Recenzja pracy doktorskiej mgr Eweliny W. Lipiec pt. Research into radiation damage in single cells using molecular spectroscopic techniques

Transkrypt

1 Prof. dr hab. inż. Marek Lankosz Wydział Fizyki i Informatyki Stosowanej Akademia Górniczo-Hutnicza w Krakowie Recenzja pracy doktorskiej mgr Eweliny W. Lipiec pt. Research into radiation damage in single cells using molecular spectroscopic techniques Wpływ promieniowania jonizującego na komórki żywych organizmów jest celem badań naukowych w licznych ośrodkach naukowych na całym świecie. Wynikiem oddziaływania promieniowania jonizującego na żywą materię na poziomie pojedynczych komórek i molekuł są efekty makroskopowe obejmujące cały organizm. Wpływ niskich dawek promieniowania na żywe organizmy jest niezwykle ważny w celu lepszego poznania i zrozumienia, w jaki sposób promieniowania jonizujące oddziałuje z pojedynczymi komórkami oraz tkankami zarówno w radioterapii jak również w przypadkach narażenia na promieniowanie np. w czasie badań diagnostycznych. Aktualny stan wiedzy na temat tych procesów jest ciągle niekompletny i wymaga dalszych badań. Skłoniło to autorkę rozprawy do podjęcia się realizacji ambitnych badań, których celem było poznanie i pogłębienie wiedzy o zjawiskach fizykochemicznych występujących w pojedynczych komórkach w wyniku naświetlania wysokoenergetycznymi protonami oraz promieniowaniem UV. W recenzowanej pracy do badania uszkodzeń radiacyjnych pojedynczych komórek oraz uszkodzenia obu nici DNA, w efekcie, których oba łańcuchy nukleotydowe w podwójnej helisie zostają zerwane, autorka wykorzystała nowoczesne metody badawcze takie jak synchrotronowa mikrospektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera (SR-FTIR), mikrospektroskopia Ramana oraz powierzchniowo wzmocniona spektroskopia Ramana (SERS). Do badania struktur molekularnych podwójnych nici łańcuchów nukleotydowych opracowała i zastosowała nowatorską metodę rozproszenia Ramana wzmocnionego na ostrzu sondy skanującej (TERS). Interpretację swoich wyników badań oparła na nowoczesnych metodach statystycznych a mianowicie analizie głównych składowych (PCA) oraz nienadzorowanej hierarchicznej analizie skupień (UHCA). Licząca 149 stron praca ma typowy układ dysertacji doktorskiej, przy czym zasadniczy tekst podzielony jest na cztery rozdziały. Tekst ten poprzedzony jest wstępem. Do pracy dołączono wnioski końcowe, spis literatury, listę tytułów tabel oraz rysunków.

2 W pierwszym rozdziale swojej rozprawy autorka opisała fizyczne, chemiczne i biologiczne zjawiska związane z oddziaływaniem promieniowania jonizującego tzn. ciężkich cząstek naładowanych oraz elektronów o energiach na poziomie MeV, jak również promieniowania jonizującego nie wprost tzn. promieniowania X, gamma oraz promieniowania ultrafioletowego z materią. Omówiła zmiany, jakie występują w żywej tkance na poziomie molekularnym pod wpływem promieniowania jonizującego oraz biologicznymi skutkami oddziaływania tego promieniowania na komórki. Następnie, przedstawiła oparty o literaturę przegląd metod fizycznych stosowanych do nieniszczącego badania uszkodzeń radiacyjnych w materiałach pochodzenia biologicznego. Szczególną uwagę zwróciła na metody oparte na spektroskopii wibracyjnej. Ponadto, przedstawiła i omówiła metody zastosowane do statystycznej oceny uzyskanych wyników badań w tym metodę klastrów i metodę analizy głównych składowych. Niezbyt korzystnym jest brak przedstawienia celów pracy po wstępie teoretycznym. Cele pracy oraz wnioski częściowe są natomiast prezentowane w rozdziałach II-IV, w których doktorantka przedstawiła część eksperymentalną swojej pracy doktorskiej. Kolejne rozdziały pracy stanowią właściwe wprowadzenie w przedmiot rozprawy. W tej części pracy, autorka przedstawiła wyniki badań istotnych dla radiobiologii makromolekuł wchodzących w skład kwasu nukleinowego oraz nukleotydów. W badaniach wykorzystała mikrospktroskopię ramanowską oraz mikrospektroskopię w podczerwieni. Badała uszkodzenia radiacyjne w DNA, nukleotydach oraz adenozynie po naświetlaniach protonami o energii 2 MeV. Ważnym osiągnięciem tego etapu badań było wykazanie, że zmiany w zarejestrowanych widmach ramanowskich są związane ze zmianami konformacyjnymi DNA, pęknięciami nici DNA i są markerami specyficznych zmian pojedynczego nukleotydu. Ponadto, wyniki tego etapu badań stanowiły bazę umożliwiającą wykrywanie uszkodzeń radiacyjnych na poziomie pojedynczych komórek. W rozdziale III została przedstawiona nowatorska w skali światowej metoda obrazowania i charakteryzacji w nanoskali struktury molekularnej najbardziej niebezpiecznych form uszkodzeń DNA a mianowicie uszkodzeń obu nici w izolowanym plazmidowym DNA, z wykorzystaniem synergii metod TERS oraz AFM. Ta część przeprowadzonych badań pozwoliła autorce na stwierdzenie, że wiązanie węglowotlenowe w strukturze DNA jest najbardziej czułe na ekspozycję na promieniowanie UVC. Obecność pasm wynikających z drgań zginających grup funkcyjnych P-O-H i CH 2 oraz drgań wachlarzowych grup CH 2 i CH 3 umożliwiło autorce pracy na postawienie hipotezy, że fragmenty pękniętych nici są zakończone wodorem w miejscu uszkodzenia (chodzi o zamianę grupy OH na H na cząsteczce deoksyrybozy), co wskazuje na powstanie uszkodzeń (przerw) 2

3 w wyniku reakcji indukowanych wolnymi rodnikami. Opracowana metoda umożliwia zarówno obrazowanie jak również analizę molekularną DNA i wykrywanie oraz badanie niebezpiecznych uszkodzeń radiacyjnych. W rozdział czwartym zostały przedstawione badania uszkodzeń w pojedynczych komórkach w wyniku naświetlania protonami, naprawy uszkodzeń po radiacyjnych w pojedynczych komórkach oraz badania tzw. efektu sąsiedztwa indukowanego w czasie ekspozycji na promieniowanie protonowe. Ponadto, badano uszkodzenia w komórkach w wyniku ich ekspozycji na promieniowanie UV. W pomiarach stosowano mikrospektroskopię Ramana oraz SR-FTIR. Do interpretacji uzyskanych pomiarów zastosowana została metoda PCA. Badania te w istotny sposób pogłębiły wiedzę na temat oddziaływań promieniowania jonizującego na żywe komórki. Recenzowaną pracę kończy sześć niezwykle obszernych wniosków dotyczących głównych celów pracy, czyli wykorzystania metod spektroskopii molekularnej do badania uszkodzeń radiacyjnych na poziomie pojedynczych komórek. W pracy autorka zacytowała 214 pozycji literatury naukowej, w tym cztery prace, których jest współautorką. Świadczy to o tym, że wyniki badań autorki rozprawy znalazły uznanie w międzynarodowym środowisku naukowym. Przechodząc do oceny pracy trzeba przede wszystkim zgodzić się z wnioskami autorki, że postawione cele badań zostały osiągnięte. Przedstawiona do recenzji praca stanowi istotny krok w badaniach nad uszkodzeniami radiacyjnymi w pojedynczych komórkach indukowanych różnego rodzaju promieniowaniem jonizującym. Autorka rozprawy zasługuje przede wszystkim na uznanie z racji opanowania warsztatu pomiarowego dla potrzeb wykorzystania różnorodnych metod spektroskopii molekularnej w celu realizacji swoich ambitnych badań. Pracę można uznać za napisaną w sposób poprawny pod względem stylistycznym i językowym. Autor niniejszej recenzji zauważył tylko cztery błędy drukarskie (str. 35 rester zamiast raster, str. 78 uisng zamiast using, str. 81 błędna numeracja podrozdziału Data processing, str. 111 Fig którego brak w tekście pracy). Niestety praca została zredagowana w sposób wysoce niestaranny. Liczne rysunki zamieszczone w pracy maja opisy wykonane czcionkami o zbyt małych rozmiarach, co utrudnia ich oglądanie, a rysunki przedstawione na stronach: 68, 72, 85, 119, 121 są całkowicie nieczytelne. W spisie literatury w wielu miejscach brak jest odstępu pomiędzy kolejnymi pozycjami literatury to niezwykle utrudnia zapoznanie się z licznymi wymienionymi w spisie pozycjami. Brak jest konsystencji w przedstawianiu widm 3

4 zarejestrowanego promieniowania. Na większości wykresów podano wartości liczb falowych dla istotnych pasm wykorzystanych do identyfikacji grup funkcyjnych lub różnicujących badane próbki, ale w pracy znajdują się również liczne wykresy gdzie te wartości zostały pominięte, co niezwykle utrudnia czytelnikowi zapoznanie się z uzyskanymi wynikami pomiarów. W wielu miejscach literowe symbole wielkości fizycznych napisane zostały drukiem prostym, co jest niezgodnie z obowiązującymi normami (druk pochyły). Tekst pracy został napisany w sposób chaotyczny a wiele jej fragmentów jest powtarzanych. Zastrzeżenia budzi niekompletny sposób opisu procedur przygotowania niektórych próbek do pomiarów oraz brak istotnych informacji utrudniających czytelnikowi ocenę przeprowadzenia PCA. Poniżej przedstawiono ważniejsze uwagi krytyczne dotyczące ocenianej pracy. W przypadku stosowania metody analizy głównych składowych autorka nie podaje, jaką liczbę zmiennych (kanałów) użyła do analizy, ile widm analizowała w każdym z badanych przypadków oraz jakie wielkości fizyczne z widm były wykorzystane jako dane wejściowe. Czy dokonano selekcji zmiennych wejściowych bądź redukcji ich liczby? Czy widma były centrowane lub normalizowane przed dokonaniem analizy? Jakie kryteria zastosowano do wyznaczenia liczby głównych składowych wykorzystanych do interpretacji pomiarów? Czy ładunki czynnikowe były poddane rotacji? Wymaga to wyjaśnienia przez doktorantkę. Do indukowania uszkodzeń DNA stosowano lampę UVC. Deponowana energia w naświetlanej próbce wyniosła 85kJ/m 2. Jak ta wartość została wyznaczona? Jak wyglądało widmo tego promieniowania? W przypadku promieniowania UVA i UVB takie widma zostały zaprezentowane w pracy. W jaki sposób zostały wyznaczone? W jaki sposób wyznaczono gęstość mocy przy naświetlaniach próbek? Do naświetlania próbek DNA, nukleotydów oraz adenozyny protonami w Krakowie stosowano wiązkę protonową o średnicy około 20 mikrometrów. W naświetlaniach pojedynczych komórek raka prostaty na tym samym akceleratorze wiązka miała średnicę około 16 mikrometrów. Czy w obu przypadkach zmierzono średnicę wiązki protonowej? Czy wyznaczono profil poprzeczny mikrowiązki? Ma to znaczenie w przypadku naświetlań pojedynczych komórek. Na rysunku 4.4 str. 80 widać, że średnice komórek raka prostaty mają rozmiary około 10 mikrometrów lub nawet mniej. W przypadku ich naświetleń wiązka protonów miała średnicę znacznie większą niż rozmiar komórek. Z tego wynika, że liczba protonów, które rzeczywiście naświetlały każdą komórkę była znacznie niższa od zmierzonej detektorem ( ). Ponadto, należy sądzić, że poszczególne struktury komórek były naświetlane w różnym stopniu. Wymaga to wyjaśnienia ze strony autorki rozprawy. 4

5 Podsumowując należy stwierdzić, że podjęta przez autorkę tematyka badań jest bardzo ważna z punktu widzenia naukowego oraz ma duże znaczenie praktyczne. Przeprowadzone badania świadczą o dużych umiejętnościach doktorantki. Reasumują, pragnę stwierdzić, że przedstawiona praca pt. Research into radiation damage in single cells using molecular spectroscopic techniques spełnia wszystkie ustawowe i zwyczajowe wymogi stawiane pracom doktorskim i może być dopuszczona do publicznej obrony w celu uzyskania stopnia naukowego doktora nauk fizycznych. Kraków, Marek Lankosz 5