Angielski w diagnostyce? Jest na to sposób.

Transkrypt

1 Angielski w diagnostyce? Jest na to sposób. Wyjeżdżasz za granicę do pracy w diagnostyce, czy przygotowujesz się do egzaminu, ale masz ciągle braki z angielskiego? Jeśli czujesz, że twoja znajomość zawodowego słownictwa mogłaby być lepsza, ale nie wiesz jak szybko podszkolić znajomość specjalistycznego angielskiego sięgnij po książkę PZWL: English for Laboratory Diagnosticians. Książka autorstwa Anny Kierczak jest skierowana do studentów i absolwentów kierunków: diagnostyka laboratoryjna, medycyna laboratoryjna, czy analityka medyczna. Książka przyda się także lekarzom, pielęgniarkom, biotechnologom i biologom pracującym w służbie zdrowia, czy osobom prowadzącym działalność naukową. English for Laboratory Diagnosticians to nowoczesny, ciekawie opracowany podręcznik, który jest oparty na oryginalnych, specjalistycznych tekstach anglojęzycznych. W książce znajdziemy wiele interesujących wiadomości z praktyki zawodowej w zakresie diagnostyki, ćwiczenia leksykalno-gramatyczne, które pozwalają na rozwój umiejętności rozumienia tekstu czytanego czy dialogi obejmujące tematykę związaną z diagnostyką laboratoryjną. Pracując z książką można w szybki i prosty sposób poznać współczesne słownictwo medyczne, jak i zwroty zawodowe zarówno z języka potocznego (a nawet bardzo, bardzo potocznego ), jak i oficjalnej terminologii medycznej. W książce znajdziecie wiele ciekawych zadań, łatwo przyswajalne tabelki, słowniczki, a nawet krzyżówki. W łatwy sposób można przyswoić wiadomości na temat realiów pracy za granicą, gramatykę i słownictwo z laboratoryjnego BHP, patomorfologii, genetyki, diagnostyki laboratoryjnej i mikrobiologii. Rzetelne przerobienie książki pomoże sprawnie funkcjonować w anglojęzycznym

2 środowisku medycznym czy akademickim. Jest to także książka bardzo przydatna dla osób planujących podjęcie pracy zagranicą. Podręcznik jest dedykowany dla osób posiadających średnią i dobrą znajomość j. angielskiego. Książka ma ponad 320 stron i kosztuje 67-90zł. Polecamy! angielski w diagnostyce - polecamy źródło: własne Oczyszczanie oligonukleotydów: odsalanie, elektroforeza czy HPLC? Gdy zamawiamy oligonukleotydy, stajemy przed wyborem metody ich oczyszczenia. Do wyboru zwykle są opcje odsalania i HPLC, chociaż niektóre firmy oferują także mniej wydajną od HPLC chromatografię odwróconej fazy lub sprawdzenie wydajności syntezy poprzez elektroforezę PAGE. Najtańsze jest odsalanie, czy jednak jest ono wystarczające? Którą opcję wobec tego wybrać? Oligonukleotydy są syntezowane automatycznie przez syntetyzery sterowane

3 komputerowo. Nić DNA jest w nich produkowana w kierunku 3 5, każda zasada dołączana jest poprzez serię następujących po sobie reakcji chemicznych. Musimy wiedzieć, że jak to w chemii bywa, żadna synteza nie jest w 100% wydajna. Dlatego otrzymany oligonukleotyd o zadanej długości to tylko jeden z produktów końcowych- synteza powoduje też powstanie niedokończonych, krótszych oligo. Zwykle na każdym etapie przyłączania nukleotydu do rosnącego łańcucha ok. 1% reakcji przebiega nieprawidłowo. W związku z tym produkt syntezy 30-merowego oligonukleotydu w efekcie stanowi mieszaninę poprawnie zsyntezowanych łańcuchów (54%-74%), a resztę stanowią produkty uboczne reakcji : 29-merowe, 28-merowe itd. Im dłuższy łańcuch, tym mniejsza zawartość prawidłowego produktu syntezy. Produkty uboczne reakcji mogą współzawodniczyć z pełnymi oligonukleotydami o matrycę reakcji, obniżając wydajność amplifikacji lub skutkując niespecyficzną amplifikacją. Dlatego właśnie czasami niezbędne jest dobre oczyszczenie oligonukleotydu, jeżeli korzystamy np. z czułych metod allelospecyficznych, albo jeżeli potrzebne nam są sondy molekularne, lub długie oligo (>40pz). Istnieje pięć głównych metody oczyszczania: odsalanie, chromatografia odwróconej fazy ( Cartdridge ), wysokoprężna chromatografia cieczowa (HPLC), oczyszczanie żelowe na akrylamidzie (PAGE), oraz filtracja żelowa Podczas odsalania roztwór oligonukleotydu jest przepuszczany przez prostą kolumnę chromatograficzną, z której odpłukiwane są sole, natomiast produkty uboczne syntezy nie są usuwane. Odsalanie jest standardowym wyborem dla starterów tradycyjnych PCR, oraz dla większości starterów do reakcji qpcr. Metoda chromatografii odwróconej fazy w kardridżu wymywa oprócz soli także część produktów niespecyficznych, pozwalając na otrzymanie frakcji ok % żądanego oligonukleotydu. Ustępuje skuteczności HPLC, zapewnia też niższy odzysk oligonukleotydu więc jest dobra tylko dla małych skal syntezy. Metoda nie ma zastosowania dla bardzo długich oligo (>50nt). Wspomniana już wyżej technika HPLC to najwydajniejsza metoda oczyszczania (ale też najdroższa). Pozwala ona na oczyszczenie nawet dużych ilości oligonukleotydów w najwyższej skali syntezy, o dużej czystości (90-97%). Metoda tak jak poprzednia, nie ma zastosowania dla bardzo długich oligo (>50nt).

4 Rozdział żelowy PAGE jest jedynym skutecznym sposobem oczyszczania długich oligonukleotydów, którym nie podoła HPLC. Pozwala otrzymać bardzo czyste (do 99% czystości) oligonukleotydy, jednakże ma poważną wadę: niski odzysk z żelu znacząco zmniejsza ilość końcową czystego oligo. Tak oczyszcza się aptamery i krótkie konstrukty syntetyczne. Sączenie żelowe jest metodą z wyboru dla konstruktów zawierających fofotioniany (tzw. s-oligo) w badaniach nad antysensem. Ma także zastosowanie dla wszelkich oligonukleotydów podawanych do hodowli komórkowych, ponieważ zapewnia najlepsze odpłukanie śladowych zanieczyszczeń chemicznych. Filtracja żelowa pozwala podobnie jak PAGE na oczyszczenie dużych fragmentów DNA. Jest wykorzystywana np. podczas oczyszczania sond do techniki FISH, doskonale wymywając niezwiązany z sondą barwnik. Marzena Wojtaszewska angielski w diagnostyce - polecamy źródło: własne Źródło: Life Technologies SigmaAldrich

5 Spektrofotometryczna analiza jakościowa i ilościowa DNA i RNA za pomocą urządzenia NanoDrop protokół Wiele laboratoriów ma problem z izolacją RNA. Ten wstępny etap może zaważyć na powodzeniu lub klęsce całej serii badań, ponieważ RNA zanieczyszczone odczynnikami używanymi podczas ekstrakcji będzie nieefektywnie odwrotnie-transkrybowane. Dlatego niezwykle ważna jest kontrola wyizolowanego RNA przed jakąkolwiek obróbką enzymatyczną. Idealnym narzędziem do takiej kontroli jakości jest NanoDrop. Cel: określenie czystości DNA lub RNA po izolacji. Wprowadzenie: po skończonej izolacji kwasów nukleinowych musimy wiedzieć jakie jest stężenie i czystość materiału przed wykonaniem jakichkolwiek badań. Podczas ekstrakcji kwasów nukleinowych używa się rozpuszczalników organicznych (fenol, chloroform, alkohole) oraz soli (np. chlorek lub izotiocyjanian guanidyny), które mogą inhibować reakcje enzymatyczne takie jak PCR, RT-PCR, znakowanie rybonukleotydów i inne. RNA zanieczyszczone solami także szybciej degraduje (nawet przechowywany w -80 C!). Dlatego tak ważna jest poprawna analiza jakościowa i ilościowa każdej próbki. Wygodną formą takiej analizy jest pomiar absorbancji przy długości fali 230, 260 i 280nm. Obecnie większość laboratoriów dysponuje systemami typu NanoDrop (Thermo Scientific), które

6 mierzą te parametry w kropli <1,5ul i automatycznie przeliczają absorbancję na stężenie i czystość białkową oraz organiczną. Wyznaczają także wykres absorbancji, bardzo pomocny przy ustalaniu źródła zanieczyszczeń kwasów nukleinowych. Wykonanie pomiaru: Próbkę DNA/ RNA przed pomiarem rozmrozić i trzymać na lodzie. Bezpośrednio przed pomiarem zvortexować lub przepipetować góra-dół aby ją dobrze wymieszać. W menu urządzenia wybrać odpowiednia opcję (w przypadku NanoDrop a 1000 jest to Nucleic Acids ->ds DNA/ ssdna/ RNA. Opcje różnią się wartością jednostkowej absorbancji przyjmowaną w przeliczeniu na stężenie, należy o tym pamiętać!) Przygotować czystą wodę (do inicjalizacji) oraz bufor, w którym rozpuszczany był kwas nukleinowy (próba ślepa używana jako kalibrator). Inicjalizację i kalibrację wykonać nakrapiając każdorazowo 1,2-1,5µl płynu.za każdym razem zetrzeć szmatką okienko spektrofotometru. Nałożyć 1,2-1,5µl próbki na okienko, uważając na ewentualne bąbelki powietrza, które mogą zafałszować pomiar. Po wykonaniu pomiaru okienko przemyć wodą i przetrzeć szmatką. Jeżeli musimy zbierać próbkę z powrotem z okienka, dbajmy o jakość wody i dokładnie przemywajmy okienko pomiędzy pomiarami kolejnych próbek!

7 Ryc. 1: Czyste RNA w zakresie stężeń od 1000 ng/µl (granatowa krzywa) do 3800 ng/µl (ceglasta). Widzimy, że stężenia powyżej 3000 ng/µl (żółta i ceglasta krzywa) są zbyt wysokie, by można było poprawnie oszacować A260. Charakterystyczne jest to, że w przypadku każdej z krzywych absorbancja A230 jest około 2x mniejsza niż A260 jest to wyznacznik dobrej jakości RNA Analiza i interpretacja wyniku: Analiza ilościowa: Ilość kwasu nukleinowego jest określana jako stężenie w 1 µl. Zakres stężeń, w którym oznaczenie jest wiarygodne to ok ng/µl. Powyżej tej wartości DNA lub RNA jest zbyt stężone, by prawidłowo określić jego ilość i wyznaczyć krzywą absorbancji (ryc. 1). Poniżej wartości 10ul znacząca absorbancja tła powoduje przeszacowanie wyniku. Próbkę o zbyt wysokiej wartości absorbancji rozcieńczamy tym samym buforem, którego używaliśmy podczas izolacji i którym kalibrowaliśmy urządzenie. Przy zbyt niskiej ilości kwasu nukleinowego próbkę zagęszczamy lub przyjmujemy że ma ona stężenie niższe niż wyliczone przez urządzenie. Analiza jakościowa: maksimum absorbancji białek, częstego zanieczyszczenia DNA przy izolacji manualnej, wynosi 280 nm, zaś zanieczyszczenia organiczne posiadają najwyższą absorbancję poniżej 240 nm. Przyjęto więc arbitralnie 230nm jako długość fali dobrze określającą stopień zanieczyszczeń rozpuszczalnikami.organicznymi. Miarą stopnia czystości kwasów nukleinowych jest stosunek A260/230

8 oraz A260/280. Przyjmuje się, że czyste DNA lub RNA ma A260/280>1,8 i A260/230>1,8. Idealnie czyste RNA rozpuszczone w wodzie DEPC może mieć A260/230 nawet ok. 2,20.Na dokładną wartość tego parametru nieznacznie wpływa użyty bufor, ale generalnie parametry dobrze wyizolowanego DNA lub RNA oscylują wokół 1,8 2,05.Najprościej rzecz ujmując oznacza to, że absorbancja przy maksimum dla kwasów nukleinowych (A260) jest 2x większa niż absorbancja tła i zanieczyszczeń. Krytyczne dla reakcji enzymatycznych są wartości A260/280 i A260/230<1,4. Niższe wartości mogą spowodować bardzo kiepskie wyniki amplifikacji np. metodą Real-Time PCR czy też słabe znakowanie sond do mikromacierzy. Przy A260/230<1 nawet zwykły RT-PCR może okazać się problemem. Dlatego w przypadku kiepskiej czystości należy powtórzyć ekstrakcję alkoholem. Rodzaje zanieczyszczeń Zanieczyszczenie fenolem powodują wzrost absorbancji w zakresie nm i rozszerzenie krzywej w zakresie nm. Obraz (w przypadku ryciny 3 dotyczy próbek znaczonych strzałką, oprócz jasnoniebieskiej) jest podobny jak w przypadku zanieczyszczenia solami chaotropowymi. Takie DNA/RNA nie nadaje się do zastosowań enzymatycznych. A260/230 i A260/280 mogą przyjmować zaskakujące wartości (>2. lub <1,4 w zależności od stężenia fenolu i towarzyszących zanieczyszczeń, np. chloroformu i alkoholu izoamylowego)

9 Ryc. 2: Zanieczyszczenie fenolem (czerwona strzałka) oraz niepoprawna aplikacja próbki na okienko (oznaczone czarnymi strzałkami) Zanieczyszczenie izotiocyjanianem lub chlorkiem guanidyny widoczne na ryc. 2 (krzywa czarna i jasnozielona). Wydatny pik przy długości fali 230nm i towarzyszące mu przesunięcie absorbancji DNA/RNA w prawo w kierunku 270nm to cechy charakterystyczne tej kontaminacji. Taka próbka w żadnym wypadku nie nadaje się do zastosowań enzymatycznych, sole izotiocyjanianu są silnymi zwiazkami chaotropowymi i unieczynniają eznymy! Najczęściej oba parametry A260/A280 i A260/A230 <1,4. Ryc. 3: Zanieczyszczenie solami chaotropowymi. Charakterystyczna skocznia mamucia na wykresie absorbancji. Zanieczyszczenie białkami powodują wzrost absorbancji w zakresie nm i rozszerzenie krzywej w zakresie nm. Przy niewielkim zanieczyszczeniu (<0,1% ) możemy nie obserwować górki z prawej strony wykresu, a jedynie niewielki spadek A260/280.

10 Ryc 4. Wysokie zanieczyszczenie białkowe DNA we wszystkich próbkach. Zanieczyszczenie etanolem i/lub izopropanolem nie obserwuje się znaczącej zmiany absorbancji, szczególnie w roztworach zbuforowanych. W wodzie parametr A260/230 może być nieznacznie obniżony. Przy niewielkiej domieszce etanolu reakcje enzymatyczne nie są mocno zakłocóne, warto jednak przywiązywać wagę do dokłądnego wysuszenia pelletu przd rozpuszczeniem, ponieważ zanieczyszczenia etanolem i izopropanolem są niewykrywalne spektrofotometrycznie! Zanieczyszczenie DNA przez RNA (i vice versa) oba kwasy nukleinowe są koekstragowane i zazwyczaj występują razem po izolacji. Mają także bardzo zbliżoną pochłanialność i emisję światła, więc są nirozróżnialne spektrofotometrycznie. W przypadku konieczności pozbycia się DNA z RNA musimy wykonać trawienie próbek DNAzą. Troubleshooting A260/230 jest >2,3 Powodem może być kalibracja urządzenia innym buform niż użyty do rozpuszczenia próbek (np.woda vs TRIS-HCl). Inna możliwość to nieprawidłowe nakropienie próbki na okienko i pomiar powietrza zamiast kropli przez spektrofotometr. Objawia się to poszarpaną krzywą (ryc. 2)

11 Absorbancja A260 jest ujemna. Powodem może być kalibracja urządzenia innym buform niż użyty do rozpuszczenia próbek (np.woda vs TRIS-HCl). Inna możliwość to nieprawidłowe nakropienie próbki na okienko i pomiar powietrza zamiast kropli przez spektrofotometr. (ryc. 2) Urządzenie nie potrafi wyznaczyć absorbancji Próbka zawieszona jest w pieniącym się bądź lepkim buforze, nakropiono zbyt mało próbki bądź poza strefą pomiaru (okienko jest puste).

12 PCR bez izolacji testujemy Direct PCR Kits od ThermoFisher Scientific Specjalnie dla Was przetestowaliśmy w naszym laboratorium odczynniki firmy Thermo Scientific umożliwiające przeprowadzanie reakcji PCR z pominięciem etapu izolacji DNA.

13 Kity te, których dystrybutorem jest firma ABO, zawierają wysokiej jakości polimerazę typu HotStart odporną na wiele inhibitorów zawartych w tkankach oraz z domenę wiążącą się z DNA, wzmacniającą jej wydajność. Zestawy zawierają także Dilution Buffer oraz odczynnik DNARelease Additive pozwalające na łatwiejsze uwolnienie DNA z wielu różnych tkanek. Testowalismy 3 typy kitów: 1) Phire Animal Tissue Direct Kit przeznaczony głównie do reakcji z użyciem tkanek zwierzęcych takich jak: uszy i ogony mysie, rybie płetwy, tkanki Drosophila, itp. pełna lista na 2) Phusion Human Specimen Direct Kit przeznaczony do reakcji z użyciem preparatów pochodzenia ludzkiego: wymazów z policzka, próbek śliny, paznokci, zębów, włosów, próbek skóry, a także preparatów utrwalonych w parafinie; 3) Phusion Blood Direct Kit dedykowany głównie do reakcji z pełnej krwi obwodowej zarówno świeżej jak i mrożonej pobranej na wiele różnych antykoagulanów. Do reakcji PCR, używa się tkanki, której fragment dodaje się bezpośrednio do mieszaniny reakcyjnej zawierającej bufor, startery oraz polimerazę. Ciekawym rozwiązaniem jest dołączone do zestawów urządzenie Harris Uni-Core podobne do ołówka automatycznego, które pozwala na pobranie niewielkich porcji tkanek i przełożenie ich bezpośrednio do mieszaniny reakcyjnej. Reakcje z użyciem 3 powyższych testów prowadzono zgodnie z protokołami

14 producenta. Zaskakujące są krótkie czasy denaturacji (1-5sek), jak również pominięcie temperatury przyłączania starterów (!). Testowe reakcje PCR prowadzono w końcowej objętości mieszaniny reakcyjnej 50μl zgodnie z rekomendacjami producenta, podobnie skład mieszaniny mix również prowadzono ściśle wg zaleceń producenta. PCR- Reakcje prowadzono z zastosowaniem starterów dostarczonych w zestawach w celu zminimalizowania ryzyka niepowodzenia reakcji. Po zakończonej reakcji, próbki rozdzielano elektroforetycznie w 2% żelu agarozowym i wizualizowano w świetle UV. Po użyciu testu dedykowanego do tkanek zwierzęcych test nr 1 próbki zawierały kolejno: fragmenty preparatów parafinowych (A i B) zawieszonych w niewielkiej kropli wody, próbki tych samych preparatów zawieszone w Dilution Buffer, dwie różne próbki z krwi obwodowej (zamrożonej), leukocyty z tych samych próbek krwi zawieszone w Dilution Buffer. W przypadku tego testu porównano jakość rozdziału elektroforetycznego po zastosowaniu buforu obciążającego zawartego w zestawie dostarczonym przez producenta oraz buforu dotychczas stosowanego w laboratorium. Wyniki na rycinie:

15 W 6 / 8 p r ó b e k u z y s k a n o p rążki, nie uzyskano prążków w próbkach 2 i 4 pochodzących z tej samej tkanki, w takich przypadkach producent zaleca modyfikację warunków reakcji poprzez dodanie np. jonów Mg lub profilu termicznego (optymalizacja czasu denaturacji lub wydłużenie czasu elongacji). Po zastosowaniu buforu obciążającego stosowanego w laboratorium i buforu zawartego w zestawie Thermo Scientific Phire Animal Tissue Direct Kit nie zaobserwowano znaczących różnic pomiędzy jakością i intensywnością prążków na żelu. W drugiej kolejności testowano zestaw nr 2 dedykowany do preparatów parafinowych. Do PCR pobrano 4 fragmenty różnych preparatów, jednak w wyniku reakcji w żadnej próbce amplifikacja nie przebiegła właściwie nie uzyskano prążków, po powtórnym przeprowadzeniu testu niestety nic się nie zmieniło.:

16 Analizując przyczynę niepowodzenia, wydaje się nam prawdopodobne, że kit Thermo nie jest dedykowany do bloczków parafinowych gorszej jakości, które nadal są w Polsce bardzo powszechne. Bardzo złej jakości polska parafina oraz sposób przeprowadzania materiału mogą uniemożliwiać wykonanie z sukcesem reakcji PCR przy użyciu kitu Thermo Scientific. Dlatego najprawdopodobniej ten zestaw do reakcji PCR ze skrawków parafinowych w polskich realiach nie będzie się sprawdzał. Jako 3. testowano odczynniki przeznaczone do reakcji bezpośrednio z krwi obwodowej. Producent zaleca dodanie nawet do 10µl krwi, w naszych testach użyto tych samych próbek co w kicie nr 1 (C, D), jednak do analiz pobierano kolejno po 1 µl, 5 µl i 10 µl. Po reakcji przeprowadzonej zgodnie z zalecanym protokołem uzyskano oczekiwane produkty we wszystkich probówkach:

17 Prążki nr 3 i 6 wydają się słabsze, natomiast wynika to z mniejszej objętości próbek pobieranych do elektroforezy po reakcji pozostała duża ilość resztek komórek na dnie probówki. Podsumowując testowane odczynniki spełniają nasze oczekiwania (w przypadku kitu nr 2, wydaje nam się, że że po pewnych modyfikacjach składu mieszaniny reakcyjnej udałoby się uzyskać produkt reakcji). Ogromną zaletą odczynników typu direct jest oszczędność czasu: przygotowanie reakcji, PCR i elektroforeza zajmują niespełna 2 godziny! Uzyskane produkty znajdują się na właściwej wysokości. Miłą niespodzianka jest też cena odczynników: w przypadku Phire Animal Tissue Direct PCR Kit cena wynosi ok 1500 zł brutto za 200 reakcji, co w przeliczeniu daje ok. 7,5 zł za jedną reakcję. W przypadku zakupu Phusion Blood Direct PCR Kit na 500 reakcji, cena brutto za cały zestaw wynosi ok 2000 PLN czyli tylko 4 zł za

18 próbkę! Biorąc pod uwagę, że pomijamy całą procedurę związaną z izolacją materiału genetycznego i oszczędzamy nasz cenny czas, cena wydaje się być bardzo atrakcyjna. Tym bardziej, że oferowane zestawy spełniają nasze oczekiwania. dr n. med. Magdalena Zawada diagnosta laboratoryjny, specjalista w zakresie genetyki laboratoryjnej Testujemy tanie polimerazy Specjalnie dla Was postanowiliśmy w naszym laboratorium przetestować tanie polimerazy, których cena wynosi około 50 groszy za 1U. Ku naszemu zaskoczeniu tanie polimerazy sprawdzają się bardzo dobrze w rutynowych oznaczeniach wykonywanych metodą PCR. Postanowiliśmy przetestować jakość nowego enzymu zawartego w polimerazach DNA pochodzącego z gatunku Pyrococcus furiosus, w odróżnieniu od najczęściej stosowanych enzymów, izolowanych z bakterii Thermus aquaticus. W celu porównania wydajności reakcji PCR, użyto dwóch rodzajów zestawów enzymów służących do przeprowadzania reakcji PCR: Paq5000 DNA Polymerase (Agilent Technologies) oraz PfuPlus! DNA Polymerase (EURx). Jako matrycy użyto 3 próbek DNA izolowanego z krwi obwodowej. Powstałe produkty PCR w dalszej kolejności miały zostać poddane sekwencjonowaniu.

19 Reakcje PCR prowadzono w końcowej objętości mieszaniny reakcyjnej 50ul (w tym 2ul DNA) zgodnie z rekomendacjami producentów, ponadto skład mieszaniny PCR-mix oraz profil termiczny reakcji prowadzono również ściśle wg zaleceń producentów. Stosowano ten sam zestaw starterów o stężeniu końcowym 0,5uM a w celu optymalizacji PCR, reakcje prowadzono w gradiencie temperatur (50 C, 55 C oraz 60 C) w tym samym termocyklerze (Biometra). Po zakończonej reakcji, próbki rozdzielano elektroforetycznie w żelu agarozowym. W wyniku przeprowadzonych analiz stwierdzono, że produkty PCR (rycina) odpowiadające szukanemu fragmentowi są zasadniczo tej samej intensywności po zastosowaniu polimerazy firmy Agilent Technologies oraz EURx. We wszystkich 3 amplifikowanych próbkach pojawił się produkt PCR w temperaturach 50 C, 55 C i 60 C; w przypadku polimerazy Paq5000 DNA temperatura 50 C okazała się najbardziej optymalna, natomiast w przypadku PfuPlus!, zależności od próbki, temperatura 50 C lub 55 C wydaje się być optymalna wymaga to dopracowania warunków reakcji lub przeanalizowania większej liczby próbek. W pierwszej próbce amplifikowanej przy pomocy polimerazy PfuPlus! pojawiły się również ciężkie niespecyficzne produkty ich eliminacja jest możliwa po dopracowaniu warunków reakcji. Fotografia przedstawia wynik elektroforezy agarozowej próbek amplifikowanych przy pomocy 2 różnych rodzajów polimeraz. Możliwe różnice widoczne na rycinie wynikają z jakości zdjęcia żelu agarozowego.

20 Magdalena Zawada, dr n med. diagnosta laboratoryjny, specjalista w zakresie genetyki Z laboratorium do kuchni: o sprzęcie laboratoryjnym, który zmienił oblicze gastronomii Czym jest gastronomia molekularna? Tych, którym kojarzy się ona z jedzeniem GMO, muszę zmartwić: nie chodzi o zdobycze biotechnologii w kontekście manipulacji genetycznych, ale o sprzęt laboratoryjny i metody analityczne, które okazały się być przydatne (a wręcz niezbędne!) podczas perfekcyjnej obróbki produktów spożywczych. O zaletach odżywczych wyrobów gastronomii molekularnej pisaliśmy wcześniej, dziś zajmiemy się aspektem technicznym, czyli sprzętowi, który wyemigrował z labów na salony. Gotowanie molekularne jest traktowane jako ciekawostka właściwie od końca lat 90-tych, chociaż powinniśmy sobie zdawać sprawę, że korzystały z niego nasze babki i prababki- takie czynności jak ubijanie piany, wyrabianie ciasta poprzez mieszanie tylko w jednym kierunku lub zagniatanie chleba zgodnie z odpowiednim

21 algorytmem, to wszystko służy uzyskaniu odpowiedniej struktury fizykochemicznej przygotowywanej potrawy i poprawieniu jej smaku. W dzisiejszych czasach, dzięki zdobyczom techniki i nauk ścisłych można było udoskonalić procesy obróbki potraw w niespotykanym dotychczas wymiarze. Łaźnie wodna i cieplarki- slow cooking: by zatrzymać smak mięs Łaźnie wodne i cieplarki laboratoryjne od dawna służyły utrzymaniu stałych warunków środowiska, które były niezbędne do wykonywania pewnych reakcji chemicznych, czy też enzymatycznych. Bez cieplarek nie byłoby możliwe prowadzenie hodowli komórkowych. Pomysł zastosowanie ich do czynności stricte kuchennych narodził się w latach 50tych XX wieku. angielski w diagnostyce - polecamy źródło: własne Chyba od czasu wynalezienia ognia wiadomo było, że obróbka termiczna produktów kulinarnych jest ważna i od sposobu prowadzenia tego procesu zależy smak i konsystencja dań. Tradycyjne piece i naczynia kuchenne umożliwiały co prawda utrzymanie stałej temperatury, ale zwykle była ona wysoka, powyżej 100 stopni. Wprowadzenie tzw. slow cookerów i metody gotowania sous-vide pozwoliło wydobyć zupełnie nowe smaki ze znanych wszystkim potraw mięsnych i rybnych. Idea obu metod jest podobna: stosować tylko tyle ciepła, ile jest potrzebne do zmiękczenia potrawy, zachowując jej teksturę, strukturę tkanek i związki odżywcze. Gotowanie/pieczenie odbywa się w niskiej (ok stopni) temperaturze przez bardzo długi okres czasu (nawet kilkadziesiąt godzin). Czasami zastosowane zostaje dodatkowo podciśnienie, by lepiej zachować aromat potraw. Ciekły azot w służbie perfekcyjnych deserów lodowych Ciekły azot służy jako chłodziwo zarówno w przemyśle, w chemii, biologii jak i w

22 medycynie. Szybkie chłodzenie w bardzo niskiej temperaturze powoduje natychmiastowe zamarzanie bez tworzenia się dużych kryształów lodu, które powodują zmianę struktury tkanek. Chłodzienie w ciekłym N2 umożliwia zatem mrożenie żywotnych komórek do hodowli komórkowych czy przeszczepów. Skoro wzrost kryształów lodu w mrożonej azotem strukturze jest minimalny, to dzięki N2 można stworzyć idealnie kremowe lody. Wg znawców kuchni molekularnej tekstura deserów lodowych zamrażanych azotem jest niesamowita, lżejsza i bardziej piankowa, niż po zastosowaniu konwencjonalnego mrożenia Ciekły azot jest także używany przez eksporterów ryb i owoców morza- głównie tuńczyka, łososia i miecznika. Polędwica z tuńczyka, zamrożona w azocie, po umiejętnym rozmrożeniu zachowuje pełnię smaku i świeżości, nadaje się więc do sporządzenia wybornego sushi lub sashimi w odległej od miejsca połowu lokalizacji. Sublimacja: esencja kawowa jak kawa sypana Skoro już o mrożeniu mowa, to warto wspomnieć o procesie technologicznym, dzięki któremu kawa rozpuszczalna smakuje jak kawa, a drożdże piekarskie w proszku są po rehydratacji wciąż żywotne i potrafią spulchniać ciasto. Sublimacja polega na przejściu ciała stałego w gaz z pominięciem etapu cieczy. By odparować z zamrożonego roztworu, czy też zawiesiny, prawie cały rozpuszczalnik, korzysta się ze specjalnych komór sublimacyjnych, w których panuje obniżone ciśnienie i temperatura niższe względem tzw. punktu potrójnego danego rozpuszczalnika. Pierwotnie sublimacja była (i dalej jest) wykorzystywana w przemyśle chemicznym do uzyskiwania czystych związków chemicznych (odparowanie rozpuszczalnika lub oddzielenie kilku substancji różniących się dostatecznie parametrami termodynamicznymi punktu potrójnego). Sublimacyjne odparowanie rozpuszczalnika znalazło swoje miejsce blisko kuchni służy dziś w produkcji drożdży piekarskich i gorzelniczych, tworzeniu aromatów i barwników naturalnych oraz w produkcji kawy. Dobrej jakości kawa rozpuszczalna zachowuje maksimum smaku i nie ma palonego posmaku właśnie dzięki sublimacji. Tańsza technologia suszenia

23 rozpyłowego polega na wysuszeniu ekstraktu w wysokiej temperaturze po jego rozpyleniu w postaci aerozolu. Tracona jest w ten sposób część właściwości organoleptycznych uzyskanego rozpyłowo suchego proszku kawowego. Sublimacja nie wymaga podgrzewania, chroni więc labilne substancje aromatyczne zawarte w ekstrakcie. Wirówki: soki, musy pasty, zupy Zastosowanie wirówek w codziennej praktyce kuchennej w zasadzie ogranicza się do zwirowania liści sałaty w specjalnej plastikowej wirówce, w celu jej wysuszenia. A szkoda. Wirowanie w przemyśle spożywczym jest świetnie znane i pozwala np. na oddzielenie drożdży od wytworów gorzelniczych, albo na zagęszczenie do pożądanej konsystencji musu owocowego. Ponadto można pozbyć się szybko fusów z napojów owocowych. Na sieci furorę robią przepisy na przezroczysty sok pomidorowy i bezbarwne kremy pomidorowe. Żeby zrobić wywar z białego pomidora trzeba bardzo dobrze przygotowany i na gładko roztarty mus zwirować. I voila. Ta sama reguła obowiązuje przy nowoczesnym przyrządzaniu tradycyjnie klarownego Consommé. Jeśli chcecie zaskoczyć znajomych na przyjęciu, zaserwujcie im w identycznych szklankach zwirowany na wysokich obrotach sok pomidorowy, arbuzowy, jabłkowy i np. chudy bulion wołowy. Dopiero smak zdradza, co kryje się w przezroczystym płynie, który wzięli do ręki! Alginiany i agary: żele nie tylko do analiz W ekskluzywnych restauracjach nastała moda na kawior. Nie chodzi tu jednak o rybie jajeczka, ale o kawior o smaku np. arbuzowym, pieczeniowym lub brokułowym! Jak twierdzą restauratorzy, ekstrakty, soki i musy wyglądają i smakują lepiej, gdy podaje się je w formie kulek, przypominających wyglądem kawior. Kawior taki powstaje przez enkapsulację dowolnej zawiesiny w spolimeryzowanym żelu alginianu wapnia. Z alginianu korzystają także wegetarianie, zastępując nim nieakceptowany zwierzęcy kolagen. Alginian jest wg nich produktem ekologicznym, pozyskiwanym prosto z natury. Nic bardziej mylnego. Takie eko-galaretki to wynalazek biotechnologii! Tworzone są one poprzez

24 zestalanie alginianu w roztworze jonów wapnia. Pierwotnie alginiany (otrzymywane z glonów podobnie jak agary) służyły jako sorbenty i stabilizatory w reakcjach chemicznych, korzystano z nich również w procesie wytwarzania biosensorów i immobilizowanych drożdży do bioreaktorów. Dziś są szeroko stosowane nie tylko w przemyśle i w kuchni, ale także w medycynie do produkcji kompresów. Sonikacja: polowanie na smak Jak najmniejszym kosztem wydobyć maksimum smaku z potrawy? Odpowiedź brzmi: użyć sonifikacji. Metoda ta wykorzystuje fale ultradźwiękowe o różnym natężeniu. Energia niesiona przez takie fale jest całkiem pokaźna, pozwala na zrywanie wiązań międzycząsteczkowych, aktywację pewnych reakcji chemicznych, porowacenie i homogenizację materiału biologicznego. Sonikacja znalazła szereg zastosowań w chemii (mieszanie próbek do NMR, odgazowanie roztworów, katalizowanie reakcji chemicznych, inicjacja procesu krystalizacji) i biologii (homogenizacja tkanek, poracja błon biologicznych celem transformacji komórek egzogennym DNA, enkapsulacja białek i innych związków bioorganicznych w liposomach). Okazuje się, że teraz wkracza do kuchni z niesamowitym potencjałem. Sonikować można np. sos vinegrette, by otrzymać perfekcyjną emulsję do sałatek. Można sonikować świeże lub suszone zioła w sosach. Można w końcu nadawać aromat dębowy piwu lub whiskey (!) lub wzbogacać smak tychże napojów cynamonem, wanilią itd. Zresztą homogenizować można nie tylko sosy i koktajleznawcy twierdzą że metoda ta pozwala uzyskać idealnie kremowe puree, mięciutkie mięsa (nie trzeba ich długo marynować, wystarczy zsonikować z dodatkiem marynaty!) czy też buliony, by zintensyfikować ich smak. Co sądzicie o takim wykorzystaniu technologii laboratoryjnej? Sonikacja i ultrawirowanie w kuchni to tylko ekscesy, czy może przyszłość gastronomii? Źródła: 1. Fun with centrifugation

25 2. Gastrophysics 3. Molecular recipes i wiele innych Testujemy termocykler Labcycler od Sensoquest Przetestowaliśmy termocykler Labcycler, którego producentem jest Sensoquest Biomedical Electronics, a dystrybutorem Syngen Biotech. Urządzenie jest niezawodne, wygodne w użytkowaniu, a na dodatek bardzo szybkie. Jest to urządzenie, które spełniło nasze wymagania. Z czystym sumieniem możemy polecić je do każdego laboratorium. Zalety urządzenia:

26 -Bardzo szybkie grzanie i chłodzenie bloku -Kolorowy ekran dotykowy -Złocone termobloki wykonane ze srebra -Niski pobór mocy -Możliwosc podziału bloku na 3 niezależne bloki, poprzez specjalne nakladki na blok -6 stref kontroli temperatury -20-letni okres bezawaryjnego użytkowania -Automatyczny restart po zatrzymaniu -Możliwość autokalibracji -Ekspresowa zmiana bloku wymaga tylko jednej ręki i trwa 10 sekund. Wady: Drobną wadą jest czytelność ekranu sterującego. W naszej opinii mógłby być nieco wiekszy, przez co nieco wygodniejszy w użytkowaniu. Broszury, ulotki i protokoły:

27 Dane techniczne: Line voltage 85 to 265 without switching, Hz Power consumption Maximum 350 Watt, standby 25 Watt Loudness Idle 38 dba, typical run 44 dba, maximum run 48 dba Interfaces RS232 Heated lid Electrically moving, temperature and pressure programmable up to 105 C Pressure Programmable from 30 to 120 Newton Dimension Length = 444 mm. Witdh = 251 mm, Height lid close = 201 mm, lid open = 347 mm Weight 11.5 kg Display TFT illuminated colour ¼ VGA, 5,7 diagonal, 320 x 240 = pixel touchscreen Keyboard Numeric silicon keys Virtual keys on the touchscreen depending on the context Languages English, German Programs stepprograms, or at least 3000 steps The last 16 program runs can be displayed any time Password protection Individual for groups, persons, folders and programs Thermoblock 48, 96, 384 Material Electroformed gold Plated silver Temperature Minus 5 C to plus 99.9 C Uniformity ± 0.25 C at 55 C, ± 0.40 C at 95 C Controll accuracy 0.01 C/s Ramp rate C/s 5.0 C/s De(In)crements Temperature ± 9.99 C, time ± seconds Gradient capable 40 C, ± 20 C from the left to the right Heating rate 4.2 C/s Cooling rate 3.6 C/s Block format 48-wells, 0.5 ml single tubes96-wells, 0.2 ml single tubes, stripes & microtiterplates,384-wells, microtiterplates

28 Poradnik: Optymalizacja reakcji PCR. Trudne matryce Jak przeprowadzić optymalizację reakcji PCR? Co zmienić w metodyce, by pozbyć się produktów niespecyficznych? Jak poprawić plon reakcji? Od czego zacząć? Czego unikać? Prezentujemy ostatnią część cyklu, w którym tematem przewodnim będą tzw. trudne matryce Czym jest trudnotopliwa matryca i jak można wspomóc polimerazę podczas amplifikacji takiej sekwencji? Trudno o jednoznaczną definicję trudnej matrycy. Z reguły jednak problemy w amplifikacji biorą się z dużej zawartości motywów repetytywnych w sekwencji, a zwłaszcza traktów bogatych w pary GC. Jak rozpoznać taką złośliwą matrycę? Można posiłkować się dostępnymi w sieci narzędziami, obliczającymi lokalną zawartość par GC w danym amplikonie. Szczególnie przydatne są programy, które potrafią wyrysować nam wykres topliwości. Znalazłam 4 działające programy tego typu. Pierwszy to stare, DOS owe narzędzie Melt94, które można pobrać tutaj. Program na zadanej matrycy wykonuje analizę topnienia in silico, a wynik zwraca w formie serii liczb. Żeby otrzymać przejrzysty wynik, trzeba niestety samodzielnie przekopiować ciąg liczb do arkusza kalkulacyjnego, ale taki wykres może nam się później przydać, np. do publikacji na posterze lub w pracy

29 dyplomowej, dlatego właśnie z niego korzystam i gorąco polecam. Ryc. 1. Okno wynikowe programu Melt94. Na osi rzędnych naniesiono kolejne aminokwasy, na osi odciętych- zakres temperatur. Kolejne algorytmy są dostępne w formie online. Są to: GC Profile Gene analysis Loopentropy Są to proste programy, szacujące %GC, które podobnie jak Melt94 rysują wykres topnienia amplikonu. Co z takiego programu możemy wyczytać? Przede wszystkim informację, czy w matrycy znajdują się obszary o wysokiej (>80%) zawartości par GC. Jeśli tak, sprawdźmy czy nasze primery nie cumują właśnie w obrębie takiej wyspy CG. Jeśli tak, to od razu powinniśmy uznać taką matrycę za kłopotliwą i pogodzić się z tym, że może zajść konieczność uciązliwej optymalizacji w celu otrzymania produktu PCR. Uwaga ogólna: czasami zdarza się, że sam PCR nie stanowi problemu, ale np. klonowanie lub sekwencjonowanie takiego produktu jest

30 awykonalne bez zmian w metodyce (przekonałam się o tym na własnej skórze!). Gdy jesteśmy gotowi do rozpoczęcia optymalizacji, postępujemy tak jak w II części naszego cyklu: próbujemy dobrać odpowiednią temperaturę topnienia i stężenie magnezu w gradiencie. Jeżeli jesteśmy w stanie otrzymać w miarę wyraźny specyficzny produkt, w zasadzie nie musimy obawiać się o dalszą optymalizację. Jeżeli natomiast efektem amplifikacji jest smear, albo obecne jest wiele różnych produktów niespecyficznych, lub co gorsza nie jesteśmy w stanie otrzymać w ogóle produktów amplifikacji, to możemy mieć problem. Co dalej? Najprostszymi zabiegami, wspomagającymi słabą amplifikację są: wydłużenie denaturacji wstępnej, podwyższenie temperatury annealingu lub zastosowanie zabiegów z III części cyklu, głównie touchdown PCR-u. Gdy te środki zawiodą, musimy posiłkować się specjalnymi KIT-ami do trudnych matryc (wiele takich zestawów jest dostępne na polskim rynku) albo wypróbowanymi dodatkami, poprawiającymi efekty PCR (gotowe KIT-y także zawierają te same substancje!). Poniżej przedstawiam najpopularniejsze odczynniki tego typu. DMSO dimetylosulfotlenek ma wiele zastosowań, przede wszystkim krioprotekcyjnych, ale także niwelujących oddziaływania międzycząsteczkowe. Ta druga właściwość sprawia, że podczas ochładzania rozplecionych nici DNA na etapie annealingu nie dochodzi do pełnego formowania się struktur II-rzędowych w DNA. W związku z tym polimeraza ma dostęp do luźniej uorganizowanych fragmentów zawierających trakty GC, które byłyby niedostępne i ciasno zwinięte gdyby DMSO w mieszaninie reakcyjnej nie było. Stężenie końcowe DMSO w MIX ie powinno wynosić nie więcej niż 10%, z reguły stosuje się go od 2 do 5%. Betaina jest osmolem organicznym o charakterze jonu obojnaczego. Sądzi się, że jej rola w PCR jest podobna jak DMSO- zmniejsza formowanie się struktur IIrzędowych. Ponadto stabilizuje kompleks polimeraza-dna. Najczęściej dostarczana jest ona w stężeniu 5M, a używana jako 1-3M. Wiele firm sprzedaje betainę jako cudowny środek własnego pomysłu pod różnymi nazwami handlowymi, np. Q-solution (QIAGEN), Advantage-GC (CLONETECH). DTT ditiotreitol to antyoksydant, zwiększający stabilność polimerazy podczas reakcji PCR dzięki swoim własnościom redukującym. Obecnie częściej niż do PCR

31 wykorzystywany w reakcjach RT-PCR. Albumina- środek blokujący wiele białek, który nie wiąże się z polimerazami. Przydatna szczególnie w reakcjach PCR, zachodzących w obecności zanieczyszczeń białkowych (np. bezpośredni PCR na lizacie, PCR na materiale antycznym). Wspomaga też utrzymanie nici DNA w formie zdenaturowanej, co może tłumaczyć jej zastosowanie przy trudnotopliwych matrycach. Formamid-używany jako środek denaturujący DNA, w niskich stężeniach obniża ilość struktur drugorzędowych. Niestety zastosowany w zbyt wysokim stężeniu powoduje unieczynnienie polimerazy, więc musi być stosowany w jak najmniejszych ilościach. Zaleca się końcowe stężenie 1-2,5% tego reagentu. Detergenty niejonowe substancje takie jak Triton, NP40 czy Tween działają stabilizująco na polimerazę i częściowo na matrycę. Mogą działać dodatnio także w reakcjach zanieczyszczonych odczynnikami organicznymi (np. po kiepskiej izolacji kwasów nukleinowych). Glikol etylenowy, 1,2-propanodiol Chińczycy ogłosili światu, że glikol i propanodiol działają podobnie do betainy, ale z dużo wyższą skutecznością. Warto spróbować, jeżeli nie mamy nic do stracenia! angielski w diagnostyce - polecamy źródło: własne Uwagi końcowe Niestety jedynym sposobem na przekonanie się, czy któryś z dodatków dla trudnych matryc będzie skuteczny w konkretnym przypadku, jest wypróbowanie go (i to w szeregu stężeń i konstelacji z innymi). Kiedyś odkryłam, że jeden z amplikonów nie chce poddać się reakcji PCR ani w obecności samego DMSO, ani samej betainy, natomiast wybornie działa zastosowanie obu tych substancji jednocześnie. Potraktujmy optymalizację PCR jako przygodę, doświadczenie które

32 wzbogaci nasz warsztat i pozwoli na wyrobienie pewnych rutynowych nawyków podczas pracy z kolejnymi matrycami. Piśmiennictwo: Doświadczenia własne Poradnik: Optymalizacja reakcji PCR algorytm postępowania Jak przeprowadzić optymalizację reakcji PCR? Co zmienić w metodyce, by pozbyć się produktów niespecyficznych? Jak poprawić plon reakcji? Od czego zacząć? Czego unikać? Proponujemy algorytm postępowania, który pozwoli na szybką i bezbolesną poprawę wyników waszych reakcji PCR. Schemat optymalizacji A. Zawsze po zamówieniu nowych starterów PCR zaczynamy od nastawienia próbnej reakcji od jej wyniku będzie zależało dalsze postępowanie. Musimy znać temperaturę annealingu starterów (albo obliczoną teoretycznie, albo używaną przez inne grupy badawcze, jeżeli nasze startery są zamówione na podstawie już publikacji). Jeżeli korzystaliśmy wcześniej z danego zestawu do PCR, mamy już jakiś działający program amplifikacji i ustalone proporcje reagentów -wykorzystajmy je

33 teraz. Jeżeli jesteśmy nieobeznani z zestawem, przeczytajmy ulotkę i na jej podstawie obliczmy ilości odczynników. Zwykle musimy w końcowej objętości mieć: bufor 1x stężony dntp 200μM MgCl2 1-2,5mM startery po 200nM polimerazę ok. 0,5-1U matrycę: DNA w ilości ng lub cdna uzyskane z ok ng RNA wodę DEPC, którą uzupełniamy objętość reakcji. (nie podajemy tutaj konkretnych objętości, ponieważ zależnie od zastosowanego zestawu PCR będą one różne, w instrukcji do zestawu jest jednak zwykle wyszczególniony przepis w mikrolitrach) B. Jeżeli nie mamy ustalonego programu PCR, zastosujmy najprostszy, obejmujący : 5 minut denaturacji w 94 stopniach (jeżeli polimeraza nie jest typu HotStart) lub 10 minut w 95 stopniach (dla enzymu HotStart) 30 cykli: (30 sekund denaturacji+ 30 sekund annealingu w temperaturze zależnej od pary starterów + 30 sekund elongacji) 2 minuty elongacji końcowej. C. Po skończonej reakcji pobieramy 5ul, dodajemy obciążnik do elektroforezy i rozdzielamy na żelu agarozowym. Nie zapomnijmy rozdzielić produktu wobec markera mas, by móc zorientować się, czy otrzymany prążek jest tym, czego oczekiwaliśmy. W zależności od tego, czy otrzymamy prążek na żelu, postępujmy dalej zgodnie z poniższym algorytmem

34 By uniknąć frustracji i niepotrzebnego kręcenia się w kółko podczas wprowadzania nowej metodyki opartej na reakcji PCR powinniśmy mieć jasny plan działania i przestrzegać kilku prostych zasad. 1. Stosujmy się do reguły małych kroków. Dążymy w pierwszej kolejności do otrzymania jakiegokolwiek śladu produktu, następnie powoli dopracowujmy reakcję korzystając po kolei ze wszelkich dostępnych metod i odczynników. Czasami od razu uda nam się trafić w idealne warunki, a czasem trzeba będzie dochodzić do nich dłużej. 2. Zapisujmy wszystkie żele, nawet te najbrzydsze. Sporządzajmy notatki dotyczące warunków reakcji i kolejnych rund optymalizacji. Moim zdaniem najlepsza metoda na takie notatki to zapisywanie bezpośrednio na elektronicznym zdjęciu żelu warunków, w jakich reakcja została wykonana. Czyli: kiedy ją wykonano, na jakim sprzęcie, na jakim zestawie do PCR (jeśli mamy kilka). Zapiszmy program PCR lub chociażby temperaturę annealingu oraz koniecznie stężenie magnezu. Jeżeli używaliśmy dodatków (np. DMSO) także nie zapomnijmy tego napisać. 3. Zanim zabierzemy się do nastawiania PCR zweryfikujmy stężenia naszych reagentów, ich termin ważności oraz (TO BARDZO ISTOTNE!) sprawdźmy sekwencje naszych starterów. Jeżeli pomyliliśmy się podczas zamawiania, zweryfikowanie tego drobnego szczegółu oszczędzi nam tygodni frustracji. 4. Jeśli jakaś metoda nie chodzi mimo wszystkich naszych działań, nie

35 wypruwajmy sobie żył. Spróbujmy zmienić startery albo zestaw do PCR. Alternatywą jest poproszenie współpracownika o pomoc. Bywa że to pomaga D. Bogatsi o tę wiedzę możemy zacząć optymalizację. Spójrzcie na powyższy prosty schemat blokowy, którym możecie się posłużyć przy wprowadzaniu większości nowych reakcji. Podstawowym narzędziem pracy podczas optymalizacji jest gradient termiczny i gradient magnezu. Pozwalają one na wykonanie dokładnie tej samej reakcji w szeregu różnych temperatur i stężeń magnezu. Wykonanie gradientu temperatury jest możliwe na nowszych termocyklerach. Potrafią one nagrzać blok grzewczy tak, by w kolejnych rzędach dołków temperatura stopniowo wzrastała. Żeby uzyskać jednolite warunki PCR w każdej próbówce, musimy przygotować wspólną mieszaninę reakcyjną zawierającą wszystkie składniki, a potem rozporcjować ją na pojedyncze próbówki. Polecam wykonać na początku dość szeroki gradient, np. co 2 stopnie celcjusza zaczynając od temperatury dużo niższej od temperatury obliczonej jako optymalna (np. 0d ok. 50 stopni celcjusza przy optymalnej ok. 60), kończąc na temperaturze wyższej niż obliczona optymalna (np. 62 w naszym przykładzie). Jeżeli taki gradient da odpowiedź, w której temperaturze produkt jest najlepiej widoczny, możemy wykonać drugi PCR gradientowy w węższym zakresie temperatur, np. co ok. 1 stopień celcjusza wokół wcześniej wytypowanej przez nas optymalnej temperatury. E. Zwykle po pierwszej lub drugiej reakcji PCR otrzymujemy jakiś ślad pożądanego produktu, nawet jeśli jest on słaby i nawet jeśli są obecne produkty niespecyficzne. Po dokonaniu wyboru optymalnej temperatury, wykonujemy gradient magnezu. Przygotowujemy kilka próbówek PCR z różnymi stężeniami magnezu. Może to być trudne dla początkującego, proponuję więc poradzić się osoby bardziej doświadczonej, jeżeli mamy z tym problem. W próbówce nr 1 przygotujmy stężenie, które po dodaniu do MIXu da nam 0,5mM, w próbówce 2: 1mM, w próbówce 3 : 1,5mM itd. aż do 3,5mM ((instrukcja znajduje się u dou strony). Wykonujemy wspólny mix reakcyjny podobnie jak przy gradiencie temperatury, ale bez dodatku magnezu. Pipetujemy mieszaninę do osobnych próbówek, a potem dodajemy odpowiednio stężony magnez, osobno do każdej z próbówek.

36 F. Po wykonaniu reakcji w gradiencie magnezu i rozdziale agarozowym produktów w 3/4 przypadków udaje nam się uzyskać w miarę czysty i dobrze widoczny produkt. W pozostałych przypadkach musimy wrócić do gradientu temperatury z już wybranym optymalnym stężeniem magnezu (o ile uda nam się takie wybrać). Jeżeli nie liczymy się z kosztami, możemy wykonać jednocześnie gradient 2D na płytce 96-dołkowej (w wymiarze szerszym gradient termiczny, w węższymmagnezu). Przeprowadzenie kolejne obu gradientów jest tańsze, ale bardziej czasochłonne niż wykonanie podwójnego gradientu. Jeżeli nie otrzymaliśmy w ogóle żadnego produktu, wykonajmy na użytych do optymalizacji odczynnikach inną reakcję PCR, o której wiemy że działa. Jeśli okaże się że równieżnie otrzymamy produktu, musimy zmienić zestaw do PCR, w przeciwnym razie dalej zmagamy się z optymalizacją na tych samych odczynnikach- możemy dodać więcej starterów lub więcej dntp. O tym jak modyfikować te parametry i jak połaczyć kilka reakcji PCR w multiplex, przeczytacie w części III naszego opracowania. Jeżeli nie otrzymujemy produktu, możemy także dodać któregoś z dodatków do trudnych matryc (DMSO, betaina, DTT, albumina). O tym jak z nich korzystać- dowiemy się w części IV niniejszego cyklu artykułów. Życzymy samych udanych optymalizacji! Krótka instrukcja wykonania gradientu (przykład dla reakcji o całkowitej objętości 25μl): Dodatek 3,5μl MgCl2 o standardowym stężeniu 25mM na 25μl całkowitej objętości reakcji daje nam finalne stężenie po sporządzeniu MIXu 3,5mM MgCl2. Żeby przygotować stężenia odpowiednio mniejsze w tej samej objętości 3,5μl, wystarczy odmierzyć odpowiednio mniej magnezu i uzupełnić wodą do 3,5μl. Tak więc żeby otrzymać: 0,5mM końcowej reakcji dodajmy 0,5 μl MgCl2 + 3μl H20 1mM : 1μl MgCl2 + 2,5μl H20, 1,5mM: 1,5μl MgCl2 + 2μl H20

37 2mM: 2μl MgCl2 + 1,5μl H20 2,5mM: 2,5μl MgCl2 + 1μl H20 3mM: 3μl MgCl2 + 0,5μl H20 Osobno mix reakcyjny na 7 próbówek przygotowujemy bez magnezu o objętości 3,5μl, który mamy sporządzony zgodnie z powyższą instrukcją w 7 osobnych próbówkach. Mix dobrze mieszamy i dozujemy po 21,5μl do gotowych stężeń magnezu. Można oczywiście sporządzić większą objętość magnezu na więcej reakcji gradientowych (np. mnożąc objętości z powyższego przepisu x10) i odmierzać po 3,5μl gdy najdzie nas taka potrzeba. Piśmiennictwo: Doświadczenia własne CE IVD bez tajemnic Czym jest, na czym bazuje i po co w ogóle to wprowadzono? Niniejszy artykuł dotyczy dyrektywy 98/79/EC i jej konsekwencji laboratoryjnych oraz prawno-ekonomicznych. Idea polityki jakości jest już dość leciwa, wymyślono ją dla celów wielkoskalowego przemysłu, bo takiego przemysłu nie stać na brak jakości. Czym w ogóle jest jakość? Jakość definiowana po konsumencku to przecież nie to samo, co jakość

38 zawarta w procedurach i normach. Tak definiowana jakość oznacza wysoką powtarzalność parametrów produktów danego typu wykonanych w zgodzie z normą, a także bezpieczeństwo wytwórcy w procesie produkcyjnym i bezpieczeństwo odbiorcy podczas użytkowania. Taka definicja jakości wcale nie daje gwarancji, że produkt na przykład będzie stworzony z wysokiej jakości bawełny. Dlatego sceptycznie podchodzimy do znaczków CE na opakowaniach, które jednak są potrzebne, bo gwarantują bezpieczeństwo użytkowania i humanitarne warunki pracy wytwórców. Jednak skupmy się na diagnostyce in vitro: co ją odróżnia od reszty rynku konsumenckiego? Mamy wytwórcę, mamy użytkownika diagnostę. Mamy jednak kogoś jeszcze. Pacjenta, który jest faktycznym beneficjentem i odbiorcą testu diagnostycznego, mimo że dzieje się to poza jego świadomością tego faktu. Po to właśnie, by chronić także chorego, którego przecież nie stać na pomyłki producenta testu (płaciłby swoim zdrowiem!) powstała dyrektywa UE o medycznych przyrządach do diagnostyki in vitro (98/79/EC). Dlatego certyfikat jakości CE nie wystarcza jako gwarancja odpowiedniej jakości w diagnostyce medycznej. 98/79/EC Cóż to za dokument i czego dotyczy? Jest to zestaw bardzo ogólnikowych norm, jakie muszą spełniać odczynniki i urządzenia używane w laboratoriach diagnostycznych. Jako medyczne przyrządy diagnostyczne rozumie się wg dyrektywy nie tylko urządzenia, ale także systemy przechowywania próbek, odczynniki diagnostyczne oraz software do analizy danych. Wszelka aparatura i chemia, która ma styczność z próbką na którymkolwiek etapie analizy jest zatem traktowana jako medyczny przyrząd diagnostyczny i podlega tym wytycznym. Dyrektywa IVD mówi między innymi, że do diagnostyki in vitromoże by stosowany sprzęt/odczynnik który spełnia kryteria dla normy CE (działającej w oparciu o dokument EN ISO 9001) i dodatkowe kryteria, zawarte w aneksach (I- X). Ponadto pewne odrębne kryteria, inne niż dla odczynników używanych w laboratoriach, muszą spełnić urządzenia do samokontroli u pacjentów glukometry, paski testowe itp. Z punktu widzenia laboratoriów najważniejszy jest załącznik 2. Zawarta jest w nim klasyfikacja badań o podwyższonym poziomie wymaganych norm jakości ze względu na istotność tych badań w kontekście zdrowia i życia pacjenta i

39 personelu. W aneksie A mamy badania serologiczne grup krwi: systemu ABO, Rh (C, c, D, E, e) Kell, oraz badania wirusologiczne HIV, HTLV oraz badania wirusów wątrobowych. W aneksie B figurują grupy krwi Duffy i Kidd, przeciwciała przeciwkrwinkowe, typowanie tkankowe HLA (serologia), detekcja toksoplazmozy i różyczki, wirusa cytomegalii i chlamydiozy (mikrobiologia, wirusologia), testy na fenyloketonurię, oznaczenie trisomii 21 (genetyczne zaburzenia wrodzone), oznaczenia markeru nowotworowego PSA oraz glukozy we krwi. Oznacza to, że oprócz obowiązkowych wymagań z aneksu I i wymogu posiadania certyfikatu CE dla tych oznaczeń wymagane jest spełnienie kryteriów załączników IV-VIII, potwierdzone certyfikatami zgodności z drugą normą, DIN EN ISO i (najlepiej) oświadczeniem producenta że produkt może by stosowany w diagnostyce in vitro. Dla diagnostów ważne jest, co rozumie się przez stosowanie się do wytycznych dla oznaczeń z aneksów A i B: testy używane w diagnostyce MUSZĄ być certyfikowane CE IVD wszystkie urządzenia służące do wykonania oznaczeń, a wiec zarówno systemy do pobierania próbek, jak i pipety, plastiki laboratoryjne i inne urządzenia muszą spełniać takowe wymagania. O tym wiele laboratoriów zapomina. Zapomina się także o tym, że zestaw może być certyfikowany np. tylko dla krwi, bo firmie nie chciało się certyfikować zestawu dla innych typów materiału (to są koszty a firmy lubią je ciąć!), a my oznaczamy tym zestawem parametry np. w PMR. To błąd który nie powinien mieć miejsca. Za to powinno się karać i to surowo (a w Polsce jest z tym różnie). Dlaczego nie wszystkie laboratoria stosują się do wytycznych aneksów A i B? Bo jakość kosztuje. Zestawy z IVD są droższe, a konkurencyjność wymaga obniżania cen. Często kadra jest też nieprzeszkolona i żyje w błogiej niewiedzy. Niestety nieznajomość prawa nie jest usprawiedliwieniem. A dlaczego producenci znanych, rewelacyjnych marek sprzętu i odczynników na przykład do biologii molekularnej często uwzględniają adnotacje for research use only, mimo że ich odczynnikom można ufać bardziej niż KITom z IVD mało znanych firm? Ma to 2 przyczyny. Po pierwsze certyfikat podraża odczynnik, a adresatami odczynników do badań molekularnych są głównie jednostki naukowe,