Metody i strategie genetyki i genomiki

Transkrypt

1 Metody i strategie genetyki i genomiki

2 Wybrane techniki genetyki klasycznej

3 Komplementacja Wiele mutacji dających taki sam, lub podobny fenotyp Czy są to mutacje w tym samym genie, czy w różnych

4 Podwójne heterozygoty cis i trans m1, m2 mutacje (bez znaczenia, czy w tym samym genie, czy w różnych m1 m2 m1 +m2 +m1 +m2 +m1 m2 Układ cis Układ trans Otrzymywanie: m1,m2 x wt (czyste linie) Otrzymywanie: m1 x m2 (czyste linie)

5 Komplementacja m1 m2 m1 m2 +m1 +m2 +m1 +m2 W układzie cis fenotyp zawsze dziki, niezależnie od tego, czy m1 i m2 są w tym samym genie, czy w różnych. Warunek m1 i m2 recesywne.

6 Komplementacja m1 +m2 m1 +m2 +m1 m2 +m1 m2 Jest funkcjonalny allel jednego i drugiego genu Oba allele niefunkcjonalne W układzie trans test daje odpowiedź Warunek m1 i m2 recesywne.

7 Test komplementacji wersja najprostsza Podwójna heterozygota trans Fenotyp dziki komplementacja, różne geny Fenotyp mutanta brak komplementacji ten sam gen Tylko dla mutacji recesywnych

8 Komplementacja Peter J. Russell, igenetics: Copyright Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings.

9 Cistron Eksperymenty Benzera na bakteriofagach Łysinki fagowe

10 Cistron Mutacje w obrębie tego samego cistronu nie komplementują Peter J. Russell, igenetics: Copyright Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings.

11 Geny i chromosomy Dwa allele genu dwa chromosomy homologiczne u organizmów diploidalnych W. S Klug, M.R Cummings Concepts of Genetics 8th edition, Prentice Hall, 2005

12 Geny i chromosomy Segregacja alleli do gamet (I prawo Mendla) koreluje z zachowaniem chromosomów podczas mejozy W. S Klug, M.R Cummings Concepts of Genetics 8th edition, Prentice Hall, 2005

13 I prawo Mendla każda gameta wytwarzana przez organizm posiada tylko jeden allel z danej pary alleli genu jest prawdziwe dla genów leżących na autosomach w jądrze cechy niemendlowskie - np. DNA organellarne

14 Chromosomy płci U wielu (ale nie wszystkich) organizmów płeć jest determinowana przez specjalną parę chromosomów Ssaki łożyskowe XX ; XY Y niezbędny do rozwoju fenotypu męskiego, X0 (zespół Turnera) fenotypowo kobiecy Drosophila XX ; XY Fenotyp determinowany przez stosunek X do autosomów, X0 fenotypowo samiec (niepłodny u D. melanogaster) Ptaki, owady, niektóre jaszczurki ZW ; ZZ

15 Sprzężenie z płcią w wt (w+) Thomas H. Morgan W. S Klug, M.R Cummings Concepts of Genetics 8th edition, Prentice Hall, 2005

16 Sprzężenie z płcią - interpretacja W. S Klug, M.R Cummings Concepts of Genetics 8th edition, Prentice Hall, 2005

17 Geny i chromosomy Niezależne dziedziczenie alleli różnych genów niezależna segregacja różnych chromosomów W. S Klug, M.R Cummings Concepts of Genetics 8th edition, Prentice Hall, 2005

18 II prawo Mendla geny należące do jednej pary alleli są dziedziczone niezależnie od genów należących do drugiej pary alleli prawdziwe dla genów spełniających I prawo Mendla i leżących na różnych chromosomach, lub dostatecznie daleko od siebie

19 Sprzężenie Geny leżące na różnych chromosomach spełniają II prawo Mendla Dla 2 genów: 4 równoliczne klasy gamet W. S Klug, M.R Cummings Concepts of Genetics 8th edition, Prentice Hall, 2005

20 Sprzężenie Allele genów leżących na tym samym chromosomie dziedziczą się razem sprzężenie Dla 2 genów: 2 równoliczne klasy gamet rodzicielskich W. S Klug, M.R Cummings Concepts of Genetics 8th edition, Prentice Hall, 2005

21 Sprzężenie Crossing-over (rekombinacja chromatyd niesiostrzanych) Dla 2 genów: 2 równoliczne klasy gamet rodzicielskich 2 równoliczne klasy gamet zrekombinowanych Klasy zrekombinowane mniej liczne od rodzicielskich W. S Klug, M.R Cummings Concepts of Genetics 8th edition, Prentice Hall, 2005

22 Mapowanie genów Aby powstały gamety zrekombinowane, crossing-over musi zajść pomiędzy genami (loci) powstają gamety zrekombinowane W. S Klug, M.R Cummings Concepts of Genetics 8th edition, Prentice Hall, 2005

23 Mapowanie genów Prawdopodobieństwo crossing-over pomiędzy genami jest proporcjonalne do odległości między nimi na chromosomie Liczebność klas rodzicielskich w potomstwie jest miarą odległości genetycznej U Drosophila najlepiej mapować za pomocą heterozygotycznej samicy i samca recesywnego

24 Mapowanie genów U Drosophila najlepiej mapować za pomocą heterozygotycznej samicy i samca recesywnego U samców nie zachodzi crossing-over Reguła Haldane a-huxleya: u płci heterogametycznej (dwa różne chromosomy płci) częstość crossing-over może być obniżona (nawet do 0)

25 Mapowanie Jednostka cm (centymorgan) = 1% rekombinacji W rzeczywistości zależność nie jest liniowa Podwójny crossing-over gamety typu rodzicielskiego Interferencja zajście crossing-over w danym miejscu wpływa na prawdopodobieństwo zajścia kolejnego w pobliżu

26 Mapy genetyczne człowieka i innych organizmów Dla 3000Mb genomu autosomalnego 1 cm u mężczyzny 1,05 Mb 1 cm u kobiety 0,88Mb 1 cm u Drosophila 0,5 Mb 1cM u drożdży 3 kb

27 Czy genetyka klasyczna ma dziś znaczenie? Wciąż aktualne metody: Izolacja i charakterystyka mutantów Test komplementacji Interakcje genetyczne! jedna z podstaw biologii systemów Konstrukcje organizmów (głównie mikroorganizmy) przez odpowiednio dobrane krzyżówki Dziedziczenie mendlowskie w medycynie poradnictwo genetyczne. Metody probabilistyczne

28 Genetyka molekularna i genomika

29 Czym jest inżynieria genetyczna? Ang. recombinant DNA manipulacje DNA in vitro izolacja i amplifikacja DNA i cdna mapowanie i sekwencjonowanie DNA tworzenie nowych cząsteczek DNA przez rekombinację cząsteczek naturalnych przez syntezę de novo wprowadzanie konstruktów DNA do komórek i organizmów modyfikacje syntezy białek ekspresja heterologiczna bioinformatyka

30 A co nie jest inżynierią genetyczną? Inżynieria embrionalna (np. klonowanie) Tworzenie nowych form organizmów przez selekcję

31 Zastosowania Badania podstawowe Biotechnologia Granica między badaniami podstawowymi a stosowanymi jest płynna, stosowane techniki są podobne, różnice dotyczą głównie skali.

32 Podstawowe techniki Izolacja DNA cdna izolacja RNA i przepisanie na DNA Chemiczna synteza DNA de novo PCR Klonowanie DNA Mutageneza losowa i ukierunkowana w tym wprowadzanie modyfikacji do genomu Wykrywanie DNA, RNA i białek Sekwencjonowanie

33 Lektura Allison Podstawy biologii molekularnej, rozdział 8 i 9

34 Tradycyjny odczyt sekwencji A T C G Znakowanie radioaktywne, osobne reakcje

35 Sekwencjonowanie automatyczne Dideoksynukleotydy znakowane fluorescencyjnie (4 kolory) Elektroforeza kapilarna

36 Sekwencjonowanie - postęp techniczny Koszt sekwencjonowania między 1999 a 2009 obniżył sie razy Prędkość odczytu sekwencji między 2000 a 2010 r. wzrosła razy Cel: sekwencja genomu jednej osoby za 1000$ osiągalny w ciągu kilku lat Im więcej znamy sekwencji, tym łatwiej poznajemy kolejne

37 Sekwencjonowanie wysokoprzepustowe Tzw. deep sequencing, sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) Generowanie w jednym przebiegu milionów niezależnych odczytów Pojedyncze odczyty krótkie ( bp) Zastosowania sekwencjonowanie nowych genomów resekwencjonowanie np. analiza zmienności badanie ekspresji przez sekwencjonowanie cdna

38 Sekwencjonowanie Głównym wyzwaniem w sekwencjonowaniu nie jest sam odczyt sekwencji Odczytywane fragmenty są krótkie do ~ nt (sekw. tradycyjne Sangera) nt (454) nt (Solexa) Wyzwaniem jest złożenie długiej sekwencji z tych krótkich fragmentów

39 Genomika Genomika jest dziedziną zajmującą się badaniem całych genomów (kompletu informacji genetycznej) różnych organizmów Techniki biologii molekularnej + robotyka + informatyka Sekwencjonowanie i charakteryzowanie genomów Badanie funkcji zawartych w nich genów

40 Metagenomika Izolacja DNA ze środowiska i sekwencjonowanie Jedyny sposób badania mikroorganizmów, które nie dają się hodować

41 Metagenomika Analiza sekwencji całości DNA wyizolowanego ze zbiorowiska organizmów

42 Odkrycia dzięki sekwencjonowaniu Tajemnicza UCYN-A Sinica (cyjanobakteria) Niewielki genom (1,4mln par zasad, 1200 genów) Brak zdolności fotosyntezy, cyklu Krebsa, syntezy niektórych aminokwasów Zdolność asymilacji azotu Symbioza (gospodarz - haptofit) Candidatus Atelocyanobacterium thalassa

43 Wielkie projekty Projekt 1000 genomów - różnorodność genetyczna człowieka Metagenomika mikrobiomu przewodu pokarmowego człowieka Genomy wymarłych gatunków (np. Neandertalczyk)

44 RNA-seq

45 Sekwencjonowanie nowej generacji wyzwanie dla bioinformatyki Krótkie odczyty ( nt) pojedyncze paired-end Problem identyfikacji i składania sekwencji Indeksowanie i multipleks

46 Genomika funkcjonalna Wysokoprzepustowe analizy: ekspresji genów (mikromacierze, RNA-seq) proteomu interakcji genetycznych i fizycznych fenotypów

47 Genom człowieka

48 Craig Venter Francis Collins (NIH)

49

50 Czym jest znajomość genomu Nie jest odczytaniem księgi życia Sama sekwencja nie daje jeszcze zrozumienia, jak funkcjonują komórki Ale jest niezwykle cennym narzędziem w badaniach Sekwencja nie jest lekarstwem Ale bardzo pomaga w zrozumieniu mechanizmów chorób i wynajdywaniu nowych terapii

51 Co genom już dał nauce Dużo ciekawych i zaskakujących odkryć Dlaczego mamy tak mało genów Jak ewoluował człowiek Narzędzie do badania funkcji genów

52 Czy warto badać genomy Nowoczesne techniki generują bardzo dużo danych Dwa podejścia hypothesis driven dane zbierane dla zweryfikowania jakiejś hipotezy data driven dane zbierane bez wstępnych założeń, potem wyszukiwane w nich prawidłowości

53 Zbieranie danych Podejście zakładające poszukiwanie prawidłowości w dużych zbiorach danych, zbieranych bez wstępnych założeń, może być produktywne Ale niesie też (dobrze znane w literaturze) ryzyko Lem, S. Cyberiada, Wyprawa szósta: czyli jak Trurl i Klapaucjusz demona drugiego rodzaju stworzyli, aby zbójcę Gębona pokonać., academia_2013/022013/ _golik.pdf

54 Co to znaczy? TCACAATTTAGACATCTAGTCTTCCACTTAAGCATATTTAGATTGTTTCCAGTTTTCAGCTTTTATGACTAAATCTTCTAAAATTGTTTTTCCCTAAATGT ATATTTTAATTTGTCTCAGGAGTAGAATTTCTGAGTCATAAAGCGGTCATATGTATAAATTTTAGGTGCCTCATAGCTCTTCAAATAGTCATCCCATTTT ATACATCCAGGCAATATATGAGAGTTCTTGGTGCTCCACATCTTAGCTAGGATTTGATGTCAACCAGTCTCTTTAATTTAGATATTCTAGTACATACAA AATAATACCTCAGTGTAACCTCTGTTTGTATTTCCCTTGATTAACTGATGCTGAGCACATCTTCATGTGCTTATTGACCATTAATTAGTCTTATTTGTTA AATGTCTCAAATATTTTATACAGTTTTACATTGTGTTATTCATTTTTTAAAAAATTCATTTTAGGTTATATGTATGTGTGTGTCAAAGTGTGTGTACATCTAT TTGATATATGTATGTCTATATATTCTGGATACCATCTCTGTTTCATGCATTGCATATATATTTGCCTATTTAGTGGTTTATCTTTTCATTTTCTTTTGGTATCT TTTCATTAGAAATGTTATTTATTTTGAGTAAGTAACATTTAATATATTCTGTAACATTTAATGAATCATTTTATGTTATGTTTAGTATTAAATTTCTGAAAACAT TCTATGTATTCTACTAGAATTGTCATAATTTTATCTTTTATATACATTGATATTTTTATGTCAAATATGTAGGTATGTGATATTATGCACATGGTTTTAATTCAG TTAATTGTTCTTCCAGATGTTTGTACCATTCCAACATCATTTAAATCATTAAATGAAAAGCCTTTCCTTACTAGCTAGCCAGCTTTGAAAATCCATTCAT AGGGTTTGTGTTAATATATTTTTGTTCTTTTTTTTCCTTTCTACTGATCTCTTTATATTAATACCTACTGTGGCTTTATATGAAGTCATGGAATAATACGTA GTAAGCCCTCTAACACTGTTCTGTTACTGTTGTTATTGTTTTCTCAGGGTACTTTGAAATATTCGAGATTTTATTATTTTTTAGTAGCCTAGATTTCAAG ATTGTTTTGACGATCAATTTTTGAATCAATTGTCAATATTTTTAGTAATAAAATGATGATTTTTGATTGGAAATACATTAAATCTATAAGCCAAATTGGAGA TTATTGATATATTAACAAAAATGAGTTTTCCAGTCCATGAATGTATGCACATTATAAAATTCATTCTTAAGTATGTCATTTTTTAAGTTTTAGTTTCAGCAG TATATGTTTGTTACATAGGTAAACTCCTGTCATGGGGGTTAGTTGTACAGGTTATTTTATCATCCAGGCATAAAGCCCAGTACCCAGTAGTTATCTTTT CTGCTCCTCTCCCTCCTGTCACCCTCCACTCTCAAGTAGACCCCAGTTTCTGTTGTTCTCTTCTTTGCATTAATGACTTCTCATCATTTAGATTGCA CTTGTAAGTGAGAACAGGACGTATGTGGTTTTCTACTCCTGTGTTAGTTTGCTAAGGATAACCACCTCCATCTCCATCCATGTTCCCACAAAAGAC ATGATCTCCTTTTTTATGGCTGCATATTATTCCATGGTATATATGTACCACATTTTCTTTATCCAATCTGTCATTGATGGACATTTAGGTTGTTTCCACAT CATTGCCGTTGTAAATACTGCTGCAGTGAATATTCGTGTGTATGTCTTTATGGTAGAATGATTTATATTCCTCTGGGTATATTTCCAAGTAATGGGATG GTTGGGTCAAATGGTAATTCTGCTTTTAGCTTTTTGAGGAATTGCCATATTGCCTTTCACAACGGTTGAACTAATTTATACTCCCAAGAGTGTATAAG TTGTTCCTTTTTCTCTGCAACCTCGACATCACCTGTTATTTATGACTTTTATATAATAGCCATTCTGCTGGTCTGAGATGGTATCTCATTATGATTTTGA TTTGCATTTCTCTAATGCTCAGTGATATTGAGCTTGGCTGCATATATGTCTTCTTTTAAAAATATCTGTTCATGTCCTTTGCCTAATTTATAACGGGGTT GTTTGTTTTTCTCTTGTAAATTTGTTTAAGTTCCTTATAGATTCTAGGTATTAAACCTTTTTTCAGAGGCGTGGCTTGCAAATATTTTCTCCCATTCTATA GGTTGTCTGTTTATTCTGTTGATAGTTTCCCTTGCTGTGCAGAAGCTCTTAACTTTAATTAGATCCGACTTGTCAATTTTTGCTTTGGTCGCAATTGC TTTTGATGTTATTGTCGTGAAATCTTTGCTAGTTCTTAGGTCCAGGATGATATTGCCCAAGTTGTCTTCCAGGGCTTTTATAATTTTGGATTTTACATTT AAGTCTTAATATATTTATTAAATTTGTTAGGGTTTCAGGATACAAGGACAATATAGCAGCAAACAATGTAAAAGTAAAATCTGAAAAATAATAGAAAAC AGTTTAATTGAACACTTTACCATTATGTAATGCCCTTCTTTGTCTTTCCTGATCTTTGTTGGTTTGAAGTTCAAAAAAGACAAACTTAATGGTACAATA GGTATTGTAGATTTCAGGACTTTCTGTATAAAATATTTTGTATATATGAATAGATCATTTTTTATTTCCAGTCTTTAAACATTTTCTTAACATTTTCTTCTATT GCTTCACTTCACTCGCTAGGACCATCAGGACAGTGTTGAACAGAAATTGTCAGACTGATCATCACAACTTTTTCTAGATTTTAGAAGGAAATTTTT CTTTATTTCAACATAAAGCAGCATGTTAATGCCAAGTTTTAATATGTGTTATCAGATTGAAATTTTTTTGTATATTTCTACATTACCAAGAATTTTTAGCAA GAGTTTTTGTTGAGTTTTAATTTAAAAATCATTTGTTAATTTCATCTGATTTTTTTATTTCTCTTTTTACCTTAAGAGATTAAACTGACTACAGATTGAATAT AAACAAACAAACAAACAAACAAAAACTCTAAAATGCTGTGGATCAACACCACTTAGTAATTTGTATACTTGGATTCAATTTGCTGAAATTTTGTTAG ACATTTTTGCGTCGATATTTATGAGGGATGTTGATCTGTAAAAGTATTAAAATGCCTTTGACAGATAGTGTCACCATATAAAAAACTTTGAACAAAATC AGATTATATCACTGTGGATATTTCTATTTTGAACTAACTTAGATGATAATTTTAATCTATATCCTAGATGAACT Mały fragment chromosomu 21

55 Odwrotna genetyka od genu do funkcji Genetyka tradycyjna Genetyka odwrotna Funkcja (mutacja, fenotyp) Gen (z sekwencji całego genomu) Klonowanie genu Inaktywacja genu Analiza sklonowanego genu Analiza uzyskanego fenotypu

56 Odwrotna genetyka inaktywacja przez rekombinację

57 Inaktywacja warunkowa System Cre-Lox Wprowadzenie do genomu miejsc Lox Ekspresja rekombinazy Cre powoduje wycięcie fragmentu pomiędzy miejscami Lox

58 Odwrotna genetyka interferencja RNA Odkrycie roku 2002 regulacyjna rola małych RNA Nagroda Nobla w dziedzinie medycyny 2006, za odkrycie mechanizmu interferencji RNA A. Fire i C. Mello

59 sirna - jak to działa? Efekt degradacja mrna Hannon G.J.: RNA interference, Nature 418, July 11, 2002

60 Zastosowania sirna Badanie funkcji genów ( odwrotna genetyka ) - szczególnie skuteczne u nicienia Caenorhabditis, ale działa też w komórkach owadów, ssaków i roślin Hamowanie wybranych genów jako metoda leczenia (np. zwalczania wirusów czy nowotworów) przykład: obniżenie poziomu receptora LDL ( zły cholesterol ) u myszy

61 Myszy knock-out Izolacja komórek ES (zarodkowe macierzyste) z blastocysty Dawcą jest mysz szczepu białego Modyfikacja i selekcja komórek ES z knock-out

62 Myszy knock-out Wprowadzenie zmodyfikowanych komórek do blastocysty myszy szczepu szarego

63 Myszy knock-out Blastocysty zawierające zmodyfikowane komórki ES wszczepia się myszy matce zastępczej

64 Myszy knock-out Selekcja chimer z transgenem w linii płciowej

65 Redagowanie genomu - system CRISPR/Cas9 System obronny bakterii przed fagami, zaadaptowany do edycji dowolnej sekwencji w genomie. Działa także u organizmów, dla których nie istnieją stabilne wektory. Nature 495, (07 March 2013) doi: /495050a

66 Biologia systemów Postęp biologii molekularnej - genomika Ogromne zbiory danych Ujawnienie złożoności interakcji genetycznych leżących u podstaw fenotypu Narzędzia teoretyczne do systemowego opisu życia