BD BBL UROTUBE 2s BBL UROTUBE BBL UROTUBE M BBL UROTUBE E BBL UROTUBE E. coli BBL UROTUBE SXT

Transkrypt

1 GOTOWE PODŁOŻA DIPSLIDE NA PŁYTKACH INSTRUKCJE STOSOWANIA DA wer.: luty 2004 BD BBL UROTUBE 2s BBL UROTUBE BBL UROTUBE M BBL UROTUBE E BBL UROTUBE E. coli BBL UROTUBE SXT PRZEZNACZENIE Zestawy BBL UROTUBE wykorzystujące metodę płytki zanurzeniowej (dipslide), stosuje się w celu izolacji i określenia liczby kolonii drobnoustrojów wyizolowanych z próbek moczu. Powierzchnie płytek pokryte są warstwami dwóch lub trzech różnych podłoży hodowlanych. Wszystkie zestawy BBL UROTUBE zawierają CLED Agar (agar o obniżonej zawartości cystyny, laktozy i elektrolitów), przeznaczone do określania całkowitej liczby bakterii i (lub) drożdży, a także MacConkey Agar do wykrywania bakterii Gramujemnych, np. z rodziny Enterobacteriaceae. Niektóre zestawy zawierają również dodatkowe, trzecie. ZASADY I OBJAŚNIENIE PROCEDURY Metoda mikrobiologiczna. Podłoża typu wykorzystujące metodę płytki zanurzeniowej mają obecnie szerokie zastosowanie jako metoda przesiewowa do analiz ilościowych i izolacji drobnoustrojów z rutynowych próbek moczu. 15 Po zanurzeniu płytki w odpowiednio pobranej próbce świeżego moczu i inkubacji płytki, porównuje się liczbę kolonii na powierzchni podłoża CLED Agar z obrazem referencyjnym. W 1960 r. Sandys opracował CLED Agar mające na celu zapobieganie wzrostowi kolonii Proteus przez ograniczenie ilości elektrolitów w podłożu hodowlanym, które zostało później kilkakrotnie zmodyfikowane do wykonywania posiewów z moczu. 6 Podłoże otrzymało nazwę podłoża o zmniejszonej zawartości cystyny, laktozy i elektrolitów (CLED, CystineLactoseElectrolyteDeficient) i zostało uznane za znakomite dla metody posiewów zanurzeniowych oraz do bakteriologicznych badań moczu w ogóle. 6,7 Składniki odżywcze zawarte w pożywce CLED Agar pochodzą z żelatyny i peptonów kazeiny, jak również z wyciągu wołowego. Laktoza stanowi źródło energii dla organizmów zdolnych do jej wykorzystania w mechanizmie fermentacji. Jako wskaźnik ph, umożliwiający odróżnienie bakterii zdolnych i niezdolnych do fermentacji laktozy, stosuje się błękit bromotymolowy. Organizmy zdolne do fermentacji laktozy obniżają ph i zmieniają zabarwienie pożywki z zielonego na żółte. Cystyna umożliwia wzrost kolonii karłowatych pałeczek jelitowych. 3 Zawartość elektrolitów została zmniejszona w celu ograniczenia do minimum wzrostu kolonii gatunków z rodzaju Proteus. Liczba kolonii na podłożu CLED Agar jest wprost proporcjonalna do liczby bakterii w 1 ml próbki moczu. Płytki zanurzeniowe wszystkich zestawów BBL UROTUBE zawierają CLED Agar jako 1. Drugim m jest MacConkey Agar. Ponieważ stężenie soli żółciowych hamujących wzrost drobnoustrojów Gramdodatnich jest niskie w porównaniu z innymi podłożami dla bakterii jelitowych, opisywane charakteryzuje się niewielką selektywnością. Zaleca się stosowanie opisywanego podłoża w przypadku próbek klinicznych, które mogą zawierać mieszaną florę bakteryjną, takich jak mocz, ponieważ pozwala ono na wstępne różnicowanie bakterii jelitowych i wielu innych bakterii Gramujemnych ze względu na zdolność do fermentacji laktozy. 8,9 W podłożu MacConkey Agar składnikami odżywczymi są peptony. Fiolet krystaliczny hamuje wzrost bakterii Gramdodatnich, zwłaszcza enterokoków i gronkowców. Różnicowanie mikroorganizmów jelitowych jest możliwe dzięki połączeniu laktozy i czerwieni obojętnej wskaźnika odczynu ph. Powstające kolonie są bezbarwne lub mają zabarwienie różowe do czerwonego, w zależności od zdolności poszczególnych szczepów do fermentacji określonego węglowodanu. DA

2 Wszystkie zestawy płytek UROTUBE zawierają MacConkey Agar jako 2. Dwustronna płytka zestawu BBL UROTUBE 2S zawiera tylko podłoża CLED i MacConkey. Wszystkie trójstronne płytki zanurzeniowe zawierają na powierzchniach trzecie, pozwalające na wykrywanie charakterystycznych grup bakterii oraz drożdży. Typ podłoża zależy od stosowanego zestawu: BBL UROTUBE zawiera, oprócz wspomnianych powyżej podłoży 1 i 2, także Cetrimide Agar, szeroko stosowane do wybiórczej izolacji Pseudomonas aeruginosa. 10,11 Składniki odżywcze pochodzą z żelatyny i peptonów kazeiny. Sole potasu i magnezu wzmagają wytwarzanie barwnika przez P. aeruginosa. Glicerol stanowi źródło energii i węgla. Bromek cetylotrimetyloamoniowy (=cetrimid) jest detergentem wybiórczo hamującym wzrost pałeczek Gramujemnych, z wyjątkiem P. aeruginosa. BBL UROTUBE M zawiera, oprócz wspomnianych podłoży 1 i 2, także Malt Agar częściowo wybiórcze, stosowane do izolacji drożdży (np. Candida albicans). Wyciąg słodowy i kwas mlekowy stanowią składniki odżywcze, a także utrzymują ph na poziomie zapewniającym wybiórczość hamowania wzrostu wielu gatunków bakterii. 11 BBL UROTUBE E zawiera oprócz wspomnianych powyżej podłoży 1 i 2 także Enterococcus Agar, wybiórcze różnicujące dla gatunków Enterococcus. 11 Składniki odżywcze zawarte w podłożu Enterococcus Agar pochodzą z kazeiny i wyciągu z drożdży. Stabilne ciśnienie osmotyczne utrzymuje chlorek sodu. Połączenie cytrynianu, azydku, kanamycyny, polimyksyny B, kwasu nalidyksowego i neomycyny hamuje wzrost bakterii, z wyjątkiem gatunków Enterococcus. Eskulina stanowi substrat dla betaglukozydazy, enzymu charakterystycznego dla gatunków Enterococcus. Jeden z produktów hydrolizy enzymatycznej eskuletyna reaguje z jonami żelazowymi, wytwarzając w podłożu otaczającym kolonie Enterococcus osad o kolorze od brązowego do czarnego. BBL UROTUBE E. coli zawiera, oprócz wspomnianych powyżej podłoży 1 i 2, także BetaGlucuronidase (=BGLU) Agar, wybiórcze różnicujące do wykrywania gatunków E. coli i Proteus. Podłoże zawiera nitrofenyloßglukuronid, substrat chromogeny stosowany do wykrywania aktywności betaglukuronidazy, enzymu charakterystycznego dla Escherichia coli. Enzymu nie posiadają inne bakterie, w tym z rodzajów Proteus, Providencia i Morganella. 11,12 Na skutek rozkładania substratu, w podłożu i koloniach gromadzi się żółty nitrofenol. Kolonie nieposiadające glukuronidazy są bezbarwne do szarawych, a otaczające je jest bezbarwne. Wzrost żółtych kolonii na tym podłożu można uzależnić od wyników testu indolowego jeśli są dodatnie, potwierdzają wykrycie E. coli. Dodanie prekursora indolu (tryptofanu) przyspiesza wytwarzanie indolu w tym podłożu. Ponadto ten aminokwas jest substratem dla deaminazy tryptofanowej (TDA, Tryptophan Deaminase), enzymu charakterystycznego dla gatunków Proteus, Providencia i Morganella. Enzym można łatwo wykryć, wykonując test TDA z chlorkiem żelaza. W celu uzyskania dalszego potwierdzenia można przeprowadzić test indolowy na koloniach bezbarwnych. Test daje wynik dodatni również w przypadku gatunków Proteus vulgaris, Providencia i Morganella morganii. W skład zestawu BBL UROTUBE SXT wchodzi, oprócz wspomnianych powyżej podłoży 1 i 2, także testowe do oznaczania wrażliwości (PDM Medium) z trimetoprimem i sulfametoksazolem (SXT), niezawierające inhibitora wzrostu, przeznaczone do oznaczania oporności lub wrażliwości na SXT. Wzrost jakichkolwiek bakterii na tym podłożu oznacza oporność na SXT. Po wykonaniu posiewu lub posiewu z inkubacją zestawy płytek zanurzeniowych można wykorzystywać jako transportowe podczas przenoszenia próbek z gabinetu lekarskiego do laboratorium analitycznego. Kolonie wyrosłe na podłożu płytki zanurzeniowej można stosować do identyfikacji oraz określenia wrażliwości izolowanych szczepów. ODCZYNNIKI Składy* w przeliczeniu na jeden litr wody oczyszczonej Podłoża 1 i 2 wchodzą w skład płytek wszystkich zestawów BBL UROTUBE. DA

3 Podłoże 1: Podłoże CLED Agar Podłoże 2: Podłoże MacConkey Agar Pepsynowy hydrolizat kazeiny 4,0 g Pepsynowy hydrolizat kazeiny 17,0 g Wybrane peptony 4,0 Peptony mięsne 3,0 Wyciąg mięsny 3,0 Laktoza 10,0 Laktoza 10,0 Chlorek sodu 5,0 Cystyna 0,128 Mieszanka soli żółciowych 1,5 Błękit bromotymolowy 0,02 Czerwień obojętna 0,03 Agar 15,0 Fiolet krystaliczny 0,001 ph 7,3 ± 0,2 Agar 13,5 ph 7,1 ± 0,2 Podłoże 3: Typ podłoża 3 (jeżeli wchodzi w skład produktu) zależy od stosowanego zestawu (zobacz ZASADY I OBJAŚNIENIE PROCEDURY). BBL UROTUBE, oprócz wspomnianych powyżej podłoży 1 i 2 zawiera również Cetrimide Agar: Pepsynowy hydrolizat żelatyny 16,0 g Glicerol 8,0 g Hydrolizat kazeiny 10,0 Bromek cetylotrimetyloamoniowy 0,3 Siarczan potasu 10,0 Agar 13,0 Chlorek magnezu 1,4 ph 7,1 ± 0,2 BBL UROTUBE M, oprócz wspomnianych powyżej podłoży 1 i 2 zawiera również Malt Agar: Wyciąg słodowy 30,0 g Agar 18,0 g Kwas mlekowy 6,3 ph 4,0 ± 0,4 BBL UROTUBE E, oprócz wspomnianych powyżej podłoży 1 i 2 zawiera również Enterococcus Agar: Pepsynowy hydrolizat kazeiny 20,0 g Kanamycyna 0,02 g Wyciąg drożdżowy 5,0 Polimyksyna B 0,002 Chlorek sodu 5,0 Kwas nalidyksowy 0,0075 Cytrynian 1,5 Neomycyna 0,002 Azydek sodu 0,15 Agar 15,0 Eskulina 1,0 ph 7,1 ± 0,2 Cytrynian amonowożelazowy 0,5 BBL UROTUBE E coli, oprócz wspomnianych powyżej podłoży 1 i 2 zawiera również BetaGlucuronidase (=BGLU) Agar: Peptony 10,0 g Chlorek sodu 5,0 g Nitrofenyloßglukuronid 0,1 Agar 15,0 Tryptofan 0,3 ph 7,2 ± 0,2 BBL UROTUBE SXT zawiera, oprócz wspomnianych powyżej podłoży 1 i 2, także (PDM Medium) z trimetoprimem i sulfametoksazolem (SXT), niezawierające inhibitora wzrostu. Podłoże PDM Medium 32,3 g Trimetoprim 0,003 g Sulfametoksazol 0,04 ph 7,3 ± 0,3 *Składy można skorygować i (lub) uzupełnić, tak by spełniały kryteria wydajnościowe. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI. Wyłącznie do zastosowań profesjonalnych. Nie należy używać zestawów płytek zanurzeniowych, jeżeli są na nich widoczne oznaki skażenia mikrobiologicznego, odbarwienia, wyschnięcia, pęknięcia lub inne objawy wskazujące na pogorszenie jakości. DA

4 Podczas wykonywania wszystkich procedur należy przestrzegać aseptycznej techniki pracy i środków ostrożności dotyczących zagrożenia mikrobiologicznego. Podczas pobierania i pracy z próbkami oraz dodatnimi płytkami zawierającymi czynniki zakaźne należy używać rękawic ochronnych. Procedury aseptycznej techniki pracy z produktem, zagrożenia biologiczne oraz usuwanie zużytego produktu opisano w dokumencie OGÓLNE INSTRUKCJE DOTYCZĄCE STOSOWANIA. W przypadku stosowania omawianych zestawów jako podłoża do transportu z gabinetu lekarskiego do laboratorium diagnostycznego, należy przestrzegać lokalnych przepisów dotyczących przewozu próbek zakaźnych. WARUNKI I OKRES PRZECHOWYWANIA Dostarczone zestawy BBL UROTUBE należy przechowywać aż do momentu użycia w oryginalnych opakowaniach, w zacienionym pomieszczeniu, w temperaturze od 15 do 20 C. Nie zamrażać, nie przegrzewać, unikać wysychania i wahań temperatury. Płytki zanurzeniowe należy wykorzystać do posiewu bakterii przed upływem daty ważności (zobacz etykietę na opakowaniu) i inkubować zgodnie z zalecanymi czasami inkubacji. Nieotwarte płytki z otwartych opakowań zbiorczych można stosować aż do upływu daty ważności, o ile były przechowywane w czystym miejscu, w temperaturze od 15 do 20 C. Płytki zanurzeniowe należy wykorzystywać natychmiast po otwarciu. KONTROLA JAKOŚCI PRZEZ UŻYTKOWNIKA Należy przygotować zawiesiny w soli fizjologicznej szczepów testowych wymienionych poniżej, tak by były równoważne ze standardem 0,5 McFarland (około 5 x 10 7 CFU/ml). Rozcieńczyć zawiesiny do stężenia od 10 4 do 10 5 CFU/ml. Zanurzyć płytki z próbkami w płynach o podanych rozcieńczeniach; odcedzić nadmiar zawiesiny i ponownie umieścić płytki w oryginalnych probówkach. Inkubować w temperaturze od 35 do 37 C, przez godziny. Skontrolować zgodnie z opisem Oczekiwane wyniki przedstawiono w tabeli: Zestaw i Zabarwienie (bez posiewu) BBL UROTUBE Podłoże 1 żółtawe do żółtozielon ego Escherichia coli ATCC żółte; żółte Podłoże 2 różowe różowe; czerwone do różowego Podłoże 3 bezbarwne do jasnoburszt ynowego Proteus mirabilis ATCC bezbarwne; żółtozielone do zielonego bezbarwne do beżowych; pomarańczowob rązowe Enterococcus faecalis ATCC żółte; żółte Pseudomonas aeruginosa ATCC Candida albicans ATCC ; małe, białawe kolonie; żółtawe do ch; niebieskozielone niebieskozielone go ch, z fluorescencją lub bez niej żółtawe do ch Zestaw i Zabarwienie (bez posiewu) BBL UROTUBE M Podłoże 1 żółtawe do żółtozielon ego Escherichia coli ATCC żółte; żółte DA Proteus mirabilis ATCC bezbarwne; Enterococcus faecalis ATCC żółte; żółte Pseudomonas aeruginosa ATCC Candida albicans ATCC ; małe, białawe kolonie; żółtawe do

5 Podłoże 2 różowe różowe; czerwone do różowego Podłoże 3 bezbarwne do jasnoburszt ynowego BBL UROTUBE E Podłoże 1 żółtawe do żółtozielon ego żółte; żółte Podłoże 2 różowe różowe; czerwone do różowego Podłoże 3 jasnoburszt ynowe BBL UROTUBE E. coli Podłoże 1 żółtawe do żółtozielon ego żółte; żółte Podłoże 2 różowe różowe; czerwone do różowego Podłoże 3 bezbarwne +; i do kolonie żółte jasnoburszt ynowego Plamkowy test + indolowy TDA b żółtozielone do zielonego bezbarwne do beżowych; pomarańczowob rązowe ch; niebieskozielone ch, z fluorescencją lub bez niej niebieskozielone go białawe bezbarwne; żółtozielone do zielonego bezbarwne do beżowych; pomarańczowob rązowe żółte; żółte brązowe do czarnych; brązowe do czarnego bezbarwne; żółtozielone do zielonego bezbarwne do beżowych; pomarańczowob rązowe bezbarwne. + żółte; żółte +; i kolonie żółte ch, z fluorescencją lub bez niej (+)/ +; małe, białawe kolonie; żółtawe do ch; niebieskozielone niebieskozielone go ch, z fluorescencją lub bez niej (+) Zestaw i +; małe, białawe kolonie; żółtawe do ch; niebieskozielone niebieskozielone go Zabarwienie (bez posiewu) BBL UROTUBE 2S Podłoże 1 żółtawe do żółtozielon ego Escherichia coli ATCC żółte; żółte DA Proteus mirabilis ATCC bezbarwne; żółtozielone do Enterococcus faecalis ATCC żółte; żółte Pseudomonas aeruginosa ATCC ch; Candida albicans ATCC ; małe, białawe kolonie; żółtawe do niebieskozielone

6 Podłoże 2 różowe różowe; czerwone do różowego zielonego bezbarwne do beżowych; pomarańczowob rązowe niebieskozielone go ch, z fluorescencją lub bez niej Zestaw i Barwa (bez posiewu) BBL UROTUBE SXT Podłoże 1 żółtawe do żółtozielon ego Escherichia coli ATCC żółte; żółte Podłoże 2 różowe różowe; czerwone do różowego Proteus mirabilis ATCC bezbarwne; żółtozielone do zielonego bezbarwne do beżowych; pomarańczowob rązowe Enterococcus faecalis ATCC żółte; żółte Pseudomonas aeruginosa ATCC Candida albicans ATCC ; małe, białawe kolonie; żółtawe do ch; niebieskozielone niebieskozielone go ch, z fluorescencją lub bez niej Podłoże 3 bezbarwne + + do jasnoburszt ynowego = brak wzrostu lub śladowy wzrost; (+) = słaby wzrost; + = wzrost dobry do bardzo dobrego a, b Oznaczone testy uzupełniające należy przeprowadzać z wykorzystaniem wzrostu na podłożu 3. Dostępność odczynników opisano w części Materiały niedostarczane. PROCEDURA Dostarczane materiały BBL UROTUBE 2s, BBL UROTUBE, BBL UROTUBE M, BBL UROTUBE E, BBL UROTUBE E. coli lub BBL UROTUBE SXT Sprawdzane pod kątem obecności mikroorganizmów. Materiały niedostarczane Pomocnicze pożywki hodowlane, odczynniki i sprzęt laboratoryjny, zgodnie z opisem. Do wykonywania testów indolowego i TDA na podłożu 3 BBL UROTUBE E. coli: Odczynniki Indole Dropper Reagent (nr kat ) lub Indole DMACA Dropper Reagent (nr kat ). Odczynnik Ferric Chloride Dropper Reagent (nr kat ). Do wykonywania testów oksydazowych na podłożu 3 BBL UROTUBE: Odczynnik Oxidase Dropper Reagent (nr kat ). Typy próbek Opisywane zestawy są przeznaczone do izolacji i analiz ilościowych bakterii i grzybów z moczu ze środkowego strumienia lub z cewnika, lub pobranego z nakłucia nadłonowego pęcherza. Należy się zapoznać z informacjami zamieszczonymi w części CHARAKTERYSTYKA WYDAJNOŚCIOWA I OGRANICZENIA DOTYCZĄCE PROCEDURY. Pobieranie i przygotowanie próbek Podczas pobierania próbek należy przestrzegać zasad techniki aseptycznej. Stosować standardowe procedury pobierania próbek. 1,13 Próbki moczu do badania powinny być świeże lub nie starsze niż 2 godziny od pobrania. Alternatywnie, próbki moczu należy przechowywać w chłodziarce (nie dłużej niż do 24 godzin) w celu uniknięcia nadmiernego wzrostu czynników zakaźnych i zanieczyszczających przed wykonaniem posiewu. 13 DA

7 Procedura testowa 1. Skontrolować powierzchnie podłoży nie otwierając probówki. Nie stosować płytek wykazujących oznaki wyschnięcia, zanieczyszczenia lub innego uszkodzenia. 2. Zapisać na probówce nazwisko pacjenta, numer próbki i datę wykonania posiewu. 3. Odkręcić pokrywę i wyjąć płytkę z plastikowej probówki unikając dotykania powierzchni podłoży (rys. 1). Nie pobierać próbek moczu do oryginalnej probówki zawierającej płytkę BBL UROTUBE! 4. Trzykrotnie krótko zanurzyć płytkę w moczu, tak aby całkowicie pokryć powierzchnie podłoży (rys. 2). Nie pozostawiać płytki zanurzonej w moczu na dłużej niż 10 sekund, ponieważ może to spowodować wypłukanie składników podłoży i (lub) obluzowanie żelu w plastikowym uchwycie. W przypadku, gdy próbka jest zbyt mała do zanurzenia w niej płytki, powierzchnie podłoży można ostrożnie polać dostępną ilością moczu. 5. Pozbyć się nadmiaru moczu przyciskając krawędź płytki do wewnętrznego brzegu probówki (rys. 3). Ostatnie krople z krawędzi probówki można usunąć za pomocą bibuły (ryc. 4). 6. Zachowując ostrożność, ponownie umieścić płytkę w plastikowej probówce i mocno zamknąć. 7. Inkubować probówkę przez godzin, w temperaturze C (rys. 5) lub przesłać do laboratorium bakteriologicznego w celu dalszej obróbki Należy zauważyć, że po wykonaniu posiewu, probówki należy przetransportować do laboratorium w ciągu 24 godzin. W czasie transportu unikać zamrażania i przetrzymywania płytek w wyższych temperaturach. Interpretacja wyników Po okresie inkubacji należy wyjąć płytkę z próbówki w celu dokonania interpretacji. W celu ilościowej oceny liczby żywych mikroorganizmów należy porównać wzrost kolonii na podłożu CLED z przedstawionymi poniżej obrazami referencyjnymi. Interpretację należy przeprowadzać przy dobrym oświetleniu (rys. 6). Zlewny wzrost, spowodowany liczbą żywych mikroorganizmów 10 6 /ml może być trudny do rozpoznania, jako że może spowodować równomierne pokrycie całej powierzchni podłoża. W takim przypadku pomocne może być dotknięcie powierzchni ezą lub wacikiem. Wzrost kolonii na podłożu MacConkey Agar ( 2) wskazuje na obecność pałeczek Gramujemnych. Stwierdzenie wzrostu na podłożu 3 (jeżeli jest wchodzi w skład płytki zanurzeniowej wskazuje, w zależności od podłoża i typu stosowanej płytki, na obecność DA

8 odpowiednich grup drobnoustrojów. Szczegółowy opis wzrostu na poszczególnych podłożach przedstawiono poniżej. Nie należy określać liczby żywych mikroorganizmów wzrastających na podłożach 2 i 3, ponieważ zawarte w nich swoiste substancje mogą wpływać na wzrost! Do dalszych testów biochemicznych i do oznaczania wrażliwości, po wykonaniu kolejnych posiewów na podłoża na płytkach hodowlanych, można wykorzystać wzrost otrzymany z jakiegokolwiek podłoża zawartego na płytce zanurzeniowej. Podłoże CLED Agar (Podłoże 1 wchodzące w skład wszystkich zestawów BBL UROTUBE): Na podłożu CLED Agar wzrastają bakterie Gramdodatnie, Gramujemne i drożdże. Zmiana zabarwienia podłoża na żółte wskazuje na fermentację laktozy, natomiast kolor żółtozielony lub zielony wskazuje na obecność bakterii niezdolnych do fermentacji laktozy. W celu zinterpretowania liczb żywych drobnoustrojów uzyskanych na podłożu CLED Agar, można zastosować następujące wytyczne oraz przewodnik do interpretacji (obrazki), znajdujący się na końcu niniejszego dokumentu: Liczba żywych drobnoustroj ów Poniżej bakterii w 1 ml od do bakterii w 1 ml Powyżej bakterii w 1 ml Interpretacja kliniczna Mocz ze środkowego strumienia: Zanieczyszczenie. Małe liczby mogą być istotne w przypadku pacjentów uprzednio leczonych lub pacjentów z zakażeniami przewlekłymi. Mocz pobierany drogą cewnikowania lub nakłucia nadłonowego pęcherza: W tych przypadkach, stwierdzenie już poniżej bakterii w 1 ml wskazuje na obecność zakażenia. Mocz ze środkowego strumienia: Wynik wątpliwy. Zaleca się powtórne wykonanie testu, ponieważ takie liczby bakterii występują w przewlekłych zakażeniach układu moczowego, jak również mogą być obecne w moczu ze środkowego strumienia jako zanieczyszczenie. Takie liczby mogą być istotne w przypadku pacjentów uprzednio leczonych lub pacjentów z zakażeniami przewlekłymi. Mocz pobierany drogą cewnikowania lub nakłucia nadłonowego pęcherza: W tych przypadkach stwierdzenie już poniżej bakterii w 1 ml wskazuje na obecność zakażenia. Tak duże liczby żywych bakterii wskazują na obecność zakażenia w przypadku wszystkich typów próbek moczu (w tym moczu ze środkowego strumienia). W takich przypadkach, rozpoznanie potwierdzić może stwierdzenie dużej liczby białych krwinek w osadzie moczu. U kobiet duża liczba kolonii bakteryjnych może wystąpić na skutek zewnętrznego zanieczyszczenia (leukorrhea, zapalenie pochwy). Rozpoznanie to potwierdza obecność zwiększonej liczby komórek nabłonka płaskiego i brak wzrostu liczby białych krwinek w osadzie moczu. Podłoże MacConkey Agar (Podłoże 2 wchodzące w skład wszystkich zestawów BBL UROTUBE): Na tym podłożu wzrastają wszystkie bakterie z rodziny Enterobacteriaceae oraz niektóre bakterie niefermentujące (np. Pseudomonas aeruginosa). Zabarwienie różowe do czerwonego jest wskaźnikiem fermentacji laktozy, np. w przypadku E. coli, natomiast stwierdzenie kolonii bezbarwnych, beżowych lub bursztynowych na pomarańczowobrązowawym podłożu wskazuje na obecność bakterii niefermentujących laktozy. Należy zauważyć, że płytka zanurzeniowa zestawu BBL UROTUBE 2s jest dwustronna i zawiera tylko podłoża CLED i MacConkey. Interpretacja wzrostu na trzecim podłożu (Podłożu 3) Jak już zaznaczono rodzaj trzeciego podłoża zależy od typu stosowanego zestawu: BBL UROTUBE: Wzrost na podłożu Cetrimide Agar należy interpretować w następujący sposób: fluoryzujące kolonie zielone do żółtych wskazują na obecność Pseudomonas aeruginosa. Rozpoznanie może potwierdzić dodatni wynik testu oksydazowego (patrz DA

9 rozdział Materiały niedostarczane). Stwierdzenie wzrostu bez fluorescencji na tym podłożu wymaga dalszych badań w celu pełnej identyfikacji. BBL UROTUBE M: Wzrost na podłożu Malt Agar wskazuje na obecność drożdży, np. Candida albicans lub innych grzybów. Należy zauważyć, że pewne szczepy drożdży wymagają od 42 do 48 godzin do osiągnięcia pełnego wzrostu na tym podłożu. W rzadkich przypadkach na tym podłożu mogą wyrastać pewne bakterie, takie jak pałeczki kwasu mlekowego. Dlatego też użyteczne może być barwienie kolonii z wzrostu na tym podłożu metodą Grama. W celu pełnej identyfikacji konieczne są dalsze badania. BBL UROTUBE E: Kolonie brązowe do czarnych na podłożu Enterococcus Agar wskazują na obecność gatunków Enterococcus, np. Enterococcus faecalis. Wzrost kolonii bezbarwnych do szarych może wskazywać na obecność paciorkowców. Wymaga to jednak potwierdzenia. BBL UROTUBE E. coli: Zmiana barwy podłoża BGLU na żółtą świadczy o obecności Escherichia coli lub innych bakterii betaglukuronidazododatnich. Należy przeprowadzić test indolowy na żółtym wzroście otrzymanym na tym podłożu. Dodatni wynik reakcji wydzielania indolu wskazuje na obecność E. coli. Stwierdzenie na tym podłożu wzrostu bezbarwnego do beżowego wymaga wykonania testu TDA. Dodatni wynik testu TDA wskazuje na obecność organizmów z grupy ProteusMorganellaProvidencia. Informacje o dostępności odczynników do testów indolowego i TDA znajdują się w rozdziale Materiały niedostarczane. W celu wykonania tych testów dodatkowych należy postępować zgodnie z instrukcjami dołączonymi do odczynników. BBL UROTUBE SXT: Podłoże stosuje się do określenia wrażliwości (lub oporności) na trimetoprim i sulfametoksazol (SXT). Brak wzrostu na tym podłożu oznacza wrażliwość, natomiast silny wzrost wskazuje na oporność na SXT. Zmniejszony w porównaniu z m CLED Agar (Podłożem 1) wzrost na tym podłożu może oznaczać obecność mieszanych kultur bakteryjnych, zawierających co najmniej jeden organizm oporny na SXT. Po wykorzystaniu wszystkie zużyte probówki oraz pozostałe skażone materiały należy przed wyrzuceniem poddać sterylizacji lub spalić. Szczegółowe informacje przedstawiono w dokumencie OGÓLNE INSTRUKCJE DOTYCZĄCE STOSOWANIA. CHARAKTERYSTYKA WYDAJNOŚCIOWA I OGRANICZENIA DOTYCZĄCE PROCEDURY Zestawy BBL UROTUBE 2s, BBL UROTUBE, BBL UROTUBE M, BBL UROTUBE E, BBL UROTUBE E. coli i BBL UROTUBE SXT znajdują zastosowanie w rozpoznawaniu pospolitych zakażeń układu moczowego na podstawie analizy próbek moczu. Dowiedziono, że metoda płytki zanurzeniowej z podłożami typu CLED i MacConkey jest skutecznym i prostym środkiem do ilościowego oznaczania pospolitych bakterii (np. rodziny Enterobacteriaceae, innych pałeczek Gramujemnych (takich jak Pseudomonas), enterokoków, gronkowców i innych bakterii obecnych w moczu). 18 Zastosowanie oprócz tych podłoży standardowych także trzeciego podłoża (jeżeli wchodzi w skład zestawu) jest pomocne przy podejrzeniu obecności niektórych grup organizmów zakaźnych. 912 Próbki moczu używane w tych lub innych systemach i podłożach muszą być bezwzględnie pobierane zgodnie z zasadami aseptyki. Do badania należy stosować próbki świeże (do 2 godzin od pobrania) lub przechowywane w chłodziarce (nie dłużej niż przez 24 godziny). 1,13 Niewłaściwy sposób pobierania moczu, przechowywanie próbek przez okresy dłuższe niż wskazane powyżej, długi czas transportu pomiędzy wykonaniem posiewu na płytkach zanurzeniowych a poddaniem ich dalszej obróbce, a także narażenie płytek z wykonanym posiewem na działanie nadmiernych temperatur, może prowadzić do błędnego rozpoznania lub nawet uniemożliwiać postawienie diagnozy. 1,13 Najdokładniejsze rozpoznanie zakażeń układu moczowego uzyskuje się na drodze nadłonowego nakłucia pęcherza moczowego, ponieważ drobnoustroje obecne w prawidłowej florze cewki moczowej mogą powodować zanieczyszczenie moczu uzyskanego z zastosowaniem innych technik pobierania. DA

10 Na podłożach stosowanych w zestawach do testów metodą płytek zanurzeniowych nie można uzyskać wzrostu bakterii o wysokich wymaganiach odżywczych, takich jak mykoplazmy, chlamydie, Neissseria gonorrhoeae, mykobakterie czy Gardnerella vaginalis. W przypadku podejrzenia, że czynnikiem patogennym zakażenia dróg moczowych są wymienione organizmy, należy zastosować odpowiednie techniki diagnostyczne. 1,13 Podłoże 1 ( CLED Agar) nie zapewnia wystarczającego wzrostu pewnych szczepów paciorkowców, zwłaszcza Streptococcus agalactiae (grupa B). Przy podejrzeniu, że paciorkowce mogą być odpowiedzialne za zakażenie układu moczowego, zaleca się założenie hodowli z moczu na podłożu agarowym z krwią (np. na podłożu BD Columbia Agar with 5% Sheep Blood). Nie należy stosować podłoży zawartych w zestawach płytek zanurzeniowych do wykonywania testów wrażliwości metodą krążków dyfuzyjnych. Wprawdzie pewne testy diagnostyczne można wykonywać bezpośrednio na opisywanych podłożach, jednak w celu przeprowadzenia pełnej identyfikacji konieczne jest wykonanie badania biochemicznego oraz, jeśli jest to wskazane, badania immunologicznego z użyciem czystych hodowli. Do wyjątków należą E. coli i grupy ProteusMorganellaProvidencia, których identyfikacji można dokonać na podłożu 3 ( BGLU Agar) zestawu BBL UROTUBE E. coli, przeprowadzając zalecane testy uzupełniające (indolowy, TDA). Stwierdzenie obecności kolonii o zielonkawej fluorescencji, dających dodatni wynik testu oksydazowego, pozwala na bezpośrednią identyfikację Pseudomonas aeruginosa na podłożu 3 ( Cetrimide Agar) zestawu BBL UROTUBE. Właściwe prowadzenie leczenia może wymagać wykonania testów wrażliwości izolowanych organizmów. Obserwacja wzrostu jakichkolwiek bakterii na podłożu 3 ( PDM Medium z trimetoprimem i sulfametoksazolem) zestawu BBL UROTUBE SXT jest równoznaczna ze stwierdzeniem oporności wyhodowanych organizmów na ten lek przeciwbakteryjny (SXT). PIŚMIENNICTWO 1. Gallien, R Mikrobiologische Diagnostik in der ärztlichen Praxis, G. Fischer Verlag, Stuttgart. 2. Ellner, P.D., and M.S. Papachristos Detection of bacteriuria by dipslide. Am. J. Clin. Pathol. 63: Guttmann, D Dipslide: an aid to quantitative urine culture in general practice. Br. Med. J. 3: McAllister, T.A., et al Assessment of plane dipslide quantitation of bacteriuria. Nephron 11: Van Dorsten, J.P., and E.R. Bannister Office diagnosis of asymptomatic bacteriuria in pregnant women. Am. J. Obstet. Gynecol. 155: Sandys, G.H A new method of preventing swarming of Proteus sp. with a description of a new medium suitable for use in routine laboratory practice. J. Med. Lab. Technol. 17: Mackey, J.P., and G.H. Sandys Laboratory diagnosis of infection of the urinary tract in general practice by means of a dipinoculum transport medium. Br. Med. J. 2: Farmer III, J.J Enterobacteriaceae: introduction and identification. In: Murray, P.R., E.J. Baron, J.H. Jorgensen, M.A. Pfaller, and R.H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 9. Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R.H. Yolken (ed.) Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 10. King, E.O., M.K. Ward, and E.E. Raney Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescein. J. Lab. Clin. Med. 44: MacFaddin, J.F Media for the isolation cultivation maintenance of medical bacteria. Volume 1. Williams and Wilkins, Baltimore, London. 12. Chapin, K.C., and T.L. Lauderdale Reagents, stains, an media: bacteriology. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 13. Thomson, R.B. jr., and J.M. Miller Specimen collection, transport, and processing: bacteriology. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. DA

11 DOSTĘPNOŚĆ Numer katalogow Nazwa zestawu Wielkość opakowania y BBL UROTUBE E. coli 10 sztuk BBL UROTUBE E 10 sztuk BBL UROTUBE 10 sztuk BBL UROTUBE 50 sztuk BBL UROTUBE SXT 10 sztuk BBL UROTUBE M 10 sztuk BBL UROTUBE 2s 10 sztuk DODATKOWE INFORMACJE W celu uzyskania dodatkowych informacji należy skontaktować się z lokalnym przedstawicielem firmy BD. BD Diagnostic Systems Tullastrasse 8 12 D69126 Heidelberg/Germany Phone: , Fax: Reception_Germany@europe.bd.com BD Diagnostic Systems Europe Becton Dickinson France SA 11 rue Aristide Bergès Le Pont de Claix/France Tel: Fax: BD, BD logo and BBL are trademarks of Becton, Dickinson and Company. Urotube is a trademark of Becton Dickinson GmbH. ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection 2003 Becton, Dickinson and Company DA

12 PRZEWODNIK DO INTERPRETACJI (Wyłącznie dla podłoża CLED Agar Podłoża 1!) (=10 3 )/ml (=10 4 )/ml (=10 5 )/ml (=10 6 )/ml Zanieczyszczenie: (= ) CFU/ml Wynik wątpliwy: > < (= ) CFU/ml Zakażenie: (= ) CFU/ml DA