Rola czynnika transkrypcyjnego Grainyhead-like 1 w rozwoju nowotworów skóry typu kolczystokomórkowego

Transkrypt

1 Mgr Michał Mlącki Dziedzina: nauki biologiczne Dyscyplina: biologia Wszczęcie: r. Temat: Rola czynnika transkrypcyjnego Grainyhead-like 1 w rozwoju nowotworów skóry typu kolczystokomórkowego Promotor: dr hab. Tomasz Wilanowski Recenzenci: dr hab. Jarosław Czyż, dr hab. Jarosław Jóźwiak

2 Michał Mlącki Rola czynnika transkrypcyjnego Grainyhead-like 1 w rozwoju nowotworów skóry typu kolczystokomórkowego Praca doktorska wykonana w Pracowni Biologii Komórki Instytutu Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN PROMOTOR: dr hab. Tomasz Wilanowski Streszczenie Białka podobne do Grainyhead (ang. Grainyhead-like, GRHL) to stara ewolucyjnie rodzina tkankowo-specyficznych czynników transkrypcyjnych. U większości organizmów, u których przeprowadzono analizę znaczenia tych białek, pełnią one waŝne funkcje w rozwoju, prawidłowym funkcjonowaniu i naprawie powłok ciała organizmów chitynowej ściany komórkowej grzybów, pancerza owadów, oskórka nicieni, czy skóry kręgowców (Pare i wsp., 2012). U ssaków zidentyfikowano trzy homologiczne czynniki z tej rodziny GRHL1, GRHL2 i GRHL3 (Auden i wsp., 2006). Wysoki poziom tych białek obserwuje się głównie w tkance nabłonkowej, w szczególności w naskórku. Badania pokazały, Ŝe kaŝdy z tych homologów pełni inne funkcje i moŝe regulować ekspresję innych genów docelowych (Auden i wsp., 2006; Boglev i wsp., 2011). Na przykład, GRHL1, ale nie GRHL3, reguluje ekspresję genu kodującego desmogleinę 1 (DSG1). Glikoproteina ta wchodzi w skład połączeń międzykomórkowych desmosomów w warstwach ponadpodstawnych naskórka (Boglev i wsp., 2011). Wiele doniesień literaturowych opisuje związki czynników z rodziny GRHL z procesem powstawania nowotworów, interpretacja tych wyników jest jednak niejednoznaczna. Wydaje się, Ŝe w zaleŝności od kontekstu tkankowego funkcje pełnione przez poszczególne czynniki GRHL mogą sprzyjać powstawaniu nowotworów lub hamować ten proces (Darido i wsp., 2011; Fabian i wsp., 2014; Kang i wsp., 2009; Tanaka i wsp., 2008). Do tej pory znaczenie GRHL1 badano w mechanizmach

3 powstawania nerwiaka płodowego, w których pełni on funkcję supresora nowotworów (Fabian i wsp., 2014). Natomiast rola tego czynnika transkrypcyjnego w procesie powstawania nowotworów skóry (organu, w którym obserwuje się najwyŝszy poziom tego białka) nie została nigdy zbadana. Celem przedstawionych w niniejszej rozprawie doktorskiej badań było sprawdzenie, jaki wpływ ma wyłączenie genu Grhl1 na proces powstawania nowotworów skóry typu kolczystokomórkowego w modelu mysim oraz próba wyjaśnienia obserwowanego fenotypu. W opisanych badaniach zostały wykorzystane myszy o tle genetycznym szczepu C57BL/6 (Black 6) z wyłączonym genem Grhl1 (zwierzęta Grhl1 -/- ). Wiek jest jednym z najwaŝniejszych czynników ryzyka przy zachorowaniu na choroby nowotworowe, dlatego w pierwszej kolejności analizowano podatność myszy Grhl1 -/- na spontaniczne rozwijanie się nowotworów. W tym celu grupy zwierząt Grhl1 -/- oraz kontrolnych obserwowano do wieku starczego. Nie odnotowano jednak Ŝadnych róŝnic w aktywności i zachowaniu zwierząt o róŝnych genotypach, które mogłyby sugerować chorobę nowotworową. Podczas przeprowadzonych po doświadczeniu sekcji zwierząt nie zaobserwowano guzów nowotworowych. Sugeruje to, Ŝe brak GRHL1 jest niewystarczający do spontanicznej inicjacji rozwoju nowotworów. Przeprowadzono więc doświadczenie, podczas którego nowotwory skóry wywoływano przy pomocy związków chemicznych (metoda DMBA/TPA). U myszy Grhl1 -/- zaobserwowano mniej łagodnych brodawek w stosunku do zwierząt kontrolnych, ale proces transformacji tych zmian do nowotworów skóry typu kolczystokomórkowego był znacznie przyspieszony. Na podstawie powyŝszych obserwacji moŝna przypuszczać, Ŝe białko GRHL1 ma właściwości supresorowe w kontekście tego typu nowotworów. W celu zbadania mechanizmów odpowiedzialnych za powstawanie zaobserwowanego fenotypu myszy Grhl1 -/- przeprowadzono mikroskopową analizę naskórka tych zwierząt. Zaobserwowano, Ŝe u myszy Grhl1 -/- jest on grubszy od naskórka zwierząt kontrolnych, co moŝe być oznaką nieprawidłowości w róŝnicowaniu keratynocytów. Ponadto, w warstwie podstawnej naskórka myszy Grhl1 -/- stwierdzono większą liczbę proliferujących komórek niŝ w naskórku zwierząt o genotypie dzikim. Wynik ten jest o tyle ciekawy, Ŝe w naturalnych warunkach u myszy kontrolnych Grhl1 +/+ w keratynocytach warstwy podstawnej nie dochodzi do ekspresji genu Grhl1. Jego wyłączenie w skórze zwierząt Grhl1 -/- powinno zatem wpłynąć na funkcjonowanie tych

4 komórek obserwowana zmiana w liczbie proliferujących keratynocytów jest więc zjawiskiem niebezpośrednio związanym z brakiem GRHL1. Analiza obecności odpowiednich markerów pokazała, Ŝe w warstwach ponadpodstawnych występują komórki charakteryzujące się obecnością markerów warstwy podstawnej. Zwiększeniu uległa równieŝ liczba warstw kolczystych. MoŜna było jednak wykryć keratynocyty warstwy ziarnistej oraz warstwę zrogowaciałą, świadczące o tym, Ŝe proces róŝnicowania końcowego keratynocytów przebiega do końca. U myszy Grhl1 -/- moŝna zaobserwować nieprawidłowości w róŝnicowaniu keratynocytów, świadczące o opóźnieniu tego procesu, co jest zgodne z faktem, Ŝe zmniejszony jest poziom DSG1, uznawanej za jeden z podstawowych regulatorów róŝnicowania końcowego keratynocytów (Harmon i wsp., 2013). Zaburzenia róŝnicowania komórek są jednym z czynników predysponujących do powstawania nowotworów. U myszy z wyłączonym genem Grhl1 (zwierzęta o genotypie Grhl1 -/- ) moŝna zaobserwować nieprawidłowości w strukturze naskórka, jednak bariera skórna jest nadal nieprzepuszczalna dla wody (Wilanowski i wsp., 2008). Badania wielu zespołów naukowych pokazały, Ŝe nawet niewielkie nieprawidłowości w funkcjonowaniu bariery skórnej mogą prowadzić do rozwinięcia się stanu zapalnego skóry (Demehri i wsp., 2009). Analiza markerów zaburzonej bariery naskórka udowodniła, Ŝe u myszy Grhl1 -/- rozwija się stan zapalny skóry. Zaobserwowano zwiększenie poziomu cytokiny TSLP w krwi myszy Grhl1 -/-, a pomiary ekspresji genów w keratynocytach naskórka pokazały podwyŝszony poziom mrna kodujących białka antybakteryjne S100A8, S100A9 oraz cytokinę IL1α. Analiza wyników mikromacierzy ekspresyjnej, przeprowadzonej na materiale z całej skóry (naskórek oraz skóra właściwa) dowiodła, Ŝe u zwierząt Grhl1 -/- następuje zwiększenie poziomu ekspresji wielu genów związanych ze stanem zapalnym. Ponadto barwienie błękitem toluidyny pokazało, Ŝe w skórze myszy Grhl1 -/- znajduje się zwiększona liczba komórek tucznych, w porównaniu z myszami kontrolnymi o genotypie Grhl1 +/+. Wyniki te pozwalają stwierdzić, Ŝe w skórze myszy Grhl1 -/- rozwija się przewlekły stan zapalny. Podsumowując, opisane w niniejszej rozprawie wyniki badań pokazują nieprawidłowości w strukturze warstw ponadpodstawnych naskórka. Prawdopodobne jest, Ŝe keratynocyty myszy Grhl1 -/- są poddane stresowi wynikającemu ze zmian

5 w adhezji komórek. Brak GRHL1 skutkuje zmniejszonym poziomem DSG1 w naskórku tych myszy, a desmosomy przyjmują konformację podobną do występującej w zranionych fragmentach skóry (Wilanowski i wsp., 2008). To z kolei prowadzi do wydzielania przez te komórki sygnałów alarmowych powodujących zwiększenie liczby komórek dzielących się w warstwie podstawnej, jak równieŝ cytokin i chemokin, inicjujących rozwinięcie się przewlekłego stanu zapalnego skóry. Takie mikrośrodowisko tkanki moŝe sprzyjać progresji łagodnych brodawek do nowotworów skóry typu kolczystokomórkowego. JednakŜe na obecnym etapie badań nie moŝna wykluczyć innych mechanizmów, które równieŝ mogą wpływać na obserwowany fenotyp myszy Grhl1 -/-.

6 Summary The family of Grainyhead-like (GRHL) proteins is an evolutionarily ancient and conserved group of tissue-specific transcription factors. In most organisms, in which they have been analyzed, they perform important functions in development, maintenance and repair of epidermal barriers the fungal chitin cell wall, the cuticle of insects and nematodes, or skin of vertebrates (Pare et al., 2012). In mammals, three homologous factors from this family have been identified GRHL1, GRHL2 and GRHL3 (Auden et al., 2006). High levels of these proteins are observed in epithelial tissues, in particular in the epidermis. Studies showed that each of these homologs may perform different function, and can regulate the expression of different target genes (Auden et al., 2006; Boglev et al., 2011). For example, GRHL1, but not GRHL3, regulates the expression of a gene encoding desmoglein 1 (DSG1), a protein component of intercellular junctions desmosomes in the suprabasal layers of the epidermis (Boglev et al., 2011). There are many reports describing links between GRHL factors and the process of tumor formation. However, the interpretation of these results is ambiguous. It appears that, depending on the tissue context, they can perform tumor suppressing or tumor promoting functions (Darido et al. and 2011, Fabian et al., 2014, Kang et al., 2009, Tanaka et al. 2008). So far GRHL1 has been shown to be a tumor suppressor in neuroblastoma (Fabian et al., 2014). The role of this transcription factor in the formation of tumors of the skin (organ, which has the highest level of Grhl1 expression) was never investigated. The aim of research presented in this PhD thesis is to examine the consequences of deletion of Grhl1 gene on the development of squamous skin tumors in a mouse model, and to explain the observed phenotype. In these studies, experiments were performed on mice with complete deletion of the Grhl1 gene (Grhl1 -/- genotype). Age is one of the most important risk factors for the onset of cancer, therefore at first we analyzed the susceptibility of Grhl1 -/- mice to develop spontaneous tumors in old age. For this purpose, groups of Grhl1 -/- animals and wild-type littermate controls were observed until 30 weeks of age. There was no difference in the activity or behavior

7 of animals with different genotypes, which could indicate cancer. The necropsies (conducted after the experiment) did not reveal any tumors either. This suggests that lack of GRHL1 is not sufficient for the initiation of tumor development. Therefore we employed a carcinogenesis protocol, in which skin cancer was induced by chemical compounds (DMBA/TPA method). In this experiment the Grhl1 -/- mice developed fewer benign skin lesions (papillomas), but their rate of conversion to squamous cell carcinomas was increased. This suggests that GRHL1 is a tumor suppressor in the context of this type of cancer. In order to investigate the mechanisms responsible for the observed phenotype of Grhl1 -/- mice we performed microscopic analysis of the skin of these animals. It was observed that in Grhl1 -/- mice the epidermis is thicker than in control animals, which may be a sign of abnormal differentiation of keratinocytes. Moreover, the basal layer of the epidermis of Grhl1 -/- mice showed higher number of proliferating cells than in their wild type littermates. This result is especially interesting because normally in Grhl1 +/+ mice GRHL1 is absent from basal keratinocytes. Therefore observed change in proliferation is an indirect result of loss of GRHL1. Also, the analysis revealed the presence of keratinocytes expressing basal cell markers in suprabasal layers of the epidermis. In addition, epidermis of Grhl1 -/- mice has increased numbers of squamous layers. However, we could detect the granular layer, indicating that keratinocyte differentiation is completed. These abnormalities in the differentiation of keratinocytes indicate a delay in this process. It is in accord with the decreased levels of DSG1, which is considered to be one of the key regulators of keratinocyte differentiation (Harmon et al., 2013). Differentiation impairment is one of the factors that predispose to cancer formation. In Grhl1-knockout mice the epidermal structural defects can be observed, but the skin barrier is still impermeable for water (Wilanowski et al., 2008). The investigations carried out by many research teams have shown that even minor irregularities in the functioning of skin barrier may lead to the development of inflammation of the skin (Demehri et al., 2009). Examination of markers of impaired epidermal barrier demonstrated that there is an increase in blood levels of TSLP cytokine in the Grhl1 -/- mice. Moreover the analysis of gene expression in epidermal keratinocytes showed elevated levels of mrna encoding the antimicrobial proteins S100A8, S100A9, and

8 cytokine IL1α in the epidermis of these mice. Microarray analysis, performed on the whole skin (epidermis and dermis) has shown that in the Grhl1 -/- animals there is an increase in the level of expression of many genes associated with inflammation. In addition, staining with toluidine blue demonstrated that in the skin of Grhl1 -/- mice there is an increased number of mast cells, as compared to control wild type littermates. These results allow us to conclude that Grhl1 -/- mice develop chronic inflammation of the skin. In conclusion, analyses revealed abnormalities in the structure of suprabasal layers of the epidermis. It is likely that keratinocytes in the epidermis of Grhl1 -/- mice are subjected to stress associated with changes in cell adhesion, because due to the decreased levels of DSG1 desmosomes in these mice assume conformation similar to that found in the wounded areas of the skin (Wilanowski et al., 2008). This in turn leads to the secretion of alarm signals and to the increase in the number of dividing cells in the basal layer of the epidermis, as well as increased levels of cytokines and chemokines. This initiates the development of chronic inflammation of the skin. Such tissue microenvironment may promote the progression of benign papillomas to skin squamous cell carcinomas. However, at the present stage we cannot yet rule out other mechanisms that may also contribute towards the observed phenotype of Grhl1 -/- mice.