Dr Anna Krzepiłko Zamość Wydział Nauk Rolniczych w Zamościu Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie ul. Szczebrzeska Zamość

Transkrypt

1 Dr Anna Krzepiłko Zamość Wydział Nauk Rolniczych w Zamościu Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie ul. Szczebrzeska Zamość Autoreferat 1. Imię i Nazwisko: Anna Krzepiłko 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe/ artystyczne z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej: -stopień magistra biologii specjalność biologia molekularna z wynikiem bardzo dobrym uzyskałam w 1991r na Wydziale Biologii i Nauk o Ziemi Uniwersytetu im. M. Curie - Skłodowskiej w Lublinie. -stopień doktora nauk przyrodniczych, specjalność biochemia. Pracę doktorską pod tytułem Rola dysmutaz ponadtlenkowych w procesie starzenia się komórek drożdży Saccharomyces cerevisiae obroniłam we wrześniu 2000 przed Radą Wydziału Biologii i Nauk o Ziemi Uniwersytetu Łódzkiego. 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych/ artystycznych: W 1991r zostałam zatrudniona w Zakładzie Biochemii, w Instytucie Nauk Rolniczych w Zamościu, Akademii Rolniczej w Lublinie. W latach pracowałam jako starszy technik, następnie w latach jako asystent. Od 2000 roku do chwili obecnej jestem zatrudniona na stanowisku adiunkta w Katedrze Biochemii i Chemii Środowiskowej Wydziału Nauk Rolniczych Uniwersytetu Przyrodniczego w Lublinie. 4. Wskazanie osiągnięcia* wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.) * w przypadku, gdy osiągnięciem tym jest praca/ prace wspólne, należy przedstawić oświadczenia wszystkich jej współautorów, określające indywidualny wkład każdego z nich w jej powstanie: 1

2 a) tytuł osiągnięcia naukowego: Cykl publikacji naukowych pt.: Wpływ pyretroidów na wybrane elementy systemu antyoksydacyjnego komórek drożdży Saccharomyces cerevisiae. b) autor/autorzy, tytuł/tytuły publikacji, rok wydania, nazwa wydawnictwa: 1. Krzepiłko A. 2007a. System antyoksydacyjny a toksyczność pyretroidów, Postępy Nauk Rolniczych, 1, Krzepiłko A. 2007b. The effect of selected pyrethroids on concentration of thiol groups in Saccharomyces cerevisiae yeast cell extracts. Ecological Chemistry and Engineering, 14, 10, Krzepiłko A. 2007c. Effect of deltamethrin on the antioxidant system of Saccharomyces cerevisiae yeast. Ecological Chemistry and Engineering,14, 2, Krzepiłko A., Święciło A. 2007a. The influence of selected pyrethroid on the growth and number of ρ-mutants in Saccharomyces cerevisiae yeast. Polish Journal of Environmental Studies, 16, 3, Krzepiłko A., Święciło A., 2007b. Assessing the toxicity of selected pyrethroids for Saccharomyces cerevisiae yeast cells by using staining methods. Ecological Chemistry and Engineering, 14, 10, Krzepiłko A., Święciło A. 2007c. The effect of selected pyrethroids on the total antioxidant capacity of yeast cell extracts. Polish Journal of Environmental Studies, 16, 3A, Krzepiłko A Effect of pyrethroids on stress-induced biosynthesis of selected haemoproteins in Saccharomyces cerevisiae yeast cells. Ecological Chemistry and Engineering, 16, 5/6, Krzepiłko A., Święciło A Do antioxidants counteract the toxic effects of pyrethroids on Saccharomyces cerevisiae yeast? Ecological Chemistry and Engineering, 16, 9, Krzepiłko A Wpływ pyretroidów na przeżywalność mutantów drożdży o zmienionym systemie antyoksydacyjnym. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych, 556, c) omówienie celu naukowego/artystycznego ww. pracy/prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania. Syntetyczne pyretroidy, związki zaliczane do insektycydów, używane są zarówno w rolnictwie jak i w ochronie sanitarnej. Charakteryzują się ostrą toksycznością w stosunku do owadów, ryb i innych wodnych organizmów. Specyficzne oddziaływanie pyretroidów polega 2

3 na blokowaniu kanałów przewodnictwa jonowego w komórkach nerwowych [Nasuti i wsp. 2003]. Związki te ingerują w funkcjonowanie kanałów przewodnictwa jonowego (kanały sodowe) w membranach komórek nerwowych na drodze blokowania receptorów nikotynoacetylocholinowych oraz receptorów dla kwasu gamma-aminomasłowego, co z kolei uniemożliwia przekazywanie impulsów nerwowych [Banerjee i wsp. 2001]. Prezentowany jako rozprawa habilitacyjna cykl publikacji dotyczy mniej poznanego aspektu zastosowania tych pestycydów, jakim jest niespecyficzne oddziaływanie pyretroidów. Pyretroidy podobnie jak i inne ksenobiotyki mogą niespecyficznie wpływać na różne procesy metaboliczne, aktywność enzymów, stężenie wybranych związków obecnych w komórkach [Bradberry i wsp. 2005]. W następujących pracach przeglądowych: Negatywne oddziaływanie pyretroidów na organizm ssaka [Krzepiłko 2002] System antyoksydacyjny a toksyczność pyretroidów [Krzepiłko 2007a - praca 1 wg pt. 4b Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.) ], Effects of insecticides on the mammalian organism the free radical mechanism of toxicity [Krzepiłko 2009b] przeanalizowano publikacje naukowe opisujące badania prowadzone na świecie związane z różnymi aspektami niespecyficznego działania pyretroidów, zwłaszcza na system antyoksydacyjny komórek. Konsekwencje toksyczności insektycydów na poziomie komórki mogą być różne; od objawów stresu oksydacyjnego po efekty cytotoksyczne. Szczególnie dużo danych literaturowych dotyczy wpływu insektycydów na komórki wyższych organizmów, głównie ssaków. Analizując dane literaturowe, zaproponowano wspólny wolnorodnikowy mechanizm niespecyficznej toksyczności insektycydów [Krzepiłko 2009b]. Badania przedstawione w prezentowanym cykl publikacji miały na celu przede wszystkim poszerzenie wiedzy na temat niespecyficznej toksyczności pyretroidów. Insektycydy mogą wpływać niespecyficznie na wiele metabolicznych procesów zachodzących w żywym organizmie, jak fosforylacja oksydacyjna w mitochondriach, metabolizm węglowodanów, biosynteza białka [Casares, Mantione 2006]. Autorzy licznych publikacji naukowych zwracają uwagę na fakt, że biologiczne skutki działania wielu pestycydów mogą nasilać się na skutek generowania wolnych rodników, a zwłaszcza reaktywnych form tlenu [Kanbur i wsp 2008, Olgun, Misra 2006, Krzepiłko 2002, Krzepiłko 2007a - praca 1, Krzepiłko 2009b]. Jeżeli reaktywne formy tlenu (RFT) występują w stężeniach wyższych niż fizjologiczne to powodują stres oksydacyjny [Sies, Cadenas 1985]. Z tej racji prezentowana rozprawa habilitacyjna skoncentrowana jest na roli systemu antyoksydacjnego w toksyczności pyretroidów. Pestycydy zaburzają równowagę we wszystkich elementach środowiska, dotyczy to także mikroorganizmów. Wiadomo też, że mikroorganizmy przeprowadzają biotransformację pestycydów. Wrażliwość mikroorganizmów sprawia, że testy mikrobioloiczne są powszechnie 3

4 stosowane w badaniach toksykologicznych. Grzyby Armillaria mellea i Mycena citricolor są zdolne do bioluminescencji i były stosowane w testach toksyczności 3,5-dichlorofenolu, pentachlorofenolu, związków miedzi i cynku [Weitz i wsp. 2002]. Również drożdże Saccharomyces cerevisiae znalazły zastosowanie w badaniach nad toksycznością wielu związków, zwłaszcza wywołujących stres oksydacyjny [Wawryn i wsp. 1999, Żyracka i wsp. 2005a, Żyracka i wsp. 2005b]. Hollis i wsp. skonstruowali szczep drożdży S. cerevisiae zdolny do luminescencji [Hollis i wsp. 2000]. Badając toksyczność herbicydu diuron stwierdzili oni, że ten szczep drożdży był bardziej wrażliwym biosensorem niż bakterie E.coli. Drożdże S. cerevisiae stosowano także jako organizm modelowy do określania toksyczności fungicydów. Z pośród badanych mikroorganizmów: Kluyveromyces marxianus, Pichia anomala, Candida utilis, Schizosaccharomyces pombe i Saccharomyces cerevisiae, to właśnie S. cerevisiae okazały się najbardziej wrażliwe na te pestycydy, a test na przeżywalność komórek drożdży S. cerevisiae może znaleźć zastosowanie do ilościowego określania toksyczności badanych fungicydów [Ribeiro i wsp. 2000]. Podejmując badania nad toksycznością pyretroidów przyjęto założenie, że niespecyficzne oddziaływania tych insektycydów należy badać na poziomie komórki, a mechanizmy oddziaływania pyretroidów na system antyoksydacyjny komórki mają na tyle uniwersalny charakter, że mogą być analizowane przy użyciu organizmu modelowego jakim są drożdże Saccharomyces cerevisiae. O wyborze tego obiektu badań zadecydowało też doświadczenie zdobyte podczas pracy w kilku projektach badawczych. Drożdże S. cerevisiae są mikroorganizmem jednokomórkowym, ale pod wieloma względami przypominają komórki organizmów wyższych. Specyficzne cechy komórek drożdży takie jak np.: rozmnażanie przez pączkowanie, brak wielonienasyconych kwasów tłuszczowych w błonach plazmatycznych, zdolność do fermentacji, zdolność komórek do życia z mutacjami, które u organizmów wyższych eukariontów są letalne [Wawryn i wsp. 1999, Krzepiłko i wsp. 2004], czyni z nich przydatne narzędzie badawcze do określenia niespecyficznych oddziaływań pyretroidów na metabolizm komórki. Komórki drożdży można upodobnić do komórek wyższych eukariontów modyfikując skład podłoża hodowlanego poprzez dodatek askorbinianu, czy tokoferolu. W ochronie antyoksydacyjnej komórek eukariotycznych, w tym także drożdży S. cerevisiae, uczestniczą enzymy i drobnocząsteczkowe antyoksydanty. W komórkach drożdży dysmutaza ponadtlenkowa usuwa anionorodnik ponadtlenkowy, SOD1 (CuZnSOD) zlokalizowana jest na terenie cytoplazmy, a SOD2 (MnSOD) występuje w mitochondriach [Wiśnicka i wsp. 1998]. Enzym katalaza rozkłada nadtlenek wodoru, przez co uczestniczy w enzymatycznej obronie organizmu przed reaktywnymi formami tlenu. Z grupy niskocząsteczkowych antyoksydantów istotne funkcje pełni zredukowany glutation, natomiast kwas askorbinowy i witamina E w komórkach drożdży nie 4

5 występują. Część doświadczeń przeprowadzono też na mutantach drożdży o zmienionym systemie antyoksydacyjny, co pozwoliło badać reakcje drożdży na pyretroidy w sytuacji gdy wybrany element systemu antyoksydacyjnego nie funkcjonuje w komórce. Chemizacja rolnictwa i narastające zanieczyszczenie środowiska pestycydami uzasadniają konieczność podjęcia badań nad niespecyficznym oddziaływaniem pyretroidów, gdyż skutki wywoływane przez te pestycydy w środowisku nie są poznane. Celem prezentowanych badań było określenie wpływu pyretroidów na wybrane elementy systemu antyoksydacyjnego komórek drożdży Saccharomyces cerevisiae. Wpływ pyretroidów na przeżywalność komórek drożdży S. cerevisiae szczepu dzikiego i mutantów o zmienionym systemie antyoksydacyjnym Dane literaturowe potwierdzają, że pyreroidy mogą generować wolne rodniki [Krzepiłko 2007a praca 1]. Drożdże Saccharomyces cerevisiae są uznanym organizmem modelowym stosowanym w badaniach nad toksycznością różnych ksenobiotyków, są też one obiektem prezentowanych doświadczeń nad pyretroidami. Podstawowym kryterium pozwalającym ocenić wpływ pyretroidów na komórkę drożdży była przeżywalność komórek po zastosowaniu różnych dawek tych związków. W publikacji [Krzepiłko, Święciło 2007a- praca 4] opisano wyniki dotyczące przeżywalności drożdży szczepu dzikiego SP4 po 2h inkubacji z wybranymi pyretroidami. Specyfika tego doświadczenia pozwala ocenić czy komórki inkubowane z pyretroidem mają zdolność do wytworzenia kolonii, a więc do przeprowadzenia licznych procesów metabolicznych związanych z podziałami komórkowymi. Zbadano wpływ różnych stężeń wybranych pyretroidów na przeżywalność komórek drożdży szczepu dzikiego. Stwierdzono, że komórki w fazie logarytmicznej są bardziej wrażliwe na te pestycydy niż w fazie stacjonarnej. W dyskusji tych wyników [Krzepiłko, Święciło 2007a - praca 4 ] nawiązano do wniosków innych autorów, a mianowicie, w stacjonarnej fazie wzrostu komórki drożdży są bardziej odporne na działanie różnych czynników toksycznych gdyż aktywność głównych enzymów systemu antyoksydacyjnego drożdży (dysmutazy ponadtlenkowej, katalazy) jest wyższa niż w fazie logarytmicznej [Jakubowski i wsp. 2000]. Wyniki uzyskanych doświadczeń wskazują też, że pyretroidy są związkami bardziej toksycznymi dla drożdży niż na przykład parakwat, związek o wolnorodnikowym mechanizmie działania [Błaszczyński i wsp. 1985]. Określono także wpływ wybranych pyretroidów na przeżywalność mutantów drożdży o zmienionym systemie antyoksydacyjnym [Krzepiłko 2010 praca 9]. W porównaniu z dzikim szczepem [Krzepiłko, Święciło 2007a praca 4] mutanty bezdysmutazowe charakteryzowały się niższą przeżywalnością [Krzepiłko 2010 praca 9]. Komórki badanych mutantów drożdży z hodowli logarytmicznej były bardziej wrażliwe na pyretroidy niż z hodowli stacjonarnej [Krzepiłko 2010 praca 9]. Z badanych pyretroidów, deltametryna powodowała najwyższą 5

6 śmiertelność opisywanych mutantów drożdży zarówno w fazie logarytmicznej jak i stacjonarnej. Mutanty bezdysmutazowe: sod1, sod1sod2, sod2 były bardziej wrażliwe na działanie pyretroidów, niż mutant ctt1cta1 bez funkcjonalnych katalaz. W fazie stacjonarnej niski poziom glutationu w komórkach mutanta gsh, podobnie jak brak katalaz w mutancie ctt1cta1, nie powodował tak gwałtownego spadku przeżywalności jak brak aktywności dysmutazy ponadtlenkowej, różnice te są dobrze widoczne przy wyższych stężeniach pyretroidów. Brak aktywności jednej z dysmutaz ponadtlenkowych, a szczególnie obu dysmutaz (jak w mutancie sod1sod2), znacznie zwiększa toksyczne działanie pyretroidów, natomiast przeżywalność mutanta bezkatalazowego i o niskim poziomie glutationu jest zbliżona do szczepu dzikiego. Komórki mutantów sod drożdży są bardziej narażone na uszkodzenia wolnorodnikowe, niż te które posiadają pełną ochronę antyoksydacyjną [Wawryn i wsp. 1999, Żyracka i wsp. 2005b]. U drożdży mutacje sod1 i sod2 dają różne efekty fizjologiczne, gdyż anionorodnik ponadtlenkowy ma ograniczone możliwości przemieszczania się przez błony biologiczne. Różna przeżywalność mutantów sod1 i sod2 po inkubacji z pyretroidami może sugerować lokalizację śmiertelnych uszkodzeń wywołanych w komórkach przez pyretroidy. Obecność dysmutazy SOD1 chroni teren cytosolu, a dysmutazy SOD2 teren mitochondrium. Brak mitochondrialnej dysmutazy ponadtlenkowej powoduje, że mutanty sod2 są bardziej narażone na pyretroidy niż komórki sod1, w których ten enzym jest aktywny. Sugeruje to, że pełna ochrona antyoksydacyjna mitochondriów jest niezbędna dla ochrony przed pyretroidami. Badając wpływ pyretroidów na przeżywalność komórek drożdży zastosowano także warunki hodowli drożdży na pożywce stałej [Krzepiłko 2007c praca 3]. Do badań wybrano deltametrynę, gdyż w hodowlli płynnej wywierała ona najbardziej toksyczny efekt [Krzepiłko 2010 praca 9, Krzepiłko, Święciło 2007a praca 4]. Komórki drożdży hodowano na pożywce stałej z różnymi stężeniami deltametryny, a więc były one chronicznie narażone na ten pestycyd. W tych warunkach obserwowano morfologiczne zmiany kształtu kolonii drożdży. Typowe kolonie drożdży są płaskie, natomiast rosnące na pożywce z dodatkiem deltametryny są wzniesione. W zastosowanych warunkach hodowli mutanty drożdży o zmienionym systemie antyoksydacyjnym są bardziej wrażliwe na deltametrynę niż szczep dziki [Krzepiłko 2007c praca 3]. Szczególnie niską przeżywalnością charakteryzowały się mutanty pozbawione aktywności dysmutazy mitochondrialnej sod2 lub obu dysmutaz sod1sod2. Mutant pozbawiony aktywności katalazy ctt1cat1, podobnie jak mutant charakteryzujący się obniżonym poziomem glutationu gsh, był nieznacznie bardziej wrażliwy na chroniczną ekspozycję na deltametrynę niż szczep dziki. Mutant sod1 ma aktywną mitochondrialną dysmutazę ponadtlenkową, i z pośród mutantów bezdysmutazowych właśnie on jest najmniej wrażliwy na deltametrynę. Mutanty ctt1cat1 i gsh mają aktywne obie dysmutazy ponadtlenkowe. Otrzymane wyniki sugerują, że dysmutazy 6

7 ponadtlenkowe, a zwłaszcza dysmutaza mitochondrialna MnSOD chroni komórki przed toksycznością pyretroidów. Drożdże są wyjątkowym organizmem eukariotycznym, ponieważ ich błony plazmatyczne nie zawierają nienasyconych kwasów tłuszczowych i proces peroksydacji lipidów w ich komórkach nie zachodzi [Daum i wsp. 1998]. Dzięki tej właściwości badając toksyczność pyretroidów u drożdży można koncentrować się bezpośrednio na ochronnej roli enzymów antyoksydacyjnych. Natomiast w doświadczeniach prowadzonych na obiektach zwierzęcych dominującym przejawem toksyczności pyretroidów jest proces peroksydacji lipidów [Gabbianelli i wsp. 2002, El-Demerdash 2012], obserwacja ta została szerzej wyjaśniona w pracy przeglądowej Krzepiłko 2009b. Zastosowanie metod barwienia komórek do oceny toksyczności pyretroidów i ich wpływu na wybrane elementy systemu antyoksydacyjnego drożdży Dotychczas opisywane wyniki doświadczeń pozwalają na stwierdzenie, że pyretroidy powodują obniżenie przeżywalności i w konsekwencji śmierć komórek drożdży. Śmierć komórek to proces zachodzący stopniowo, charakteryzujący się nasileniem zmian degeneracyjnych i można do jego opisu zastosować metody mikroskopii klasycznej i fluorescencyjnej [Krzepiłko 2009c]. Zastosowano różne metody barwienia komórek drożdży, aby scharakteryzować objawy toksyczności pyretroidów: utratę witalności, słabszą kondycję metaboliczną komórek, zachodzące zmiany degeneracyjne [Krzepiłko, Święciło 2007b praca 5]. Ocenę toksyczności metodą barwienia przeprowadzono na komórkach drożdży w fazie logarytmicznej, gdyż te komórki są bardziej wrażliwe na pyretroidy. Przeprowadzone barwienia komórek drożdży mogą być stosowane jako szybki, wstępny test pozwalający określić toksyczność pyretroidów. Często obserwowanym symptomem toksyczności pyretroidów dla różnych organizmów jest proces peroksydacji lipidów [Krzepiłko 2007a praca 1, Krzepiłko 2009b]. Mechanizm działania pyretroidów na komórki ssaków wiąże się z procesami utlenienia składników błon plazmatycznych [Nasuti i wsp. 2003, Gabbianelli i wsp. 2002]. Drożdże są stosowane w badaniach oksydacyjnych modyfikacji białek [Lushchak 2006]. Jak już wspominano różnice w składzie lipidowym błon komórek drożdży i wyższych eukariontów dotyczą zawartości wielonienasyconych kwasów tłuszczowych [Daum i wsp. 1998]. Funkcje błon plazmatycznych zależą nie tylko od składu lipidowego ale też od aktywności budujących ich białek. Wykonano barwienie błękitem metylenowym i safraniną drożdży poddanych działaniu pyretroidów, co umożliwiło ocenę integralności ich błony komórkowej [Krzepiłko, Święciło 2007b praca 5]. Dodatek do hodowli drożdży szczepu dzikiego pyretroidów powoduje wzrost liczby komórek wybarwionych tymi barwnikami. Stwierdzono, że liczba wybarwionych komórek wzrasta wraz z zastosowaną dawką pyretroidów. Wynik ten sugeruje, że uszkodzona przez pyretroidy błona komórkowa pozwala na swobodną dyfuzję barwnika do wnętrza komórki. 7

8 W dyskusji tych wyników nawiązano do opisywanego w literaturze mechanizmu oddziaływania pyretroidów na błony komórkowe [Krzepiłko, Święciło 2007b praca 5]. Nowe dane literaturowe potwierdziły, że pyretroidy mogą zmieniać ich płynność, polarność, powodować utlenienie białek i lipidów błony [Vadhana i wsp. 2011]. Dynamiczna, asymetryczna, niejednorodna struktura jaką jest błona komórkowa jest zaangażowana w regulację wielu ważnych szlaków przekazywania sygnałów. Wiele ksenobiotyków, w tym pestycydów zmienia właściwości błony komórkowej, tym samym zmieniając fizjologię komórek [Tekpli i wsp. 2011]. Jak już podkreślano, obserwowany w przypadku komórek wyższych eukariontów proces peroksydacji lipidów w komórkach drożdży ma marginalne znaczenie, ponieważ są one niezdolne do syntezy wielonienasyconych kwasów tłuszczowych. Pyretroidy mogą oddziaływać na strukturę błony komórkowej i powodują jej uszkodzenia, mogą wpływać na funkcjonowanie kanałów jonowych w błonach co dezorganizuje transport błonowy. Wyniki barwienia safraniną i błękitem metylenowym sugerują, że pyretroidy jako związki hydrofobowe mogą akumulować się w błonach komórkowych i naruszają ich strukturę [Krzepiłko, Święciło 2007b praca 5]. Pyretroidy wpływają też na stan metaboliczny komórek, co potwierdzono przy pomocy barwienia fluorescencyjnego Live-Dead, które pozwala odróżnić komórki żywe- aktywne metabolicznie, osłabione i martwe [Krzepiłko, Święciło 2007b praca 5]. Test ten jest powszechnie stosowany do oceny toksycznego wpływu różnych związków na drożdże [Millard i wsp. 1997, Haugland 1996]. Badając toksyczność wybranych pyretroidów dla drożdży stwierdzono, że wraz ze wzrostem stężenia tych insektycydów spada liczba komórek drożdży aktywnych metabolicznie. W komórkach drożdży szczepu dzikiego inkubowanych z pyretroidami (wyższe dawki) zwiększa się liczba komórek osłabionych, o małej aktywności metabolicznej. Cytoplazma tych komórek fluoryzuje na zielono. Pojawiają się także liczne komórki martwe, które całe świecą zielono-żółtym jaskrawym światłem. Oddziaływanie pyretroidów na komórki drożdży powiązane jest z zaburzeniem homeostazy środowiska wewnętrznego, co potwierdzono stosując barwienie fluorescencyjne RedooxSensor Red [Krzepiłko, Święciło 2007b praca 5]. Barwnik ten po wniknięciu do komórek tworzy produkt fluoryzujący na czerwono, a intensywność jego fluorescencji zależy od potencjału oksydoredukcyjnego cytosolu komórki [Haugland 1996, Oksvold i wsp. 2002]. Komórki kontrolne charakteryzowały się intensywną fluorescencją. Komórki drożdży po inkubacji z pyretroidami (cypermetryna, alfametryna, deltametryna, bifentryna) charakteryzowały się słabą intensywnością fluorescencji, a przy najwyższych zastosowanych stężeniach 50 g cm -3 fluorescencja była bardzo słaba. Wynik ten sugeruje zaburzenie homeostazy oksydoredukcyjnej w tych komórkach pod wpływem pyretroidów, co może sugerować obniżenie stężenia związków o charakterze antyoksydacyjnym [Herrero i wsp. 2008]. W pracy przeglądowej [Krzepiłko 2007a praca 1] 8

9 zacytowano dane potwierdzające, że pyretroidy mogą wpływać na różne procesy metaboliczne, co prowadzi do potencjalnie niebezpiecznych biochemicznych następstw takich jak: zmiany aktywności różnych enzymów (także enzymów systemu antyoksydacyjnego komórek) nasilenie procesów starzenia, zmiany stężenia kwasu askorbinowego, przyrost ilości produktów peroksydacji lipidów i zmiany stężenia glutationu. Komórki drożdży S. cerevisiae są specyficzne, gdyż w nich zredukowany glutation pełni główne funkcje antyoksydacyjne, natomiast kwas askorbinowy i witamina E nie występują [Huh i wsp. 1998]. Badając toksyczność pyretroidów zastosowano metodę fluorescencyjnego barwienia komórek przy pomocy monochlorobimanu (mbcl), barwnika do wykrywania wewnątrzkomórkowego zredukowanego glutationu [Oksvold i wsp. 2002, Ublacker i wsp. 1991]. Wyniki przeprowadzonych doświadczeń pozwalają wnioskować, że pod wpływem pyretroidów zachodzą u drożdży zmiany stężenia zredukowanego glutationu [Krzepiłko 2007b praca 2]. Komórki drożdży szczepu dzikiego inkubowano z różnymi stężeniami pyretroidów, a następnie barwiono mbcl. Fluorescencja komórek kontrolnych z hodowli stacjonarnej była intensywniejsza niż z hodowli logarytmicznej. Inkubacja komórek z wybranymi pyretroidami: bifentryną, cypermetryną i deltametryną powodowała obniżenie intensywności fluorescencji zarówno w komórkach z hodowli logarytmicznej jak i stacjonarnej. Komórki z hodowli stacjonarnej inkubowane z tymi pestycydami fluoryzowały słabo, podczas gdy z hodowli logarytmicznej bardzo słabo. Przy wyższych stężeniach pyretroidów (40 lub 50 g cm -3 ) we wszystkich próbach obserwowano bardzo słabą fluorescencję komórek. Barwienie drożdży tym fluorescencyjnym barwnikiem pozwoliło na stwierdzenie, że w komórkach pod wpływem pyretroidów nastąpiło obniżenie stężenia GSH, ponieważ natężenie fluorescencji jest proporcjonalne do stężenia zredukowanego glutationu. Autorzy licznych publikacji potwierdzają, że u różnych organizmów obserwuje się obniżenie stężenia zredukowanego glutationu pod wpływem pyretroidów [Sayeed i wsp. 2003, Krzepiłko 2009b, El-Demerdash 2012, Aydin-Sinan i wsp. 2012]. Wpływ pyretroidów na stężenie grup tiolowych w ekstrakcie z komórek drożdży Zredukowany glutation nie jest jedynym związkiem tiolowym uczestniczącym w ochronie antyoksydacyjnej komórek drożdży [Sugiyama i wsp. 2000]. Związki zawierające grupy tiolowe np.: glutation, różne białka, tioredoksyny, metalotioneiny, cysteina są zaangażowane w ochronę antyoksydacyjną, dlatego też oznaczono stężenie grup tiolowych w ekstraktach z komórek drożdży [Krzepiłko 2007b praca 2]. Zawartość grup tiolowych w ekstrakcie komórek szczepu dzikiego w stacjonarnej fazie wzrostu była wyższa niż z hodowli logarytmicznej. Inkubacja komórek z wybranymi pyretroidami (bifentryna, cypermetryna, deltametryna) powodowała obniżenie stężenia grup tiolowych w ekstraktach, zarówno w logarytmicznej jak i stacjonarnej fazie wzrostu. Pyretroidy silniej obniżały stężenie grup tiolowych w ekstraktach pochodzących z komórek 9

10 z hodowli logarytmicznej. Zaprezentowane wyniki sugerują, że zmiany stężenia grup tiolowych mogą być przydatnym markerem stresu oksydacyjnego w badaniach nad toksycznością pyretroidów. Inni autorzy też podkreślają rolę związków tiolowych w ochronie antyoksydacyjnej komórek drożdży [Pedrajas i wsp. 1999, Zechmann i wsp. 2011]. I chociaż reakcja sprzęgania z glutationem jest jednym z podstawowych mechanizmów detoksykacji ksenobiotyków to wiele z pestycydów nie reaguje bezpośrednio ze zredukowanym glutationem, a jednak powodują one obniżenie jego stężenia w komórce [Penninckx 2002, Tuzmen i wsp. 2008]. W publikacjach naukowych jak do tej pory brakuje przykładów potwierdzających bezpośrednie oddziaływanie pyretroidów z wolnym glutationem. Jednak możliwe jest oddziaływanie pośrednie. Obniżenie stężenia grup tiolowych i zredukowanego glutationu w komórkach drożdży sugeruje, że te elementy systemu antyoksydacyjnego komórki drożdży są zaangażowane w detoksykację pyretroidów [Krzepiłko 2007b praca 2]. Wpływ pyretroidów na całkowitą zawartość antyoksydantów w ekstrakcie z komórek drożdży Badając toksyczność pyretroidów zastosowano też metodę pomiaru całkowitej zdolności antyoksydacyjnej (CZA, ang. TEAC) pozwalającej na określenie zdolności badanego materiału biologicznego do przeciwdziałania reakcjom utlenienia [Krzepiłko, Święciło 2007c praca 6]. Całkowitą zdolność antyoksydacyjną oznaczono metodą ABTS [Bartosz 2003]. Oznaczając CZA w ekstraktach z komórek drożdży szczepu dzikiego stwierdzono, że w próbie kontrolnej ten parametr w ekstrakcie z komórek w stacjonarnej fazie wzrostu był wyższy niż z hodowli logarytmicznej. Inkubacja z pyretroidami komórek w logarytmicznej fazie wzrostu powodowała znaczne obniżenie CZA. Dodanie do hodowli stacjonarnej pyretroidów nie powodowało tak gwałtownego spadku CZA jaki obserwowano w przypadku hodowli logarytmicznej. Wynik ten potwierdza dane uzyskane podczas innych doświadczeń badających reakcję systemu antyoksydacyjnego drożdży na pyretroidy (barwienia mbcl, Redox Sensor Red, zawartość grup tiolowych). Obniżenie CZA w ekstraktach z komórek drożdży sugeruje, że system antyoksydacyjny komórki zaangażowany jest w detoksykację pyretroidów [Krzepiłko, Święciło 2007c praca 6]. Wpływ pyretroidów na aktywność głównych enzymów antyoksydacyjnych komórek drożdży System antyoksydacyjny umożliwia komórkom drożdży zachowanie homeostazy i chroni je przed szkodliwym działaniem wolnych rodników. Analizując dane literaturowe zauważono, że częstą reakcją komórek na obecność pyretroidów jest zmiana aktywności enzymów antyoksydacyjnych [Krzepiłko 2007a praca 1]. Długotrwałe narażenie na pestycydy może powodować wyczerpanie zdolności ochronnych systemu antyoksydacyjnego komórki, czego 10

11 rezultatem jest obniżenie aktywności enzymów antyoksydacyjnych [Krzepiłko 2009 praca 7, Ogut i wsp. 2011]. Autorzy badający wpływ pyretroidów na enzymy antyoksydacyjne zwracają też uwagę, że odpowiedź komórek może zależeć od rodzaju organizmu i narządu [Krzepiłko 2007a praca 1]. Aktywność katalazy może być czułym markerem stresu oksydacyjnego wywoływanego w czasie działania pestycydów na różne organizmy [Krzepiłko 2009b]. Drożdże posiadają dwa typy katalaz: cytoplazmatyczną katalazę T i peroksysomalną katalazę A [Krawiec i wsp. 2000]. Katalaza A nie występuje w komórkach drożdży w warunkach represji glukozowej, natomiast w warunkach derepresji np.: podczas wzrostu na pożywce z etanolem, lub w obecności kwasów tłuszczowych osiąga dość wysoki poziom aktywności. Pomiar aktywności cytoplazmatycznej katalazy T w logarytmicznej fazie wzrostu hodowli jest często stosowanym markerem odpowiedzi stresowej [Święciło i wsp. 2000]. Podczas wzrostu komórek drożdży na pożywkach płynnych z glukozą można badać zmiany aktywności katalazy T zachodzące pod wpływem czynników stresowych. W komórkach drożdży szczepu dzikiego znajdujących się w logarytmicznej fazie wzrostu poziom aktywności katalazy T jest bardzo niski, natomiast w stacjonarnej fazie wzrostu jest dużo wyższy [Krzepiłko 2009 praca 7]. Po dodaniu do hodowli logarytmicznej wybranych pyretroidów (esfenwalerat, deltametryna, cypermetryna) i 1,5 godzinnej inkubacji aktywność katalazy w komórkach drożdży nieznacznie się obniżyła. Natomiast po inkubacji z pyretroidami hodowli stacjonarnej drożdży stwierdzono znaczne obniżenie aktywności katalazy. W komórkach drożdży szczepu dzikiego rosnacych na pożywce stałej w obecności deltametryny aktywność głównych enzymów antyoksydacyjnych katalazy i dysmutazy ponadtlenkowej ulega obniżeniu [Krzepiłko 2007c praca 3]. Zmiany te występowały nawet w komórkach rosnących na pożywce z deltametryną o stężeniu 5 g cm -3, przy którym przeżywalność drożdży szczepu dzikiego wynosiła 100%. Aktywność katalazy w próbie kontrolnej wynosiła 46,8 Umg -1 białka, a całkowita aktywność dysmutazy ponadtlenkowej wynosiła 32,6 Umg -1 białka. Wartości te są zbliżone do aktywności tych enzymów w hodowli stacjonarnej prowadzonej w pożywce płynnej [Krzepiłko 2009 praca 7]. Typową odpowiedzią komórek na zmieniające się warunki środowiska jest synteza specyficznej grupy białek HSP (białek szoku termicznego) [Izawa i wsp. 2008]. Pod wpływem działania różnych czynników stresowych w komórkach następuje wzrost poziomu reaktywnych form tlenu i zmiany poziomu aktywności enzymów antyoksydacyjnych. Cytowane dane literaturowe potwierdzają, że drożdże S. cerevisiae są często stosowanym obiektem badań odpowiedzi stresowej, a katalaza może chronić inne białka przed utlenieniem [Lushchak, Gospodaryov 2005, Herrero i wsp. 2008]. 11

12 W praktyce laboratoryjnej intensywność i zakres odpowiedzi komórek na stres można określić między innymi poprzez oznaczanie poziomu aktywności wybranych białek indukowanych przez czynniki stresowe, takim markerem stresu jest katalaza T [Krawiec i wsp. 2000]. Czynniki stresowe zastosowane w hodowli logarytmicznej drożdży wywołują indukcję ekspresji genu CTT1 kodującego katalazę T. W tych warunkach katalaza T jest syntetyzowana de novo i w ciągu krótkiego czasu osiąga wysoki poziom aktywności. Katalaza A nie podlega w tych warunkach indukcji. Indukowana przez warunki stresu biosynteza katalazy jest często obserwowaną u drożdży odpowiedzią wywoływaną przez różne czynniki (zmiana temperatury, dodatek soli, menadionu, pestycydów) [Krzepiłko 2009 praca 7]. Opisując oddziaływanie pyretroidów na system antyoksydacyjny drożdży zbadano wpływ wybranych pyretroidów na indukowaną syntezę katalazy. Po dodaniu do hodowli logarytmicznej pyretroidów nie stwierdzono przyrostu aktywności katalazy, a więc te pestycydy nie indukowały biosyntezy tego enzymu [Krzepiłko 2009 praca 7]. Następnie sprawdzono, czy pyretroidy hamują indukowaną innym czynnikiem reakcję biosyntezy katalazy. W tym celu komórki drożdży w logarytmicznej fazie hodowli poddano stresowi osmotycznemu, alkoholowemu i stresowi wywołanemu przy pomocy 0,5M azotanu (V) sodu. Badane komórki drożdży były zdolne do odpowiedzi stresowej, czego wyrazem był przyrost aktywności katalazy w próbach, w których zastosowano czynniki stresowe. Natomiast równoczesne zastosowanie warunków stresu i pyretroidów o stężeniu 40 g cm -3 nie powodowało przyrostu aktywności katalazy. Wynik ten sugeruje, że pyretroidy hamują indukowaną syntezę katalazy T w logarytmicznych komórkach drożdży S. cerevisiae. Komórki z hodowli logarytmicznej drożdży poddane warunkom stresu zmieniają swój metabolizm i rozpoczynają syntezę wielu białek, do których należą też cytochromy. Zarówno katalaza jak i cytochromy to białka zaliczane do hemoproteidów. Stwierdzono także, że równoczesne zastosowanie warunków stresu i dodanie do hodowli pyretroidu hamuje także indukowaną biosyntezę cytochromów [Krzepiłko 2009 praca 7]. Na tym etapie badań trudno jest stwierdzić, który z etapów biosyntezy tych białek ulega zahamowaniu. Ponieważ oba białka to hemoproteidy, można więc sugerować, że pyretroidy wpływają na szlak biosyntezy hemu. Jednym z możliwych wyjaśnień przyczyny zahamowania indukowanej biosyntezy badanych hemoproteidów może być wolnorodnikowe oddziaływanie pyretroidów. Na szlaku biosyntezy hemu występuje kilka enzymów wrażliwych na obecność wolnych rodników, jak ferrochelataza. Pyretroidy wpływają na integralność błony komórkowej drożdży [Krzepiłko, Święciło 2007b praca 5]. Być może uszkadzają też błony mitochondriów i uniemożliwiają transport metabolitów do syntezy hemu do mitochondrium. Pośrednio sugeruje to zwiększenie liczby mutantów - stwierdzone po inkubacji komórek drożdży z pyretroidami wśród przeżywających komórek, zwłaszcza w logarytmicznej fazie wzrostu [Krzepiłko, Święciło 2007a praca 4]. Mutanty - są bardziej odporne na związki 12

13 chemiczne generujące reaktywne formy tlenu niż szczepy dzikie. W przypadku komórek drożdży inhibicja łańcucha oddechowego nie powoduje śmierci komórek. Jednak prawidłowo funkcjonujące mitochondria są niezbędne do zachowania funkcji życiowych i odpowiedniej długości życia komórek drożdży [Daverman i wsp. 2002, Braun, Westerman 2011]. Czy antyoksydanty przeciwdziałają skutkom toksycznego oddziaływania pyretroidów na komórki drożdży? Komórki drożdży są niezdolne do syntezy tokoferoli i kwasu askorbinowego, jednak łatwo pobierają z pożywki te składniki i wbudowują w struktury komórkowe [Huh i wsp. 1998]. Drożdże S. cerevisiae nie wytwarzają kwasu askorbinowego (wytwarzają kwas erytroaskorbinowy, jednak jego stężenie jest znacznie niższe niż stężenie kwasu askorbinowego w komórkach innych eukariotycznych organizmów) i dlatego w kolejnym etapie doświadczeń sprawdzono, czy dodatek antyoksydantów do pożywki uchroni ich komórki przed zabiciem powodowanym inkubacją z pyretroidami [Krzepiłko, Święciło 2009 praca 8]. Dodawane do pożywek antyoksydanty działają w obrębie środowiska hydrofilowego (kwas askorbinowy) lub hydrofobowego (tokoferol) a pochodne tych związków: kwas palmitylo-6-askorbinowy działa w obrębie środowiska hydrofobowego, a kwas bursztynylotokoferolowy działa też w obrębie środowiska hydrofilowego organelli komórkowych. Pierwszy etap tego doświadczenia miał na celu ustalenie wpływu wybranych antyoksydantów na przeżywalność komórek drożdży. Obniżenie przeżywalności komórek drożdży po zastosowaniu wyższych dawek tokoferolu, bursztynylotokoferolu i palmitynianu askorbylu wskazuje, że antyoksydanty te mogą wykazywać działanie prooksydacyjne. Drożdże są zdolne do wzrostu w obecności wysokich dawek witaminy C [Żyracka i wsp. 2005a, Krzepiłko i wsp. 2004]. Przekroczenie dawki 80mM powoduje znaczne obniżenie przeżywalności komórek w powietrzu. Chcąc sprawdzić czy dodatek antyoksydantów chroni przed toksycznym działaniem pyretroidów komórki drożdży inkubowano z pyretroidami (cyprmetryną, fenwaleratem, tetrametryną, permetryną) a następnie wysiano je na podłoża zawierające antyoksydanty. Jednak nie stwierdzono znaczącego wpływu antyoksydantów na przeżywalność komórek drożdży. Jedynie przy niższej z zastosowanych dawek cypermetryny, tetrametryny i permetryny stwierdzono niewielki wzrost przeżywalności w próbie z alfatokoferolem. Porównując te wyniki z danymi z literatury podkreślono, że inni autorzy potwierdzają ochronną rolę witamin, zwłaszcza E, dla tkanek szczurów poddanych działaniu pyretroidów [Giray i wsp 2001]. Brak wyraźnej reakcji ochronnej w przypadku drożdży można uzasadnić specyfiką tego organizmu, a mianowicie u drożdży dominuje odpowiedź układu antyoksydacyjnego, u wyższych organizmów peroksydacja lipidów. Wnioski Pyretroidy są toksyczne dla komórek drożdży Saccharomyces cerevisiae. 13

14 Z badanych pyretroidów deltametryna powodowała najwyższą śmiertelność komórek drożdży, zwłaszcza w logarytmicznej fazie wzrostu. Mutanty drożdży, które mają aktywne dysmuazy ponadtlenkowe są bardziej odporne na działanie pyretroidów, niż mutanty bezdysmutazowe. Pyretroidy mogą wywoływać w komórkach drożdży Saccharomyces cerevisiae zmiany charakterystyczne dla stresu oksydacyjnego, są to: - obniżenie aktywności dysmutazy ponadtlenkowej i katalazy, - obniżenie stężenia wewnątrzkomórkowego GSH i grup tiolowych, - zaburzenie homeostazy oksydoredukcyjnej w komórce, - obniżenie całkowitej zdolności antyoksydacyjnej w ekstrakcie. Pyretroidy powodują zahamowanie indukowanej biosyntezy katalazy wywoływanej przez czynnik stresowy działający w logarytmicznej fazie wzrostu hodowli. pyretroidów. Dodatek do pożywki antyoksydantów nie chronił komórek drożdży przed toksycznością Literatura Aydin-Sinan H., Güngördü A., Ozmen M Toxic effects of deltamethrin and λ-cyhalothrin on Xenopus laevis tadpoles. Environ Sci Health., 47(5), Banerjee B.D., Seth V., Ahmed R Pesticide-induced oxidative stress: perspectives and trends. Environ Health., 16 (1), Bartosz G Druga twarz tlenu. Wolne rodniki w przyrodzie. PWN, Warszawa, 447ss. Beers R.F., Sizer J A spectrophotometric method of measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J. Biol. Chem., 195, Biliński T., Krawiec Z., Liczmański A., Litwińska J Is hydroxyl radical generated by the Fenton reaction in vivo? Biochem. Biophys. Res. Commun., 130, (2) Błaszczynski M., Litwńska J., Zaborowska D., Biliński T The role of respiratory chain in paraquat toxicity in yeast. Acta Microbiol. Polon., 34, 3/ 4, Bradberry S.M., Cage S.A., Proudfoot A.T., Vale J Poisoning due to pyrethroids. Toxicol Rev., 24 (2), Braun R.J., Westermann B Mitochondrial dynamics in yeast cell death and aging. Biochem. Soc. Trans., 39 (5), Casares F.M., Mantione K Pesticides may be altering constitutive nitric oxide release, thereby compromising health. Med. Sci. Monit., 12 (10), Daum G., Lees N. D., Bard M., Dickson R Biochemistry, cell biology and molecular biology of lipids of Saccharomyces cerevisiae. Yeast, 14, Davermann D., Martinez M., Mc Koy J., Patel N., Averbeck D., Moore C.W Impaired mitochondrial function protects against free radical-mediated cell death. Free Radic Biol Med., 1, 33 (9), El-Demerdash F.M Cytotoxic effect of fenitrothion and lambda-cyhalothrin mixture on lipid peroxidation and antioxidant defense system in rat kidney. J. Environ. Sci. Health, 47 (4), Gabbianelli R., Falcioni G., Nasuti C., Cantalamessa F Cypermethrin induced plasma membrane perturbation on erythrocytes from rats: reduction of fluidity in the hydrophobic core and glutathione peroxidase activity. Toxicol., 175, Giray B., Gurbay A., Hincal F Cypermethrin-induced oxidative stress in rat brain and liver is prevented by vitamin E or allopurinol. Toxicol. Lett., 118 (3), Haugland R Handbook of fluorescent probes and research chemicals. Sixth edition by Haugland R. Molecular Probes Inc. Herrero E., Ros J., Bellí G., Cabiscol E Redox control and oxidative stress in yeast cells. Biochim. Biophys. Acta, 1780 (11), Hollis R.P., Killham K., Glover L.A Design and application of a biosensor for monitoring toxicity of compounds to eukaryotes. Appl. Environ. Microbiol., 66 (4), Huh W., Lee B., Kim S., Kim Y., Rhie G., Baek Y., Hwang C., Lee J., Kang S D-Erythroascorbic acid is an important antioxidant molecule in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Microbiol., 30,

15 Izawa S., Kita T., Ikeda K., Inoue Y Heat shock and ethanol stress provoke distinctly different responses in processing and nuclear export of HSP mrna in Saccharomyces cerevisiae. Biochem J., 15, 414 (1), Jakubowski W., Bilinski T., Bartosz G Oxidative stress during aging of stationary cultures of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Free Radic. Biol. Med., 1, 28 (5), Kanbur M., Liman B., Eraslan G., Altinordulu S Effects of cypermethrin, propetamphos, and combination involving cypermethrin and propetamphos on lipid peroxidation in mice. Environ Toxicol., 23 (4), Kocwowa E Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej. PWN Warszawa. Krawiec Z., Biliński T., Schüller C., Ruis H Reactive oxygen species as second messengers? Induction of the expression of yeast catalase T gene by heat and hyperosmotic stress does not require oxygen. Acta Biochim Pol., 47 (1), Krzepiłko A Negatywne oddziaływanie pyretroidów na organizm ssaków. Post. Nauk Rol., 1, Krzepiłko A., Święciło A., Wawryn J., Zadrąg R., Kozioł S., Bartosz G., Biliński T Ascorbate restores lifespan of superoxide-dismutase deficient yeast. Free Rad. Res., 38 (9), Krzepiłko A. 2007a. System antyoksydacyjny a toksyczność pyretroidów. Post. Nauk Rol., 1, Krzepiłko A. 2007b. The effect of selected pyrethroids on concentration of thiol groups in Saccharomyces cerevisiae yeast cell extracts. Ecol. Chem. Engin.,14, 10, Krzepiłko A. 2007c. Effect of deltamethrin on the antioxidant system of Saccharomyces cerevisiae yeast. Ecol. Chem. Engin., 14, 2, Krzepiłko A., Święciło A. 2007a. The influence of selected pyrethroid on the growth and number of ρ-mutants in Saccharomyces cerevisiae yeast. Pol. J. Environ. Stud., 16, 3, Krzepiłko A., Święciło A. 2007b. Assessing the toxicity of selected pyrethroids for Saccharomyces cerevisiae yeast cells by using staining methods. Ecol. Chem. Engin., 14, 10, Krzepiłko A., Święciło A. 2007c. The effect of selected pyrethroids on the total antioxidant capacity of yeast cell extracts. Pol. J. Environ. Stud., 16, 3A, Krzepiłko A Effect of pyrethroids on stress-induced biosynthesis of selected haemoproteins in Saccharomyces cerevisiae yeast cells. Ecol. Chem. Engin., 16, 5/6, Krzepiłko A. 2009b. Effects of insecticides on the mammalian organism the free radical mechanism of toxicity. [w:] Pierwiastki, środowisko i życie człowieka pod red. Pasternak K., ISBN , Krzepiłko A. 2009c. Assessment of aging in Saccharomyces cerevisiae yeast mutants using microscopy techniques. Pol. J. Environ. Stud., 18, 3, Krzepiłko A., Święciło A Do antioxidants counteract the toxic effects of pyrethroids on Saccharomyces cerevisiae yeast? Ecol. Chem. Engin. 16, 9, Krzepiłko A Wpływ pyretroidów na przeżywalność mutantów drożdży o zmienionym systemie antyoksydacyjnym. Zesz. Probl. Post. Nauk Roln., 556, Lowry O., Rosebrough W., Farr A., Randall R Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 193, Lushchak V., Gospodaryov D Catalases protect cellular proteins from oxidative modification in Saccharomyces cerevisiae. Cell Biol. Int. 29 (3), Lushchak V Budding yeast Saccharomyces cerevisiae as a model to study oxidative modification of proteins in eukaryotes. Acta Biochim. Pol., 53 (4), Millard P., Roth B., Thi H., Yue S., Haugland R Development of the FUN-1 family of fluorescent probes for vacuole labeling and viability testing of yeasts. Appl. Environ. Microbiol., 63 (7), Misra H.P W: Greenwald R.A., (red) CRC Handbook of Methods for Oxygen Radical Research. CRC Press, Boca Raton, Nasuti C., Cantalamessa F., Falcioni G., Gabbianelli R Different effects of type I and type II pyrethroids on erythrocyte plasma membrane properties and enzymatic activity in rats. Toxicol., 191, Ogut S., Gultekin F., Kisioglu A., Kucukoner E Oxidative stress in the blood of farm workers following intensive pesticide exposure. Toxicol. Ind. Health., 27 (9), Oksvold M., Skarpen E., Widerberg J., Huitfeldt H Fluorescent histochemical techniques for analysis of intracellular signaling. J. Histochem. Cytochem., 50 (3), Olgun S., Misra H Pesticides induced oxidative stress in thymocytes. Mol. Cell Biochem., 290 (1-2), Pedrajas J., Kosmidou E., Miranda-Vizuete A., Gustafsson J., Wright A., Spyrou G Identification and functional characterization of a novel mitochondrial thioredoxin system in Saccharomyces cerrevisiae. J. Biol. Chem., 274, Penninckx M An overview on glutathione in Saccharomyces versus non-conventional yeasts. FEMS Yeast Res., 2 (3), Ribeiro I., Veríssimo I., Moniz L., Cardoso H., Sousa M., Soares A., Leão C Yeasts as a model for assessing the toxicity of the fungicides penconazol, cymoxanil and dichlofluanid. Chemosphere. 41(10),

16 Rice G., Bump E Quantitative analysis of cellular glutathione by flow cytometry utilizing monochlorobimane: some applications to radiation and drug resistance in vitro and in vivo. Cancer Res., 46,12, Sayeed I., Parvez S., Pandey S., Bin-Hafeez B., Haque R., Raisuddin S Oxidative stress biomarkers of exposure to deltamethrin in freshwater fish, Channa punctatus Bloch., Ecotoxicol. Environ. Saf., 56 (2), Sies H., Cadenas E Oxidative stress: damage to intact cells and organs. Philos. Trans. Soc. Lond. Biol. Sci., 17 (311), Sugiyama K., Kawamura A., Izawa S., Inoue Y Role of glutathione in heat-shock-induced cell death of Saccharomyces cerevisiae. Biochem J., 15, 352, 1, Święciło A., Krawiec Z., Wawryn J., Bartosz G., Biliński T Effect of stress on the life span of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Acta Biochim. Pol., 47 (2), Święciło A., Gardiasz Z Response of the Saccharomyces cerevisiae yeast cells to sodium nitrate (III) and (V). Polish J. Environ. Stud., 16, 3A, Tekpli X., Holme J., Sergent O., Lagadic-Gossmann D Importance of plasma membrane dynamics in chemical-induced carcinogenesis. Rec. Pat. Anticancer Drug Discov., 6 (3), Tuzmen N., Candan E., Kaya N., Demiryas N Biochemical effects of chlorpyrifos and deltamethrin on altered antioxidative defense mechanisms and lipid peroxidation in rat liver. Cell Biochem. Funct., 26, Ublacker G., Johnson J., Siegel F., Mulcahy R Influence of glutathione S-transferases on cellular glutathione determination by flow cytometry using monochlorobimane. Cancer Res., 51 (7), Vadhana D., Carloni M., Fedeli D., Nasuti C., Gabbianelli R Perturbation of rat heart plasma membrane fluidity due to metabolites of permethrin insecticide. Cardiovasc. Toxicol., 11 (3), Wawryn J., Krzepiłko A., Myszka A., Biliński T Deficiency in superoxide dismutases shortens life span of yeast cells. Acta Biochim. Pol., 46 (2), Weitz H., Campbell C., Killham K Development of a novel, bioluminescence-based, fungal bioassay for toxicity testing. Environ. Microbiol., 4 (7), Wiśnicka R., Krzepiłko A., Wawryn J., Krawiec Z., Bilinski T Protective role of superoxide dismutase in iron toxicity in yeast. Biochem. Mol. Biol. Int., 44 (3), Zechmann B., Liou L., Koffler B., Horvat L., Tomašić A., Fulgosi H., Zhang Z Subcellular distribution of glutathione and its dynamic changes under oxidative stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae. EMS Yeast Res., 11 (8), Żyracka E., Zadrag R., Koziol S., Krzepiłko A., Bartosz G., Bilinski T. 2005a. Ascorbate abolishes auxotrophy caused by the lack of superoxide dismutase in Saccharomyces cerevisiae yeast can be a biosensor for antioxidants. J. Biotech., 115, Żyracka E., Zadrag R., Koziol S., Krzepiłko A., Bartosz G., Biliński T. 2005b. Yeast as a biosensor for antioxidants: simple growth tests employing a Saccharomyces cerevisiae mutant defective in superoxide dismutase. Acta Biochim. Pol., 52 (3), Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo - badawczych (artystycznych) Od początku pracy naukowej jestem zaangażowana w prowadzenie badań podstawowych, koncentrujących się na roli systemu antyoksydacyjnego w różnych procesach życiowych komórek. Badania prowadzone na poziomie komórki mają uniwersalny charakter i pozwalają na poznanie biochemicznych reakcji organizmów. Organizmem modelowym w tych badaniach są głównie drożdże Saccharomyces cerevisiae, a także siewki różnych roślin. Przy założeniu, że funkcjonowanie systemu antyoksydacyjnego komórek - podobnie główne szlaki metaboliczne są zasadniczo takie same u wszystkich organizmów, stosując komórki drożdży dysponuję organizmem dobrze poznanym pod względem genetycznym i biochemicznym, łatwym w hodowli i o krótkim cyklu życiowym. Komórki wszystkich organizmów w warunkach fizjologicznych wytwarzają wolne rodniki, które uczestniczą w wielu procesach metabolicznych. Warunki stresowe powodują nadmierną produkcję wolnych rodników i niebezpieczeństwo uszkodzeń cząsteczek i struktur komórkowych. Komórki każdego organizmu dysponują antyoksydantami 16

17 nieenzymatycznymi oraz enzymami antyoksydacyjnymi chroniącymi przed uszkodzeniami wolnorodnikowymi. Dane literaturowe potwierdzają rolę stresu oksydacyjnego podczas działania czynników środowiskowych na rośliny i zwierzęta. Dlatego też poznanie funkcji systemu antyoksydacyjnego w warunkach fizjologicznych i zmienionych działaniem czynników środowiskowych ma fundamentalne znaczenie dla zrozumienia problemów poruszanych w badaniach naukowych w zakresie rolnictwa. Przed doktoratem pracowałam w zespole badawczym zajmującym się peroksydacją lipidów in vivo i stresem oksydacyjnym wywoływanym przez produkty peroksydacji. W ramach pracy doktorskiej pt.: Rola dysmutaz ponadtlenkowych w procesie starzenia się komórek drożdży Saccharomyces cerevisiae badałam rolę enzymów antyoksydacyjnych w procesie starzenia się drożdży w hodowli płynnej. Do najważniejszych osiągnięć tamtych badań należy stwierdzenie, że brak dysmutazy ponadtlenkowej (mutacja sod) wpływa na przyspieszone starzenie się komórek drożdży. Opisałam różny wpływ mutacji sod1 (brak funkcjonalnej dysmutazy ponadtlenkowej w cytosolu) i sod2 (brak funkcjonalnej dysmutazy ponadtlenkowej w mitochondrium) na proces starzenia się komórek drożdży. Opisałam przydatność różnych technik mikroskopowych do określenia starzenia się i stanu metabolicznego drożdży (praca IIA5 według Wykazu opublikowanych prac naukowych lub twórczych prac zawodowych oraz informacja o osiągnięciach dydaktycznych, współpracy naukowej i popularyzacji nauki). Poznanie roli wolnych rodników w procesach metabolicznych, patologii i starzeniu spowodował wzrost zainteresowania antyoksydantami. W literaturze znajdujemy liczne prace opisujące zawartość antyoksydantów w materiale biologicznym i wskazanie, że spożywanie żywności bogatej w te związki jest korzystne dla ludzi i zwierząt. Powoduje to konieczność opracowania metod badania skuteczności antyoksydantów w układach biologicznych. Prace IIA1 i IIA3 dotyczą wpływu kwasu askorbinowego na komórki drożdży. Najważniejszym moim osiągnięciem było udowodnienie, że dodatek kwasu askorbinowego przywracał zdolność do życia mutanta sod1 w atmosferze czystego tlenu (mutant sod1 w przeciwieństwie do szczepu dzikiego ginie podczas inkubacji w tlenie -praca IIA1). Kontynuacją tych badań była możliwość zastosowania mutantów o zmienionym systemie antyoksydacyjnym drożdży do testowania in vivo właściwości antyoksydacyjnych różnych substancji. Szczególnie przydatny okazał się mutant pozbawiony aktywnej dysmutazy ponadtlenkowej sod1 charakteryzujący się auksotrofią lizyny i metionny. W publikacji IIA3 opisano odkrycie, że ten defekt metaboliczny auksotrofia lizyny i metioniny- może być usunięty przez dodanie antyoksydantów (askorbinianu, glutationu, cysteiny, N-acetylocysteiny), i zależy też od stężenia tlenu. Zaproponowano też, aby do badań właściwości antyoksydacyjnych różnych związków wykorzystać testy oparte o: wydłużanie czasu życia, opisywany wcześniej efekt auksotrofii lub wzrost w pożywce hypertonicznej przeprowadzane 17