OCENA. pod kierunkiem Promotor dr hab. Barbary Kot, prof. nadzw. oraz Promotora pomocniczego dr inż. Piotra Szwedy.

Transkrypt

1 dr hab. Marcin Weiner, prof. nadzw. Dziekan Wydziału Nauk o Zdrowiu i Nauk Społecznych Państwowa Szkoła Wyższa im Papieża Jana Pawła II w Białej Podlaskiej OCENA rozprawy doktorskiej mgr Anety Frankowskiej-Maciejewskiej pt. Molekularna i fenotypowa charakterystyka szczepów Staphylococcus aureus wyizolowanych od krów z zapaleniem gruczołu mlekowego przygotowanej w Zakładzie Mikrobiologii Insytutu Biologii Wydziału Przyrodniczego Uniwersytetu Przyrodniczo-Humanistycznego w Siedlcach pod kierunkiem Promotor dr hab. Barbary Kot, prof. nadzw. oraz Promotora pomocniczego dr inż. Piotra Szwedy. Praca dotyczy ważnego i aktualnego, szczególnie w obecnej dobie znacznej intensyfikacji produkcji zwierzęcej, aspektu molekularnej i fenotypowej charakterystyki szczepów Staphylococcus aureus wyizolowanych od krów z zapaleniem gruczołu mlekowego. Zapalenie gruczołu mlekowego (mastitis) jest najczęstszą i jednocześnie najbardziej kosztowną chorobą krów mlecznych. Z jednej strony ogranicza opłacalność hodowli, z drugiej zaś wpływa negatywnie na jakość i cenę żywności pochodzenia zwierzęcego. Straty ekonomiczne dotyczą głównie samych hodowców jak i przemysłu mleczarskiego. Ci pierwsi tracą na skutek obniżenia wydajności mlecznej krów, niższej ceny surowca wynikającej z pogorszenia się wskaźników jakościowych, eliminacji zwierząt z hodowli oraz kosztów samego rozpoznania czynnika chorobotwórczego i prób, często nieudanych, jego eliminacji. Straty przemysłu mleczarskiego wynikają z trudności w produkcji produktu żywnościowego o satysfakcjonującej dla konsumenta jakości, a także konieczności stosowania pracochłonnych i droższych technologii w celu sterylizacji mleka a także wskutek przeznaczania na kazeinę lub paszę mleka, zawierającego 1

2 pozostałości substancji leczniczych, przed upływem okresu karencji. Należy w tym miejscu wspomnieć o niewątpliwych stratach społecznych, które są efektem spożywania mleka o niższej wartości biologicznej niż spodziewana i wskazana. Z zakażeniem gruczołu mlekowego ma bezpośredni związek obecność w mleku bakterii, odpowiedzialnych za choroby ludzi, które noszą nazwę milk-borne diseases. Wymienić tu należy szczepy Staphylococcus aureus, shigatoksyczne Escherichia coli, Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni czy Pseudomonas aeruginosa. Należy mieć także na uwadze problem uczuleń występujących coraz częściej u ludzi, na antybiotyki stosowane w leczeniu mastitis, narastającą oporność bakterii na stosowane antybiotyki i coraz większą trudność z doborem właściwego antybiotyku do leczenia infekcji u ludzi. Stany zapalne gruczołu mlekowego mają zróżnicowaną patogenezę, przebieg kliniczny, objawy i w różnym stopniu, tj. trwale lub czasowo, prowadzą do dysfunkcji tego narządu. W zależności od czynnika etiologicznego zapalenia oraz stanu immunologicznego zwierzęcia, reakcja zapalna w obrębie gruczołu mlekowego może mieć przebieg gwałtowny lub bardzo gwałtowny, z silnie wyrażonymi objawami klinicznymi lub bardzo wolny, z niewielkim naciekiem komórek zapalnych do mleka. Wśród zapaleń wyróżnia się postacie kliniczne (mastitis clinica) i podkliniczne (mastitis subclinica). O postaciach klinicznych mówi się, gdy przy pomocy metod klinicznych, możliwe jest stwierdzenie zmian w obrębie samego gruczołu (zaczerwienienie, bolesność, obrzęk, guzki) lub w samym mleku (zmiana konsystencji, barwy, zapachu, obecność domieszek). Największym problemem, ze względów higienicznych jak i ekonomicznych, są podkliniczne zapalenia gruczołu mlekowego ze względu na długotrwały przebieg bez zewnętrznych oznak choroby. Mastitis subclinica cechuje się wszystkimi patofizjologicznymi cechami zapalenia, jednakże ich natężenie nie daje widocznych objawów klinicznych i do ich diagnostyki potrzebne są dodatkowe testy terenowe i laboratoryjne. Rozpoznanie opiera się na ocenie poziomu komórek somatycznych w mleku i obecności czynnika zakaźnego, wywołującego stan zapalny. W przypadku gdy liczba komórek somatycznych przekracza /ml, można podejrzewać zapalenie podkliniczne. Szacuje się, że od 20-70% krów każdego dnia dotkniętych jest zapaleniami podklinicznymi. Do samowyleczenia dochodzi jedynie w 10-20% przypadków. Uważa się, że podkliniczne stany zapalne gruczołu mlekowego odpowiadają za 70% ogółu strat 2

3 ekonomicznych będących następstwem mastitis. Zapalenie podkliniczne występuje razy częściej niż kliniczne, często trwa kilka- kilkanaście miesięcy, jest bardzo trudne do rozpoznania i antybiotykoterapii, ujemnie wpływa na jakość mleka i może stanowić źródło infekcji dla innych krów w stadzie. Za najczęstszą przyczynę mastitis subclinica uważa się gronkowce: Staphylococcus aureus i CNS a także niektóre paciorkowce: Stretococcus uberis i S. agalactiae. Zdolność gronkowców do wywoływania infekcji wiąże się z obecnością i ekspresją wielu czynników wirulencji takich jak adhezyny, enzymy zewnątrzkomórkowe, toksyny cytolityczne, pirogenne i eksfoliatywne (łącznie ponad 20), zdolność tworzenia biofilmu i transformacji do form SCV lub L. Na drodze ewolucyjnej gronkowce wykształciły też szereg mechanizmów oporności na antybiotyki, które mogą być przenoszone pomiędzy różnymi gatunkami gronkowców na drodze koniugacji, transformacji i transdukcji. To wszystko sprawia, że zakażenia gronkowcowe stanowią poważne wyzwanie dla lekarzy weterynarii opiekujących się stadami bydła mlecznego, a skuteczność antybiotykoterapii wynosi jedynie 15-25%. Z tego względu, przedstawiona do recenzji praca doktorska Pani mgr Anety Frankowskiej Maciejewskiej stanowi trudne i ambitne wyzwanie, bowiem dotyczy zarówno najtrudniejszych w diagnostyce podklinicznych zapaleń gruczołu mlekowego, jak również obejmuje Staphylococcus aureus, sprawiający największy problem w terapii mastitis. Oceniana praca doktorska ma klasyczny układ (przygotowano ją jako maszynopis książki zgodnie z wytycznymi ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki, art. 13 pkt. 2), zawiera 138 stron tekstu, w tym tytuł pracy w języku angielskim wraz ze 5 słowami kluczowymi w języku polskim i angielskim, spis treści (3 strony), dwustronnicowy wstęp wyłączony z numeracji rozdziałów, przegląd piśmiennictwa (28 stron), cel pracy, materiał i metody (16 stron), wyniki (26 stron), dyskusja (20 stron), po których następują wnioski i stwierdzenia, streszczenia w języku polskim i angielskim oraz piśmiennictwo, liczące 401 ponumerowanych i ułożonych w kolejności alfabetycznej pozycji (33 strony). Dokumentacja graficzna wyników badań przedstawiona została w postaci 19 tabel i 24 rycin, zamieszczonych bezpośrednio w tekście pracy. 3

4 Tytuł przedstawionej do oceny dysertacji doktorskiej odzwierciedla zasadniczy cel zaplanowanych badań, którego kilkupunktowe rozwinięcie obejmuje sprecyzowane zadania badawcze, które pozwoliły na jego realizację. Krótki wstęp pracy wprowadza w kwestie zagadnień takich jak definicja mastitis, znaczenie czynników etiologicznych zapaleń gruczołu mlekowego oraz znaczenie Staphylococcus aureus w wywoływaniu mastitis. Rozwinięcie wstępu stanowi obszerny przegląd piśmiennictwa, w którym Doktorantka dokonała charakterystyki S. aureus, przedstawiła choroby wywoływane przez ten drobnoustrój u ludzi i zwierząt oraz scharakteryzowała czynniki zjadliwości, dokonując ich funkcjonalnego podziału na białka adhezyjne, biofilm, enzymy zewnątrzkomórkowe, toksyny cytolityczne, eksfolitaywne i pirogenne, wytwarzanie form SCV i L. Następnie Doktorantka omówiła mechanizmy oporności na antybiotyki. Przegląd piśmiennictwa zamyka podrozdział pt. Zapalenie gruczołu mlekowego jako problem zdrowotny zwierząt hodowlanych. Część doświadczalna rozprawy doktorskiej rozpoczyna się od sformułowania 5 celów, powiązanych z przedstawionymi w części ogólnej czynnikami zjadliwości oraz opornością na antybiotyki. Celem badań Doktorantki była ocena występowania ważnych w patogenezie mastitis czynników chorobotwórczości S. aureus, ocena potencjalnej zjadliwości poprzez identyfikację genów kodujących adhezyny, proteazy i toksyny wraz z ustaleniem genotypów wirulencji. Kolejne cele stanowiły ocena wrażliwości na antybiotyki, ocena innych niż powyższe czynników aktywności przeciwbakteryjnej oraz określenie zróżnicowania genetycznego S. aureus pochodzących ze stad hodowlanych w Polsce północno-wschodniej. W tym celu Doktorantka poddała badaniom 123 szczepy S. aureus wyizolowane z próbek mleka pobranego od krów z gospodarstw położonych w okolicach Łomży. Przynależność do gatunku S. aureus potwierdzona została w oparciu o morfologię komórek, zdolność wytwarzania katalazy oraz reakcję amplifikacji fragmentu genu nuc, kodującego termostabilną nukleazę, występującego u S. aureus. Zdolność tworzenia biofilmu przez szczepy S. aureus na powierzchni polistyrenowej Doktoranta oceniała, stosując płytki titracyjne a badanie wrażliwości szczepów na antybiotyki przeprowadziła metodą dyfuzyjno-krążkową. Obecność genów kodujących wybrane czynniki wirulencji (geny kodujące proteazy, adhezyny, 4

5 toksyny, białka uczestniczące w tworzeniu biofilmu) oraz geny kodujące mechanizmy oporności S. aureus na antybiotyki β-laktamowe, Doktorantka wykrywała stosując technikę PCR. Dokonała przy tym również oceny aktywności przeciwdrobnoustrojowej lizostafiny, nizyny oraz polimyksyny B ustalając wartości MIC dla szczepów S. aureus, wykazujących oporność na co najmniej jeden badany antybiotyk. Typowanie molekularne szczepów S. aureus zostało przeprowadzone przez Doktorantkę w oparciu o analizę polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych amplifikowanego fragmentu genu coa (PCR/RFLP). Wszystkie oceniane szczepy S. aureus wytwarzały proteazy oraz powodowały hemolizę typu β. Większość szczepów wytwarzała fosfolipazy, natomiast ponad połowa szczepów S. aureus wytwarzała hialuronidazę. W grupie 123 szczepów S. aureus 61,8% tworzyło biofilm na powierzchni polistyrenowej. Doktorantka w swojej pracy stwierdziła, że nie wszystkie szczepy, u których wykryto geny operonu ica, kodujące białka związane z tworzeniem biofilmu, wytwarzały biofilm na powierzchni polistyrenowej. Wśród genów kodujących białka umożliwiające przyleganie S. aureus do macierzy zewnątrzkomórkowej, najczęściej Doktorantka identyfikowała gen eno (91,9%), kodujący białko wiążące lamininę oraz gen fib (82,9%), kodujący białko wiążące fibrynogen. Geny fnba i fnbb kodujące adhezyny wiążące fibronektynę były obecne u 64,5% szczepów. Analiza klastrowa genów kodujących adhezyny wykazała, że geny fib, eno i fnbb należały do grupy genów często identyfikowanych w ocenianej populacji szczepów S. aureus, w odróżnieniu od genów cna, bbp, fnba i ebps, które należały do grupy genów rzadko identyfikowanych. Najczęściej identyfikowaną grupą genów kodujących proteazy były geny kodujące proteazy serynowe, natomiast geny kodujące toksyny eksfoliatywne występowały rzadko. Geny kodujące enterotoksyny zidentyfikowano u 35,8% szczepów S. aureus. Geny sei (21,1%), sem (19,5%), sen (19,5%), seg (18,7%) i seo (13,8%) występowały częściej niż inne geny kodujące enterotoksyny. W grupie ocenianych szczepów największą oporność zaobserwowała Doktorantka w przypadku antybiotyków β-laktamowych z grupy penicylin. Większość szczepów wykazujących oporność na tę grupę antybiotyków miało gen blaz. Dwa szczepy S. aureus były wielooporne, z których jeden wykazywał oporność na 5

6 antybiotyki należące do aminoglikozydów, linkozamidów oraz makrolidów, natomiast drugi był dodatkowo oporny na penicylinę. Szczepy S. aureus były wrażliwe na działanie lizostafiny, gdyż uzyskane wartości MIC w stosunku do badanych szczepów mieściły się w zakresie 0,008-0,5 µg/ml. Ponad połowa szczepów S. aureus była wrażliwa na nizynę, a uzyskane wartości MIC zawierały się w zakresie 12,8-25,6 µg/ml. Na podkreślenie zasługuje ilość oznaczeń, jakie wykonała Doktorantka. Analizując 123 szczepy S. aureus Doktorantka musiała poświęcić wiele czasu i pracy by oznaczyć miedzy innymi: 6 proteaz, 7 adhezyn, 17 toksyn, 3 geny kodujące markery biofilmowe czy dwa geny oporności. Pani mgr Aneta Frankowska- Maciejewska doskonale opanowała zarówno techniki klasycznej bakteriologii, metod molekularnych, oznaczanie antybiotykooporności oraz ocenę pokrewieństwa filogenetycznego pomiędzy badanymi szczepami. Wyniki badań własnych Doktoranta porównała z wynikami uzyskanymi zarówno w Polsce jak i na świecie w obszernej, liczącej 20 stron dyskusji. Na podstawie uzyskanych rezultatów Doktorantka przedstawiła 6 wniosków i stwierdzeń, będących konsekwencją postawionych sobie celów i wykonanych badań. Z obowiązku Recenzenta należy jednak zwrócić uwagę na pewne niedociągnięcia i uchybienia, których nie ustrzegła się Autorka w trakcie przygotowania dysertacji doktorskiej, w większości jednak są one natury stylistycznokorektorskiej, których korekta pozwoli na ostateczne przygotowanie pracy do druku. Przede wszystkim w przedstawionej do oceny dysertacji brakuje uzasadnienia podjęcia tematu przez Doktorantkę. Autorka niezwykle wnikliwie opisuje szereg mechanizmów patogenności gronkowców, jednakże w kwestii podklinicznych zapaleń gruczołu mlekowego ich praktycznego znaczenia wypowiada się w jednym zdaniu dopiero w rozdziale 1.5, kończącym przegląd piśmiennictwa. W opinii Recenzenta, przedstawiając globalny problem mastitów w rozdziale 1.1. i 1.2., choroby wywoływane przez gronkowce u ludzi i zwierząt w rozdziale i , w tym miejscu należałoby opisać cechy zapaleń podklinicznych, a dopiero potem przejść do omawiania czynników zjadliwości. Z drugiej strony Doktorantka poświęciła dwa podrozdziały i wytwarzaniu przez gronkowce form SCV i L, jednakże ani w badaniach ani w dyskusji nie powraca do tego tematu. Niepotrzebny wydaje się również zawarty na stronie 35 fragment dotyczący wspólnego pochodzenia szczepów pochodzących od bydła i ludzi. 6

7 Recenzent pragnie zwrócić również uwagę, że pomimo, iż piśmiennictwo przedstawionej do recenzji dysertacji liczy 401 pozycji, a praca została ukończona w czerwcu 2016 roku, jedynie jedno cytowanie pochodzi z roku 2015 i dotyczy ono bakterii gram ujemnych, trzy cytowania pochodzą z roku 2014 i trzy z W punkcie 2 Wniosków i Stwierdzeń Doktorantka stwierdziła że zdolność tworzenia biofilmu przez szczepy S. aureus pochodzące z przypadków podklinicznego zapalenia gruczołu mlekowego nie była związana z obecnością genów operonu ica. W opinii Recenzenta bardziej trafne byłoby sformułowanie: Pomimo obecności u wszystkich badanych szczepów genu ica, nie wszystkie szczepy S. aureus pochodzące z przypadków podklinicznego zapalenia gruczołu mlekowego cechowała fenotypowa zdolność tworzenia biofilmu. Nie mogę również zgodzić się z Wnioskiem nr 6 że Niskie wartości MIC lizostatyny i nizyny w stosunku do badanych S. aureus mogą być brane pod uwagę jako ALTERNATYWNE czynniki przeciwgronkowcowe w terapii mastitis u krów. Uzyskane wyniki, bardzo obiecujące, jednakże wymagające dalszych badań, przede wszystkim klinicznych, nie mogą zastąpić stosowanych klasycznych terapii antybiotykowych, tylko je wspomagać. Z tego względu słowo alternatywne proponuję zastąpić słowem wspomagające. Drobne uwagi redakcyjne przedstawiam poniżej: 1. Strona tytułowa pracy powinna pozostać nienumerowana, podobnie jak strona tytułowa w języku angielskim wraz ze słowami kluczowymi. 2. W przypadku numerowania rozdziałów po powinien wystąpić punkt 3.5.2, podobnie jak po powinien wystąpić W punkcie Doktorantka używa zamiennie określeń: zespół wstrząsu toksycznego, zespół szoku toksycznego, syndrom wstrząsu toksycznego proponuję ujednolicić nazewnictwo i przyjąć jednakową formę w całej pracy. 4. Punkt ma inny tytuł w spisie treści niż tytuł tego samego rozdziału w samym tekście pracy. 5. W samym wstępie występuje 39 podwójnych spacji, w dyskusji jest ich 44, należy je skorygować w ostatecznej wersji opracowania. 6. Niewłaściwe jest sformułowanie zawarte na stronie 22 niewłaściwe przechowywanie żywności ( ) w temperaturze od 4 do 60 stopni. 7

8 W temperaturze 60 stopni żywność nie jest przechowywana, co najwyżej utrwalana (wędzenie). 7. Na stronie 34 zamieszczono informację, ze straty ekonomiczne w USA wynoszą 2 mld dolarów, natomiast na stronie 79 na skutek błędnego zapewne tłumaczenia podano, ze wynoszą 2 biliony dolarów. 8. W materiałach i metodach brakuje informacji dotyczącej liczby zbadanych szczepów. Takowa informacja pojawia się dopiero w wynikach. 9. Na stronie 41 Doktorantka mierzyła absorbancję przy długości fali 595 nm, natomiast na stronie 55, w wynikach podaje długość fali 550 nm. 10. W punkcie 3.9 dotyczącym analizy statystycznej Doktorantka zamieściła tylko lakoniczną informację o wykonanej analizie z zastosowaniem programu Statistica 12. Należy zwrócić uwagę, że nazwana przez Doktorantkę analiza klasterowa jest w rzeczywistości analizą klastrową. Brakuje na Rycinie 13 zaznaczonych krzywych odcięcia, które jednoznacznie identyfikowałaby poszczególne klastry. 11. Położenie tekstu od strony lewej na stronach jest znacznie przesunięte w stosunku do całości pracy. 12. Legenda na rycinach nr 4 i 5 jest przesunięta w prawo i nie pokrywa się ze właściwym rozdziałem elektroforetycznym. 13. Należy zwrócić uwagę by nowe myśli rozpoczynać od akapitów a akapity od wcięć, co ułatwiłoby czytającemu łatwiejsze zapoznanie się z treścią pracy. Przykładowo: od stron 86 do strony 89 prowadzony jest jeden akapit, gdzie omawianych jest kilkanaście różnych toksyn; od strony 89 do strony 94 prowadzony jest również jeden akapit, dotyczący antybiotykoodporności. Wspomniane i zawarte uwagi nie mają jednak istotnego wpływu na bardzo dobra ocenę przygotowanej rozprawy doktorskiej. Podsumowując, pragnę podkreślić, że recenzowana rozprawa doktorska wnosi nowe, istotne dane do nauki i w sposób znaczący pogłębia wiedzę na temat molekularnej i fenotypowej charakterystyki szczepów Staphylococcus aureus. Pani mgr Aneta Frankowska-Maciejewska sumiennie wywiązała się z postawionego sobie zadania. Doświadczenia zaplanowała prawidłowo i dokładnie je wykonała, przy użyciu aktualnych metod badawczych, warunkujących wiarygodność uzyskanych 8

9 wyników. Ponadto wykonana przez Doktorantkę analiza piśmiennictwa w odniesieniu do czynników patogenności gronkowców, jest niezmiernie cennym kompendium wiedzy, jakiego brakuje na polskim rynku wydawniczym. Stwierdzam zatem, że rozprawa doktorska Pani mgr Anety Frankowskiej- Maciejewskiej pod tytułem Molekularna i fenotypowa charakterystyka szczepów Staphylococcus aureus wyizolowanych od krów z zapaleniem gruczołu mlekowego odpowiada warunkom określonym w art. 13 Ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz stopniach w zakresie sztuki. Przedstawiam zatem Wysokiej Radzie Wydziału Przyrodniczego UPH w Siedlcach wniosek o dopuszczenie Pani mgr Anety Frankowskiej Maciejewskiej do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Ponadto wnioskuję o wyróżnienie pracy stosowną nagrodą. Biała Podlaska, dnia r. Dr hab. Marcin Weiner, prof. nadzw. 9