Lipidy nasion wiesiołka i ogórecznika

Transkrypt

1 Tom XX Rośliny Oleiste 1999 Ryszard Zadernowski, Halina Polakowska-Nowak, Abdul Aleem Rashed Marta Kowalska Uniwersytet Warmińsko Mazurski w Olsztynie, Katedra Przetwórstwa i Chemii Surowców Roślinnych Lipidy nasion wiesiołka i ogórecznika Lipids from evening primrose and borage seeds Słowa kluczowe Key words: olej z wiesiołka, olej z nasion ogórecznika, lipidy, kwasy tłuszczowe oil evening primrose, oil borage seeds, triacyloglycerols, lipids, fatty acids Celem niniejszej pracy była charakterystyka chemiczna oleju tłoczonego z nasion wiesiołka i ogórecznika. Próby nasion użyte do badań pochodziły z poletek doświadczalnych ART w Olsztynie. W nasionach obu roślin oznaczono ilość tłuszczu ekstrahując nasiona heksanem w aparacie Soxhleta. Scharakteryzowano skład chemiczny olejów wiesiołkowego i ogórecznikowego oraz określono jego trwałość. Ilościowy i jakościowy skład kwasów tłuszczowych oznaczono metodą chromatografii gazowej, a budowę triacylogliceroli metodą HPLC. W nasionach wiesiołka ilość tłuszczu wynosiła 24%, a ogórecznika 34%. Procentowy udział kwasu γ-linolenowego w triacyloglicerolach wiesiołka stanowił ok. 10%, a ogórecznika ok. 18%. Lipidy nasion obu tych roślin różniły się nie tylko składem ilościowym i jakościowym kwasów tłuszczowych, ale również budową chemiczną triacylogliceroli. Olej wiesiołkowy jest mieszaniną ok. 13, a ogórecznikowy ok. 25 frakcji triacylogliceroli. W oleju wiesiołkowym przeważają formy: LLL (kwas linolowy linolowy linolowy) 40%, LLLnγ (kwas linolowy linolowy γlinolenowy) 15% oraz LLP (kwas linolowy linolowy palmitynowy) i LLO (kwas linolowy linolowy oleinowy) ok. 8%, a w oleju ogórecznikowym frakcje: LLnγ Lnγ (kwas linolowy γlinolenowy γ-linolenowy) 10%, LLLnγ (kwas linolowy linolowy γ-linolenowy) 15%, LLL (kwas linolowy linolowy linolowy) 10%, OLLnγ (kwas oleinowy linolowy γ-linolenowy) 13%, The aim of this study was the chemical characteristic of oil pressed from evening primrose and borage seeds. Seed samples used in these studies were obtained from experimental plants of Olsztyn Academy of Agriculture and Technology. Fat content in seeds of both plants was determined by the extraction of seeds with hexane in Soxhlet extractor apparatus. The chemical composition and stability of oils from evening primrose and borage was characterized. Quantitative and qualitative composition of fatty acids was determined by a gas chromatography. The structure of triacyloglycerols was determined by HPLC. Evening primrose seeds contained 24% of fat, whereas in borage seeds fat content was 34%. Percentage contribution of γ-linolenic acid in the evening primrose triacylglycerols was 10% and in borage triacylglycerols about 18%. Seed lipids from both plants were different not only in quantitative and qualitative composition of fatty acids, but also in chemical structure of triacylglycerols. Oil from the evening primrose seeds is a mixture of 13 triacylglycerol fractions, while oil from borage seeds contains 25 fractions of this chemical compound. In the evening primrose oil, in the majority are LLL forms (acids: linoleic linoleic linoleic) 40%, LLLnγ (acids: linoleic linoleic γ linolenic) 15%, LLP (acids: linoleic linoleic palmitic) and LLO (acids: linoleic linoleic oleic) about 8%. In borage oil dominant fractions are: LLnγnγ (acids: linoleic γ linolenic γ linolenic) 10%,

2 582 Ryszard Zadernowski... LLO (kwas linolowy linolowy oleinowy), PLLnγ (kwas palmitynowy linolowy γ-linolenowy), LLP (kwas linolowy linolowy palmitynowy) ok. 8%. LLLnγ (acids: linoleic linoleic γ linolenic) 15%, LLL (acids: linoleic linoleic linoleic) 10%, OLLnγ (acids: oleic linoleic γ linolenic) 13%, LLO (acids: linoleic linoleic oleic), PLLnγ (acids: palmitic linoleic γ linolenic), LLP (acids: linoleic linoleic palmitic) about 8%. Wstęp Aktualnie coraz częściej tłuszcze roślinne dzieli się na oleje spożywcze i oleje farmaceutyczne, tzw. biooleje. Wzrost zainteresowania olejami farmaceutycznymi wiąże się ściśle z pojawieniem się szeregu chorób cywilizacyjnych. Oleje spożywcze (rafinowane) są produktem o najwyższym stopniu przetworzenia, natomiast oleje farmaceutyczne tłoczone na zimno, są to tzw. oleje dziewicze, poddawane tylko oczyszczeniu fizycznemu. Według zaleceń Komisji Kodeksu Żywnościowego (Codex Alimentarius Commision FAO/WHO) z oleju dziewiczego nie można niczego usuwać, ani też nie wolno niczego dodawać. Źródłem olejów spożywczych i farmaceutycznych są szeroko rozpowszechnione w uprawie rośliny oleiste, takie jak: kukurydza, sezam, arachid, bawełna, len, oliwa, rzepak, palma oleista itd. oraz rośliny uprawiane w ograniczonym zakresie, takie jak: wiesiołek, ogórecznik lekarski, czarnuszka siewna. Aktualnie głównym źródłem bioolejów roślinnych, produkowanych na skalę przemysłową, są nasiona wiesiołka i ogórecznika lekarskiego. Celem podjętych badań była charakterystyka chemiczna oleju tłoczonego i ekstrahowanego z nasion wiesiołka i ogórecznika. Materiał i metody Materiał badawczy stanowiły oleje z nasion wiesiołka dwuletniego oraz ogórecznika lekarskiego otrzymane w skali laboratoryjnej dwiema metodami: poprzez tłoczenie na prasie ślimakowej oraz ekstrakcję heksanem metodą Soxhleta. Oznaczenie zawartości tłuszczu w nasionach Zawartość tłuszczu surowego w nasionach oznaczono metodą Soxhleta opisaną w polskich normach (PN-73/A-82111), stosując heksan jako rozpuszczalnik. Po usunięciu rozpuszczalnika za pomocą wyparki rotacyjnej w temp. 80 o C, próby suszono w temp. 130 o C przez 1 godz. i wyliczano procentową zawartość tłuszczu w przeliczeniu na suchą masę. Rozdział oleju na frakcję polarną i niepolarną (Drozdowski, Niewiadomski 1970) Do kolby o pojemności 500 cm 3 odważono 12 g oleju i rozpuszczono w 150 cm 3 chloroformu, następnie dodawano 100 g uprzednio przygotowanego kwasu krze-

3 Lipidy nasion wiesiołka i ogórecznika 583 mowego i wytrząsano przez 20 min. Zawartość kolby przenoszono na lejek Schotta 65 o wymiarach: wysokość 100 mm i średnica 150 mm. Niepolarne tłuszczowce wymywano 1500 cm 3 chloroformu pod małą próżnią (stosując pompę wodną). Natomiast polarne tłuszczowce wymywano 1000 cm 3 metanolu. Eluaty zbierano do oddzielnych kolb i zagęszczano na wyparce rotacyjnej pod próżnią w temp. 50 o C. Otrzymane frakcje lipidów suszono w eksykatorze przez 4 godz. w celu ustalenia masy, ważono i obliczono procentową zawartość poszczególnych frakcji. Frakcjonowanie lipidów niepolarnych metodą chromatografii cienkowarstwowej (Freeman, West 1966). Przygotowanie płytek : Płytki szklane o wymiarach 34 cm x 20 cm powlekano warstwą 0,5 mm mieszaniny żelu krzemionkowego G 60 (firma Merck) i wody w stosunku 1 : 2 v/ v. Płytki suszono w temp. pokojowej przez 12 godz. Następnie płytki aktywowano przez 1 godz. w temp. 105 o C. Rozdział tłuszczu: Na płytki chromatograficzne, nanoszono po 0,5 cm 3 10% roztworu tłuszczu. Płytki umieszczano w wysyconej komorze chromatograficznej, zawierającej 150 cm 3 mieszaniny eteru etylowego, benzenu, alkoholu etylowego i kwasu octowego w stosunku 40 : 50 : 2 : 0,2 v/v. Płytki rozwijano do momentu, aż czoło rozpuszczalnika osiągnęło wysokość 25 cm. Następnie płytki wyjmowano i suszono na powietrzu. Po odparowaniu rozpuszczalników płytki umieszczano w następnej komorze chromatograficznej, zawierającej mieszaninę eteru etylowego i heksanu w stosunku 6 : 94 v/v. Płytki rozwijano do momentu, aż czoło rozpuszczalnika osiągnęło wysokość 32 cm. Następnie płytki suszono na powietrzu. Wywoływanie i identyfikacja plam. Poszczególne plamy tłuszczu oznaczano i identyfikowano poprzez umieszczenie płytek chromatograficznych w komorze wysyconej jodem. Otrzymane plamy porównywano z wzorcami poszczególnych tłuszczów. Ilościowe oznaczanie obojętnych klas lipidów. Poszczególne frakcje tłuszczu zeskrobywano do 50 cm 3 kolbek stożkowych, dodając 40 cm 3 chloroformu. Tak przygotowane próby pozostawiano na kilka godzin w ciemnym miejscu, co pewien czas wytrząsano zawartość kolbek. Następnie zawartość poszczególnych kolb sączono przez lejek Schotta, stosując pompę wodną, dodatkowo popłukując kolby 20 cm 3 chloroformu. Zebrane roztwory każdej frakcji zagęszczano do objętości 5 cm 3, na wyparce rotacyjnej. Tę objętość przenoszono do kolby o pojemności 10 cm 3, wcześniej suszonej do stałej masy, a następnie zważonej, i ponownie zagęszczano do sucha. Suchą pozostałość pozostawiono w eksykatorze przez 4 godz., ważono i wyliczano procentowy udział poszczególnych frakcji. Hydroliza enzymatyczna triacylogliceroli wiesiołka i ogórecznika Wydzielenie triacylogliceroli z oleju. Triacyloglicerole oddzielano od innych składników metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym wypra-

4 584 Ryszard Zadernowski... żonym do stałego ciężaru w temp. 200 o C i uwodnionym do 5% wody. Kolumnę szklaną o średnicy 2,5 cm i długości 50 cm wypełniono zawiesiną (30 g) żelu krzemowego w eterze naftowym i przemywano 100 cm 3 eteru naftowego. Badaną mieszaninę oleju, ok. 1 g, rozpuszczono w 15 cm 3 chloroformu i nanoszono na kolumnę. Szybkość wycieku eluatu 1,5 2 cm 3 na minutę. Triacyloglicerole eluowano 200 cm 3 benzenu. Po odparowaniu rozpuszczalnika pozostałość suszono do stałego ciężaru. Warunki hydrolizy. Hydrolizę enzymatyczną triacylogliceroli badanych olejów prowadzono według metody Brockerhoffa w modyfikacji Drozdowskiego (1974). Do kolbki zawierającej ok. 400 mg badanych triacylogliceroli dodawano: 8 cm 3 1 M wodnego roztworu Tris o ph = 8,0 (zakwaszanie stężonym kwasem solnym), 0,5 cm 3 45% wodnego roztworu CaCl 2, 0,2 cm 3 1% wodnego roztworu soli żółci No 3. Kolbę wypełniano azotem i zamykano szczelnie korkiem, a następnie zawartość termostatowano w temp. 40 o C przez 20 min. Po tym czasie wprowadzono 200 mg lipazy w postaci zawiesiny w 2 cm 3 Tris, przedmuchiwano azotem i szczelnie zamykano. Zawartość intensywnie mieszano. Czas hydrolizy liczono od momentu dodania enzymu. Reakcję przerywano, dodając 15 cm 3 etanolu oraz 5 cm 3 kwasu solnego (rozcieńczonego 1 : 1). Produkty hydrolizy ekstrahowano trzykrotnie eterem etylowym. Roztwór przemywano wodą do odczynu obojętnego i osuszano bezwodnym siarczanem sodu. Rozdział produktów hydrolizy za pomocą CCW. Produkty enzymatycznej hydrolizy rozpuszczano w eterze etylowym (1 : 10 v/v), nanoszono pasmowo na płytki szklane o wymiarach 20 x 20 cm, pokryte żelem krzemionkowym Kieselgel G (Merck). Do rozwijania chromatogramu stosowano mieszaninę eteru naftowego, etylowego i kwasu octowego w stosunku 70 : 30 : 1. Rozdzielone pasma identyfikowano w komorze wysyconej jodem. Rozfrakcjonowane produkty hydrolizy zdejmowano wraz z żelem z płytek, eluowano substancję tłuszczową i określano ilościowo jej zawartość w mieszaninie. Oznaczanie składu kwasów tłuszczowych w poszczególnych frakcjach lipidów Do ampułek farmaceutycznych przenoszono pipetą 2 3 kropelki badanych olejów i dodawano 2 cm 3 mieszaniny metylującej (chloroform metanol kwas siarkowy w stosunku 100 : 100 : 1 v/v/v) i po ich zatopieniu metylowano, ogrzewając w suszarce przez 2 godz. w temp. 80 o C. Następnie dodawano w niewielkich ilościach cynku w celu neutralizacji kwasu siarkowego i suszono do sucha, następnie rozpuszczano w heksanie. Estry metylowe kwasów tłuszczowych rozdzielano metodą chromatografii gazowej na aparacie Unicam 4600, wyposażonym w detektor płomieniowo-jonizacyjny (FID) i komputerowy integrator PU 4815.

5 Lipidy nasion wiesiołka i ogórecznika 585 Estry metylowe nanoszono na kolumnę kapilarną (WCOT) o parametrach 0,32 mm x 30 m, grubość filmu 0,25mm (Supelcowax 10), stosując jako gaz nośny hel. Parametry pracy chromatografu: temp. detektora 250 o C, kolumny 185 o C, odparowywacza 220 o C. Badanie struktury triacylogliceroli Udział procentowy poszczególnych triacylogliceroli określono stosując metodę chromatografii cieczowej z detektorem laserowym fotodyspersyjnym, metodą opisaną przez Stołychwę (1995). Wyniki i ich omówienie Na podstawie badań ustalono, że zawartość tłuszczu w nasionach wiesiołka i ogórecznika mieściła się w granicach 24,6 ± 2% i 34,3 ± 3% (tab. 1). Zawartość tłuszczu w nasionach wiesiołka i ogórecznika [% s.m.] The fat content in evening primrose and borage seeds [% d.m.] Tabela 1 Wiesiołek Evening primrose Ogórecznik Borage 24,6 ± 2 34,3 ± 3 Otrzymany tłuszcz jest mieszaniną lipidów polarnych i neutralnych. Udział procentowy tłuszczowców polarnych i niepolarnych przedstawiono w tabeli 2, z której można wnioskować, że w oleju wiesiołkowym surowym tłoczonym i ekstrahowanym udział frakcji polarnej jest większy niż w oleju ogórecznikowym. W oleju wiesiołkowym ekstrahowanym, poziom polarnych lipidów jest dwukrotnie wyższy niż w oleju tłoczonym. Natomiast różnica w zawartości polarnych lipidów w oleju ogórecznika nie jest wielka i wynosi 0,2%. Zawartość lipidów neutralnych w olejach, niezależnie od metody otrzymywania, kształtowała się w przedziale 99,2 99,6% w oleju wiesiołka i 99,5 99,7% w oleju ogórecznika. Stosując chromatografię cienkowarstwową ustalono, że udział poszczególnych pochodnych acylogliceroli, wolnych kwasów tłuszczowych i węglowodorów, zależy od metody otrzymania oleju (tab. 2). Na podstawie danych zestawionych w tabeli 3 można stwierdzić, że badane oleje są bogatym źródłem wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, w tym kwasu γ-linolenowego. Zawartość kwasów wielonienasyconych w olejach tłoczonych i ekstrahowanych wiesiołka wynosi odpowiednio 79,43% i 80,13%, a ogórecznika 59,58% i 55,30%. Udział kwasu γ-linolenowego w składzie kwasów tłuszczowych stanowi w oleju wiesiołka 10%, a w oleju ogórecznika 23%. Stosując metodę chromatografii cieczowej określono strukturę triacylogliceroli.

6 586 Ryszard Zadernowski... Tabela 2 Udział procentowy lipdów polarnych i niepolarnych oleju wiesiołka i ogórecznika Weight percentage polar and nonpolar lipids in evening primrose and borage seeds Lipidy Lipids wiesiołkowy Evening primrose Olej Oil ogórecznikowy Borage OT OE OT OE Polarne Polar 0,4 0,8 0,3 0,2 Niepolarne Nonpolar W tym including: 99,6 99,2 99,7 99,8 Węglowodory Hydrocarbons 7,3 5,7 8,3 4,1 Estry sterole Sterol esters 2,5 2,8 2,9 2,7 Triacyloglicerole Triacyloglycerols 74,1 82,2 77,6 80,1 Diacyloglicerole Diacyloglycerols 6,8 1,8 5,0 9,3 Monoacyloglicerole Monoacyloglycerols 2,2 1,9 Wolne kwasy tłuszczowe Free fatty acids 7,1 5,6 6,2 3,8 OT olej tłoczony pressed oil; OE olej ekstrahowany extracted oil wiesiołek evening primrose Wiesiołek ogórecznik borage Ogórecznik LLnLn LLL LLLn LLP LLO OLLn OOO SOL Rys. 1. Udział procentowy kompozycji triacylogliceroli oleju wiesiołka i ogórecznika Composition of triacyloglycerols in evening primrose and borage oils (weight percentage)

7 Lipidy nasion wiesiołka i ogórecznika 587 Skład kwasów tłuszczowych oleju wiesiołka i ogórecznika [%] Fatty acids composition in evening primrose and borage oils [%] Tabela 3 Kwasy tłuszczowe Fatty acids wiesiołek evening primrose Olej Oil ogórecznik borage OT OE OT OE C 14:0 0,14 0,16 0,10 0,15 C 16:0 5,70 6,44 10,30 10,69 C 16:1 0,15 0,05 0,19 0,55 C 17:0 C 18:0 2,0 1,09 3,5 4,17 C 18:1 10,40 10,56 17,90 17,68 C 18:2 68,90 70,05 36,28 32,46 C 18:3 ślad ślad ślad ślad C 18:3 γ 10,5 10,08 23,00 22,79 C 18:4 0,10 0,05 C 20:0 0,10 0,28 0,30 0,65 C 20:1 0,20 0,58 0,20 3,86 C 20:2 0,03 0,20 C 22:0 0,10 0,78 0,20 0,20 C 22:1 2,10 2,52 Nasycone Saturated 2,34 8,75 14,4 15,86 Jednonienasycone Monoenic 10,75 11,19 20,39 24,61 Wielonienasycone Polyenic 79,43 80,13 59,58 55,30 Ustalono, że triacyloglicerole oleju wiesiołka to przede wszystkim 40% form LLL (kwas linolowy linolowy linolowy), 15% LLLnγ (linolowy linolowy γ-linolenowy) oraz 15% LLP i LLO (linolowy linolowy palmitynowy i linolowy linolowy oleinowy). Natomiast triaceloglicerole oleju ogórecznika to: 10% LLnγ Lnγ (linolowy γ-linolenowy γ-linolenowy), 15% LLL (linolowy linolowy linolowy), 10% OLLnγ (oleinowy linolowy γ-linolenowy), 13% LLO (linolowy linolowy oleinowy) i po około 8% PLLnγ (palmitynowy linolowy γ-linolenowy) i LLP (linolowy linolowy palmitynowy). Pod wpływem lipazy trzustkowej triacyloglicerole oleju wiesiołka i ogórecznika ulegają częściowej hydrolizie do diacylogliceroli, monoacylogliceroli, wolnych kwasów tłuszczowych. W warunkach reakcji, hydrolizie ulegało około 90% triacylogliceroli (tab. 4).

8 588 Ryszard Zadernowski... Udział procentowy poszczególnych lipidów po hydrolizie lipazą Composition of lipids after lipase hydrolysis (weight percentages) Tabela 4 Lipidy Lipids Wiesiołek Evening primrose Ogórecznik Borage Triacyloglicerole Triacyloglycerols 10,1 5,2 Diacyloglicerole Diacyloglycerols 20,6 29,8 Monoacyloglicerole Monoacyloglycerols 30,9 40,3 Wolne kwasy tłuszczowe Free fatty acids 38,4 24,7 Analizując skład kwasów tłuszczowych frakcji po hydrolizie enzymatycznej (tab. 5) można stwierdzić, że dominującym kwasem we frakcji monoglicerydów wiesiołka jest kwas linolowy (74,7%), a ogórecznika kwas oleinowy (34,5%). Ustalono, że w pozycji centralnej triacylogliceroli (sn-2), wiesiołek syntetyzuje kwasy C 18:2 >C 18:1 >C 18:3 γ, a ogórecznik C 18:1 >C 18:2 >C 16:0 >C 18:3 γ. Tabela 5 Skład kwasów tłuszczowych głównych frakcji lipidów po hydrolizie lipazą [%] Fatty acids composition of principal lipid fractions after lipase hydrolysis [%] Kwasy tłuszczowe Fatty acids Wiesiołek Evening primrose Frakcja lipidów Lipids fractions Ogórecznik Borage MG DG WKT TG MG DG WKT TG C 14:0 0,9 1,3 0,5 0,5 C 16:0 2,7 9,5 14,5 20,1 20,8 9,9 5,0 13,4 C 16:1 1,1 0,8 0,7 3,9 2,3 0,6 2,8 C 18:0 1,3 2,3 4,7 6,6 5,2 26,9 1,7 5,6 C 18:1 13,1 14,5 12,0 18,1 34,5 33,3 30,3 25,8 C 18:2 74,7 62,4 66,2 38,8 24,9 22,4 46,6 39,6 C 18:3 0,1 0,4 6,7 0,3 C 18:3 γ 7,1 10,5 1,9 9,7 11,0 3,7 9,2 10,6 C 22:1 1,3 0,5 1,9 Nasycone Saturated 4 11,8 19,2 27,6 27,3 11,0 6,7 19,5 Jednonienasycone 14,2 15,3 12,7 22,0 36,8 35,2 30,8 30,5 Monoenic Wielonienasycone Polyenic 81,8 72,9 68,1 48,6 35,9 26,5 62,5 50,5

9 Lipidy nasion wiesiołka i ogórecznika 589 Wnioski Olej wiesiołkowy i ogórecznikowy tłoczony jest mieszaniną różnorodnych triacylogliceroli, którym towarzyszą acyloglicerole częściowe, wolne kwasy tłuszczowe, estry steroli, węglowodory, fosfolipidy. Ilość biologicznie aktywnego kwasu γ-linolenowego w oleju wiesiołkowym wynosi około 10%, a ogórecznikowym około 23% Literatura Drozdowski B., Niewiadomski H The relationship between the acid composition of rapeseed oil glycerides and phospholipids. Zeszyty Problemowe. Postępy Nauk Rolniczych, z. 91. Warszawa. Drozdowski B. Wpływ budowy glicerydów i występujących w nich kwasów tłuszczowych na mechanizm hydrolizy enzymatycznej. Z. Nauk. Politech. Gdańskiej nr 217, Chemia, XXV: Codex Alimentarius Commision FAO/WHO; Suplement 1, Volume XI, Part I: 203. Freman C.P., West D Complete separation of classes on a single thin-layer plate. J. Lipid Res., 7 (2): Stołychwo A Metody HPLC i HR-GC w badaniach składu tłuszczów naturalnych, modyfikowanych chemicznie, margaryn i mleka kobiecego. W: Metody analizy żywności w perspektywie wymagań Unii Europejskiej. Merck Warszawa.