je zawartości alkoholu. Dodatkową zaletą tej metody jest też fakt, że polisacharydy usunięte w takcie procesu nadają się do wykorzystania w innych procesach biotechnologicznych. Sposób według wynalazku przedstawiony jest w przykładach wykonania. P r z y k ł a d I Owocniki grzyba Lentinula edodes zbiera się w pełni dojrzałości fizjologicznej, kroi się na plastry, po czym ewentualnie chłodzi się w temperaturze 1 C do 2 C przez czas niezbędny dla zebrania pełnego wsadu. Następnie odsącza się płyn a kawałki owocników suszy się w temperaturze 50 C przez 12 godzin. Wysuszone owocniki rozdrabnia się do postaci proszku o średnim wymiarze cząsteczki równym 0.12 mm, tj. co najmniej 45% drobin w proszku powinna posiadać taki wymiar. Następnie sproszkowany materiał biologiczny, w celu usunięcia frakcji polisacharydowej, zalewa się 80% etanolem, podgrzewa do temperatury 80 C, utrzymuje przez 1 godzinę ciągle mieszając. Z otrzymanej zawiesiny oddziela się osad poprzez odwirowanie przy 6000 obrotów/min przez 30 minut. Z kolei w celu usunięcia związków białkowych otrzymany osad zalewa się 4% NaOH, podgrzewa do 60 C i utrzymuje w tych warunkach przez 3 godziny. Ponownie na drodze wirowania oddziela się ciecz, zaś osad poddaje się dalszej obróbce poprzez płukanie wodą destylowaną 5 razy po 25 minut. Otrzymany osad zawiera chitozaminę, którą zalewa się 40% alkoholem etylowym i pozostawia na 15 minut przy ciągłym mieszaniu zawiesiny. Po upływie 15 minut alkohol oddziela się przy użyciu prasy. Otrzymane wytłoki, w celu demineralizacji, zalewamy 10% HCL, podgrzewa się do temp. 25 C i przez 2 godziny stale mieszając zawiesinę utrzymuje się podaną temperaturę procesu. Po upływie tego czasu mieszaninę odsącza się na prasie a część stałą przeznacza się do dalszej obróbki. Kolejny etap ma na celu odbarwianie i dekoloryzację przyszłego chitozanu. Do osadu dodaje się aceton o stężeniu 4% a uzyskaną zawiesinę utrzymuje się przez dwie godziny przy ciągłym mieszaniu, po czym odsącza się rozpuszczalnik. Powstały w ten sposób osad suszy się do wilgotności 7,7%, metodą liofilizacji, przy zachowaniu następujących parametrów: temperatura mrożenia -60 C, temperatura lodu na zamrażalniku -75 C, temperatura półki liofilizatora +35 C. Otrzymany liofilizat pozostawiamy w postaci włókien albo rozdrabniamy na młynku do postaci proszku. Ze 100 gramów świeżych grzybów uzyskano 9 gramów chitozanu. Otrzymany chitozan posiada parametry określone w Tabeli nr 1. P r z y k ł a d II Świeże owocniki grzybów Agaricus blazei suszy się w temperaturze 60 C i miele. Dalsze postępowanie przebiega zgodnie z technologią podaną w Przykładzie I. Otrzymany chitozan pozostawiono w postaci włókien. P r z y k ł a d III Owocniki grzyba Pleurotus ostreatus zbiera się w pełni dojrzałości fizjologicznej, kroi się na plastry, po czym chłodzi w temperaturze 1 C do 2 C. Po zebraniu pełnego wsadu, ze względu na długi okres przechowywania, inaktywuje się enzymy po czym przeprowadza się ekstrakcję substancji aktywnych biologicznie. W tym celu pokrojone owocniki zalewa się 3% roztworem NaCl z dodatkiem kwasu cytrynowego w stężeniu 1%. Uzyskaną mieszaninę podgrzewa się do 100 C, miesza sie i pozostawia na 15 minut. Następnie odsącza się osad, suszy się w temperaturze 60 C i miele. Dalsze postępowanie przebiega zgodnie z technologią podaną w Przykładzie I, przy czym mieszaninę w trakcie demineralizacji podgrzewa się do 30 C. P r z y k ł a d p o r ó w n a w c z y I Parametry chitozanu otrzymanego w Przykładzie I porównano z parametrami chitozanu ze skorupiaków i zestawiono w Tabeli 1.

4 4 PL B1 T a b e l a 1 Chitozan wg Przykładu I Ze skorupiaków Gęstość usypna [kg/m 3 ] Gęstość utrzęsiona [kg/m 3 ] Kąt zsypu [ ] Kąt usupu [ ] Wilgotność [%] Średni wymiar cząsteczki d g [mm] Rehydratacja ml/100 g 237,44 292, ,54 0, ,36 9,26 0, Badania wykazały, że chitozan według wynalazku posiada dwie istotnie lepsze cechy od cech chitozanu ze skorupiaków. Po pierwsze można uzyskać cząsteczki o wymiarze, który pozwala z jednej strony na zastosowanie chitozanu grzybowego w nanotechnologii, zaś z drugiej strony znacznie zwiększyła się jego powierzchnia aktywna, co podnosi walory chitozanu jako nośnika substancji czynnych w ogóle. Są to cechy istotne dla produkcji leków, a zwłaszcza leków, które mają przekraczać barierę krew-mózg. Chitozan ze skorupiaków nie nadawał się do zastosowania w nanotechnologii. Drugą istotną cechą jest znacznie wyższa zdolność do rehydratacji co ma dodatni wpływ na szybkość procesów wykorzystujących chitozan. Preparaty oparte na chitozanie grzybowym, nadają się szybciej do użycia i są wydajniejsze niż oparte na chitozanie ze skorupiaków. P r z y k ł a d p o r ó w n a w c z y II Porównano parametry klarowanego soku jabłkowego za pomocą chitozanu grzybowego, z Przykładu II oraz chitozanu ze skorupiaków. Wyniki zestawiono w Tabeli 2. Porównanie to wykazało między innymi, że klarowanie soku za pomocą chitozanu grzybowego przyczynia się do całkowitego usunięcia alkoholu z soku, co jest istotne przy produkcji soków dla dzieci i osób chorych. T a b e l a 2. Wyniki analiz chemicznych zagęszczonego soku jabłkowego bezpośrednio po dodaniu chitozanu Wyszczególnienie analiz (cechy jakościowe) Ekstrakt aerometryczny Ekstrakt refraktometryczny Zagęszczony sok jabłkowy, nieklarowany (próba kontrolna) Zagęszczony sok jabłkowy z dodatkiem chitozanu w ilości 0,6 g/200 ml (średnia z trzech powtórzeń) Ze skorupiaków 73,2% wag. 73,2% wag. 73,2% wag. 70,1% 70,52% 71,36% Kwasowość ogólna 3,70% m/m 2,44% m/m 3,53% m/m Kwasowość lotna 0,12 g/kg 0,129 g/kg 0,017 g/kg Pochodzenia grzybowego, Przykład II Alkohol 0,2% v/v 0,1% v/v nie stwierdza się Przepuszczalność 94,6% T 88,5% T 81,2% T NTU 4,2 10,0 17,5 Barwa 0,223 0,413 0,400 Gęstość 1, , ,36742 Pektyny i skrobia nie stwierdza się nie stwierdza się nie stwierdza się Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób otrzymywania chitozanu z grzybów wyższych, w którym wysuszone grzyby miele się, usuwa się związki białkowe poprzez działanie wodorotlenkiem, przemywa wodą, po czym uzyskany osad kolejno traktuje się rozpuszczalnikami organicznymi, stale mieszając i ewentualnie płucząc wodą

5 PL B1 5 lub/i susząc po każdym etapie, znamienny tym, że zmielone grzyby traktuje się gorącym etanolem, po czym oddziela się osad, na który następnie działa się wodorotlenkiem, płucze wodą, traktuje się etanolem, po czym działa się roztworem kwasu nieorganicznego, a następnie przemywa się acetonem i tak otrzymany produkt suszy się. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zmielone grzyby traktuje się 80% etanolem o temperaturze 80 C przez jedną godzinę jednocześnie mieszając. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mieszaninę osadu i wodorotlenku podgrzewa się do temperatury 60 C i utrzymuje się przez trzy godziny, przy czym wodorotlenek stanowi 4% roztwór wodny NaOH. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że na osad działa się roztworem kwasu nieorganicznego przez dwie godziny w temperaturze 25 C, przy czym roztwór kwasu nieorganicznego to 10% roztwór kwasu solnego. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że osad, po zakończeniu każdej operacji oddziela się od fazy ciekłej za pośrednictwem wirówki lub prasy filtracyjnej. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że produkt poddaje się liofilizacji. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że surowe grzyby przed wysuszeniem chłodzi się lub/i inaktywuje się zawarte w nich enzymy, po czym grzyby suszy się i rozdrabnia. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że enzymy inaktywuje się poprzez zalanie zmielonych grzybów 3% roztworem NaCl z dodatkiem 1% kwasu cytrynowego i tak uzyskaną mieszaninę podgrzewa się do 100 C. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że grzyb stanowi jeden lub kilka grzybów wybranych spośród Armillariella mella, Agaricus blazei, Agaricus bisporus, Lyophyllum ulmarium, Grifola frondosa, Ganoderma lucidum, Polyporus squmosus, Pleurotus plumonarius, Pleurotus cornucopiae, Flammulina velutipes, Pleutotus citrinopileatus, Lentinula edodes, Coprinus comatus, Hypholoma sublaterituum, Hypsizigus ulmarius, Pholoiota nameko, Pleurotus osteratus, Psilucybe cyanescens, Stropharia rugosoanulata, Volvariella volvacea. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że grzyby pochodzą z hodowli. 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że hodowlę prowadzi się na podłożu stałym. 12. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że hodowlę prowadzi się na pożywkach w fermentorze. 13. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że hodowlę prowadzi się w kierunku zwiększenia zawartości chityny w grzybach. 14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wysuszone grzyby stanowią owocniki zebrane w pełni dojrzałości fizjologicznej.

6 6 PL B1 Departament Wydawnictw UPRP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)