PL B1. Sposób wyjaławiania i modyfikacji podłoży hodowlanych stosowanych w hodowli selektantów pleśni Mucor racemosus

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. C12N 1/14 ( ) C12R 1/785 ( ) A61L 2/20 ( ) A61L 101/10 ( ) (54) Sposób wyjaławiania i modyfikacji podłoży hodowlanych stosowanych w hodowli selektantów pleśni Mucor racemosus (73) Uprawniony z patentu: POLITECHNIKA ŁÓDZKA, Łódź, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 20/13 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 08/16 (72) Twórca(y) wynalazku: TADEUSZ ANTCZAK, Łódź, PL ŁUKASZ STAŃCZYK, Łódź, PL KRZYSZTOF ŚMIGIELSKI, Łódź, PL STANISŁAW BIELECKI, Łódź, PL MIROSŁAWA SZCZĘSNA-ANTCZAK, Łódź, PL KRZYSZTOF KROSOWIAK, Łódź, PL KATARZYNA STRUSZCZYK-ŚWITA, Rosanów, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Ewa Kaczur-Kaczyńska

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób wyjaławiania i modyfikacji podłoży hodowlanych stosowanych w hodowli selektantów pleśni Mucor racemosus, w wyniku której powstają preparaty enzymów katalizujące syntezę i hydrolizę estrów i hydrolizę chitozanu. Znane sposoby sterylizacji podłoży hodowlanych przeznaczonych do hodowli pleśni Mucor racemosus, opisane w opisach patentach: PL , , , i w czasopismach: Biotechnologia, (1995), 29, 82 91; Progres in Biotechnology, (2000), 17, ; Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic (2002), 19 20, , Enzyme and Microbial Technology (2006), 39, ; Zeszyty Naukowe Politechniki Łódzkiej, (2001), 884, 1 175, polegają na określonej czasowo termicznej sterylizacji podłoża w środowisku nasyconej pary wodnej pod ciśnieniem równym 1000 hpa i w temperaturze 121 C. Ze zgłoszeń patentowych P , P , P , P , P są znane sposoby termicznego wyjaławiania podłoży hodowlanych przeznaczonych do hodowli selektantów pleśni Mucor racemosus: CH52, A40/3SE, A27/3sTAG, A33/PPDGP, MSA/52. Sposoby te polegają na przetrzymaniu tych podłoży przez 20 minut w autoklawie w nasyconej parze wodnej w temperaturze 121 C pod nadciśnieniem 1000 hpa. Wyjałowione metodą termiczną podłoże należy następnie poddać ochłodzeniu oraz rozprężeniu w celu obniżenia temperatury i ciśnienia i dopiero wtedy możliwym jest jego zaszczepienie kulturą mateczną. Sposób ten jest procesem energochłonnym, wymagającym użycia kosztownych, ciśnieniowych urządzeń, co podwyższa koszt otrzymania preparatów enzymatycznych. W opisie patentowym GB 1,148,279 opisano zastosowanie ozonu do wyjaławiania podłoży zawierających węglowodory, stosowanych do hodowli drożdży. Zgodnie z opisem patentowym PL podłoża melasowe wyjaławia się w drodze ozonowania. Z czasopisma Bioresourse Technology, 2008, tom 99, s jest znane zastosowanie ozonu do wyjaławiania wód odpadowych po przerobie zboża, stosowanych jako podłoże do wytwarzania biomasy Rhizopus oligosporus. W czasopiśmie Agro Przemysł, 2007 roku, tom 3, s opisano zastosowanie technologii ozonowania w przemyśle środków spożywczych i napojów. Znane jest, z czasopisma Gazeta Cukrownicza, 2004 roku, tom 9, s , zastosowanie ozonu do odbarwiania syropów cukrowniczych. W czasopiśmie International Journal of Dairy Technology, 2005 rok, tom 58, s porównano działanie ozonu, temperatury i chloru na przeżywalność bakterii zakażających żywność. W czasopiśmie Journal of Food Protection, 1999, tom 9, s opisano zastosowanie ozonu do zwiększenia mikrobiologicznego bezpieczeństwa i jakości żywności. W czasopiśmie Journal of Food Science, 2001 roku. tom 66, zeszyt 9, s opisano mikrobiologiczny aspekt zastosowania ozonu do zabezpieczania żywności, zaś w czasopiśmie Journal of Food Science, 2005 rok, tom 70, s. M197-M201 wykazano bójcze działanie ozonu na szczepy bakterii Escherichia coli i Salmonella. W kolekcji Instytutu Biochemii Technicznej Politechniki Łódzkiej znajdują się selektanty pleśni Mucor racemosus wykorzystywane w przykładach realizacji wynalazku. Sposób wyjaławiania i modyfikacji podłoży hodowlanych stosowanych w hodowli selektantów pleśni Mucor racemosus, inokularnych i produkcyjnych ciekłych, zawierających namok kukurydziany, oliwę z oliwek lub olej oraz wodę wodociągową, a w przypadku ciekłych produkcyjnych dodatkowo porowaty stały nośnik w postaci pianki poliuretanowej, oraz produkcyjnych stałych zawierających śrutę kukurydzianą, wysłodki buraczane, wytłoki rzepakowe i wodę wodociągową, z wykorzystaniem ozonu, według wynalazku polega na tym, że podłoże poddaje się działaniu mieszaniny ozonu i powietrza wprowadzanej w sposób ciągły przy ciśnieniu 500 hpa w temperaturze C. Podłoże inokularne poddaje się działaniu mieszaniny ozonu i powietrza o zawartości ozonu g/m 3, wprowadzanej do kolb z tym podłożem przez spiek o porowatości G4, z prędkością 0,1 0,2 l/min w czasie 5 10 min. Ciekłe podłoże produkcyjne poddaje się działaniu mieszaniny ozonu i powietrza o zawartości ozonu g/m 3, wprowadzanej do fermentora z tym podłożem z prędkością 0,2 0,6 l/min w czasie 30 min przewodem przeznaczonym do napowietrzania podłoża w trakcie hodowli produkcyjnej, przy mieszaniu podłoża z szybkością obrotową 120 min -1. Stałe podłoże produkcyjne poddaje się działaniu mieszaniny ozonu i powietrza o zawartości ozonu g/m 3, wprowadzanej do kolb z tym podłożem z prędkością 0,1 0,4 l/min w czasie 10 min, przy wstrząsaniu kolb co 15 s.

3 PL B1 3 W wyniku hodowli selektantów pleśni Mucor racemosus na podłożach wyjałowionych sposobem według wynalazku otrzymuje się preparaty lipaz i esteraz o wyższej 28 65% całkowitej aktywności katalitycznej w porównaniu z całkowitą aktywnością katalityczną preparatów otrzymanych w wyniku hodowli na podłożach sterylizowanych Stosując sposób wyjaławiania według wynalazku eliminuje się operację ogrzewania i schładzania podłoży konieczną w przypadku ich termicznej sterylizacji skraca czas hodowli, co dodatkowo obniża koszt procesu wytwarzania enzymów w drodze tej hodowli. Sposób według wynalazku ilustrują bliżej podane niżej przykłady. P r z y k ł a d I Podłoże hodowlane inokularne o składzie w częściach wagowych: 29 części oliwy z oliwek, 41 części namoku kukurydzianego firmy Roquette oraz 1000 części wody wodociągowej o barwie większej niż 5 mg Pt (PN-EN ISO 7887:2002), mętności nie większej niż 0,4 NTU (PN-EN ISO 7027:2003), przewodności nie większej niż 500 S/cm (PN-EN-27888:1999), ph w zakresie 7,1 7,4 (PN-90/C ), ChZT nie większym niż 1,75 (PN-ISO 15705:2005 PB-22.00:2009), twardości nie większej niż 15 n, o zawartości azotanów nie większej niż 4 mg/l (PB-03.00:2008) i żelaza nie większej niż 0,2 mg/l (PN-ISO 6332 : 2001) oraz wyjściowym ph równym 4,9 wprowadzano w ilości 200 ml do kolb o objętości 1000 ml i poddawano ozonowaniu za pomocą mieszaniny ozonu i powietrza o zawartości ozonu 80 g/m 3, wprowadzanej z prędkością 0,2 l/min przy nadciśnieniu 500 hpa, przez spiek G4, w temperaturze C, w czasie 10 min. Po 30 min od zakończenia sterylizacji podłoże inokularne szczepiono selektantem pleśni Mucor racemosus A40/3SE, którego zarodniki hodowano na sterylnym podłożu stałym zawierającym w częściach wagowych: agaru 30 części, 1000 części brzeczki piwowarskiej o stężeniu 8 Be, a nadto 0,5 części oleinianu oleilu i zmywano sterylną solą fizjologiczną zawierającą 0,01% Tritonu X-100, stosując 1 cm 3 zarodników na 100 cm 3 podłoża i prowadzono hodowlę wstrząsaną w temperaturze C, w czasie 18 godz. i szybkości obrotowej wstrząsarki 180 min -1. Otrzymanym inokulum zaszczepiono podłoże produkcyjne o składzie identycznym jak skład podłoża inokularnego, o objętości 18 l, znajdujące się w fermentorze produkcyjnym o objętości całkowitej 24 l, stosując 10% objętościowych inokulum w stosunku do objętości podłoża. Podłoże produkcyjne było uprzednio wysterylizowane za pomocą mieszaniny ozonu i powietrza o zawartości ozonu 80 g/m 3, wprowadzanej z prędkością 0,2 l/min przy nadciśnieniu 500 hpa, w temperaturze C w czasie 30 min, za pomocą przewodu do doprowadzania powietrze do podłoża w fermentorze, przy mieszaniu podłoża mieszadłem z szybkością obrotową 120 min -1, następnie podgrzane do temperatury 30 C oraz wysycone sterylnym powietrzem przez 10 min. Do mieszadła umieszczonego w fermentorze zamocowano w powtarzalny sposób prostopadłościenne płaty pianki poliuretanowej na bazie poliolu polieteru o całkowicie otwartej strukturze komórkowej, tzw. pianki retykulowanej, uzyskanej w wyniku procesu termicznej retykulacji, o numerze klasyfikacyjnym S 28133, o wymiarach 250 x 120 x 10 mm, charakteryzującej się gęstością kg/m 3, wytrzymałością na rozciąganie 150 kpa i średnicą porów 1,08 1,58 mm. Hodowlę produkcyjną prowadzono w temperaturze C w czasie 65 godz., w obecności środków przeciwdziałających pienieniu, przy mieszaniu z szybkością obrotową 120 min -1, doprowadzając powietrze w ilości 1 część objętościowa na 1 część objętościową podłoża w czasie 1 min. Otrzymane w wyniku hodowli produkcyjnej płaty pianki poliuretanowej, przerośnięte biomasą Mucor racemosus A40/3SE, po oddzieleniu od cieczy pohodowlanej na drodze filtracji, przemywano wodą w celu odmycia rozpuszczalnych produktów metabolizmu monitorowanego pomiarem absorbancji A<0,05 dla długości fali =280 nm, zalewano kolejno 3 porcjami acetonu schłodzonego do temperatury 4 C, stosowanego w ilości 15 części wagowych na 1 część wagową pianki przerośniętej biomasą i odwadniano 10 min w zakrytym naczyniu umieszczonym na wytrząsarce o szybkości obrotowej 120 min -1. Odwodnioną i odlipidowaną biomasę, zaadsorbowaną w porach pianki poliuretanowej, suszono na powietrzu w czasie 18 godz. w temperaturze pokojowej. w reakcji syntezy oleinianu oleilu, wyższej o 40% w porównaniu z aktywnością syntetyczną w tej samej reakcji preparatu enzymów otrzymanego w wyniku hodowli na podłożach sterylizowanych P r z y k ł a d II Podłoże hodowlane produkcyjne o składzie w częściach wagowych: 107 części oliwy z oliwek, 58 części namoku kukurydzianego firmy Roquette oraz 1000 części wody wodociągowej o właściwościach jak w przykładzie 1, poddano sterylizacji jak podłoże produkcyjne w przykładzie 1, przy czym stosowano mieszaninę ozonu i powietrza zawierającą ozonu 120 g/m 3, wprowadzaną z szybkością

4 4 PL B1 0,3 l/min. Na podłożu tym hodowano selektant szczepu Mucor racemosus A40/3SE jak w przykładzie I i wyodrębniono preparat enzymatyczny postępując jak w przykładzie I. w reakcji syntezy oleinianu oleilu, wyższej o 63% w porównaniu z aktywnością syntetyczną w tej samej reakcji preparatu enzymów otrzymanego w wyniku hodowli na podłożach sterylizowanych P r z y k ł a d III Podłoże hodowlane produkcyjne o składzie w częściach wagowych: 29 części oleju słonecznikowego, 41 części namoku kukurydzianego firmy Roquette oraz 1000 części wody wodociągowej o właściwościach jak w przykładzie 1 poddano sterylizacji jak w przykładzie I. Na podłożu tym hodowano selektant szczepu Mucor racemosus A40/3SE jak w przykładzie I i wyodrębniono preparat enzymatyczny postępując w przykładzie I. w reakcji syntezy oleinianu oleilu, wyższej o 55% w porównaniu z aktywnością syntetyczną w tej samej reakcji preparatu enzymów otrzymanego w wyniku hodowli na podłożach sterylizowanych P r z y k ł a d IV Podłoże hodowlane produkcyjne o składzie w częściach wagowych: 105 części oleju słonecznikowego, 56 części namoku kukurydzianego firmy Roquette oraz 1000 części wody wodociągowej o właściwościach jak w przykładzie I poddano sterylizacji jak w przykładzie I, przy czym stosowano mieszaninę ozonu i powietrza zawierającą ozonu 130 g/m 3, wprowadzaną z szybkością 0,4 l/min. Na podłożu tym hodowano selektant szczepu Mucor racemosus A40/3SE jak w przykładzie I i wyodrębniono preparat enzymatyczny postępując jak w przykładzie I. w reakcji syntezy oleinianu oleilu, wyższej o 64% w porównaniu z aktywnością syntetyczną w tej samej reakcji preparatu enzymów otrzymanego w wyniku hodowli na podłożach sterylizowanych P r z y k ł a d V Podłoże hodowlane produkcyjne o składzie w częściach wagowych: 29 części oleju rzepakowego, 41 części namoku kukurydzianego firmy Roquette oraz 1000 części wody wodociągowej o właściwościach ozonu i powietrza zawierającą ozonu 180 g/m 3, wprowadzaną z szybkością 0,2 l/min. Na podłożu tym hodowano selektant szczepu Mucor racemosus A40/3SE jak w przykładzie I i wyodrębniono preparat enzymatyczny postępując jak w przykładzie I. w reakcji syntezy oleinianu oleilu, wyższej o 39% w porównaniu z aktywnością syntetyczną w tej samej reakcji preparatu enzymów otrzymanego w wyniku hodowli na podłożach sterylizowanych P r z y k ł a d VI Podłoże hodowlane produkcyjne o składzie w częściach wagowych: 109 części oleju rzepakowego, 59 części namoku kukurydzianego firmy Roquette oraz 1000 części wody wodociągowej o właściwościach ozonu i powietrza zawierającą ozonu 140 g/m 3, wprowadzaną z szybkością 0,3 l/min. Na podłożu tym hodowano selektant szczepu Mucor racemosus A40/3SE jak w przykładzie I i wyodrębniono preparat enzymatyczny postępując jak w przykładzie I. w reakcji syntezy oleinianu oleilu, wyższej o 58% w porównaniu z aktywnością syntetyczną w tej samej reakcji preparatu enzymów otrzymanego w wyniku hodowli na podłożach sterylizowanych P r z y k ł a d VII Podłoże hodowlane inokularne o składzie w częściach wagowych: 0,5 części handlowej chityny, 27 części oliwy z oliwek, 37 części namoku kukurydzianego firmy Roquette oraz 1000 części wody wodociągowej o właściwościach jak w przykładzie I wprowadzano w ilości 200 ml do kolb o objętości 1000 ml i poddano ozonowaniu za pomocą mieszaniny ozonu i powietrza o zawartości ozonu 90 g/m 3, wprowadzanej z prędkością 0,2 l/min przy nadciśnieniu 500 hpa, przez spiek o porowatości G4, w temperaturze C, w czasie 10 min. Po 30 min od zakończenia sterylizacji podłoże inokularne

5 PL B1 5 szczepiono selektantem pleśni Mucor racemosus CH52/3SC, którego zarodniki hodowano na sterylnym podłożu stałym zawierającym w częściach wagowych: agaru 30 części, 1000 części brzeczki piwowarskiej o stężeniu 8 Be, a nadto 0,5 części koloidalnej chityny i zmywano sterylną solą fizjologiczną zawierającą 0,01% Tritonu X-100, stosując 1 cm 3 zarodników na 100 cm 3 podłoża i prowadzono hodowlę wstrząsaną w temperaturze C, w czasie 18 godz. i szybkości obrotowej wstrząsarki 180 min -1. Otrzymanym inokulum zaszczepiono podłoże produkcyjne o identycznym jak inokulum składzie, o objętości 18 l znajdujące się w fermentorze produkcyjnym o objętości całkowitej 24 l, stosując 10% objętościowych inokulum w stosunku do objętości podłoża. Podłoże produkcyjne było uprzednio wysterylizowane za pomocą mieszaniny ozonu i powietrza o zawartości ozonu 90 g/m 3 wprowadzanej z prędkością 0,4 l/min przy nadciśnieniu 500 hpa, w temperaturze C w czasie 30 min za pomocą przewodu do doprowadzania powietrze do podłoża podczas hodowli, mieszanego mieszadłem z szybkością obrotową 120 min -1 i następnie podgrzane do temperatury 30 C i wysycone sterylnym powietrzem przez 10 min. Do mieszadła umieszczonego w fermentorze zamocowano w powtarzalny sposób prostopadłościenne płaty pianki poliuretanowej na bazie poliolu polieteru o całkowicie otwartej strukturze komórkowej (tak zwanej pianki retykulowanej, uzyskanej w wyniku procesu termicznej retykulacji, numer kwalifikacyjny TM 23280, charakteryzującej się następującymi parametrami fizykochemicznymi: gęstością kg/m 3, wytrzymałością na rozciąganie 70 kpa i średnicą porów 2,2 3,4 mm, o wymiarach 250 x 120 x 10 mm (wysokość/szerokość/grubość). Hodowlę prowadzono w temperaturze C w czasie 60 godz., w obecności środków przeciwdziałających pienieniu, przy mieszaniu z szybkością obrotową 120 min -1, doprowadzając powietrze w ilości 1 część objętościowa na 1 część objętościową podłoża w czasie 1 min. Z otrzymanymi w wyniku hodowli produkcyjnej płatami pianki poliuretanowej, przerośniętymi biomasą Mucor racemosus CH52/3SC, postępowano jak w przykładzie I. Otrzymano nierozpuszczalny preparat enzymów o całkowitej aktywności, endochitozanazy wyższej o 27% i całkowitej aktywności egzochitozanazy wyższej o 29% w porównaniu z całkowitą aktywnością endochitozanazy i całkowitą aktywnością egzochitozanazy preparatu enzymów otrzymanego w wyniku hodowli na podłożach sterylizowanych P r z y k ł a d VIII Podłoże hodowlane produkcyjne o składzie w częściach wagowych: 1 część wagowa handlowego chitozanu, 79 części oliwy z oliwek, 48 części namoku kukurydzianego firmy Roquette oraz 1000 części wody wodociągowej o właściwościach jak w przykładzie VII poddano sterylizacji, jak w przykładzie I, przy czym stosowano mieszaninę ozonu i powietrza zawierającą ozonu 120 g/m 3, wprowadzaną z szybkością 0,3 l/min. Na podłożu tym hodowano selektant szczepu Mucor racemosus CH52/3SC jak w przykładzie VII i wyodrębniono preparat enzymatyczny postępując jak w przykładzie I. Otrzymano nierozpuszczalny preparat enzymów o całkowitej aktywności, endochitozanazy wyższej o 47% i całkowitej aktywności egzochitozanazy wyższej o 30% w porównaniu z całkowitą aktywnością endochitozanazy i całkowitą aktywnością egzochitozanazy preparatu enzymów otrzymanego w wyniku hodowli na podłożach sterylizowanych P r z y k ł a d IX Podłoże hodowlane produkcyjne o składzie w częściach wagowych: 0,3 części handlowego chitozanu, 29 części oleju rzepakowego, 41 części namoku kukurydzianego firmy Roquette oraz 1000 części wody wodociągowej o właściwościach jak w przykładzie I poddano sterylizacji jak w przykładzie I, przy czym stosowano mieszaninę ozonu i powietrza zawierającą ozonu 70 g/m 3, wprowadzaną z szybkością 0,6 l/min. Na podłożu tym hodowano selektant szczepu Mucor racemosus CH52/3SC jak w przykładzie VII i wyodrębniono preparat enzymatyczny postępując jak w przykładzie I. Otrzymano nierozpuszczalny preparat enzymów o całkowitej aktywności, endochitozanazy wyższej o 39% i całkowitej aktywności egzochitozanazy wyższej o 28% w porównaniu z całkowitą aktywnością endochitozanazy i całkowitą aktywnością egzochitozanazy preparatu enzymów otrzymanego w wyniku hodowli na podłożach sterylizowanych P r z y k ł a d X Podłoże hodowlane produkcyjne o składzie w częściach wagowych: 1 część handlowej chityny, 77 części oleju rzepakowego, 47 części namoku kukurydzianego firmy Roquette oraz 1000 części wody wodociągowej o właściwościach jak w przykładzie I poddano sterylizacji jak w przykładzie I, przy czym stosowano mieszaninę ozonu i powietrza zawierającą ozonu 140 g/m 3, wprowadzaną z szybkością 0,2 l/min. Na podłożu tym hodowano selektant szczepu Mucor racemosus CH52/3SC jak w przykładzie VII i wyodrębniono preparat enzymatyczny postępując jak w przykładzie I. Otrzymano nieroz-

6 6 PL B1 puszczalny preparat enzymów o całkowitej aktywności, endochitozanazy wyższej o 41% i całkowitej aktywności egzochitozanazy wyższej o 36% w porównaniu z całkowitą aktywnością endochitozanazy i całkowitą aktywnością egzochitozanazy preparatu enzymów otrzymanego w wyniku hodowli na podłożach sterylizowanych P r z y k ł a d XI Podłoże hodowlane inokularne o składzie w częściach wagowych jak w przykładzie I wprowadzano w ilości 200 ml do kolb o objętości 1000 ml i poddawano ozonowaniu za pomocą mieszaniny ozonu i powietrza o zawartości ozonu 90 g/m 3, wprowadzanej z prędkością 0,2 l/min przy nadciśnieniu 500 hpa, przez spiek o porowatości G4, w temperaturze C, w czasie 10 min. Po 30 min od zakończenia sterylizacji podłoże inokularne szczepiono selektantem pleśni Mucor racemosus A27/3sTAG, którego zarodniki hodowano na sterylnym podłożu stałym zawierającym w częściach wagowych: agaru części, 1000 części brzeczki piwowarskiej o stężeniu 8 Be, a nadto 0,5 części tripalmitynianu glicerolu i zmywano sterylną solą fizjologiczną zawierającą 0,01% Tritonu X-100, stosując 1 cm 3 zarodników na 100 cm 3 podłoża i prowadzono hodowlę wstrząsaną w temperaturze C, w czasie 18 godz. i szybkości obrotowej wstrząsarki 180 min -1. Otrzymanym inokulum zaszczepiono podłoże produkcyjne o składzie identycznym jak skład podłoża inokularnego, o objętości 18 l znajdujące się w fermentorze produkcyjnym o objętości całkowitej 24 l, stosując 10% objętościowych inokulum w stosunku do objętości podłoża. Podłoże produkcyjne było uprzednio wysterylizowane za pomocą mieszaniny ozonu i powietrza o zawartości ozonu 80 g/m 3 wprowadzanej z prędkością 0,2 l/min przy nadciśnieniu 500 hpa, w temperaturze C w czasie 30 min, za pomocą przewodu do doprowadzania powietrze do podłoża podczas hodowli, mieszanego mieszadłem z szybkością obrotową 120 min -1, a następnie podgrzane do temperatury 30 C i wysycone sterylnym powietrzem przez 10 min. Do mieszadła umieszczonego w fermentorze zamocowano w powtarzalny sposób prostopadłościenne płaty pianki poliuretanowej będące porowatym nośnikiem hodowanego selektanta w postaci prostopadłościennych płatów pianki poliuretanowej na bazie poliolu poliestrowego o całkowicie otwartej strukturze komórkowej, tzw. pianki retykulowanej, uzyskanej w wyniku procesu termicznej retykulacji, o numerze klasyfikacyjnym S28280, charakteryzującej się gęstością kg/m 3, wytrzymałością na rozciąganie 100 kpa, średnicą porów 2,30 3,30 mm, o wymiarach 250 x 120 x 10 mm. Hodowlę prowadzono w temperaturze C w czasie 65 godz., w obecności środków przeciwdziałających pienieniu, przy mieszaniu z szybkością obrotową 120 min -1, doprowadzając powietrze w ilości 1 część objętościowa na 1 część 20 objętościową podłoża w czasie 1 min. Z otrzymanymi w wyniku hodowli produkcyjnej płatami pianki poliuretanowej, przerośniętymi biomasą Mucor racemosus A27/3sTAG postępowano jak w przykładzie I. Otrzymano nierozpuszczalny preparat enzymów o całkowitej aktywności, mierzonej w reakcji acydolizy oleju rzepakowego kwasem palmitynowym, wyższej o 32% w porównaniu z całkowitą aktywnością w tej samej reakcji preparatu enzymów otrzymanego w wyniku hodowli na podłożach sterylizowanych P r z y k ł a d XII Podłoże hodowlane produkcyjne o składzie w częściach wagowych: 109 części oliwy z oliwek, 56 części namoku kukurydzianego firmy Roquette oraz 1000 części wody wodociągowej o właściwościach ozonu i powietrza zawierającą ozonu 130 g/m 3, wprowadzaną z szybkością 0,4 l/min. Na podłożu tym hodowano selektant szczepu Mucor racemosus A27/3sTAG jak w przykładzie I i wyodrębniono preparat enzymatyczny postępując jak w przykładzie I. acydolizy oleju rzepakowego kwasem palmitynowym, wyższej o 55% w porównaniu z aktywnością całkowitą w tej samej reakcji preparatu enzymów otrzymanego w wyniku hodowli na podłożach sterylizowanych P r z y k ł a d XIII Podłoże hodowlane produkcyjne o składzie w częściach wagowych: 27 części oleju słonecznikowego, 37 części namoku kukurydzianego firmy Roquette oraz 1000 części wody wodociągowej o właściwościach jak w przykładzie I poddano sterylizacji jak w przykładzie I. Na podłożu tym hodowano selektant szczepu Mucor racemosus A27/3sTAG jak w przykładzie I i wyodrębniono preparat enzymatyczny postępując w przykładzie I. acydolizy oleju rzepakowego kwasem palmitynowym, wyższej o 52% w porównaniu z aktywnością

7 PL B1 7 całkowitą w tej samej reakcji preparatu enzymów otrzymanego w wyniku hodowli na podłożach sterylizowanych P r z y k ł a d XIV Podłoże hodowlane produkcyjne o składzie w częściach wagowych: 109 części oleju rzepakowego, 58 części namoku kukurydzianego firmy Roquette oraz 1000 części wody wodociągowej o właściwościach jak w przykładzie 1 poddano sterylizacji jak w przykładzie I, przy czym stosowano mieszaninę ozonu i powietrza zawierającą ozonu 150 g/m 3, wprowadzaną z szybkością 0,4 l/min. Na podłożu tym hodowano selektant szczepu Mucor racemosus A27/3sTAG jak w przykładzie I i wyodrębniono preparat enzymatyczny postępując jak w przykładzie I. acydolizy oleju rzepakowego kwasem palmitynowym, wyższej o 60% w porównaniu z aktywnością całkowitą w tej samej reakcji preparatu enzymów otrzymanego w wyniku hodowli na podłożach sterylizowanych P r z y k ł a d XV Podłoże hodowlane inokularne o składzie w częściach wagowych: 44 części oliwy z oliwek, 46 części namoku kukurydzianego firmy Roquette oraz 1000 części wody wodociągowej o właściwościach jak w przykładzie I wprowadzano w ilości 200 ml do kolb o objętości 1000 ml i poddano ozonowaniu za pomocą mieszaniny ozonu i powietrza o zawartości ozonu 100 g/m 3, wprowadzanej z prędkością 0,1 l/min przy nadciśnieniu 500 hpa, przez spiek o porowatości G4, w temperaturze C, w czasie 5 min. Po 30 minutach od zakończenia sterylizacji podłoże inokularne szczepiono selektantem pleśni Mucor racemosus A33/PPDGP, którego zarodniki hodowano na sterylnym podłożu stałym zawierającym w częściach wagowych: agaru 30 części, 1000 części brzeczki piwowarskiej o stężeniu 8 Be, a nadto 0,2 części distearynianu glikolu polietylenowego Mc 6000 i zmywano sterylną solą fizjologiczną zawierającą 0,01% Tritonu X-100, stosując 1 cm 3 zarodników na 100 cm 3 podłoża i prowadzono hodowlę wstrząsaną w temperaturze C, w czasie 18 godz. przy szybkości obrotowej wstrząsarki 180 min -1. Otrzymanym inokulum zaszczepiono, podłoże produkcyjne o składzie identycznym jak skład podłoża inokularnego, o objętości 18 l znajdujące się w fermentorze produkcyjnym o objętości całkowitej 24 l, stosując 10% objętościowych inokulum w stosunku do objętości podłoża. Podłoże produkcyjne było uprzednio wysterylizowane za pomocą mieszaniny ozonu i powietrza o zawartości ozonu 80 g/m 3 wprowadzanej z prędkością 0,2 l/min przy nadciśnieniu 500 hpa w temperaturze C w czasie 30 min, za pomocą przewodu do doprowadzania powietrze do podłoża podczas hodowli, mieszanego mieszadłem z szybkością obrotową 120 min -1, następnie podgrzane do temperatury 30 C i wysycane sterylnym powietrze przez 10 min. Do mieszadła umieszczonego w fermentorze zamocowano w powtarzalny sposób prostopadłościenne płaty pianki poliuretanowej na bazie poliolu poliestrowego, o całkowicie otwartej strukturze komórkowej, tzw. pianki retykulowanej, uzyskanej w wyniku procesu termicznej retykulacji, o numerze klasyfikacyjnym S31380, charakteryzującej się gęstością kg/m 3, wytrzymałością na rozciąganie 125 kpa, średnicą porów 3,40 4,20 mm, o wymiarach 250 x 120 x 10 mm. Hodowlę prowadzono w temperaturze C w czasie 60 godz., w obecności środków przeciwdziałających pienieniu, przy mieszaniu z szybkością obrotową 120 min -1, doprowadzając powietrze w ilości 1 część objętościowa na 1 część objętościową podłoża w czasie 1 min. Z otrzymanymi w wyniku hodowli produkcyjnej płatami pianki poliuretanowej, przerośniętymi biomasą Mucor racemosus A33/PPDGP postępowano jak w przykładzie I. hydrolizy oligopeptydów, wyższej o 52% w porównaniu z aktywnością całkowitą w tej samej reakcji preparatu enzymów otrzymanego w wyniku hodowli na podłożach sterylizowanych P r z y k ł a d XVI Podłoże hodowlane produkcyjne o składzie w częściach wagowych: 109 części oliwy z oliwek, 58 części namoku kukurydzianego firmy Roquette oraz 1000 części wody wodociągowej o właściwościach ozonu i powietrza zawierającą ozonu 160 g/m 3, wprowadzaną z szybkością 0,2 l/min. Na podłożu tym hodowano selektant szczepu Mucor racemosus A33/PPDGP jak w przykładzie XV i wyodrębniono preparat enzymatyczny postępując jak w przykładzie I. hydrolizy oligopeptydów, wyższej o 62% w porównaniu z aktywnością całkowitą w tej samej reakcji preparatu enzymów otrzymanego w wyniku hodowli na podłożach sterylizowanych

8 8 PL B1 P r z y k ł a d XVII Podłoże hodowlane produkcyjne o składzie w częściach wagowych: 29 części oleju słonecznikowego, 41 części namoku kukurydzianego firmy Roquette oraz 1000 części wody wodociągowej o właściwościach jak w przykładzie I poddano sterylizacji jak w przykładzie I, przy czym stosowano mieszaninę ozonu i powietrza zawierającą ozonu 110 g/m 3, wprowadzaną z szybkością 0,1 l/min. Na podłożu tym hodowano selektant szczepu Mucor racemosus A33/PPDGP jak w przykładzie XV i wyodrębniono preparat enzymatyczny postępując jak w przykładzie I. hydrolizy oligopeptydów, wyższej o 50% w porównaniu z aktywnością całkowitą w tej samej reakcji preparatu enzymów otrzymanego w wyniku hodowli na podłożach sterylizowanych P r z y k ł a d XVIII Podłoże hodowlane produkcyjne o składzie w częściach wagowych: 109 części oleju słonecznikowego, 47 części namoku kukurydzianego firmy Roquette oraz 1000 części wody wodociągowej o właściwościach jak w przykładzie I poddano sterylizacji jak w przykładzie I, przy czym stosowano mieszaninę ozonu i powietrza zawierającą ozonu 160 g/m 3, wprowadzaną z szybkością 0,2 l/min. Na podłożu tym hodowano selektant szczepu Mucor racemosus A33/PPDGP jak w przykładzie XV i wyodrębniono preparat enzymatyczny postępując jak w przykładzie I. hydrolizy oligopeptydów, wyższej o 61% w porównaniu z aktywnością całkowitą w tej samej reakcji preparatu enzymów otrzymanego w wyniku hodowli na podłożach sterylizowanych P r z y k ł a d XIX Podłoże hodowlane produkcyjne o składzie w częściach wagowych: 29 części o oleju rzepakowego, 41 części namoku kukurydzianego firmy Roquette oraz 1000 części wody wodociągowej o właściwościach ozonu i powietrza zawierającą ozonu 90 g/m 3, wprowadzaną z szybkością 0,3 l/min. Na podłożu tym hodowano selektant szczepu Mucor racemosus A33/PPDGP jak w przykładzie XV i wyodrębniono preparat enzymatyczny postępując jak w przykładzie I. hydrolizy oligopeptydów, wyższej o 60% w porównaniu z aktywnością całkowitą w tej samej reakcji preparatu enzymów otrzymanego w wyniku hodowli na podłożach sterylizowanych P r z y k ł a d XX Podłoże hodowlane produkcyjne o składzie w częściach wagowych: 109 części oleju rzepakowego, 58 części namoku kukurydzianego firmy Roquette oraz 1000 części wody wodociągowej o właściwościach ozonu i powietrza zawierającą ozonu 180 g/m 3, wprowadzaną z szybkością 0,2 l/min. Na podłożu tym hodowano selektant szczepu Mucor racemosus A33/PPDGP jak w przykładzie i wyodrębniono preparat enzymatyczny postępując jak w przykładzie I. hydrolizy oligopeptydów, wyższej o 65% w porównaniu z aktywnością całkowitą w tej samej reakcji preparatu enzymów otrzymanego w wyniku hodowli na podłożach sterylizowanych P r z y k ł a d XXI Podłoże hodowlane produkcyjne o składzie w częściach wagowych: 12,09 części wagowych śruty kukurydzianej o średniej średnicy drobin 2,51 mm, 11,92 części wagowych wysłodków buraczanych o średniej średnicy drobin 2,55 mm, 8,24 części wagowych wytłoków rzepakowych o średniej średnicy drobin 0,60 mm i 115 części wagowych wody wodociągowej o właściwościach jak w przykładzie I oraz wyjściowym ph równym 4,85 poddano ozonowaniu za pomocą mieszaniny ozonu i powietrza o zawartości ozonu 90 g/m 3, wprowadzanej z prędkością 0,4 l/min przy nadciśnieniu 500 hpa przez 10 min w temperaturze C, do kolby stożkowej o objętości 1000 ml, wstrząsając co 15 s umieszczone w niej podłoże hodowlane. Po czasie 20 min, od zakończenia procesu sterylizacji, podłoże szczepiono selektantem pleśni Mucor racemosus MSA52, którego zarodniki hodowano na sterylnym podłożu stałym zawierającym w częściach wagowych: agaru 30 części, 1000 części brzeczki piwowarskiej o stężeniu 8 Be, a nadto zawierające 0,01 części wagowych oleju rzepakowego i zmywano sterylną solą fizjologiczną zawierającą 0,01% Tritonu X-100. Statyczną hodowlę produkcyjną prowadzono w temperaturze C w czasie 3 dni mieszając stałe podłoże hodowlane co 24 godz. Do uzyskanej po hodowli mieszaniny grzybni oraz niewykorzystanych, stałych składników podłoża wprowadzano 300 ml acetonu i intensywnie mieszając prowadzono ekstrakcję składników rozpusz-

9 PL B1 9 czalnych, po czym ekstrakt sączono na przegrodzie ceramicznej. Ekstrakcję powtarzano 3-krotnie. Otrzymany stały preparat enzymatyczny suszono w temperaturze 21 C przez 24 godziny, mielono w młynie udarowym i przechowywano w temperaturze pokojowej w zamkniętych naczyniach. Otrzymano nierozpuszczalny preparat enzymów o całkowitej aktywności lipolitycznej wyższej o 48% w porównaniu z całkowitą aktywnością lipolityczną preparatu enzymów otrzymanego w wyniku hodowli na podłożach sterylizowanych P r z y k ł a d XXII Podłoże hodowlane produkcyjne o składzie w częściach wagowych: 12,09 części wagowych śruty kukurydzianej o średniej średnicy drobin 2,51 mm, 15,05 części wagowych wytłoków jabłkowych, 8,24 części wagowych wytłoków rzepakowych o średniej średnicy drobin 0,60 mm i 115,00 części wagowych wody wodociągowej o właściwościach jak w przykładzie I poddano sterylizacji jak w przykładzie XXI, przy czym stosowano mieszaninę ozonu i powietrza zawierającą ozonu 120 g/m 3, wprowadzaną z szybkością 0,2 l/min. Na podłożu tym hodowano selektant szczepu Mucor racemosus MSA52 i wyodrębniono preparat enzymatyczny postępując jak w przykładzie XXI. Otrzymano nierozpuszczalny preparat enzymów o całkowitej aktywności lipolitycznej wyższej o 54% w porównaniu z całkowitą aktywnością lipolityczną preparatu enzymów otrzymanego w wyniku hodowli na podłożach sterylizowanych P r z y k ł a d XXIII Podłoże hodowlane o składzie w częściach wagowych: 12,09 części wagowych śruty kukurydzianej o średniej średnicy drobin 2,51 mm, 11,92 części wagowych wysłodków buraczanych o średniej średnicy drobin 2,55 mm, 8,24 części wagowych wytłoków słonecznikowych o średniej średnicy drobin 0,69 mm i 115,00 części wagowych wody wodociągowej o właściwościach jak w przykładzie I poddano sterylizacji jak w przykładzie V przy czym stosowano mieszaninę ozonu i powietrza zawierającą ozonu 180 g/m 3, wprowadzaną z szybkością 0,1 l/min. Na podłożu tym hodowano selektant szczepu Mucor racemosus MSA52 i wyodrębniono preparat enzymatyczny postępując jak w przykładzie XXI. Otrzymano nierozpuszczalny preparat enzymów o całkowitej aktywności lipolitycznej wyższej o 44% w porównaniu z całkowitą aktywnością lipolityczną preparatu enzymów otrzymanego w wyniku hodowli na podłożach sterylizowanych Zastrzeżenie patentowe Sposób wyjaławiania i modyfikacji podłoży hodowlanych stosowanych w hodowli selektantów pleśni Mucor racemosus, inokularnych i produkcyjnych ciekłych, zawierających namok kukurydziany, oliwę z oliwek lub olej oraz wodę wodociągową, a w przypadku produkcyjnych ciekłych dodatkowo porowaty stały nośnik w postaci pianki poliuretanowej, oraz produkcyjnych stałych zawierających śrutę kukurydzianą, wysłodki buraczane, wytłoki rzepakowe i wodę wodociągową, z wykorzystaniem ozonu, znamienny tym, że podłoże poddaje się działaniu mieszaniny ozonu i powietrza wprowadzanej w sposób ciągły przy ciśnieniu 500 hpa w temperaturze C, przy czym podłoże inokularne poddaje się działaniu mieszaniny ozonu i powietrza o zawartości ozonu g/m 3, wprowadzanej do kolb z tym podłożem przez spiek o porowatości G4, z prędkością 0,1 0,2 l/min w czasie 5 10 min, ciekłe podłoże produkcyjne poddaje się działaniu mieszaniny ozonu i powietrza o zawartości ozonu g/m 3, wprowadzanej do fermentera z tym podłożem z prędkością 0,2 0,6 l/min w czasie 30 min przewodem przeznaczonym do napowietrzania podłoża w trakcie hodowli produkcyjnej, przy mieszaniu podłoża z szybkością obrotową 120 min -1, zaś stałe podłoże produkcyjne poddaje się działaniu mieszaniny ozonu i powietrza o zawartości ozonu g/m 3, wprowadzanej do kolb z tym podłożem z prędkością 0,1 0,4 l/min w czasie 10 min, przy wstrząsaniu kolb co 15 s.

10 10 PL B1 Departament Wydawnictw UPRP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)