(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (13) T3 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2010/13 EP B1 (51) Int. Cl. C12N15/62 C12N15/19 A61K48/00 A61P35/00 A61P37/04 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) (54) Tytuł wynalazku: Rekombinantowa szczepionka z antygenem chemokiny (30) Pierwszeństwo: CN (43) Zgłoszenie ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2007/39 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 09/2010 (73) Uprawniony z patentu: Cancer Institute, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing, CN (72) Twórca (y) wynalazku: PL/EP T3 Zhang Shuren, Beijing, CN Lin Chen, Beijing, CN Sun Wenxin, Beijing, CN Qin Hanjun, Beijing, CN Zhou Chunxia, Beijing, CN Liang Xiao, Beijing, CN Wang Dongmei, Beijing, CN Ma Wenbo, Beijing, CN Zhang Xueyan, Beijing, CN Fu Ming, Beijing, CN (74) Pełnomocnik: Kancelaria Prawno-Patentowa Radosław Chmura rzecz. pat. Pankowski Jacek Warszawa J.P. Woronicza 78/1 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 046/10/JP_T EP B1 Rekombinantowa szczepionka z antygenem chemokiny Dziedzina techniki [0001] Wynalazek dotyczy nowej sekwencji rekombinantowego genu, białka fuzyjnego wyrażanego z genu, oraz szczepionki wytwarzanej przez gen, jak również innych genowych szczepionek wytwarzanych przez zastąpienie genu kodującego antygen w rekombinantowej sekwencji, lub użycia wyrażanych produktów jako białek fuzyjnych będących szczepionką. Stan techniki [0002] Ludzka drugorzędowa chemokina tkanki limfoidalnej (SLC) wzbudza zainteresowanie od momentu jej odkrycia. SLC reguluje sekrecję cytokin, wpływa na immunosupresyjny stan mikrośrodowiska nowotworu i aktywuje różnicowanie Th1. A zatem SLC jest użyteczna dla odporności przeciwnowotworowej. Ponadto, SLC wykazuje wpływ na przyciąganie limfocytów oraz komórek dendrytycznych (DC). Wstrzyknięcie do wnętrza nowotworu powoduje lokalną i ogólnoustrojową przeciwnowotworową odpowiedź układu odpornościowego. SLC może także regulować supresję angiogenezy w nowotworach. Stąd też SLC jest bardzo użyteczna w immunoterapii nowotworów. Jednakże, zastosowanie samego białka SLC lub metod transgenicznych nie dało satysfakcjonujących rezultatów w postaci przeciwnowotworowej odporności. Si-Yi Chen i współpr. zasugerowali, że przeciwnowotworowa reakcja immunologiczna może być wzmocniona przez immunizację myszy z użyciem DC-ów, które zostały transfekowane rekombinantowym retrowirusowym wektorem zawierającym geny kodujące fragment Fc przeciwciał IgG oraz antygen nowotworu. Mechanizm polega na tym, iż białko fuzyjne wyrażane i wydzielane z DC jest powtórnie wychwytywane przez DC-y za pośrednictwem receptora Fc (FcR), a następnie epitop białka fuzyjnego jest prezentowany limfocytom T pomocniczym (Th) przez cząsteczki MHC klasy II i krzyżowo prezentowane cytotoksycznym limfocytom T (CTL) przez cząsteczki MHC klasy I, co powoduje ogólnoustrojową indukcję przeciwnowotworowej odpowiedzi humoralnej oraz komórkowej. Serre K.

3 - 2 - i współpr. pokazali, że zdolność DC do wychwytywania antygenów przez FcR-zależną endocytozę jest razy większa niż przez pinocytozę. Jednakże izolacja, amplifikacja i transfekcja genu do DC zwiększa złożoność wytwarzania szczepionki. W takim przypadku, DC-y muszą być przygotowywane indywidualnie, co utrudnia kontrolę jakości i wytwarzanie przemysłowe. Istota wynalazku [0003] Aby przezwyciężyć niedogodności wcześniejszych technik, jednym z celów wynalazku jest dostarczenie nowej rekombinantowej sekwencji genu. [0004] Kolejnym celem wynalazku jest dostarczenie białka fuzyjnego wyrażanego z sekwencji rekombinantowego genu. [0005] Kolejnym celem wynalazku jest dostarczenie szczepionki genowej fuzyjnego białka kodowanego przez rekombinantową sekwencję genu według wynalazku. [0006] Ponadto, celem wynalazku jest dostarczenie szczepionki z rekombinantowym genem jako antygenem powodującym chemotaksję na komórki nowotworów. [0007] Aby osiągnąć cele według wynalazku, następujące rozwiązania techniczne zostały zastosowane: Wynalazek dotyczy sekwencji rekombinantowego genu obejmującej gen ludzkiego SLC, gen antygenu oraz gen fragmentu Fc-IgG1, gdzie gen SLC jest połączony z końcem genu kodującego antygen oraz gen fragmentu Fc-IgG1 jest połączony z początkiem genu antygenu. Wymieniony gen antygenu zawiera Her2/neu, P53, PSA, PAP, PSM, MAGE1, MAGE2, MAGE3, BAGE, GAGE1, GAGE2, CAG3, RAGE, NY-ESO-1, tyrozynazę, CEA, idiotyp Ig, gp100, melan A, gp75, TRP-1, TRP-2, CDK4, CASP-8, ras, bcr/abl, MUC-1 i geny kodujące białka związane z wirusami HCV, HIV i mikroorganizmami patogennymi. [0008] W sekwencji rekombinantowego genu według wynalazku, miejsca rozpoznawane przez endonukleazę restrykcyjną EcoRI oraz geny trzech glicyn są obecne pomiędzy genem SLC i genem antygenu, a miejsca rozpoznawane przez

4 - 3 - endonukleazę restrykcyjną EcoRV oraz geny pięciu glicyn są obecne pomiędzy genem antygenu i genem fragmentu Fc-IgG1. [0009] Sekwencja rekombinantowego genu według wynalazku obejmuje SEK ID NR: 1 oraz SEK ID NR: 12. [0010] Wynalazek również dotyczy sekwencji aminokwasowej kodowanej przez sekwencję rekombinantowego genu według wynalazku. Wymieniona sekwencja aminokwasowa obejmuje SEK ID NR: 2. [0011] Wynalazek dotyczy również sekwencji aminokwasowej kodowanej przez SEK ID NR: 12. Wymieniona sekwencja aminokwasowa to SEK ID NR: 13. [0012] Wynalazek dotyczy również szczepionki genowej, obejmującej sekwencję rekombinantowego genu według wynalazku. [0013] W dodatku, wynalazek również dotyczy szczepionki genowej. Korzystnie, szczepionka genowa obejmuje SEK ID NR: 1, SEK ID NR: 12 oraz odpowiadające sekwencje aminokwasowe. [0014] Innymi słowy, wynalazek dotyczy sekwencji rekombinantowego genu obejmującej gen ludzkiej SLC, gen antygenu oraz gen fragmentu Fc-IgG1, gdzie gen SLC jest połączony z końcem genu antygenu a gen fragmentu Fc-IgG1 jest połączony z początkiem genu antygenu. Wymieniony gen antygenu obejmuje Her2/neu, P53, PSA, PAP, PSM, MAGE1, MAGE2, MAGE3, BAGE, GAGE1, GAGE2, CAG3, RAGE, NY-ESO-1, tyrozynazę, CEA, idiotyp Ig, gp100, melan A, gp75, TRP-1, TRP-2, CDK4, CASP-8, ras, bcr/abl, MUC-1 oraz inne geny kodujące białka związane z wirusami HCV, HIV i innymi mikroorganizmami patogennymi. Miejsca rozpoznawane przez endonukleazę restrykcyjną EcoRI oraz geny trzech glicyn znajdują się pomiędzy genem SLC i genem antygenu według wynalazku, a miejsca rozpoznawane przez endonukleazę restrykcyjną EcoRV oraz geny pięciu glicyn znajdują się pomiędzy genem antygenu i genem fragmentu Fc-IgG1. [0015] Wynalazek dotyczy także zastosowania sekwencji rekombinantowego genu według wynalazku do przygotowania szczepionki genowej. Konkretnie szczepionki genowej, obejmującej sekwencję genu według

5 - 4 - wynalazku, w szczególności SEK ID NR: 1, SEK ID NR: 12 oraz odpowiadające sekwencje aminokwasowe SEK ID NR: 2 i SEK ID NR: 13. [0016] Innymi słowy, przedmiotowy wynalazek dotyczy sekwencji rekombinantowego genu, obejmującej gen ludzkiego SLC, gen antygenu i gen fragmentu Fc-IgG1 (zobacz fig. 13). Gen SLC jest połączony z początkiem genu antygenu, i wprowadzone są miejsca rozpoznawane przez endonukleazę restrykcyjną EcoRI oraz geny trzech glicyn. Gen fragmentu Fc-IgG1 jest połączony z końcem genu antygenu, i wprowadzone są miejsca rozpoznawane przez endonukleazę restrykcyjną EcoRV oraz geny pięciu glicyn. [0017] Według wynalazku, zastąpienie genu antygenu w wymienionych genach przez miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne może wytworzyć zróżnicowane fuzyjne geny antygenów chemotaktycznych. W szczególności, przedmiotowy wynalazek dotyczy rekombinantowego genu obejmującego sekwencję kwasów nukleinowych SEK ID NR: 1. Sekwencja kwasów nukleinowych SEK ID NR:1 jest sztucznie zligowaną sekwencją SLC-Her2/P53- Fc, gdzie gen SLC zlokalizowany jest od pozycji 1 do pozycji 402 kwasu nukleinowego; wligowany gen Her2 zlokalizowany jest od pozycji 418 do pozycji 711 kwasu nukleinowego. Kwasy nukleinowe od pozycji 418 do pozycji 444 w rekombinantowym genie odpowiadają tym od pozycji 1105 do pozycji 1131 otwartej ramki odczytu (ORF) genu Her2/neu. Kwasy nukleinowe od pozycji 445 do pozycji 546 w rekombinantowym genie odpowiadają tym od pozycji 244 do pozycji 345 otwartej ramki odczytu (ORF) genu Her2/neu, gdzie wprowadzona jest mutacja z G w C, w pozycji 250. Kwasy nukleinowe od pozycji 547 do pozycji 711 w rekombinantowym genie odpowiadają tym od pozycji 1333 do pozycji 1479 w ORF genu Her2/neu. W rekombinantowym genie część genu P53 jest zlokalizowana od pozycji 712 do pozycji 1113, odpowiadająca kwasom nukleinowym od pozycji 475 do pozycji 876 z ORF p53. Gen fragmentu Fc IgG (zawierający introny) zlokalizowany jest od pozycji 1147 do pozycji 2057 w rekombinantowym genie, gdzie dwa introny zlokalizowane są odpowiednio od pozycji 1189 do pozycji 1309 oraz od pozycji 1640 do pozycji Sekwencja kwasów nukleinowych od pozycji 1147 do pozycji 1189 jest sekwencją

6 - 5 - C-końcowego zawiasu. Sekwencja kwasów nukleinowych od pozycji 1310 do pozycji 1369 jest dla CH2, a sekwencja kwasów nukleinowych od pozycji 1740 do pozycji 2057 jest dla CH3. Geny trzech glicyn oraz miejsca rozpoznawane przez endonukleazę restrykcyjną EcoRI są dołączone do początku fragmentu Her2/P53, a geny pięciu glicyn oraz miejsca rozpoznawane przez endonukleazę restrykcyjną EcoRV są dołączone do końca Her2/P53. Według wynalazku, aby zapewnić właściwą, biologiczną funkcję wyrażanych czynników, 3-5 geny glicyn są dołączone do początku i końca genu antygenu. Zadaniem genów glicyn jest zapobieganie interakcji rekombinantowego antygenu z trójwymiarową strukturą. [0018] Przedmiotowy wynalazek dotyczy także sekwencji aminokwasowej (612aa mat 589aa SEK ID NR: 2 kodowanej przez sekwencję nukleotydową SEK ID NR: 1, gdzie SEK ID NR: 1 jest sztucznie rekombinantowym genem SLC-Her2/P53-Fc. We wymienionej sekwencji aminokwasowej, fragment SLC zlokalizowany jest od pozycji 1 do pozycji 134, trzy glicyny zlokalizowane są od pozycji 135 do pozycji 137, a część peptydu Her2 zlokalizowana jest od pozycji 140 do pozycji 237. Aminokwasy od pozycji 140 do pozycji 148 w białku fuzyjnym odpowiadają tym od pozycji 369 do pozycji 377 w Her2/neu. Aminokwasy od pozycji 149 do pozycji 182 w białku fuzyjnym odpowiadają tym od pozycji 82 do pozycji 115 w Her2/neu, gdzie mutacja z V do L jest wprowadzona w pozycji 84. Aminokwasy od pozycji 183 do pozycji 238 w białku fuzyjnym odpowiadają tym od pozycji 445 do pozycji 499 w Her2/neu. Część peptydu P53 zlokalizowana jest od pozycji 238 do pozycji 371 w białku fuzyjnym (odpowiadająca aminokwasom od pozycji 159 do pozycji 292 w natywnej postaci P53). Pięć glicyn zlokalizowanych jest od pozycji 374 do pozycji 378. Fragment Fc IgG zlokalizowany jest od pozycji 383 do pozycji 612, gdzie sekwencja od pozycji 383 do pozycji 396 jest C-końcowym zawiasem, sekwencja od pozycji 397 do pozycji 506 jest dla CH2, a sekwencja od pozycji 507 do pozycji 612 jest dla CH3. [0019] Przedmiotowy wynalazek dotyczy także kolejnego rekombinantowego genu szczepionki na raka prostaty, sekwencja którego jest przedstawiona jako SEK ID NR: 12. Sekwencja nukleotydowa w SEK ID NR: 12

7 - 6 - jest sekwencją sztucznie zligowanego genu SLC-PSM-mPAP-PSA-Fc (SLC-3P- Fc), gdzie są włączone tylko części sekwencji PSM (ludzki specyficzny dla prostaty antygen błonowy), mpap mysiej prostatycznej kwaśnej fosfatazy i PSA (ludzki specyficzny antygen prostaty). W genie fuzyjnym, gen SLC zlokalizowany jest od pozycji 1 do pozycji 402; część genu PSM zlokalizowana od pozycji 418 do pozycji 603 odpowiada sekwencji od pozycji 1987 do pozycji 2172 w otwartej ramce odczytu (ORF) PSM; gen mpap zlokalizowany od pozycji 604 do pozycji 759 odpowiada sekwencji od pozycji 328 do pozycji 484 w ORF mpap; gen PSA zlokalizowany od pozycji 760 do pozycji 981 odpowiada sekwencji od pozycji 151 do pozycji 372 w ORF PSA; gen fragmentu Fc IgG (razem z intronami) zlokalizowany jest od pozycji 1003 do pozycji 1925, gdzie dwa introny są zlokalizowane, odpowiednio, od pozycji 1057 do pozycji 1177 oraz od pozycji 1508 do pozycji Geny trzech glicyn oraz miejsca rozpoznawane przez endonukleazę restrykcyjną EcoRI są dołączone do końca 3P sekwencji, a geny pięciu glicyn oraz miejsca rozpoznawane przez endonukleazę restrykcyjną EcoRV są dołączone do początku sekwencji 3P. [0020] Przedmiotowy wynalazek dotyczy także sekwencji aminokwasowej o SEK ID NR: 13 kodowanej przez sekwencję nukleotydową SEK ID NR:12. Konkretnie, wynalazek dotyczy sekwencji aminokwasowej (568 aa) odpowiadającej sztucznej sekwencji rekombinantowego genu SLC-3P-Fc. W tej fuzyjnej sekwencji aminokwasowej, SLC zlokalizowany jest od pozycji 1 do pozycji 134, trzy glicyny są zlokalizowane od pozycji 135 do pozycji 137, PSM zlokalizowany jest od pozycji 140 do pozycji 201, część peptydu mpap zlokalizowana jest od pozycji 202 do pozycji 253, część peptydu PSA zlokalizowana jest od pozycji 254 do pozycji 327, pięć glicyn zlokalizowanych jest od pozycji 374 do pozycji 378, a fragment Fc IgG1 zlokalizowany jest od pozycji 335 do pozycji 568. [0021] Przedmiotowy wynalazek dotyczy także zastosowania sekwencji rekombinantowego genu według wynalazku, wraz z sekwencją SEK ID NR: 1, do przygotowania szczepionek.

8 - 7 - [0022] Jak można dostrzec na podstawie powyższego, strategia chemotaktycznego antygenu według wynalazku jest następująca: przyłączenie chemokiny SLC do końca antygenu oraz połączenie fragmentu Fc IgG do początku antygenu; wprowadzenie trzyczęściowego fuzyjnego genu bezpośrednio do zdrowej lub nowotworowej tkanki w celu ekspresji i sekrecji; i utworzenie dwuczęściowego ciała połączonego przez region zawiasowy Fc. Wymienione rekombinantowe białko aktywnie przyciąga DC i limfocyty T przez aktywność chemotaktyczną SLC in vivo. DC wychwytuje fuzyjne białko z wysoką wydajnością przez pinocytozę, szczególnie z pomocą receptora Fc oraz receptora SLC CCR7. W międzyczasie DC przenosi antygen do komórki. Po przetworzeniu i obróbce antygen jest prezentowany limfocytom Th oraz CTL przez cząsteczki MHC-II lub MHC-I. W rezultacie jest w pełni indukowana specyficzna przeciwnowotworowa odpowiedź humoralna i komórkowa. Ponadto, DC może być aktywowany przez kombinację fragmentu Fc z receptorem Fc komórek DC. SLC może aktywnie odszczepiać DC i limfocyty T, jak również promować sekrecję cytokin, takich jak IL-12, IFN-γ, oraz indukowane przez interferon białko (IP-10), promować rozwój Th1, hamować produkcję TGF-β i VEGF. Dzięki temu SLC jest bardzo użyteczna w immunizacji przeciwnowotworowej. Z powodów wskazanych powyżej, taka kombinacja daje synergistyczny efekt i może indukować silniejszą immuniczną odpowiedź przeciwnowotworową (patrz fig. 1). [0023] W przedmiotowym wynalazku, zostały użyte zróżnicowane rekombinantowe geny, co nie ogranicza jednak zakresu wynalazku. Badania kontrolne ujawniły, że zarówno w formie plazmidu jak i w formie białka fuzyjnego, rekombinantowy antygen chemokiny może być produkowany na skalę przemysłową. Etap przygotowania DC został pominięty w zgłoszeniu. Jednakże, DC mogą być aktywowane z wysoką wydajnością in vivo. Ponadto, wprowadzenie miejsc rozpoznawanych przez endonukleazy restrykcyjne do dwóch końców genu antygenu umożliwia zamianę antygenu w celu wytworzenia zróżnicowanych szczepionek z antygenami chemokin przeciwko chorobom nowotworowym lub nie-nowotworowym. Na przykład, nowa szczepionka

9 - 8 - z antygenem chemokiny może być wytworzona przez zastąpienie antygenu HP w SLC-HP-Fc przez antygen związany z rakiem prostaty. [0024] Rekombinantowy gen może być skonstruowany w wektorze eukariotycznym przez użycie bezpośredniej iniekcji plazmidu do organizmu lub nowotworu. Inne techniki, takie jak strzelba genowa lub elektroporacja mogą zwiększyć częstość transfekcji i wydajność ekspresji. Skonstruowany, rekombinantowy wirus, taki jak retrowirus, adenowirus, wirusy zależne od adenowirusów, wirusy szczepionkowe, wirus opryszczki i tym podobne, mogą być również użyte jako szczepionki do iniekcji in vivo. Plazmid może być transfekowany do komórki eukariotycznej (na przykład CHO) i hodowany in vitro dla sekrecji i ekspresji. Poprzez fragment Fc białko fuzyjne może być łatwo i efektywnie oczyszczone przez chromatografię powinowactwa i używane jako szczepionka białkowa. Krótki opis rysunków [0025] Fig. 1 pokazuje schemat mechanizmu chemotaktycznej szczepionki antygenowej według przedmiotowego wynalazku. Fig. 2 pokazuje konstrukcję plazmidu. HP oznacza gen fuzyjny Her2/neu-p53; sig oznacza gen wydzielanego peptydu SLC. Fig. 3 pokazuje rekombinację SLC-Her2/neu-Fc według przedmiotowego wynalazku. Fig. 4 pokazuje wykrywanie ekspresji w komórce oraz sekrecji fuzyjnego białka pslc-hp-fc w transfekowanych komórkach, metodą Western blot. A wskazuje lizaty komórek transfekowanych pslc-hp-fc; B wskazuje supernatant z hodowli komórek transfekowanych pslc-hp-fc; C wskazuje supernatant z hodowli komórek transfekowanych pcdna. Fig. 5 pokazuje efekt zahamowania wzrostu nowotworu in vivo po preszczepieniu chemotaktyczną szczepionką z antygenem nowotworu (pslc-hp- Fc).

10 - 9 - Fig. 6 pokazuje okres przeżycia myszy niosących nowotwór od pre-szczepienia chemotaktyczną szczepionką z antygenem nowotworu (pslc-hp-fc). Fig. 7 pokazuje zahamowania wzrostu nowotworu in vivo przez terapię chemotaktyczną szczepionką z antygenem nowotworu (pslc-hp-fc). Fig. 8 pokazuje okres przeżycia od terapii chemotaktyczną szczepionką z antygenem nowotworu (pslc-hp-fc). Fig. 9 pokazuje aktywność CTL po immunizacji chemotaktyczną szczepionką z antygenem nowotworu (pslc-hp-fc). Fig. 10 pokazuje ilość specyficznego antygenu przeciw-hp w surowicy, w 2 i 4 tygodnie po szczepieniu. Mysia surowica jest rozcieńczona w proporcji 1:100. Zastosowano oznaczenie metodą ELISA. Fig. 11 pokazuje, że szczepionka pslc-hp-fc może indukować CTL specyficznie przeciwko Her2/neu oraz p53 in vitro. Fig. 12 pokazuje konstrukcję plazmidu pslc-3p-fc. Fig. 13 pokazuje zahamowanie wzrostu nowotworu in vivo po terapii z użyciem chemotaktycznej szczepionki genowej z antygenem nowotworu (pslc-3p-fc). Fig. 14 pokazuje okres przeżycia po terapii z użyciem chemotaktycznej szczepionki genowej z antygenem nowotworu (pslc-3p-fc). Fig. 15 pokazuje charakterystyczną strukturę rekombinantowego genu według wynalazku. Szczegółowy opis wynalazku [0026] Wynalazek zostanie szczegółowo opisany wraz z zilustrowaniem wynalazku. Powinno być zrozumiałe, iż celem załączonych przykładów realizacji jest tylko dostarczenie wyjaśnień, a nie ograniczanie zakresu wynalazku. Przykład. Klonowanie ludzkiego genu SLC. [0027] mrna zostało wyizolowane z węzłów chłonnych pacjenta chorego na raka. Z użyciem metod ogólnie znanych specjalistom w tej dziedzinie, miejsce rozpoznawane przez endonukleazę restrykcyjną KpnI zostało dodane do wiodącego primiera SLC (5 -cggtaccacagacatggctcagtcac-3 ) a sekwencja kodująca trzy glicyny i miejsce rozpoznawane przez endonukleazę restrykcyjną

11 EcoRI do odwróconego primera SLC (5 -tgaattctcctcctcctggccctttagg-3 ). Gen SLC został uzyskany przez amplifikację w reakcji RT-PCR. Uzyskany fragment został oczyszczony i wstawiony do wektora pucmt (puc-slc) w celu zsekwencjonowania. Wyniki pokazały, że sekwencja uzyskanego fragmentu była zgodna z zaprojektowaną sekwencją (podkreślony fragment). [0028] W przedmiotowym wynalazku, sekwencjonowanie produktów PCR przeprowadzono z użyciem sekwencera DNA 377 (firma ABI) z wykorzystaniem metody SANGERA z hamowaniem reakcji przez dideoksynukleotydy posiadające 4 różne barwniki fluorescencyjne. Sekwencja od pozycji 36 do pozycji 464 jest sekwencją sklonowanego fragmentu wynalazku (zobacz SEK ID NR:3). Przykład 2. Przygotowanie i łączenie genu Her-2/neu [0029] Najpierw, dwa fragmenty genu Her-2/neu zostały sklonowane metodą PCR. Pierwszy fragment uzyskano w następujący sposób: użyto primer wiodący 5 -agaattcaagatctttgggagcctggcatttctgggctacctgctcatcgctca c-3, mający miejsce rozpoznawane przez endonukleazę restrykcyjną EcoRI, oraz użyto odwrócony primer 5 -gatgcccagcccttgca gggccagggcatagttgtc-3. Plazmid zawierający pozakomórkowy fragment genu neu został zaadoptowany jako matryca a fragment odpowiadający sekwencji aminokwasowej od pozycji 82 do pozycji 115 został amplifikowany, gdzie aminokwas V w pozycji 103 został zastąpiony przez aminokwas L. Drugi fragment został uzyskany w następujący sposób: primer wiodący to 5 -ctgcaagggctgggcatc-3, oraz primer odwrócony z miejscem rozpoznawanym przez endonukleazę restrykcyjną NcoI to 5 - tccatggcccggttggcagtgtggag-3. Fragment odpowiadający sekwencji aminokwasowej od pozycji 445 do pozycji 499 został zamplifikowany. [0030] Dwa produkty PCR zostały zebrane i połączone w systemie PCR. Następnie, otrzymany fragment został użyty jako matryca, przez użycie primera wiodącego pierwszego fragmentu i primera odwróconego drugiego fragmentu; fuzyjny gen o wielkości 249 bp został zamplifikowany. Następnie uzyskany fuzyjny gen został wstawiony do wektora pucmt (puc-her2p)

12 i zsekwencjonowany. Wynik wskazywał na to, że sekwencja uzyskanego genu fuzyjnego jest zgodna z zaprojektowaną sekwencją (podkreślona sekwencja). [0031] Wynik jest przedstawiony jako SEK ID NR: 4, gdzie sekwencja od pozycji 121 do pozycji 465 jest sekwencją sklonowanego fragmentu według wynalazku. Przykład 3. Klonowanie segmentu genu p53 [0032] Fragment genu o wielkości 402 bp kodujący sekwencję aminokwasową od pozycji 156 do pozycji 289 w białku p53 został sklonowany z plazmidu zawierającego kompletny gen p53. Użyte zostały następujące primery: primer wiodący z jednym miejscem rozpoznawanym przez endonukleazę restrykcyjną NcoI 5 -acc atg gcc atc tac aag cag tca cag cac atg ac-3 ; primer odwrócony z jednym miejscem rozpoznawanym przez endonukleazę restrykcyjną EcoRV 5 -tga tat ctt tct tgc gga gat tct ctt c-3. Uzyskany fragment został wstawiony do wektora pucmt (puc-p53p) w celu zsekwencjonowania. Wynik wskazuje, że sekwencja uzyskanego fragmentu jest zgodna z oczekiwaną sekwencją (podkreślony fragment). [0033] Wynik jest pokazany jako SEK ID NR: 5, gdzie sekwencja od pozycji 39 do pozycji 445 jest sekwencją fragmentu według wynalazku. Przykład 4. Łączenie fragmentów Her2/neu i p53 [0034] Jak pokazano na fig. 3, najmniejszy fragment wycięty z puc- Her2P przez enzymy EcoRI/NcoI i najmniejszy fragment wycięty z puc-p53p przez enzymy NcoI/EcoRV zostały zligowane z dużym fragmentem wyciętym z pcdna3z, enzymami EcoRI/EcoRV aby skonstruować plazmid pcdna- Her2/p53, nazywany również pcdna-hp. HP oznacza gen zligowany między Her2/neu i p53. Sztucznie zligowany fragment Her2/neu-p53 zawiera geny kodujące peptydy wiążące HLA-I i HLA-II.

13 Przykład 5. Konstrukcja PcDNA-Fc [0035] Najpierw, chemicznie zsyntetyzowany fragment zawierający wiele miejsc klonowania został użyty do zastąpienia wielokrotnych miejsc klonowania w pcdna3. [0036] Proces konstrukcji był następujący: chemicznie zsyntetyzowano dwa oligonukleotydy. Primer wiodący to 5 - GCTAGCGAAGCTTTGGTACCGTAGGATCCACGAATTCAGTCCAGGATA TCGGCGGTGG-3. Primer odwrócony to 5 - GGTTTAAACGTTAACCCCGGGCCCTCGAGCTCTAGAGCCTCCTCCACC GCCGATATC-3 [0037] Ostatnie 15 zasad na 3 końcach każdego primera są komplementarne do siebie nawzajem. Produkt PCR uzyskano w systemie zawierającym mieszaninę dwóch primerów w proporcji 1:1, polimerazę DNA Taq i dntp w temperaturze 45 C dla denaturacji i elongacji. Oczyszczony produkt został wstawiony do wektora pucmt w celu zsekwencjonowania. Wynik pokazuje, że sekwencja uzyskanego produktu jest zgodna z zaprojektowaną sekwencją. Podkreślona sekwencja wskazuje zsyntetyzowane miejsca klonowania. Ostateczne miejsce klonowania miało następującą strukturę: NheI-HindIII- Kpn1-BamHI-EcoRI-EcoRV-glicyna x 5-XbaI-Xho1-Apa1-Sma1-Hpa1-Pme1. W tej sekwencji mały fragment genu GGCGGTGGAGGAGGC kodujący pięć glicyn został wstawiony pomiędzy miejsca EcoRV i XbaI. NheI/PmeI tnie sklonowany plazmid i uzyskano fragment o wielkości około 100 bp. Następnie, fragment został zligowany z większym fragmentem wyciętym z pcdna3.1 przez NheI/PmeI w celu skonstruowania nowego wektora o nazwie pcdnaf. [0038] Wynik sekwencjonowania chemicznie zsyntetyzowanego miejsca klonowania jest przedstawiony jako SEK ID NR: 6, gdzie sekwencja od pozycji 3 do pozycji 100 jest sekwencją fragmentu według wynalazku.

14 Proces konstrukcji plazmidu PcDNA-Fc [0039] Fragment Fc został wycięty z plazmidu zawierającego IgG1 Fc przez endonukleazy restrykcyjne XbaI/ApaI i wstawiony do wektora pcdnaf, przy czym wektor pcdnaf został pocięty tymi samymi endonukleazami. Uzyskany konstrukt został nazwany PcDNA-Fc. Sekwencja fragmentu Fc IgG1 została potwierdzona przez sekwencjonowanie uzyskanego plazmidu. Sekwencjonowanie fragmentu Fc [0040] Fragment Fc o wielkości 900 bp został amplifikowany z plazmidu zawierającego gen fragmentu Fc IgG1 w reakcji PCR i wstawiony do wektora pucmt do sekwencjonowania. Primery użyte podczas amplifikacji były następujące: primer wiodący: 5 -gaattcggagttaacgagcccaaatcttg-3 ; primer odwrócony: 5 -gggccctcatttacccggagac-3. Wynik sekwencjonowania pokazuje, że plazmid zawierał region zawiasowy, CH2 i CH3 z IgG1. Innymi słowy, plazmid zawierał fragment Fc (zobacz podkreślona sekwencja). Wynik jest pokazany jako SEK ID NR: 7, gdzie sekwencja od pozycji 78 do pozycji 991 jest sekwencją według wynalazku. Przykład 6. Łączenie genu SLC-Her2/neu-Fc [0041] Jak pokazano na fig. 3, większy fragment wycięty z pcdna-hp enzymami KpnI/EcoRI został połączony z mniejszym fragmentem wyciętym z puc-slc enzymami KpnI/EcoRI, aby skonstruować pcdna-slc-hp. Następnie, najmniejszy fragment wycięty z pcdna-slc-hp enzymami KpnI/EcoRV został połączony z większym fragmentem wyciętym z pcdna-fc enzymami KpnI/EcoRV aby skonstruować pcdna-slc-hp-fc (nazywany również pslc-hp-fc). [0042] Konstrukcja kontrolnego plazmidu jest przedstawiona na fig. 2. Przykład 7. Wykrywanie komórkowego i wydzielonego rekombinantowego białka w komórkach transfekowanych szczepionką genową z użyciem metody Western Blot. [0043] Rekombinantowy plazmid pslc-hp-fc został transfekowany do komórek B16-F10 z użyciem liposomów. Właściwe klony zostały wyselekcjo-

15 nowane przez G418. Komórki hodowano w podłożu 1640 bez surowicy przez 24 godziny, a następnie zebrano i zatężono supernatant. Metoda Western Blot została użyta do wykrycia ekspresji fuzyjnego białka. Użytymi przeciwciałami pierwszorzędowymi były królicze przeciwciała poliklonalne skierowane przeciw ludzkiemu p53, a przeciwciałami drugorzędowymi były kozie przeciwciała koniugowane z HRP skierowane na epitopy królika. Bloty zostały wizualizowane zestawem do chemiluminescencji ECL-Plus (Amersham Pharmacia Biotech). Ostatecznie błony eksponowano na promieniowanie X. Wynik wskazywał, że ekspresja białka fuzyjnego może być wykryta w supernatancie i lizacie komórek B 16-F10 transfekowanych pslc-hp-fc. Masa cząsteczkowa jest zgodna z oczekiwaną (zobacz fig. 4). Uzyskano potwierdzenie, że sekwencja białka fuzyjnego to SEK ID NR: 2. Przykład 8. Klonowanie genu ludzkiego PSM (ludzki antygen błonowy specyficzny dla prostaty). [0044] Całkowite RNA zostało wyizolowane z komórek nowotworowych ludzkiej prostaty linii LNCaP. Wykorzystano reakcję RT-PCR z użyciem primera wiodącego (5 -ACTCGAGAT GAAGACATACAGTGTATC-3') i primera odwróconego (5 -TGATATCTTAGGCTAC TTCACTCAAAG-3'). Po elektroforezie prążek odpowiadający hpsm o wielkości 390 bp został wycięty. Fragment został oczyszczony i odzyskany z użyciem metody Glass Milk. Oczyszczony fragment został zligowany z wektorem pucm-t w celu skonstruowania pucmhpsm. Właściwe klony zostały wybrane i zsekwencjonowane. Wynik jest zgodny z oczekiwaniami. Jak można zauważyć w SEK ID NR: 8, uzyskany fragment genu odpowiada sekwencji od pozycji 1864 do pozycji 2253 w ORF ludzkiego PSM. Sekwencja od pozycji 229 do pozycji 618 w uzyskanej sekwencji jest sekwencją według wynalazku. Przykład 9. Klonowanie fragmentu genu ludzkiego PSA (antygen specyficzny dla prostaty). [0045] Całkowite RNA zostało wyizolowane z komórek nowotworowych ludzkiej prostaty linii LNCaP. Wykorzystano reakcję RT-PCR z użyciem primera

16 wiodącego (5'-TCTCGAGGGC GGTGTTCTGGTGCA-3') i primera odwróconego (5'-AGATATCATGTCC AGCGTCCAGCAC-3'). Po elektroforezie prążek o wielkości około 600 bp został wycięty. Fragment został oczyszczony i odzyskany z użyciem metody Glass Milk. Uzyskany fragment został zligowany z wektorem pucm-t w celu skonstruowania pucm-psa. Właściwe klony zostały wybrane i zsekwencjonowane. Wynik został przestawiony jako SEK ID NR: 9. Uzyskany fragment genu odpowiada sekwencji od pozycji 151 do pozycji 609 w ORF ludzkiego PSA. Sekwencja od pozycji 45 do pozycji 503 w uzyskanej sekwencji jest sekwencją według wynalazku. Przykład 10. Klonowanie mysiego genu PAP (kwaśna fosfataza prostaty). [0046] Całkowite RNA zostało wyizolowane z tkanki mysiej prostaty. Wykorzystano reakcję RT-PCR z użyciem primera wiodącego (5'- TCTAGATGAGAGCTGTTCCTCTG-3') i primera odwróconego (5'- GGGCCCTTAATTCCGTCCTTGGTG-3'). Po elektroforezie, prążek o wielkości 1146 bp został wycięty. Fragment został oczyszczony i odzyskany z użyciem metody Glass Milk. Uzyskany fragment został zligowany z wektorem pucm-t w celu skonstruowania pucm-mpap. Właściwe klony zostały wybrane i zsekwencjonowane. Wynik jest przedstawiony jako SEK ID NR: 10. Sekwencja od pozycji 48 do pozycji 1193 w uzyskanej sekwencji jest sekwencją według wynalazku. Przykład 11. Łączenie PSM, mpap i fragmentu genu PSA (3P). [0047] Fragment genu hpsm został sklonowany z plazmidu pucm-hpsm metodą PCR z wykorzystaniem następujących primerów: primer wiodący odpowiadający sekwencji od pozycji 1987 do pozycji 2007 ORF hpsm (dodano miejsce rozpoznawane przez endonukleazę restrykcyjną EcoRI) 5'- AGAATTCATGATGAATGATCAACTCATG-3'; primer odwrócony 5'- AGCACTCATCAAAGTCCTGGCCTTGGAAGGGTCCAC-3, gdzie podkreślony fragment odpowiada sekwencji od pozycji 328 do pozycji 345 w ORF mpap, a pozostały fragment odpowiada sekwencji od pozycji 2155 do pozycji 2172 w ORF hpsm. Po elektroforezie, uzyskany fragment hpsm został wycięty

17 i oczyszczony metodą Glass Milk. Fragment genu mpap został sklonowany z plazmidu pucm- mpap metodą PCR z wykorzystaniem następujących primerów: primer wiodący odpowiadający sekwencji od pozycji 328 do pozycji 348 ORF mpap to 5'-AGGACTTTGATGAGTGCTATG-3'; primer odwrócony odpowiadający sekwencji od pozycji 463 do pozycji 483 ORF mpap to 5 -AGGGCAGTCTCTGAAAGGCAG-3'. Po elektroforezie, uzyskany fragment mpap został wycięty i oczyszczony metodą Glass Milk. Fragment genu hpsa został sklonowany z plazmidu pucm-hpsa metodą PCR z wykorzystaniem następujących primerów: primer wiodący to 5'- CCTTTCAGAGACTGCCCTGGCGGTGTTC TGGTGCAC-3' (podkreślony fragment odpowiada sekwencji od pozycji 466 do pozycji 483 ORF mpap, a pozostały fragment odpowiada sekwencji od pozycji 151 do pozycji 168 ORF hpsa); primer odwrócony to 5'-AGATATCGAGCAGCATGAGGTCGT-3'. Po elektroforezie, uzyskany fragment hpsa został wycięty i oczyszczony metodą Glass Milk. [0048] Primer 5'-AGAATTCATGATGAATGATCAACTCATG-3' został użyty do zamplifikowania hpsm, a primer 5'-AGGGCAGTCTCTGAAAGGCAG- 3' został użyty do zamplifikowania mpap w indywidualnej reakcji w 25 μl przez 10 cykli w celu wzbogacenia ilości pojedynczych łańcuchów. Następnie, dwie reakcje zostały zmieszane, aby przeprowadzić dalszy PCR w 50 μl przez 18 cykli. Po elektroforezie, uzyskany fragment hpsm-mpap o wielkości 352 bp został wycięty i oczyszczony metodą Glass Milk. [0049] Primer 5'-AGGACTTTGATGAGTGCTATG -3', odpowiadający sekwencji od pozycji 328 do pozycji 348 ORF mpap, został użyty do zamplifikowania mpap, a primer 5'-AGATATCGAGCAGCATGAGGTCGTG- 3', odpowiadający sekwencji od pozycji 355 do pozycji 372 ORF PSA, został użyty do zamplifikowania hpsa w indywidualnej reakcji w 25 μl przez 10 cykli w celu zwiększenia ilości pojedynczych łańcuchów. Następnie, dwie reakcje zostały zmieszane, aby przeprowadzić dalszy PCR w 50 μl przez 18 cykli. Po elektroforezie, uzyskany fragment mpap-hpsa o wielkości 378 bp został wycięty i oczyszczony metodą Glass Milk.

18 [0050] Primer 5'-AGAATTCATGATGAATGATCAACTCATG-3' został użyty do zamplifikowania hpsm-mpap, a primer 5 - AGATATCGAGCAGCATGAGGTCGTG-3' został użyty do zamplifikowania mpap-hpsa w indywidualnej reakcji w 25 μl przez 10 cykli w celu zwiększenia ilości pojedynczych łańcuchów. Następnie, dwie reakcje zostały zmieszane, aby przeprowadzić dalszy PCR w 50 μl przez 18 cykli. Po elektroforezie, uzyskany fragment hpsm-mpap-hpsa o wielkości 564 bp został wycięty i oczyszczony metodą Glass Milk. Uzyskany fragment został wstawiony do wektora pucm-tv dla sekwencjonowania. Wynik był zgodny z oczekiwaniami. Zobacz SEK ID NR: 1, gdzie sekwencja od pozycji 54 do pozycji 629 jest sekwencją według wynalazku. Przykład 12. Rekombinacja antygenu SLC-3P-Fc genu chemokiny [0051] Po sekwencjonowaniu, plazmid zawierający poprawną sekwencję genową 3P (3P oznacza gen fuzyjny PSM-PAP-PSA o wielkości 564 bp kodujący 188 aminokwasów) został rozcięty endonukleazami restrykcyjnymi EcoRI/EcoRV. Uzyskany mniejszy fragment 3P zligowano z wektorem PSLC- HP-Fc wyciętym EcoRI/EcoRV, aby skonstruować pslc-3p-fc (zobacz fig. 12). Sekwencja rekombinantowego genu SLC-3P-Fc jest pokazana jako SEK ID NR: 12, która odpowiada sekwencji aminokwasowej pokazanej jako SEK ID NR: 13. Przykłady testów Test 1. Wykrywanie czynności chemotaktycznej immunizowanych komórek z białkiem fuzyjnym za pomocą komory Boydena Czynność odszczepiająca ludzkiej SLC in vitro [0052] A. Linię komórkową czerniaka B16F10 transfekuje się oczyszczonym plazmidem pcdna3z-slc-hp-fc i plazmidem kontrolnym. W 48 godzin po inkubacji środowisko hodowlane zbiera się i zatęża za pomocą PEG20000 (supernatant z nie-transfekowanych komórek B16-F10 użyto jako negatywną próbę kontrolną).

19 B. Komórki monojądrowe krwi obwodowej (PBMC) zbiera się z 5 ml zdrowej pełnej krwi obwodowej za pomocą środowiska do separacji limfocytów, przemywa dwa razy roztworem soli i ponownie zawiesza w środowisku RPMI pozbawionym surowicy. Zlicza się PBMC i rozcieńcza do stężenia 1 x 10 6 /ml. C. Przygotowanie komory Bowdena. Komorę nabywa się z Neuro Probe Co. Niższe studzienki komory napełnia się 27 µl kondycjonowanego środowiska hodowlanego, a górne studzienki napełnia się 50 µl 1 x 10 6 /ml zawiesiny komórek PBMC. Dolne i górne studzienki oddziela się poliwęglanowym filtrem (Neuro Probe) o wielkości porów 5 µm. Komorę inkubuje się w 37 C przy 5% CO 2 przez 4 godz. D. Filtr usuwa się, a komórki zeskrobuje z górnej strony filtra, a następnie filtr przemywa się, utrwala i wybarwia. Zlicza się migrujące komórki w pięciu losowo wybranych polach wysokiej mocy (x200). Oblicza się CI (wskaźnik chemotaktyczny) następująco: CI = liczba komórek pięciu pól wysokiej mocy w badanych studzienkach/liczba komórek pięciu pól wysokiej mocy z studzienkach kontrolnych. Wartość CI grupy negatywnej wynosi 1. Tablica 1. Wykrywanie czynności chemotaktycznej białka fuzyjnego Grupy Liczba komórek chemotaktycznych CI Wartość P Negatywna próba kontrolna 34 ± 10,4 1 Wektor kontrolny 44,6 ± 11,9 1,31 >0,05* psig-hp 68,6 ± 9.5 2,02 <0,05* pslc-hp-fc 157,4 ± 19,2 4,63 <0,01* <0,05** pslc 156,6 ± 20,3 4,61 <0,01* <0,05** * względem negatywnej próby kontrolnej. ** vs psig-hp.

20 [0053] Wynik. Poziom czynności chemotaktycznej supernatantu pozbawionego surowicy z komórek transferowanych pslc-hp-fc jest znacznie wyższy niż innych, wskazując, że po transfekcji plazmid może być wyrażany, oraz że wyrażane białko jest czynne. Poziom chemotaktycznej zdolności komórek transfekujących pslc-hp-fc jest podobny do tego dla transfekujących komórek pslc, wskazując, że białko fuzyjne nie wpływa na czynność SLC. Test 2. Przeciwnowotworowa odpowiedź immuniczna ludzkiej chemotaktycznej szczepionki z genem antygenu u myszy [0054] Plazmidy (geny nieklonowane) umieszcza się na cząstkach złota i powleka na wewnętrznej powierzchni rurki Tefzel a, którą tnie się na odpowiednie segmenty jako pociski dla dostarczania 1 µg DNA, według poradnika BioRad. Kilka grup wydziela się jako kontrolne: wektor kontrolny, pslc-fc, psig-hp (plazmid wyrażający HP zawierający peptyd sygnałowy SLC), pslc-hp i psig-hp-fc. Test 3. Reakcja immuniczna przeciwko rakowi [0055] 14 dni i 7 dni przed inokulacją guza nowotworowego, myszy szczepi się dwukrotnie pslc-hp-fc lub wektorami kontrolnymi na skórze brzusznej. W dniu 0 każdą mysz inokuluje się 5 x 10 4 komórek nowotworowych B16F10 (komórki B16F10 transfekuje się genem HP i selekcjonuje przez G418) w 0,2 ml roztworu. Wielkości guza otworowego rejestruje się 2-3 razy na tydzień. Wielkość guza nowotworowego oblicza się jako długość (cm) x szerokość (cm 2 ). [0056] Wynik. Szczepienie pslc-hp-fc dwukrotnie istotnie zwiększa efekt supresji guza nowotworowego (zobacz fig. 5, 6), i przeciętny okres przeżycia myszy istotnie zostaje zwiększony. Efekt terapeutyczny pslc-hp-fc jest istotnie lepszy niż dla któregokolwiek z innych wektorów (p<0,05), co wskazuje na synergistyczny efekt immuniczny SLC i fragmentu Fc. Test 4. Immunoterapia na raka [0057] W dniu 0 każdą mysz inokuluje się 5 x 10 4 komórkami guza nowotworowego w 0,2 ml roztworu. W dniu 6, 12, 18 myszy szczepi się za pomocą systemu strzelby genowej (Gene Gun). Wielkości guza nowotworowego

21 rejestruje się 2-3 razy na tydzień. Wielkość guza oszacowuje się tak, jak wskazano powyżej. [0058] Jak pokazano na fig. 7 i 8, szczepionka pslc-hp-fc wykazuje najbardziej skuteczną supresję wzrostu guza nowotworowego. W dniu 28 różnica pomiędzy grupami pslc-hp-fc i psig-hp-fc jest istotna (P < 0,05). Przeciętny okres przeżycia myszy jest wydłużony wskutek immunizacji pslc-hp-fc. Myszy w grupie B160 pslc-hp-fc inokulowano komórkami B16 typu dzikiego. Po trzykrotnej immunizacji pslc-hp-fc, grupa B16 wykazuje brak efektu supresji guza nowotworowego, co sugeruje, ze reakcja immuniczna indukowana pslc- HP-Fc jest specyficzna dla antygenu HP. Test 5. Czynność CTL indukowana przez nowotworową szczepionkę chemotaktyczną z genem antygenu [0059] Dwa tygodnie po trzykrotnym szczepieniu za pomocą systemu strzelby genowej, myszy z guzem nowotworowym uśmierca się i przeprowadza się oznaczenie cytotoksyczności CTL z użyciem komórek śledziony za pomocą zestawu LDH (Promega). Proporcja komórek śledziony i komórek docelowych (proporcja E:T) wynosiła, odpowiednio, 40:1, 20:1, oraz 10:1. [0060] Limfocyty pochodzące od myszy immunizowanych szczepionką z nukleotydami chemokiny wykazują znaczny efekt cytotoksyczny względem komórek B 16 F 10-HP (zobacz fig. 9). Gdy proporcje E:T wynosiły 40:1 lub 20:1, nadal występowała istotna różnica pomiędzy badaną szczepionką, a wektorami kontrolnymi (P<0,05), co sugeruje, ze szczepionka ma większą moc do indukowania czynności CTL. Test 6. Wykrywanie specyficznych przeciwciał w surowicy immunizowanych myszy. [0061] Ilość HP-specyficznych przeciwciał w surowicy grupy immunizowanych myszy wykrywa się za pomocą ELISA, 2 i 4 tygodnie po immunizacji (pslc-ph-fc). Pokrótce, płytki mikrotitracyjne powlekane rekombinantowymi białkami p53 inkubuje się przez noc, blokuje 20% surowicą cielęcą i inkubuje kolejno z pierwszorzędowymi przeciwciałami (seryjnie

22 rozcieńczonymi surowicą mysią) i drugorzędowymi przeciwciałami (peroksydaza chrzanowa-koniugowana koźla przeciwmysia IgG). Po przemyciu i wizualizacji za pomocą OPD o-fenylenodiaminy, wartość OD odczytuje się przy 490 nm. Monoklonalne przeciwciało przeciw p53 używa się jako pozytywną próbę kontrolną a zwykłą surowicę mysią używa się jako negatywną próbę kontrolną. [0062] Wynik. Poziom przeciwciała p53 u myszy immunizowanych SLC- HP-Fc jest najwyższy i istotnie wyższy niż ten dla innych wektorów (zobacz fig. 10). Test 7. Immunizacja pslc-hp-fc indukowana ludzką specyficzną CTL przeciw Her2/neu lub p53 in vitro. [0063] Poprzez wirowanie z użyciem środowiska do separacji limfocytów, zbiera się komórki monojądrowe (MNCs) z pełnej obwodowej krwi zdrowych dawców HLA-A2 +. Połowę MNC-ów transfekuje się plazmidem pslc-hp-fc z użyciem liposomu i inkubuje z nietraktowanymi MNC-ami w proporcji 1:1 w 37 przy 5% CO 2. W dniu 6 zlicza się żywe komórki, ponownie zawiesza i hoduje z różnymi docelowymi komórkami przy rozmaitych proporcjach E:T w mikropłytkach 96-studzienkowych. Oznaczenie LDH (Promega Kits) używa się do analizowania cytotoksyczności. [0064] Wynik. Po mieszanej hodowli, pslc-hp-fc transfekuje indukowane MNC specyficzne CTL do niszczenia komórek nowotworowych, które nadwyrażają Her2/neu lub p53 w sposób MHC-restrykcyjny (zobacz fig. 11). Innymi słowy, specyficzne CTL jedynie istotnie niszczą komórki nowotworowe HLA-A2 +, które wyrażają Her2/neu lub p53, wskazując na specyficzność CTL indukowanych przez chemotaktyczną szczepionkę z genem antygenu. Test 8. Efekt przeciw rakowi prostaty szczepionki z genem antygenu chemokiny pslc-3p-fc in vivo. [0065] 5 x 10 4 komórek rakowych B16-3P pcdna-3p transfekowanych B 16 komórek rakowych przez selekcję G418, inokuluje się na boku myszy C57BL/6 (po osiem myszy w każdej grupie). Myszy immunizuje się trzeciego,

23 ósmego i trzynastego dnia po inokulacji komórek guza nowotworowego. Jako grupy kontrolne stosuje się wektor kontrolny, pslc-fc, spig-3p (plazmid zawierający gen peptydu sygnałowego SLC na początku genu 3P). Obserwuje się wielkości guzów nowotworowych i okresy przeżycia myszy. [0066] Wynik. Jak pokazano na fig. 13 i 14, szczepionka z genem antygenu chemokiny pslc-3p-fc istotnie inhibituje wzrost guza nowotworowego (względem grup kontrolnych P<0,05), i istotnie przedłuża okres przeżycia (względem grup kontrolnych P<0,05), co sugeruje, ze zmiana antygenu w chemotaktycznej szczepionce z genem antygenu może wytworzyć inną szczepionkę przeciw związanemu antygenowi.

24 LISTA SEKWENCJI <110> DONGGUAN HAOFA BIO-ENGINEERING DEVELOPMENT CO., LTD <120> REKOMBINANTOWA CHEMOTAKTYCZNA SZCZEPIONKA Z GENEM ANTYGENU <130> CGCNC41111 <160> 13 <170> PatentIn wersja 3.1 <210> 1 <211> 2060 <212> DNA <213> ludzki <400> 1

25 <210> 2 <211> 612 <212> PRT <213> ludzki <400> 2

26 - 25 -

27 - 26 -

28 <210> 3 <211> 512 <212> DNA <213> ludzki <400> 3 <210> 4 <211> 498 <212> DNA <213> ludzki <400> 4 <210> 5 <211> 721 <212> DNA <213> ludzki <400> 5

29 <210> 6 <211> 335 <212> DNA <213> ludzki <400> 6 <210> 7 <211> 1077 <212> DNA <213> ludzki <400> 7

30 <210> 8 <211> 651 <212> DNA <213> ludzki <400> 8 <210> 9 <211> 643 <212> DNA <213> ludzki

31 <400> 9 <210> 10 <211> 1257 <212> DNA <213> mysi <400> 10

32 <210> 11 <211> 652 <212> DNA <213> ludzki i mysi <400> 11 <210> 12 <211> 1928 <212> DNA <213> ludzki i mysi <400> 12

33 <210> 13 <211> 568 <212> PRT <213> ludzki i mysi <400> 13

34 - 33 -

35 - 34 -

36 - 35 -

37 Zastrzeżenia patentowe 1. Rekombinantowa sekwencja genu obejmującej gen ludzkiego SLC, gen antygenu oraz gen fragmentu Fc-IgG1, znamienna tym, że gen SLC jest połączony z końcem genu kodującego antygen oraz gen fragmentu Fc-IgG1 jest połączony z początkiem genu antygenu. 2. Rekombinantowa sekwencja genu według zastrz. 1, znamienna tym, że gen antygenu zawiera Her2/neu, P53, PSA, PAP, PSM, MAGE1, MAGE2, MAGE3, BAGE, GAGE1, GAGE2, CAG3, RAGE, NY-ESO-1, tyrozynazę, CEA, idiotyp Ig, gp100, melan A, gp75, TRP-1, TRP-2, CDK4, CASP-8, ras, bcr/abl, MUC-1 i geny kodujące białka związane z wirusami HCV, HIV i mikroorganizmami patogennymi. 3. Rekombinantowa sekwencja genu według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że miejsca rozpoznawane przez endonukleazę restrykcyjną EcoRI oraz geny trzech glicyn są obecne pomiędzy genem SLC i genem antygenu, a miejsca rozpoznawane przez endonukleazę restrykcyjną EcoRV oraz geny pięciu glicyn są obecne pomiędzy genem antygenu i genem fragmentu Fc-IgG1. 4. Rekombinantowa sekwencja genu według zastrz. 1, znamienna tym, że sekwencją jest SEK ID NR: Rekombinantowa sekwencja genu według zastrz. 1, znamienna tym, że sekwencją jest SEK ID NR: Sekwencja aminokwasowa kodowana przez rekombinantową sekwencję genu według SEK ID NR: Sekwencja aminokwasowa według zastrz. 6, znamienna tym, że sekwencją aminokwasową jest SEK ID NR: Sekwencja aminokwasowa kodowana przez rekombinantową sekwencję genu SEK ID NR: 12 według zastrz. 5, znamienna tym, że sekwencją aminokwasową jest SEK ID NR: 13.

38 Szczepionka genowa obejmująca rekombinantową sekwencję genu według któregokolwiek z zastrz Szczepionka genowa według zastrz. 9, znamienna tym, że sekwencja genowa jest określona przez SEK ID NR: 1, SEK ID NR: 12 lub odpowiadające im sekwencje aminokwasowe.

39

40

41

42

43

44

45

46