Mezenchymalne komórki macierzyste w medycynie regeneracyjnej

Transkrypt

1 Mezenchymalne komórki macierzyste w medycynie regeneracyjnej Katarzyna Wojno, Janusz Kocki Samodzielna Pracownia Genetyki Klinicznej UM w Lublinie Abstrakt Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) dzięki swym wyjątkowym właściwościom do odnawiania się i różnicowania w różne linie komórkowe budzą wielkie nadzieje co do zastosowania ich w nowczesnej medycynie regeneracyjnej. Komórki te potrafią różnicować się w kierunku wyspecjalizowanych komórek będącymi elementami skłądowymi tkanek i organów ale także wytwarzają różne czynniki wzrostu oraz cytokiny umożliwiające komórkom rezydującymi w miejscu uszkodzenia umożliwiając im regenerację lub różnicowanie w określonym kierunku. Prowadzone są liczne badania mające na celu ocenę ich przydatności w leczeniu lub niwelowaniu skutków takich przypadłości jak choroby tkanki chrzęsnej, kostnej czy mięśniowej, ale i w regeneracji takich organów jak mięsień sercowy, wątroba czy trzustka. Najczęstszym źródłem, z którego izolowane są MSC jest szpik kostny, ale udowodniono istnienie tych komórek prawie w każdej tkance i narządzie. Wstęp Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC, mesenchymal stem cells, mesenchymal stromal cells) multipotencjalnymi samoodnawiającymi się komórkami niehematopoetycznymi obecnymi w wielu tkankach organizmu. [1] Określenie mezenchyma oznacza rozwijającą się tkankę łączną zarodka, wywodzącą się głównie z mezodermy. Z mezodermy mogą tworzyć się komórki dające początek tkankom łącznym dorosłego organizmu. Definicja mezenchymy obejmuje takie tkanki dorosłego organizmu jak: mięśnie, tkanka tłuszczowa, fibroblasty, chrząstka, ścięgno, tkanka nerwowa. Wiele tkanek mezenchymalnych zawiera komórki prekursorowe ukierunkowane na różnicowanie w określonym kierunku - mezenchymalne komóki prekursorowe (MPC), które mogą uczestniczyć w miejscowej regeneracji tkanek, np. prekursory adipocytów w tkance tłuszczowej. W mezenchymie można także znaleźć komórki, które nie są ukierunkowane na konkretne potomne linie komórkowe, mają one potencjał różnicowania się w różne linie komórkowe, np. komórki kości, mięśni, chrząstki i komórki tłuszczowe. Mezenchymalne komórki macierzyste stanowią populację komórek prekursorowych, które charakteryzują się, jak inne komórki macierzyste: zdolnością do samoodnawiania (posiadają zdolność wytwarzania komórki potomnej podobnej do komórki macierzystej), pojedyncza komórka posiada zdolność różnicowania się w wiele linii komórkowych oraz in vivo są zdolne do odtworzenia tkanek, w które są mogą się różnicować. [2] Odkryto wiele źródeł, z których można wyizolować MSC. Pierwszym, najczęściej

2 wykorzystywanym jest szpik kostny. Kolejnym, łatwo dostępym miejscem rezydowania MSC jest tkanka tłuszczowa, której komórki te mogą być pobierane w trakcie liposukcji. Ponadto MSC zostały odkryte w pępowinie (tkance łącznej zanej galaretą Wharton'a), krwi pępowinowej, łożysku, miazdze zębów mlecznych, płynie maziowym, więzadle przyzębowym, migdałkach, przytarczycy, mieśniach szkieletowych [3], oponie twardej, chrząstce, skórze, cebulce włosa. [4], a nawet ostatnio pojawiły się doniesienia o obecności komórek multipotencjalnych we krwi menstruacyjnej. [5] Medycyna regeneracyjna jest noworozwijajacą się gałęzią medycyny, która dzięki zaawansowanym technikom wykorzystuje komórki macierzyste do odtworzenia prawidłowej funkcji tkanki, bądź narządu wewnętrznego. Przeprowadzone na całym świecie badania niosą obiecujące wyniki dające nadzieję na leczenie wielu chorób ortopedycznych, kardiologicznych, związanych z funkcją wątroby, nerek, czy trzustki. [6] [7] MSC w chorobach tkanki chrzęstnej Tkanka chrzęstna często ulega uszkodzeniu w wyniku stanów zapalnych, czy warunków uszkadzających wynikających z nadmiernego zużycia, chorób cywilizacyjnych. Niestety tkanka ta nie posiada zdolności do regeneracji, co prowadzi do poważnych schorzeń, w tym do artretyzmu (osteoarthritis, OA). [8] OA jest najczęściej spotykanym schorzeniem reumatologicznym u osób powyżej 65 roku życia. Do dnia dzisiejszego nie odkryto skutecznego lekarstwa na tą chorobę. W przypadku chorób związanych z degeneracją tkanki chrzęstnej są poddawani terapii zwązanej z przeszczepianiem ich własnych chondrocytów, jednak często pacjenci z OA nie mogą zostać poddani takiemu zabiegowi między innymi z powodu braku u ich zdrowych chondrocytów, które nadawałyby sie do wykoniania przeszczepu. W tym przypadku nadzieję budzi zastosowanie mezenchymalnych komórek macierzystych. [9] Wykazano, że MSC są zdolne do różnicowania się w kierunku komórek tkanki chrzęstnej chondrocytów podczas hodowli z użyciem medium hodowlanego zawierającego duże stężenie glukozy oraz czynnika wzrostu TGF β3 (transforming growth factor beta-3). W celu odtworzenia naturalnych warunków panujących w żywym organizmie podczas różnicowania stosowane są różnego rodzaju struktury trówymiarowe (3D). Materiałem budulcowym tych rusztowań mogą być takie naturalnie występujące związki, jak kolagen, fibryna alginian, agaroza, hialuronian, czy chitosan a tkaże są syntetyzowane struktury zbudowane z polimerów kwasu mlekowego czy poliglikolowego. [10] MSC w regeneracji kości Wykazano, że proces naprawy kości u osob dorosłych przypomina proces osteogenezy podczas rozwoju embrionu. Osteoklasty oraz MSC są głównymi komórkami biorącymi udział w procesie tworzenia kości. Odkryto, że w określonych warunkach in vitro możliwym jest stymulowanie MSC

3 wyizolowanych z różnych źródeł do różnicowania w kierunku osteoblastów. Przykładowa mieszanina może skłądać się z deksametazonu, kwasu askorbowego, oraz 10β fosforanu glicerolu. [7]. Prowadzono badania nad zastosowaniem komórek macierzystych w osteogenesis imperfecta (OI), chorobie uwarunkowanej genetycznie związanej z produkcją nieprawidłowej formy kolagenu typu I. Le Blanc i wsp. wprowadzali allogeniczne MSC otrzymane z wątroby do 32-tygodniowego płodu z osteogenesis imperfecta przez żyłę pępowinową. Komórki macierzyste wykazywały różnicowanie w kierunku komórek kostnych, które zachowywały swoj fenotyp przez dłuższy czas. Podobnie Guillot i wsp. wykazali, że transplantacja MSC myszom chorym na OI znacznie obniżyła u nich częstość występowania złamań i nieprawidłowości w budowie szkieletu.[11] MSC zostały także zastosowane z pozytywnym skutkiem w naprawie złamań kości na modelach zwierzęcych. Autologiczne komórki macierzyste wyizolowane ze szpiku kostnego namnożone w hodowli pierwotnej zostały wysiane na cylindrach ceramicznych a następnie implantowane wewnątrz 8-mm uszkodzeń w kościach udowych szczura. Po 8 tygodniach uzyskano pełną regenerację kości. Ten sam zespół następnie zastosował do leczenia złamań kości szczura komórki macierzyste ze szpiku kostnego pochodzące od człowieka udowadniając ich skuteczność w procesie regeneracji kości. Podczas badań klinicznych Marcacci i współpracownicy zastosowali MSC otrzymane ze szpiku kostnego hodowane in vitro na trójwymiarowych rusztowaniach złożonych z hydroksyapatytu. Następnie struktury te wszczepiano pacjentom z defektami trzonu kości długich, przeszczepy były stabilizowane zewnetrznym czynnikiem stabilizującym. Badania te wykazały dobrą postępującą implantację przeszczepu, tworzenie nowej kości wewnątrz rusztowania z hydroksyapatytu oraz tworzenie wewnętrznej sieci naczyń krwionośnych. Wszyscy pacjenci odzyskani prawidłową funkcję kończyn. [12] Prowadzone są także badania nad możliwością zastosowania mezenchymalnych komórek macierzystych w niwelowaniu skutków osteoporozy. Osteoporoza jest częstą przypadłością dotykającą obie płcie, ale częściej występuje u kobiet w wieku postmenopauzalnym. W tym przypadku występuje niedobór estrogenu (E2). Podczas stosowania terapii hormonalnej z użyciem E2 następuje odbudowa kości dzięki zwiększeniu ekspresji genów odpowiedzialnych za proces osteogenezy ALP (fosfatazy alkalicznej), kolagenu typu 1, transformującego czynnika wzrostu β, morfogenetycznego białka kości 2 (bone morphogenic protein-2, BMP2) oraz Cbfa-1/Runx-2. Dzięki wprowadzeniu BMP2 zwiększono liczbę MSC, ich aktywności osteogenicznej oraz uzyskano zredukowanie liczby osteoblastów ulegających apoptozie. Kumar i współpracownicy dzięki inżynierii genetycznej otrzymali myszy wykazujące nadekspresję BMP-2, u których MSC posiadały znacznie większe zdolności do różnicowania w kierunku osteoblastów niż w przypadku naiwnych MSC. MSC w których uzyskano nadekspresję tego genu mogą odtwarzać kość u

4 starzejących się szczurów. [11] Prowadzono podobne badania z zastosowaniem MSC otrzymanych z tkanki mięśniowej i poddanych transfekcji genem kodującym morfogenetycznego białka kości 4 (BMP4), czynnik indukujący osteogenezę. Dzięki zastosowaniu tej techniki komórki wytwarzały ten czynnik in vivo w miejscu ich implantacji i różnicowały się w osteoblasty. W przypadku gdy transfekowane komórki były wysiane na rusztownie przygotowane do implantacji, MSC zdolne były po wszczepieniu do odbudowy ubytku w kościach długich u szczurów. Podbnie zastosowano struktury 3D zbudowane z kolagenu lub żelatyny do odbudowy ubytków w sklepieniu czaszki na modelu mysim. [3] MSC w chorobach serca MSC są także rokującym kandydatem do zastosowania w regeneracji mięśnia sercowego. Przeprowadzono szereg badań wskazujacych na możliwość zastosowania tych komórek do zmniejszania blizn w miokardium, przywracania prawidłowej czynności skurczowej, polepszanie miejscowej i całościowej funkcji komór w przypadku zawału mięśnia sercowego oraz kardiomiopatii niedokrwiennej, a także MSC znacznie oprawiają stan w przypadku kardiomiopatii rozstrzeniowej oraz arytmii. Pełny mechanizm, dzięki któremu MSC przyczyniają się do regeneracji mięśnia sercowego nie jest poznany. Najprawdopodobniej jest on wieloczynnikowy i składa się z bezpośredniej zdolności komórek macierzystych do rżnicowania w kierunku kardiomiocytów, komórek mięśni gładkich oraz komórek endotelialnych, zdolności MSC do wydzielania cytokin oraz czynników wzrostu posiadających włąściwości troficzne, łagodzenie stanu zapalnego poprzez właściwości immunosupresyjne oraz stymulację engogennych mechanizmów naprawy. [13] Pojawiły się doniesienia, że MSC otrzymane ze szpiku kostnego, czy krwi pępowinowej są zdolne do różnicowania w kierunku komórek przypominających kardiomiocyty pod wpływem czynnika demetylującego 5-azacytydyny [14] [15] [16], dodatek czynników wzrostu, czy elektrostymulacji. [16] Komórki o morfologii fibroblastów poddane działaniu 5-azacytydyny powiększały się i przybierały kulisty wygląd lub wydłużały się w jednym kierunku formując podłużną komórkę. Zmiany te następowały po tygodniu hodowli. Po 2 tygodniach komórki łączyły się a po 3 tygodniach formowały struktury przypominające włókna mięśniowe. Komorki te zachowywały fenotyp komórek mięśnia sercowego oraz wykazywały pulsowanie przez przynajmniej 8 tygodni od ostatniej dawki 5-azacytydyny oraz nie powracały do stanu niezróżnicowanego [15] Jednak wielu badaczy nie zdołało odtworzyć tego doświadczenia, in vivo nie uzyskano kardiomiogenezy przy braku 5-azacytydyny oraz ze względu na dużą toksyczność tego związku nie jest możliwym zastosowanie tego rodzaju terapii do odzyskania fizjologicznej funkcji mięśnia sercowego.

5 Pojawiło się wiele badań udowadniających, że MSC wykazują ekspresję wielu związków cytokin, chemokin oraz czynników wzrostu, które poprzez zmiany w mikrośrodowisku mięśnia sercowego wywołują nań korzystny wpływ. Czynniki te indukują angiogenezę poprzez czynniki proangiogenne i antyapoptotyczne: VEGF, FGF, TGF β, HGF, adrenomedullinę czynnik antyapoptotyczny, wydzielają IGF-1 czynnik stymulujący rozwój miokardium, interleukiny 10, 11 oraz erytropoetynę. Dzięki tym związkom możliwa jest regeneracja uszkodzonego mięśnia sercowego. [16] [17] Podobnie jak w przypadku badań nad zastosowaniem struktur trójwymiarowych w leczeniu uszkodzeń chrząstki i kości, tak i w przypadku miokardium są próby stosowania specjalnie skonstruowanych szkieletów umożliwających optymalną retencję, dystrybucję oraz implantację komórek macierzystych. Idealny materiał stosowany jako rusztowanie dla MSC powinien być biokompatybiny, możliwy do sterylizacji, a produkty jego degradacji nie powinny być toksyczne. Najczęściej w tym celu stosowane są struktury zbudowane z naturalnych białek kolagenu czy fibryny lub syntetyczne polimery kwasu poliglikolowego, polimeru kwasów mlekowego i glikolowego oraz polikoprolakton. Wykazano, że implantacja skrawka biologicznego zawierającego MSC znacznie polepszyła funkcję serca oraz indukowała angiogenezę. Wykazano, że zastosowanie strukur 3D in vitro poprawia zdolność MSC do różnicowania w kierunku kardiomiocytów. Yang i wsp. jako rusztowanie stosowali mikroczasteczki polisacharydowe połączone z fibroiną pochodzącą z jedwabiu. Komórki macierzyste pochodzące ze szpiku kostnego wykazywały wyższą ekspresję genów zaangażowanych w kardiomiogenezę, takich jak Gata4, Nkx2.5, Tnnt2 oraz Actc1 oraz białek kardiotiny oraz konaksyny 43 w porównaniu z komórkami hodowanymi w standardowych płaskich płytkach hodowlanych. [16] MSC a terapia cukrzycy Ostatnie badania wskazują, że transplantacja mezenchymalnych komórek macierzystych wywiera ochronne działanie na organizm w przypadku cukrzycy. Badania na modelu zwierzęcym z cukrzycą indukowaną poprzez niszczenie wysp trzustkowych indukowane przez streptozotocynę pokazały, że MSC pochodzące ze szpiku kostnego podane dożylnie docierały do trzustki i znacznie obniżały pozion glukozy we krwi. Podwyższał się natomiast poziom insuliny w surowicy krwi. Badania histologiczne wykazały, że MSC zasiedlały uszkodzone miejsce w trzustce i promowały wytwarzanie komórek wytwarzających insulinę pochodzących od biorcy. Działanie to prawdopodobnie było wywołane poprzez związki wydzielanie przez komórki macierzyste. Pojawiły się także doniesienia, że to same MSC wykazują zdolność do różnicowania się w komórki wytwarzające insulinę. Podobne wyniki otrzymano przy zastosowaniu MSC wyizolowanych z galarety Wharton'a. Komórki te posiadały zdolność różnicowania w kierunku komórek

6 przypominających dojrzałe komórki wysp trzustkowych zdolne do wytwarzania insuliny in vitro i in vivo. [13] [18].Wiele badań sugeruje także istnienie komórek macierzystych zasiedlających trzustkę, które potrafią dawać początek komórkom produkującym insulinę. Pojawiły się również doniesienia, że komórki o zdolności do różnicowania w komórki beta wysp trzustkowych występują w wątrobie. [19] MSC, które są zdolne do przekształcania sie w komórki produkujace insulinę stanowią alternatywę dla transplantacji wysp trzustkowych, procedurę skuteczną lecz ograniczoną przez brak dawców, nad którą są nadal prowadzone badania. [20] Pomimo licznych badań nadal nie do końca jest poznany mechanizm terapeutycznego działania MSC na trzustkę. Implantowane MSC mogą powodować powstawanie nowych komórek produkujących insulinę albo poprzez wydzielanie cytokin promujących endogenne komóki macierzyste trzustki do różnicowania w kierunku dojrzałych komórek beta, lub same się różnicują w te komórki. Ponadto MSC naturalnie produkują szereg czynników wzrostu oraz cytokin, które wspierają przeżycie komórek je otaczających oraz znacznie polepszają mikrośrodowisko panujące w trzustce. [13] Oprócz leczenia samej przyczyny cukrzycy odtwarzanie komórek wytwarzających insulinę pojawiają się także doniesienia o możliwości zastosowania MSC w niwelowaniu powikłań związanych z tą chorobą. Dzięki zdolności MSC do miogenezy i angiogenezy mogą one poprawiać funkcję mięśnia sercowego w przypadku kardiomiopatii cukrzycowej. Podobnie MSC mogą zapobiegać oraz leczyć związaną z cukrzycą nefropatię transplantacja MSC zapobiega tworzeniu zmian paologicznych w kłębuszkach nerkowych oraz wspiera ich regenerację. W przypadku cukrzycy częstym powikłaniem jest polineuropatia związana z niszczeniem włókien nerwowych. Cytokiny angiogenne wydzielane przez MSC takie jak czynnik wzrostu fibroblastów, VEGF mogą okazać się użyteczne w leczeniu polineuropatii. Z sukcesem przeprowadzono badania na szczurach cierpiących na cukrzycę, u których po 4 tygodniach od wszczepienia MSC poprawiła się funkcja włókien nerwowych oraz prędkość przekazywania sygnałów przez włókna motoryczne. Kolejnym powikłaniem związanym z występowaniem cukrzycy jest przedłużone i niecałkowite gojenie ran spowodowane przez zmniejszoną produkcję czynników wzrostu, nieprawidłową angiogenezę oraz upośledzone wytwarzanie matrycy kolagenowej. Podczas badań na modelach zwierzęcych wykazano, że injekcja MSC w miejsce występowania ran związanych z cukrzycą powoduje znacznie zwiąkszoną produkcję kolagenu, który jest istotnym elementem podczas gojenia ran polepszającym zwartość, wytrzymałość i strukturę odbudowywanej tkanki. [21] MSC w chorobach pęcherza moczwego Obecnie stosowane metody podczas zabiegów regeneracyjnych pęcherza moczowego wymagają powiększania złókniałego pęcherza, tworzenia nowego zbiornika z jelita [22] lub zastosowania

7 szkieletu biologicznego, na którym są in vitro wysiewane komórki pobrane z pęcherza moczowego pacjenta. Niestety komórki te często są w niewystarczającej ilości lub niemożliwe do izolacji. Odpowiednim zamiennikiem dla komórek pobranych wprost z pęcherza moczowego wydają się mezenchymalne komórki macierzyste. Wykazano, że potrafią one się różnicować in vitro w komórki o fenotypie komórek mięśni gładkich pod wpływem odpowiednich substancji zawartych w pożywce hodowlanej. Otrzymano takie medium z hodowli komórek mięśni gładkich lub z mieszaniny czynników wzrostu dla komórek mięśniowych: HGF, TGF, PDFF-BB). Podczas zabiegu rekonstrukcji pęcherza moczowego ważnym jest, aby MSC były indukowane do różnicowania zarówno w kierunku komórek mięśni gładkich, ale i urotelium. Tian i wsp. wykazali, że MSC pochodzące ze szpiku kostnego mogą różnicować się właśnie w tych kierunkach oraz, że podczas hodowli in vitro stosowanie skutecznym jest stosowanie podłoża otrzymanego z hodowli komórek mięśni gładkich, które zawierało odpowiednie czynniki wzrostu. Podczas badań in vivo MSC wykazywały ekspresję markerów mięśni gładkich po 4 tygodniach od implantacji, co wskazywało na to, że komórki te zachowywały fenotyp mięśni gładkich, który uzyskały podczas hodowli in vitro. [23] MSC w leczeniu ran Zastosowanie komórek macierzystych okazało się także skuteczne podczas leczenia przewlekłych ran. Wu i wsp. wykazali, że injekcja MSC ze szpiku kostnego w okolicy rany znacznie przyspiesza proces gojenia rany zarówno u myszy zdrowych, jak i u myszy z cukrzycą. Wykazano, że MSC potrafią różnicować sę w kierunku różnych typów komórek skóry między innymi w keratynocyty, pericyty czy komórki endotelialne. Ponadto wydzielają one czynniki parakrynne, które pobudzają leczenie ran, takie jak VEGF, IGF-1, EGF, czynnik wzrostu keratynocytów, angiopoetyna, erytropoetyna. Prowadzone badania na komórkach macierzystych z tkanki tłuszczowej wykazały, że wydzielają one podobne związki co komórki pochodzące ze szpiku kostnego. Kim i współpracownicy wykazali, że komórki macierzyste izolowane z tkanki tłuszczowej stymulują migrację fibroblastów skóry po utworzeniu rany w pierwotnej hodowli fibroblastów. Komórki te wydzielały czynniki wzrostu: FGF, KGF, TGF, HGF oraz VEGF. Badania in vitro zostały zweryfikowane na modelu zwierzęcym, co wykazało znaczne zmnieszenie rozmiaru rany oraz przyspieszyło regenerację komórek na obrzeżach rany. Podczas badań zespół ten także wykazał, że hipoksja zwiększa wytwarzanie czynników wzrostu, a co za tym idzie przyczynia sie do zmiejszania obszaru rany oraz, że MSC wykazują działanie chroniące przed uszkadzającym wpływem promieniowania UVB. [24] Sheng i współpracownicy ponado udowodnili zdolność MSC do odtwarzania prawidłowej funkcji gruczołów potowych u 5 pacentów z głebokimi ranami oparzeniowymi. Po 2-12 miesiącach

8 od procedury obserwowali polepszenie funkcji perspiracji we wszystkich obszarach, gdzie zostały wszczepione komórki macierzyste, co wskazuje na to, ze komórki te były zaangażowane w proces rekonstrukcji gruczołów potowych. [13] MSC w regeneracji wątroby Ostatnie badania wskazują, że mezenchymalne komórki macierzyste są zdolne do różnicowania w kierunku komórek wytwarzających albuminę podobnych do hepatocytow. Mogą one być hodowane in vitro przez dłuższy okres czasu bez straty właściwości różnicujących, w odróżnieniu od hematopoetycznych komórek macierzystych. Co więcej są one podatne na modyfikacje genetyczne, więc mogą być pozyskane od pacjenta z wrodzonym defektem wątroby a następnie poddane procedurom inżynierii genetycznej w celu poprawienia występujących zmian. Komórki te mogą być następnie namnożone i wykorzystane do wykonania przeszczepu. Wykazano także, że MSC są zdolne do wytwarzania czynników stymulujących endogenne komórki parenchymalne, co może mieć istotne znaczenie w regeneracji tkanek. Podczas innych badań in vitro ponadto wykazano, że w odpowiednich warunkach środowiskowych MSC są zdole do różnicowania w komórki podobne do hepatocytów. Podczas badań na modelach zwierzęcych udowodniono także, że MSC zwiększają degradację matrycy włóknistej, prawdopodobnie poprzez zwiększenie ekspresji metaloproteinaz. Badania te wskazują na możliwość zastosowania MSC w przypadku zwłóknienia wątroby. Jednak są też doniesienia, że w przypadku zastosowania innych warunków hodowlanych przeszczepione MSC mogą różnicować się w kierunku miofibroblastów co z kolei może prowadzić do włóknienia wąroby. [25] Mizuguchi i wsp. prowadząc hodowlę mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego razem z pierwotnymi hepatocytami otrzymali długoterminowy funkcyjny model wątrobowy in vitro. Powstało kilka teorii jaki jest mechanizm tego procesu. Białka Jagged1 i Notch były uważane za niezbędne podczas procesu różnicowania, jednak ostatnie doniesienia wskazują na to, że samo zastosowanie kokultury z komórkami wątrobowymi indukuje powstawanie hepatocytów z komórek wątrobowych. [26] Literatura: 1. Song L., Tuan R.S. Transdifferentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from bone marrow. FASEB J 2004;18 (9): Roufosse C.A., Direkze N.C., Otto W.R., Wright N.A. Circulating mesenchymal stem cells. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2004; 36: Jackson W.M., Nesti L.J., Tuan S. Potential therapeutic applications of muscle-derived mesenchymal stem and progenitor cells. Expert Opin. Biol. Ther. 2010; 10(4): Aronin C.E.P. Tuan R.S. Therapeutic potential of the immunomodulatory activities of adult

9 mesenchymal stem cells. Birth Def. Res. (Part C) 2010: 90: Allickson J.G., Sanchez A., Yefimenko N., Borlongan C.V., Sanberg P.R. Recent studies assessing the prolifrative capability of a novel adult stem cell identified in menstrual blood. Open Stem Cell J. 2011; 3: Kanemura Y. Development of cell-processing systems for human stem cells (neural stem cells, mesenchymal stem cells, and ips cells) for regenerative medicine. Keio J. Med. 2010; 59(2): Arien-Zakay H., Lazarovici P., Nagler A. Tissue regeneration potential in human umbilical cord blood. Best Pract. And Res. Clin. Haematology 2010; 23: De Bari C. Kurth T. B., Augello A. Mesenchymal stem cells from development to postnatal joint homeostasis, aging and disease. Birth Def. Res. (Part C) 2010; 90: Scharsuhl A., Schewe B., Benz K., Gaissmaier C., Bühring H.-J., Stoop R. Chondrogenic potential of human adult mesenchymal stem cells is independent of age or osteoarthritis etiology. Stem Cells 2007; 25: Khan W.S., Johnson D.S., Hardingham T.E. The potential of stem cells in the treatment of knee cartilage defects. The Knee 2010; 17: Chanda D., Kumar S., Ponnazhagan S. Therapeutic potential of adult one marrow-derived mesenchymal stem cells in diseases of the skeleton. J. Cell. Biochem. 2010; 111: Undale A.H., Westendorf J.J., Yaszemski M.J., Khosla S. Mesenchymal stem cells for bone repair and metabolic bone diseases. Mayo Clin. Proc. 2009; 84(10): \ 13. Si Y.-L., Zhao Y.-L., Hao-H.-J., Fu X.-B., Han W.-D. MSCs: biological characteristics, clinical applications and their outstanding concerns. Ageing Res. Rev. 2011; 10: Fanjun C., Ping Z., Handong Y., Zhengtong Y., Zhaodong Z. Induced differentiation of human cord blood mesenchymal stem/progenitor cells into cardiomyocyte-like cells in vitro. J. Huazhong Univ. Sci. Technolog. Med. Sci. 2003; 23(2): Fukuda K. Use of adult marrow mesenchymal stem cells for regeneration of cardiomyocytes. Bone Marrow Transplant. 2003; 32: S25-S Martinez E.C., Kofidis T. Adult stem cells for cardiac tissue engineering. J. Mol. Cel. Cardiol. 2011; 50: Flynn A., O'Brien T. Stem cell therapy for cardiac disease. Expert Opin. Biol. Ther. 2011; 11(2): Aguyao-Mazzucato C., Bonner-Weir S. Stem cell therapy fro type 1 diabetes mellitus. Nat. Rev. Endocrinol. 2010; 6: Mishra P.K., Singh S.R., Joshua I.G., Tyagi S.C. Stem cells as a therapeutic target for diabetes. Front. Biosci. 2011; 15:

10 20. Zulewski H. Stem cells with potential to generate insulin-producing cells in man. Swiss Med. Wkly 2006; 136: Volarevic V., Arsenijevic N., Lukic M.L., Stojkovic M. Coincise Review: Mesenchymal stem cell treatment of the complications ODF diabetes mellitus. Stem Cells 2011; 29: Drzewiecki B.A., Thomas J.C., Tanaka S.T. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells: current and future applications in the urinary bladder. SAGE-Hindawi Access to Research Stem Cells Int. 2010; Article ID , 5 pages 23. Tian H., Bharadwaj S., Liu Y., Ma P.X., Atala A., Zhang Y. Differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells into bladder cells: potential use for urological tissue engineering. Tissue Eng. Part A 2010; 16 (5): Kim W.-S., Park B.-S., Sung J.-H. The wound-healing and antioxidant effects of adiposederived stem cells. Expert Opin. Biol. Ther. 2009; 9(7): Almeida-Porada G., Zanjani E.D., Porada C.D. Bone marrow stem cells and liver regeneration. Exp.Hematol. 2010; 38: Snykers S., De Kock J., Rogiers V., Vanhaecke T. In vitro differentiation of embrionic and adult stem cells into hepatocytes: state of the art. Stem cells 2009; 27: